CN107002027B

CN107002027B - 具有生产l-精氨酸能力的棒状杆菌属微生物和使用其生产l-精氨酸的方法

Info

Publication number: CN107002027B
Application number: CN201580055711.1A
Authority: CN
Inventors: 裴贤爱; 李翰衡; 姜旼暻; 金宗贤; 金蕙园
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2014-10-13
Filing date: 2015-10-13
Publication date: 2021-05-28
Anticipated expiration: 2035-10-13
Also published as: TWI583790B; PL3153573T3; JP2017518760A; EP3153573A4; CA2951019A1; AU2015331160B2; KR101835935B1; MY188962A; JP6476212B2; BR112016029730A2; CN107002027A; ES2724000T3; TW201619374A; US10626426B2; EP3153573B1; HUE042618T2; DK3153573T3; AU2015331160A1; RU2671106C1; CA2951019C

Abstract

本发明涉及一种用于生产L‑精氨酸的棒状杆菌属微生物和使用其的L‑精氨酸生产方法。

Description

具有生产L-精氨酸能力的棒状杆菌属微生物和使用其生产L- 精氨酸的方法

技术领域

本发明涉及一种具有生产L-精氨酸能力的棒状杆菌属微生物和使用其生产 L-精氨酸的方法。

背景技术

L-精氨酸为广泛用于氨基酸补充剂、药物、食品等中的氨基酸，并且需要开发在相关行业中高效的L-精氨酸生产。

通过常规生物发酵法生产L-精氨酸的方法是直接从碳源和氮源生产L-精氨酸的方法，且已报道了各种方法，包括使用由短杆菌或棒状杆菌属微生物诱导的修饰菌株的方法、使用通过细胞融合而成为具有增强的氨基酸生产能力的细菌细胞系的方法等。最近，报道了使用遗传重组菌株的方法，其中抑制精氨酸生物合成操纵子argR的表达的基因被灭活(美国专利号7,160,705)，以及使用 argF在精氨酸操纵子中过表达的方法(韩国专利号10-0854234)等。特别地，控制精氨酸操纵子的argR中的缺失已被认为是精氨酸生产中的重要因素。

根据迄今已知的事实，在棒状杆菌属微生物中，参与精氨酸生物合成的argCJBDFR基因以操纵子的形式构成，并且通过细胞内精氨酸进行反馈抑制 (VeharySakanyan等，微生物学，142:9-108，1996)，因此对其高产量L-精氨酸生产施加了限制。

发明内容

技术问题

因此，本发明的发明人在致力于提高L-精氨酸产量的同时，发现L-精氨酸可以通过增强精氨酸操纵子和鸟氨酸氨甲酰基转移酶的活性，在通常已知为重要因素的精氨酸阻遏物(argR)中没有任何缺失的情况下，以比亲本L-精氨酸生产菌株更高产量地生产L-精氨酸，从而完成本发明。

技术问题

本发明的目的为提供一种具有生产L-精氨酸能力的棒状杆菌属微生物。

本发明的另一个目的为提供使用棒状杆菌属微生物生产L-精氨酸的方法。

技术效果

可以使用根据本发明的具有增强活性的精氨酸操纵子和鸟氨酸氨甲酰基转移酶(ArgF或ArgF2)的生产L-精氨酸的棒状杆菌属微生物以较高产率来生产 L-精氨酸。此外，以高产率生产的L-精氨酸可以有效地用于人类药物和药物工业。

具体实施方式

在实现上述目的的一方面，本发明提供一种具有增强活性的精氨酸操纵子和鸟氨酸氨甲酰基转移酶的、能够生产L-精氨酸的棒状杆菌属微生物。

在本发明中，精氨酸操纵子是由参与L-精氨酸生物合成机制的酶组成的操纵子，特别地，精氨酸操纵子由构成L-精氨酸生物合成的循环步骤的酶组成。具体地，精氨酸操纵子由N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶(ArgC)、N-乙酰谷氨酸转移酶(ArgJ)、N-乙酰谷氨酸激酶(ArgB)、乙酰鸟氨酸转氨酶(ArgD)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶(ArgF)和精氨酸阻遏物(ArgR)组成，这些酶参与L-精氨酸生物合成的连续酶反应。

构成精氨酸操纵子的这些酶使用L-谷氨酸作为前体参与最终的L-精氨酸生物合成。N-乙酰谷氨酸转移酶(ArgJ)使用L-谷氨酸作为前体合成N-乙酰谷氨酸，且其可以为由argJ基因编码的。特别地，乙酰基是通过将N-乙酰鸟氨酸分解成L-鸟氨酸而获得的。已知N-乙酰谷氨酸转移酶参与属于棒状杆菌属的微生物中L-精氨酸生物合成的再循环反应。

生产的N-乙酰谷氨酸通过N-乙酰谷氨酸激酶(ArgB)被合成为N-乙酰谷氨酰磷酸，ADP通过消耗ATP作为辅酶生产，且可以为由argB基因编码的。由于已知由最终产物L-精氨酸进行反馈抑制，通过L-精氨酸释放反馈抑制的修饰是已知的，并且有报道使用其可以提高L-精氨酸的生产率(中国专利号 102021154和氨基酸.2012年7月；43(1)：255-66.doi：10.1007/s00726-011-1069-x. Epub 2011年9月8日)。

N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶(ArgC)在大肠杆菌或酵母中也称为乙酰谷氨酸半醛脱氢酶，且可以由argC基因编码。通过该酶将N-乙酰谷氨酰磷酸转化为 N-乙酰谷氨酸5-半醛。NADPH用作辅酶以提供能量。使用L-谷氨酸作为氨基酸供体，将生产的N-乙酰谷氨酸5-半醛转化为N-乙酰鸟氨酸，并且该反应由乙酰鸟氨酸转氨酶(ArgD)介导。乙酰鸟氨酸转氨酶可由argD基因编码。转化的 N-乙酰鸟氨酸通过N-乙酰谷氨酸转移酶(ArgJ)的再循环反应，将其乙酰基递送至L-谷氨酸，并作为L-鸟氨酸反应。

鸟氨酸氨甲酰基转移酶(ArgF)通常称为鸟氨酸氨甲酰水解酶，并且可以由argF或argF2基因编码。L-鸟氨酸与氨基甲酰磷酸结合以形成L-瓜氨酸，并生产作为副反应产物的磷酸酯。通过上述的与精氨酸操纵子分开存在的精氨基琥珀酸合酶(ArgG)和精氨基琥珀酸裂解酶(ArgH)的酶反应，最终将生产的 L-瓜氨酸合成为L-精氨酸。L-精氨酸通过总共8个生物合成步骤来合成，在本发明中，通过强化精氨酸操纵子(argCJBDFR)的活性来诱导L-精氨酸生产率的增强。

构成精氨酸操纵子的酶可以包括在本发明的范围内，只要它们具有上述活性，具体地，酶可以为来自棒状杆菌属微生物的蛋白质。更具体地，N-乙酰谷氨酸转移酶(ArgJ)可以包括SEQ ID NO：19的氨基酸序列或与该序列具有至少70％、特别是80％、更特别是90％或更高同源性的氨基酸序列。N-乙酰谷氨酸激酶(ArgB)可以包括SEQ ID NO：21的氨基酸序列或与该序列具有至少70％、特别是80％、更特别是90％或更高同源性的氨基酸序列。此外，在相应的酶的情况下，可以引入本领域中已知的修饰，以通过精氨酸释放反馈抑制。N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶(ArgC)可以包括SEQ ID NO：23的氨基酸序列或与该序列具有至少70％、特别是80％、更特别是90％或更高同源性的氨基酸序列。乙酰鸟氨酸转氨酶(ArgD)可包括SEQ ID NO：25的氨基酸序列或与该序列具有至少70％、特别是80％、更特别是90％或更高同源性的氨基酸序列。鸟氨酸氨甲酰基转移酶(ArgF)可以包括SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：3的氨基酸序列，或者可以包括与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少70％同源性的氨基酸序列。具体地，鸟氨酸氨基甲酰基转移酶(ArgF)可以包括与 SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、 95％、96％、97％、98％或99％或更高同源性的氨基酸序列。此外，显而易见的是，在一个或多个氨基酸残基中包括缺失、修饰、取代或添加的氨基酸序列落入本发明的范围内，只要它们与上述蛋白质具有同源性并且具有与上述蛋白质基本上相同或相应的生物活性即可。

如本文所用，术语“同源性”是指用于比较的两个氨基酸序列或核苷酸序列之间的相似性程度，并且它们的同源性可以通过裸眼或使用生物信息学算法的比较来确定，其通过比对要对比的序列来提供同源性程度的分析结果。两个氨基酸序列之间的同源性可以以百分比表示。有用的自动算法可以用于威斯康星州遗传学软件包(美国威斯康星州遗传学电脑集团，麦迪逊)的GAP、 BESTFIT、FASTA和TFASTA计算机软件模块中。其它有用的算法和比对的同源性测定已经在软件中自动化，例如FASTP、BLAST、BLAST2、PSIBLAST 和CLUSTALW。

在本发明中，精氨酸操纵子活性的增强可以指精氨酸操纵子中存在的酶中的至少一种酶的活性的增强，然而，其不包括单独的argR基因的单一增强。例如，精氨酸操纵子活性的增强可以指通过增强精氨酸操纵子中存在的一种酶的启动子来增强操纵子中存在的所有酶的活性，并具体地，可以指通过增强N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶的启动子来增强整个操纵子的活性。另外，在本发明中，对构成精氨酸操纵子的酶中至少一种酶进行编码的基因的表达的增加也可以被认为是精氨酸操纵子活性的增强。

如本文所用，术语活性的“增强”是指提供没有具蛋白质活性的蛋白质的特定活性的微生物，或者提高具有蛋白质活性的微生物的细胞内活性等，并且指与蛋白质的内在活性相比，蛋白质的细胞内活性的增加。如本文所用，术语内在活性是指属于棒状杆菌属的微生物在天然或预修饰状态下具有的酶的活性状态。

为了增强或增加酶的活性，可以应用本领域中已知的各种方法。尽管它们不限于此，但方法的示例可以包括：通过进一步将包含编码相应酶的核苷酸序列的多核苷酸插入染色体中或将多核苷酸导入载体系统等以增加编码酶的核苷酸序列的复制数量的方法、用强启动子代替酶启动子的方法，并具体地，可以包括在启动子上引入修饰的方法、以及通过遗传修饰将酶修饰为具有强活性的酶的方法。

本发明中的具体实例可以包括：通过修饰或取代启动子，将存在于精氨酸操纵子中的酶启动子修饰为与内源启动子相比较强的启动子的方法。可以连接具有核苷酸取代修饰的改良启动子或异源启动子来代替内源酶的启动子，并且异源启动子的示例可以包括pcj7启动子(韩国专利号10-0620092)、lysCP1启动子(韩国专利号10-0930203)、EF-Tu启动子、groEL启动子、aceA启动子、 aceB启动子等，但不限于此。

如本文所用，术语“启动子”是指编码区上游的非编码核酸序列，其包括聚合酶结合区，且具有转录启动到启动子下游基因的mRNA的活性，即，其中聚合酶结合并启动基因转录的DNA区域，并且位于mRNA转录启动区的5'区域。

在本发明中，可以使用本领域公知的各种方法进行鸟氨酸氨甲酰基转移酶活性的增强，并且它们与上述相同。具体地，可以通过将包含编码鸟氨酸氨甲酰基转移酶的多核苷酸的表达载体(vector)转化到细菌菌株中来实现增强，但不限于此。

如本文所用，术语“转化”是指将DNA引入宿主中，从而使插入的DNA 可复制为染色体外因子或通过染色体整合。具体地，本发明的转化体可以通过在将包含上述DNA的载体转化到宿主细胞中后，在载体内具有启动子活性的核酸分子的序列和内源靶基因的启动子区域中的序列之间的同源重组插入染色体中，或可以以质粒的形式保留。

本发明的载体转化方法可以包括能够将核酸导入细胞的任何方法，并且可以根据每个宿主细胞选择和进行本领域中已知的任何适当的标准技术。例如，可以使用电穿孔、磷酸钙(CaPO₄)沉淀、氯化钙(CaCl₂)沉淀、显微注射、聚乙二醇(PEG)法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法、乙酸锂/DMSO法等，但是该方法不限于此。

如本文所用，术语“棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)微生物”可以指属于具有L-精氨酸生产能力的棒状杆菌属的所有菌株，例如谷氨酸棒状杆菌、产氨棒状杆菌、热产氨棒状杆菌、黄色短杆菌、发酵短杆菌等，但不限于此。具体地，可以使用谷氨酸棒状杆菌，但是微生物不限于此。

另一方面，本发明提供一种生产L-精氨酸的方法，包括在合适的培养基中培养棒状杆菌属的L-精氨酸生产微生物。

在本发明中，微生物培养可以根据本领域中公知的方法进行，培养温度、培养时间、培养基的pH等条件可以适当地调整。已知的培养方法详细地描述于参考文献(Chmiel；Bioprozesstechnik 1.Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav FischerVerlag，Stuttgart，1991)和Storhas；Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag，Braunschweig/Wiesbaden，1994)。此外，培养方法可以包括分批培养、连续培养和补料分批培养，具体地，培养可以通过分批方法或补料分批或重复补料分批方法连续进行，但不限于此。

使用的培养基应当适当地满足特定菌株的所需条件。用于各种微生物的培养基是已知的(例如，“Manual of Methods for General Bacteriology”from American Societyfor Bacteriology(Washington D.C.，USA，1981))。包含在培养基中的碳源可以包括糖和碳水化合物(例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素)、油和脂肪(例如，大豆油、葵花籽油、花生油和椰子油)、脂肪酸(例如，棕榈酸、硬脂酸和亚油酸)、醇(例如，甘油和乙醇)、有机酸 (例如乙酸)等。这些材料可以单独或作为混合物使用，但不限于此。包含在培养基中的氮源可以包括含氮有机化合物(例如，蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉末和尿素)和无机化合物(例如，硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)，这些材料也可以单独或作为混合物使用，但不限于此。培养基中所含的磷源可以包括磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或其等价的含钠盐，但不限于此。培养基可以含有生长必需的金属盐(例如，硫酸镁或硫酸铁)，并且除了上述材料之外，还可以使用基本的生长促进材料例如氨基酸和维生素。另外，可以将适当的前体进一步加入到培养基中。上述待供应的材料可以在培养期间立即或适当地添加到培养基中。

培养基的pH可以使用碱性化合物(例如，氢氧化钠、氢氧化钾或氨)或酸性化合物(例如，磷酸或硫酸)适当调节。

发泡可以使用消泡剂例如脂肪酸聚乙二醇酯调节。可以通过将氧气或含氧气体混合物例如空气引入培养基中以维持需氧条件。培养温度可以为20℃至 45℃，并具体为25℃至40℃。可以继续培养直至获得所需L-氨基酸产量的最大量，并具体为10小时至160小时。L-精氨酸可以释放到培养基中或可以保持包含在细胞中。

同时，包括培养上述微生物的本发明的L-精氨酸的生产方法可以进一步包括在培养过程中回收L-精氨酸的步骤。也就是说，本发明的L-精氨酸的制备方法可以包括在培养基中培养棒状杆菌属微生物，并从微生物和培养基中回收L- 精氨酸。回收精氨酸的步骤可以意指使用本领域中广泛已知的回收精氨酸的方法从细胞或培养基中分离精氨酸。回收L-精氨酸的方法可以包括离心分离、过滤、萃取、喷雾、干燥、蒸发、沉淀、结晶、电泳、分级溶解、色谱(例如离子交换、亲和、疏水性、尺寸排除和高性能液相色谱)等，但不限于此。

实施例

在下文中，将参考以下实施例更详细地描述本发明。然而，这些实施例仅用于说明的目的，并且本发明不受这些实施例的限制。

实施例1：具有增强的精氨酸操纵子的载体的构建

为了增强微生物染色体上的精氨酸操纵子，构建了缺失N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶(ArgC)的自启动子并用不同的启动子取代的载体。使用lysCP1(韩国专利号10-0930203中公开的SEQ ID NO：18)作为取代启动子，其具有强的表达诱导活性。

首先，使用谷氨酸棒状杆菌(保藏号：ATCC13869)的野生型菌株的染色体DNA作为模板，以及引物对SEQ ID NO：13(SF_pargC_PR_pDC融合引物； 5'-CGAGCTCGGTACCCGGGCAAAGAATACGGCTTCCTTGGC-3')和SEQ ID NO：14(SR_pargC_PR_XbaI-XhoI-BamHI融合/限制酶引物； 5'-CTGGATCCTCGAGTCTAGAGACGGGTTAGACATGCAAAA-3')和引物对 SEQ ID NO：15(SF_pargC_PR_SpeI-ScaI-BamHI融合/限制酶引物； 5'-GACTCGAGGATCCAGTACTAGTATGATAATCAAGGTTGCAAT-3')和SEQ ID NO：16(SR_pargC_PR_pDC融合引物； 5'-TGCAGGTCGACTCTAGGGTAACGCCTTCTTTCAAAG-3')，通过初级聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段。PCR反应的具体条件如下：通过使用PCR 装置(Bio-rad C1000热循环仪)和Pfu聚合酶(Macrogen)在95℃下变性10 分钟，在55℃下退火30秒，并在72℃下延伸1分钟，并且重复28个循环以进行PCR反应。

使用片段DNA纯化试剂盒(GeneAll)纯化由此获得的初级PCR片段，然后通过将其与已经通过用XmaI-XbaI限制性酶消化而制备的pD载体混合以将三个DNA片段连接。使用融合克隆试剂盒(Clontech)，使连接的DNA片段在50℃下进行反应10分钟，从而构建pD-RargC_PR载体。

以如下方式进行取代启动子的插入：使用pDZ-lysCP1(韩国专利号 10-0930203)作为模板，以及引物对SEQ ID NO：5(SF_PlysCP1_XhoI-XbaI融合引物；5'-CCGTCTCTAGACTCGAGCCATCTTTTGGGGTGCGG-3')和SEQ ID NO：6(SR_PlysCP1_SpeI融合引物； 5'-TTGATTATCATACTAGTCTTTGTGCACCTTTCGAT-3')扩增lysCP1启动子，并通过将它们与已经通过用XhoI-SpeI限制酶消化而制备的pD-PargC_PR载体混合以连接。PCR和融合克隆的方法与上述相同，最后通过所述方法构建 pD-PargC::lysCP1载体。

实施例2：具有增强的鸟氨酸氨甲酰基转移酶的载体的构建

为了增强精氨酸生物合成酶之一的鸟氨酸氨甲酰基转移酶，构建了重组表达载体。使用p117-cj7-GFP(韩国专利号10-0620092)作为模板载体，并通过用EcoRV-Xba I限制酶处理而除去模板载体中编码GFP的核苷酸序列，并且插入来源于谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的野生型菌株argF和argF2(韩国专利号 10-0830290)。

使用谷氨酸棒状杆菌(保藏号：ATCC13869)的野生型菌株的染色体DNA 作为模板，以及引物对SEQ ID NO：7(SF_argF_EcoRV融合引物； 5'-ACGAAAGGAAACACTCGATATCATGACTTCACAACCACAGGT-3')和SEQ ID NO：8(SR_argF_XbaI融合引物； 5'-GCCAAAACAGCTCTAGATTACCTCGGCTGGTGGGCCA-3')，通过PCR扩增argF基因的DNA片段。通过使用Pfu聚合酶在95℃下变性10分钟，在55℃下退火30秒，和在72℃下延伸2分钟，并重复28个循环以进行PCR反应。将如此获得的PCR片段纯化并与已经用EcoRV-XbaI限制酶处理的p117-cj7-GFP 混合，并通过融合克隆法连接，从而构建了重组表达载体p117-Pcj7-argF。

使用谷氨酸棒状杆菌(保藏号：ATCC13032)的野生型菌株的染色体DNA 作为模板，使用引物对SEQ ID NO：9(SF_argF2_EcoRV融合引物； 5'-ACGAAAGGAAACACTCGATATCATGGCCAGAAAACATCTGCT-3')和SEQ ID NO：10(SR_argF2_XbaI融合引物； 5'-GCCAAAACAGCTCTAGACTACGCATTGATCGACCGAG-3')和Pfu聚合酶 (Macrogen)，通过在95℃下变性10分钟，在55℃下退火30秒，并使用Pfu 聚合酶在72℃下延伸2分钟，重复28个循环以进行PCR，通过PCR扩增argF2 基因。将如此获得的PCR片段纯化并与已经用EcoRV-XbaI限制酶处理的 p117-cj7-GFP混合，并通过融合克隆试剂盒连接，从而构建了重组表达载体 p117-Pcj7-argF2。

此外，构建了可同时表达argF和argF2基因的重组表达载体。将如此构建的表达载体p117-Pcj7-argF用NotI处理，然后将p117-Pcj7-argF2插入其中。具体地，使用重组质粒p117-Pcj7-argF2作为模板，以及SEQ ID NO：11 (SF_Pcj7_argF2_NotI融合引物； 5'-CCTTTTTGCGGCGGCCGCAGAAACATCCCAGCGCTACT-3')和SEQ ID NO：12(SR_argF2_NotI融合引物：5'-CACCGCGGTGGCGCGGTGGCGGCCGCCGCAAAAAGGCCATCCGTCA-3') 引物和Pfu聚合酶，通过在95℃下变性10分钟，在55℃下退火30秒并在72℃下延伸2.5分钟，并重复28个循环，从而进行PCR反应。将如此获得的PCR 片段纯化并与已经用NotI限制酶处理的p117-Pcj7-argF混合，并通过融合克隆试剂盒连接，最后构建了重组表达载体p117-Pcj7-argF/Pcj7-argF2。

实施例3：其中插入有重组载体的菌株的构建

3-1.插入具有增强的精氨酸操纵子的载体

为了将棒状杆菌染色体上的精氨酸操纵子的自启动子pD-PargC::lysCP1替换，将实施例1中构建的重组载体转化到现有的精氨酸生产棒状杆菌菌株，从而构建插入有重组载体的棒状杆菌菌株。具体地，通过将实施例1中构建的重组载体pD-PargC::lysCP1转化到现有的KCCM10741P(韩国专利号10-07916590) 和ATCC21831的产精氨酸菌株中，将lysCP1启动子序列插入染色体中，由此通过同源重组用载体的启动子序列置换亲本菌株具有的自启动子序列。

在进行转化时，首先通过电脉冲法(Appl Microbiol Biotechnol.1999Oct；52(4)：541-5)将重组载体插入KCCM10741P和ATCC21831中，并通过重组在其染色体上插入的菌株的同源序列在含有25mg/L卡那霉素的培养基中选择。使选择的初级菌株进行杂交，从而选择那些用lysCP1启动子取代启动子并除去载体的菌株。通过使用引物对SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的PCR确认最终转化菌株中启动子取代的存在，并将菌株命名为KCCM10741P_ΔPargC::lysCP1 和ATCC21831_ΔPargC::lysCP1。

3-2、插入具有增强的鸟氨酸氨甲酰基转移酶的载体

通过电脉冲法将实施例2中构建的重组表达载体p117-Pcj7-argF、 p117-Pcj7-argF2、和p117-Pcj7-argF/Pcj7-argF2插入到菌株KCCM10741P_Δ PargC::lysCP1和ATCC21831_ΔPargC::lysCP1，在含有25mg/L卡那霉素的培养基中选择，并且最终构建进一步表达argF、argF2和argF/argF2的菌株。该菌株被命名为KCCM10741P_ΔPargC::lysCP1_Pcj7-argF、KCCM10741P_Δ PargC::lysCP1_Pcj7-argF2、KCCM10741P_ΔPargC::lysCP1_Pcj7-argF/ Pcj7-argF2、ATCC21831_ΔPargC::lysCP1_Pcj7-argF、ATCC21831_ΔPargC::lysCP1_Pcj7-argF2和ATCC21831_ΔPargC::lysCP1_Pcj7-argF/ Pcj7-argF2，而其中，在2013年12月9日，根据布达佩斯条约在韩国微生物保藏中心(KCCM)，将KCCM10741P_ΔPargC::lysCP1_Pcj7-argF2改名为 CA06-2044，登记号为KCCM11498P。

实施例4：构建菌株的评价

为了使用谷氨酸棒状杆菌KCCM10741P_ΔPargC::lysCP1、KCCM10741P_ ΔPargC::lysCP1_Pcj7-argF、KCCM10741P_ΔPargC::lysCP1_Pcj7-argF2、 KCCM10741P_ΔPargC::lysCP1_Pcj7-argF/Pcj7-argF2、ATCC21831_ΔPargC::lysCP1、ATCC21831_ΔPargC::lysCP1_Pcj7-argF、ATCC21831_Δ PargC::lysCP1_Pcj7-argF2和ATCC21831_ΔPargC::lysCP1_Pcj7-argF/Pcj7-argF2 (实施例3中构建的精氨酸生产菌株)来检查精氨酸操纵子和鸟氨酸氨甲酰基转移酶的增强对精氨酸生产能力的影响，将它们进行如下所示培养。具体地，将作为亲本菌株的谷氨酸棒状杆菌KCCM10741P和ATCC21831用作对照，将菌株的铂圈分别接种到含有25mL(6％葡萄糖、3％硫酸铵、0.1％磷酸钾、0.2％七水硫酸镁、1.5％玉米浆(CSL)、1％氯化钠、0.5％酵母提取物和100μg/L生物素，pH7.2)生产培养基的250mL角挡板烧瓶上，并在30℃下在200rpm下温育48小时。培养完成时，通过HPLC测量L-精氨酸产量，将结果示于下表1中。

[表1]

通过亲本菌株和重组菌株确认精氨酸生产能力

如上表1中所示，与对照相比，其中编码精氨酸操纵子和鸟氨酸氨甲酰基转移酶的基因同时增强的菌株显示出的精氨酸产生能力最大增加50％。此外，通过引入argF、argF2或argF和argF2，解决了单独的精氨酸操纵子 (KCCM10741P_ΔPargC::lysCP1和ATCC21831_ΔPargC::lysCP1)的增强中所示的精氨酸浓度和鸟氨酸浓度的增加，并最终显示精氨酸浓度增加的结果。

从前述内容，本发明所属的本领域技术人员将能够理解的是，在不改变本发明的技术概念或本质特征的情况下，本发明可以以其它具体形式实施。在这点上，本文中公开的示例性实施例仅用于说明性目的，而不应被解释为限制本发明的范围。相反，本发明旨在不仅覆盖示例性实施方式，而且覆盖可以包括在由所附权利要求限定的本发明的精神和范围内的各种替代、修改、等同和其它实施方式。

<110> CJ第一制糖株式会社

<120> 用于生产L-精氨酸的棒状杆菌属微生物和使用其的L-精氨酸生产方法

<130> OPA15238

<150> KR10-2014-0137794

<151> 2014-10-13

<150> KR10-2015-0076311

<151> 2015-05-29

<160> 26

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 319

<212> PRT

<213> 谷氨酸棒状杆菌argF

<400> 1

Met Thr Ser Gln Pro Gln Val Arg His Phe Leu Ala Asp Asp Asp Leu

1 5 10 15

Thr Pro Ala Glu Gln Ala Glu Val Leu Thr Leu Ala Ala Lys Leu Lys

20 25 30

Ala Ala Pro Phe Ser Glu Arg Pro Leu Glu Gly Pro Lys Ser Val Ala

35 40 45

Val Leu Phe Asp Lys Thr Ser Thr Arg Thr Arg Phe Ser Phe Asp Ala

50 55 60

Gly Ile Ala His Leu Gly Gly His Ala Ile Val Val Asp Ser Gly Ser

65 70 75 80

Ser Gln Met Gly Lys Gly Glu Thr Leu Gln Asp Thr Ala Ala Val Leu

85 90 95

Ser Arg Tyr Val Glu Ala Ile Val Trp Arg Thr Tyr Ala His Ser Asn

100 105 110

Phe His Ala Met Ala Glu Thr Ser Thr Val Pro Leu Val Asn Ser Leu

115 120 125

Ser Asp Asp Leu His Pro Cys Gln Ile Leu Ala Asp Leu Gln Thr Ile

130 135 140

Val Glu Asn Leu Ser Pro Glu Glu Gly Pro Ala Gly Leu Lys Gly Lys

145 150 155 160

Lys Ala Val Tyr Leu Gly Asp Gly Asp Asn Asn Met Ala Asn Ser Tyr

165 170 175

Met Ile Gly Phe Ala Thr Ala Gly Met Asp Ile Ser Ile Ile Ala Pro

180 185 190

Glu Gly Phe Gln Pro Arg Ala Glu Phe Val Glu Arg Ala Glu Lys Arg

195 200 205

Gly Gln Glu Thr Gly Ala Lys Val Val Val Thr Asp Ser Leu Asp Glu

210 215 220

Val Ala Gly Ala Asp Val Val Ile Thr Asp Thr Trp Val Ser Met Gly

225 230 235 240

Met Glu Asn Asp Gly Ile Asp Arg Thr Thr Pro Phe Val Pro Tyr Gln

245 250 255

Val Asn Asp Glu Val Met Ala Lys Ala Asn Asp Gly Ala Ile Phe Leu

260 265 270

His Cys Leu Pro Ala Tyr Arg Gly Lys Glu Val Ala Ala Ser Val Ile

275 280 285

Asp Gly Pro Ala Ser Lys Val Phe Asp Glu Ala Glu Asn Arg Leu His

290 295 300

Ala Gln Lys Ala Leu Leu Val Trp Leu Leu Ala His Gln Pro Arg

305 310 315

<210> 2

<211> 960

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒状杆菌argF

<400> 2

atgacttcac aaccacaggt tcgccatttc ctggctgatg atgatctcac ccctgcagag 60

caggcagagg ttttgaccct agccgcaaag ctcaaggcag cgccgttttc ggagcgtcca 120

ctcgagggac caaagtccgt tgcagttctt tttgataaga cttcaactcg tactcgcttc 180

tccttcgacg cgggcatcgc tcatttgggt ggacatgcca tcgtcgtgga ttccggcagc 240

tcacagatgg gtaagggcga gaccctgcag gacaccgcag ctgtattgtc ccgctacgtg 300

gaagcaattg tgtggcgcac ctacgcacac agcaatttcc acgccatggc ggagacgtcc 360

actgtgccac tggtgaactc cttgtccgat gatctgcacc catgccagat tctggctgat 420

ctgcagacca tcgtggaaaa cctcagccct gaagaaggcc cagcaggcct taagggtaag 480

aaggctgtgt acctgggcga tggcgacaac aacatggcca actcctacat gattggcttt 540

gccaccgcgg gcatggatat ctccatcatc gctcctgaag ggttccagcc tcgtgcggaa 600

ttcgtggagc gcgcggaaaa gcgtggccag gaaaccggcg cgaaggttgt tgtcaccgac 660

agcctcgacg aggttgccgg cgccgatgtt gtcatcaccg atacctgggt atccatgggt 720

atggaaaacg acggcatcga tcgcaccaca cctttcgttc cctaccaggt caacgatgag 780

gtcatggcga aagctaacga cggcgccatc ttcctgcact gccttcctgc ctaccgcggc 840

aaagaagtgg cagcctccgt gattgatgga ccagcgtcca aagttttcga tgaagcagaa 900

aaccgcctcc acgctcagaa agcactgctg gtgtggctgc tggcccacca gccgaggtaa 960

960

<210> 3

<211> 274

<212> PRT

<213> 谷氨酸棒状杆菌argF2

<400> 3

Met Ala Arg Lys His Leu Leu Ser Leu Ala Asp Trp Asn Arg Gly Glu

1 5 10 15

Leu Glu Ala Leu Phe Glu Leu Ala Glu Gln Tyr Glu Ala Gly Gly Gly

20 25 30

Pro Arg Phe Asp Gly Ala Ala Ala Met Phe Phe Pro Pro Thr Ser Leu

35 40 45

Arg Thr Arg Leu Ser Phe Glu Arg Gly Ala Thr Ala Met Gly Leu Gln

50 55 60

Pro Ile Thr Phe Pro Ser Asp Ser Leu Asp Lys Asp Glu Asp Leu Val

65 70 75 80

Asp Val Val Gly Tyr Leu Ser Gln Trp Ala Asp Val Val Val Val Arg

85 90 95

His Pro Gln Leu Thr Ala Leu Gln Arg Leu Ala Ser Ala Asp Ala Ala

100 105 110

Pro Val Ile Asn Ala Met Thr Ser Glu Asn His Pro Cys Glu Val Leu

115 120 125

Ser Asp Leu Tyr Ala Leu Ser Arg His His Asp Ile Ser Ala Leu Arg

130 135 140

Tyr Leu Phe Val Gly Gly Asp Gly Asn Ile Ala Arg Ala Trp Trp Glu

145 150 155 160

Ala Ala Gln Ala Phe Gly Leu Glu Met Arg Gln Ser Cys Pro Glu Glu

165 170 175

Leu Arg Val Val Gly Met Pro Trp Glu Glu Asn Leu Pro His Ala Ile

180 185 190

Ala Ser Ala Asp Val Val Leu Thr Asp Gly Pro Gly Arg His Ala Glu

195 200 205

Leu Leu Glu Pro Tyr Arg Val Thr Ala Ala Leu Leu Asp Arg Ala Pro

210 215 220

Arg Gly Val Arg Leu Ala Pro Cys Pro Pro Phe Ile Arg Gly Arg Glu

225 230 235 240

Val Ser Ala Asp Ala Ile Glu His Pro Ala Phe Val Gly Tyr Ser Phe

245 250 255

Lys Arg His Leu Met Pro Val Gln Gln Ala Ile Leu Ala Arg Ser Ile

260 265 270

Asn Ala

<210> 4

<211> 825

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒状杆菌argF2

<400> 4

atggccagaa aacatctgct ctccctggca gactggaaca gaggcgagct tgaggcatta 60

ttcgagctcg cggagcagta tgaagctggc ggtgggccac gattcgatgg tgccgcggcg 120

atgttcttcc cgccgacgag tttgcgtaca cggctctcat tcgagcgtgg ggcaacggca 180

atgggactcc agccgatcac gttcccgtca gacagcctgg acaaggacga agatctcgtc 240

gacgtcgtcg gctatctctc gcagtgggct gatgtcgttg tcgtccgaca cccgcaattg 300

acggcgcttc agcggttggc gtcagcggat gcagcgcccg tgatcaacgc gatgacgagt 360

gagaaccatc cgtgcgaagt cctctcggac ttgtatgcgc tgtctcgtca ccatgacatt 420

tcggccctgc ggtacctgtt tgtcggtggc gatggcaaca tcgccagggc ctggtgggag 480

gcggcccaag cgttcggcct cgagatgcgg cagagttgtc ctgaagagct gcgtgtcgtc 540

gggatgccgt gggaggagaa cctgccgcat gcaattgcat cagcggatgt cgtgctgacg 600

gatgggccag gtagacatgc ggagttactc gagccgtatc gtgtgaccgc tgcgttgttg 660

gatcgcgcgc cccgtggagt gcggctcgcg ccctgcccgc cgttcatccg cgggcgcgaa 720

gtgagcgccg atgcgatcga gcatccggcg ttcgtcgggt actcgttcaa gcgtcatctc 780

atgccggttc agcaggcgat tctggctcgg tcgatcaatg cgtag 825

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SF_PlysCP1_XhoI-XbaI引物

<400> 5

ccgtctctag actcgagcca tcttttgggg tgcgg 35

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SR_PlysCP1_SpeI引物

<400> 6

ttgattatca tactagtctt tgtgcacctt tcgat 35

<210> 7

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SF_argF_EcoRV引物

<400> 7

acgaaaggaa acactcgata tcatgacttc acaaccacag gt 42

<210> 8

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SR_argF_XbaI引物

<400> 8

gccaaaacag ctctagatta cctcggctgg tgggcca 37

<210> 9

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SF_argF2_EcoRV引物

<400> 9

acgaaaggaa acactcgata tcatggccag aaaacatctg ct 42

<210> 10

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SR_argF2_XbaI引物

<400> 10

gccaaaacag ctctagacta cgcattgatc gaccgag 37

<210> 11

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SF_Pcj7_argF2_NotI引物

<400> 11

cctttttgcg gcggccgcag aaacatccca gcgctact 38

<210> 12

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SR_argF2_NotI引物

<400> 12

caccgcggtg gcggccgccg caaaaaggcc atccgtca 38

<210> 13

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SF_pargC_PR_pDC引物

<400> 13

cgagctcggt acccgggcaa agaatacggc ttccttggc 39

<210> 14

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SR_pargC_PR_XbaI-XhoI-BamHI引物

<400> 14

ctggatcctc gagtctagag acgggttaga catgcaaaa 39

<210> 15

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SF_pargC_PR_SpeI-ScaI-BamHI引物

<400> 15

gactcgagga tccagtacta gtatgataat caaggttgca at 42

<210> 16

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SR_pargC_PR_pDC引物

<400> 16

tgcaggtcga ctctagggta acgccttctt tcaaag 36

<210> 17

<211> 317

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒状杆菌cj7启动子

<400> 17

agaaacatcc cagcgctact aatagggagc gttgaccttc cttccacgga ccggtaatcg 60

gagtgcctaa aaccgcatgc ggcttaggct ccaagatagg ttctgcgcgg ccgggtaatg 120

catcttcttt agcaacaagt tgaggggtag gtgcaaataa gaacgacata gaaatcgtct 180

cctttctgtt tttaatcaac atacaccacc acctaaaaat tccccgacca gcaagttcac 240

agtattcggg cacaatatcg ttgccaaaat attgtttcgg aatatcatgg gatacgtacc 300

caacgaaagg aaacact 317

<210> 18

<211> 353

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒状杆菌lysCP1启动子

<400> 18

ccatcttttg gggtgcggag cgcgatccgg tgtctgacca cggtgcccca tgcgattgtt 60

aatgccgatg ctagggcgaa aagcacggcg agcagattgc tttgcacttg attcagggta 120

gttgactaaa gagttgctcg cgaagtagca cctgtcactt ttgtctcaaa tattaaatcg 180

aatatcaata tatggtctgt ttattggaac gcgtcccagt ggctgagacg catccgctaa 240

agccccagga accctgtgca gaaagaaaac actcctctgg ctaggtagac acagtttatt 300

gtggtagagt tgagcgggta actgtcagca cgtagatcga aaggtgcaca aag 353

<210> 19

<211> 388

<212> PRT

<213> 谷氨酸棒状杆菌argJ

<400> 19

Met Ala Lys Lys Gly Ile Thr Ala Pro Lys Gly Phe Val Ala Ser Ala

1 5 10 15

Thr Thr Ala Gly Ile Lys Ala Ser Gly Asn Pro Asp Met Ala Leu Val

20 25 30

Val Asn Gln Gly Pro Glu Phe Ser Ala Ala Ala Val Phe Thr Arg Asn

35 40 45

Arg Val Phe Ala Ala Pro Val Lys Val Ser Arg Glu Asn Val Ala Asp

50 55 60

Gly Gln Ile Arg Ala Val Leu Tyr Asn Ala Gly Asn Ala Asn Ala Cys

65 70 75 80

Asn Gly Leu Gln Gly Glu Lys Asp Ala Arg Glu Ser Val Ser His Leu

85 90 95

Ala Gln Asn Leu Gly Leu Glu Asp Ser Asp Ile Gly Val Cys Ser Thr

100 105 110

Gly Leu Ile Gly Glu Leu Leu Pro Met Asp Lys Leu Asn Thr Gly Ile

115 120 125

Asp Gln Leu Thr Ala Glu Gly Ala Leu Gly Asp Asn Gly Ala Ala Ala

130 135 140

Ala Lys Ala Ile Met Thr Thr Asp Thr Val Asp Lys Glu Thr Val Val

145 150 155 160

Phe Ala Asp Gly Trp Thr Val Gly Gly Met Gly Lys Gly Val Gly Met

165 170 175

Met Ala Pro Ser Leu Ala Thr Met Leu Val Cys Leu Thr Thr Asp Ala

180 185 190

Ser Val Thr Gln Glu Met Ala Gln Ile Ala Leu Ala Asn Ala Thr Ala

195 200 205

Val Thr Phe Asp Thr Leu Asp Ile Asp Gly Ser Thr Ser Thr Asn Asp

210 215 220

Thr Val Phe Leu Leu Ala Ser Gly Ala Ser Gly Ile Thr Pro Thr Gln

225 230 235 240

Asp Glu Leu Asn Asp Ala Val Tyr Ala Ala Cys Ser Asp Ile Ala Ala

245 250 255

Lys Leu Gln Ala Asp Ala Glu Gly Val Thr Lys Arg Val Ala Val Thr

260 265 270

Val Val Gly Thr Thr Asn Asn Glu Gln Ala Ile Asn Ala Ala Arg Thr

275 280 285

Val Ala Arg Asp Asn Leu Phe Lys Cys Ala Met Phe Gly Ser Asp Pro

290 295 300

Asn Trp Gly Arg Val Leu Ala Ala Val Gly Met Ala Asp Ala Asp Met

305 310 315 320

Glu Pro Glu Lys Ile Ser Val Phe Phe Asn Asp Gln Ala Val Cys Leu

325 330 335

Asp Ser Thr Gly Ala Pro Gly Ala Arg Glu Val Asp Leu Ser Gly Ala

340 345 350

Asp Ile Asp Val Arg Ile Asp Leu Gly Thr Ser Gly Glu Gly Gln Ala

355 360 365

Thr Val Arg Thr Thr Asp Leu Ser Phe Ser Tyr Val Glu Ile Asn Ser

370 375 380

Ala Tyr Ser Ser

385

<210> 20

<211> 1167

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒状杆菌argJ

<400> 20

atggccaaaa aaggcattac cgcgccgaaa ggcttcgttg cttctgcaac gaccgcgggt 60

attaaagctt ctggcaatcc tgacatggcg ttggtggtta accagggtcc agagttttcc 120

gcagcggccg tgtttacacg caaccgagtt ttcgcagcgc ctgtgaaggt gagccgggag 180

aacgttgctg atggccagat cagggctgtt ttgtacaacg ctggtaatgc taatgcgtgt 240

aatggtctgc agggtgagaa ggatgctcgt gagtctgttt ctcatctagc tcaaaatttg 300

ggcttggagg attccgatat tggtgtgtgt tccactggtc ttattggtga gttgcttccg 360

atggataagc tcaatacagg tattgatcag ctgaccgctg agggcgcttt gggtgacaat 420

ggtgcagctg ctgccaaggc gatcatgacc actgacacgg tggataagga aaccgtcgtg 480

tttgctgatg gttggactgt cggcggaatg ggcaagggcg tgggcatgat ggcgccgtct 540

cttgccacca tgctggtctg cttgaccact gatgcatccg ttactcagga aatggctcag 600

attgcgctgg ctaatgctac ggccgttacg tttgacaccc tggatattga tggatcaacc 660

tccaccaatg acaccgtgtt cctgctggca tctggcgcta gcggaatcac cccaactcag 720

gatgaactca acgatgcggt gtacgcagct tgttctgata tcgcagcgaa gcttcaggct 780

gatgcagagg gggtgaccaa gcgcgttgct gtgacagtgg tgggaaccac caacaacgag 840

caggcgatca atgcggctcg cacggttgct cgtgacaatt tgttcaagtg cgcaatgttt 900

ggatctgatc caaactgggg tcgcgtgttg gctgcagtcg gcatggctga tgctgatatg 960

gaaccagaga agatttctgt gttcttcaat gatcaagcag tatgccttga ttccactggc 1020

gctcctggtg ctcgtgaggt ggatctttcc ggcgctgaca ttgatgtccg aattgatttg 1080

ggcaccagtg gggaaggcca ggcaacagtt cgaaccactg acctgagctt ctcctacgtg 1140

gagatcaact ccgcgtacag ctcttaa 1167

<210> 21

<211> 317

<212> PRT

<213> 谷氨酸棒状杆菌argB

<400> 21

Met Asn Asp Leu Ile Lys Asp Leu Gly Ser Glu Val Arg Ala Asn Val

1 5 10 15

Leu Ala Glu Ala Leu Pro Trp Leu Gln His Phe Arg Asp Lys Ile Val

20 25 30

Val Val Lys Tyr Gly Gly Asn Ala Met Val Asp Asp Asp Leu Lys Ala

35 40 45

Ala Phe Ala Ala Asp Met Val Phe Leu Arg Thr Val Gly Ala Lys Pro

50 55 60

Val Val Val His Gly Gly Gly Pro Gln Ile Ser Glu Met Leu Asn Arg

65 70 75 80

Val Gly Leu Gln Gly Glu Phe Lys Gly Gly Phe Arg Val Thr Thr Pro

85 90 95

Glu Val Met Asp Ile Val Arg Met Val Leu Phe Gly Gln Val Gly Arg

100 105 110

Asp Leu Val Gly Leu Ile Asn Ser His Gly Pro Tyr Ala Val Gly Thr

115 120 125

Ser Gly Glu Asp Ala Gly Leu Phe Thr Ala Gln Lys Arg Met Val Asn

130 135 140

Ile Asp Gly Val Pro Thr Asp Ile Gly Leu Val Gly Asp Ile Ile Asn

145 150 155 160

Val Asp Ala Ser Ser Leu Met Asp Ile Ile Glu Ala Gly Arg Ile Pro

165 170 175

Val Val Ser Thr Ile Ala Pro Gly Glu Asp Gly Gln Ile Tyr Asn Ile

180 185 190

Asn Ala Asp Thr Ala Ala Gly Ala Leu Ala Ala Ala Ile Gly Ala Glu

195 200 205

Arg Leu Leu Val Leu Thr Asn Val Glu Gly Leu Tyr Thr Asp Trp Pro

210 215 220

Asp Lys Ser Ser Leu Val Ser Lys Ile Lys Ala Thr Glu Leu Glu Ala

225 230 235 240

Ile Leu Pro Gly Leu Asp Ser Gly Met Ile Pro Lys Met Glu Ser Cys

245 250 255

Leu Asn Ala Val Arg Gly Gly Val Ser Ala Ala His Val Ile Asp Gly

260 265 270

Arg Ile Ala His Ser Val Leu Leu Glu Leu Leu Thr Met Gly Gly Ile

275 280 285

Gly Thr Met Val Leu Pro Asp Val Phe Asp Arg Glu Asn Tyr Pro Glu

290 295 300

Gly Thr Val Phe Arg Lys Asp Asp Lys Asp Gly Glu Leu

305 310 315

<210> 22

<211> 954

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒状杆菌argB

<400> 22

atgaatgact tgatcaaaga tttaggctct gaggtgcgcg caaatgtcct cgctgaggcg 60

ttgccatggt tgcagcattt ccgcgacaag attgttgtcg tgaaatatgg cggaaacgcc 120

atggtggatg atgatctcaa ggctgctttt gctgccgaca tggtcttctt gcgcaccgtg 180

ggcgcaaaac cagtggtggt gcacggtggt ggacctcaga tttctgagat gctaaaccgt 240

gtgggtctcc agggcgagtt caagggtggt ttccgtgtga ccactcctga ggtcatggac 300

attgtgcgca tggtgctctt tggtcaggtc ggtcgcgatt tagttggttt gatcaactct 360

catggccctt acgctgtggg aacctccggt gaggatgccg gcctgtttac cgcgcagaag 420

cgcatggtca acatcgatgg cgtacccact gatattggtt tggtcggaga catcattaat 480

gtcgatgcct cttccttgat ggatatcatc gaggccggtc gcattcctgt ggtctctacg 540

attgctccag gcgaagacgg ccagatttac aacatcaacg ccgataccgc agcgggtgct 600

ttggctgcag cgattggtgc agaacgcctg ctggttctca ccaatgtgga aggtctgtac 660

accgattggc ctgataagag ctcactggtg tccaagatca aggccaccga gctggaggcc 720

attcttccgg gacttgattc cggcatgatt ccaaagatgg agtcttgctt gaatgcggtg 780

cgtgggggag taagcgctgc tcatgtcatt gacggccgca tcgcgcactc ggtgttgctg 840

gagcttttga ccatgggtgg aattggcacg atggtgctgc cggatgtttt tgatcgggag 900

aattatccgg aaggcaccgt ttttagaaaa gacgacaagg atggggaact gtaa 954

<210> 23

<211> 347

<212> PRT

<213> 谷氨酸棒状杆菌argC

<400> 23

Met Thr Ile Lys Val Ala Ile Ala Gly Ala Ser Gly Tyr Ala Gly Gly

1 5 10 15

Glu Ile Leu Arg Leu Leu Leu Gly His Pro Ala Tyr Ala Ser Gly Glu

20 25 30

Leu Glu Ile Gly Ala Leu Thr Ala Ala Ser Thr Ala Gly Ser Thr Leu

35 40 45

Gly Glu Leu Met Pro His Ile Pro Gln Leu Ala Asp Arg Val Ile Gln

50 55 60

Asp Thr Thr Ala Glu Thr Leu Ala Gly His Asp Val Val Phe Leu Gly

65 70 75 80

Leu Pro His Gly Phe Ser Ala Glu Ile Ala Leu Gln Leu Gly Pro Asp

85 90 95

Val Thr Val Ile Asp Cys Ala Ala Asp Phe Arg Leu Gln Asn Ala Ala

100 105 110

Asp Trp Glu Lys Phe Tyr Gly Ser Glu His Gln Gly Thr Trp Pro Tyr

115 120 125

Gly Ile Pro Glu Ile Pro Gly His Arg Glu Ala Leu Arg Gly Ala Lys

130 135 140

Arg Val Ala Val Pro Gly Cys Phe Pro Thr Gly Ala Thr Leu Ala Leu

145 150 155 160

Leu Pro Ala Val Gln Ala Gly Leu Ile Glu Pro Asp Val Ser Val Val

165 170 175

Ser Ile Thr Gly Val Ser Gly Ala Gly Lys Lys Ala Ser Val Ala Leu

180 185 190

Leu Gly Ser Glu Thr Met Gly Ser Leu Lys Ala Tyr Asn Thr Ser Gly

195 200 205

Lys His Arg His Thr Pro Glu Ile Ala Gln Asn Leu Gly Glu Val Ser

210 215 220

Asp Lys Pro Val Lys Val Ser Phe Thr Pro Val Leu Ala Pro Leu Pro

225 230 235 240

Arg Gly Ile Leu Thr Thr Ala Thr Ala Pro Leu Lys Glu Gly Val Thr

245 250 255

Ala Glu Gln Ala Arg Ala Val Tyr Glu Glu Phe Tyr Ala Gln Glu Thr

260 265 270

Phe Val His Val Leu Pro Glu Gly Ala Gln Pro Gln Thr Gln Ala Val

275 280 285

Leu Gly Ser Asn Met Cys His Val Gln Val Glu Ile Asp Glu Glu Ala

290 295 300

Gly Lys Val Leu Val Thr Ser Ala Ile Asp Asn Leu Thr Lys Gly Thr

305 310 315 320

Ala Gly Ala Ala Val Gln Cys Met Asn Leu Ser Val Gly Phe Asp Glu

325 330 335

Ala Ala Gly Leu Pro Gln Val Gly Val Ala Pro

340 345

<210> 24

<211> 1044

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒状杆菌argC

<400> 24

atgacaatca aggttgcaat cgcaggagcc agtggatatg ccggcggaga aatccttcgt 60

ctccttttag gccatccagc ttatgcatct ggtgaactag aaatcggagc actcaccgcg 120

gcatcaaccg caggcagcac gctcggtgaa ttgatgccac acattccgca gttggcggat 180

cgtgttattc aagacaccac agctgaaact ctagccggtc atgatgtcgt atttctagga 240

cttccacacg gattctctgc agaaattgca cttcagctcg gaccagatgt cacagtgatt 300

gactgtgcag ctgactttcg tctgcaaaat gctgcagatt gggagaagtt ctacggctca 360

gagcaccagg gaacatggcc ttatggcatt ccagaaatac caggacaccg cgaggctctt 420

cgtggtgcta agcgtgtagc agtgccagga tgtttcccaa ccggtgcaac cttggctctt 480

cttcctgcgg ttcaagcggg acttatcgag ccagatgttt ccgtagtgtc catcaccggc 540

gtatcaggtg caggtaagaa agcatctgtt gcactacttg gctcggaaac catgggttca 600

ctcaaggcgt acaacacctc cggaaagcac cgccacaccc cggaaattgc ccagaacctc 660

ggcgaagtca gcgacaagcc agtcaaggtg agcttcaccc cagtgcttgc accgttacct 720

cgcggaattc tcaccactgc aaccgcacct ttgaaagaag gcgttaccgc agagcaggct 780

cgcgcagtat atgaagagtt ctatgcacag gaaaccttcg tgcatgttct tccagaaggt 840

gcacagccac aaacccaagc agttcttggc tccaacatgt gccacgtgca ggtagaaatt 900

gatgaggaag caggcaaagt ccttgttacc tccgcaatcg ataacctcac caagggaact 960

gccggcgccg ctgttcagtg catgaactta agcgttggct ttgatgaggc agcaggcctg 1020

ccacaggtcg gcgtcgcacc ttaa 1044

<210> 25

<211> 391

<212> PRT

<213> 谷氨酸棒状杆菌argD

<400> 25

Met Ser Thr Leu Glu Thr Trp Pro Gln Val Ile Ile Asn Thr Tyr Gly

1 5 10 15

Thr Pro Pro Val Glu Leu Val Ser Gly Lys Gly Ala Thr Val Thr Asp

20 25 30

Asp Gln Gly Lys Val Tyr Ile Asp Leu Leu Ala Gly Ile Ala Val Asn

35 40 45

Ala Leu Gly His Ala His Pro Ala Ile Ile Glu Ala Val Thr Asn Gln

50 55 60

Ile Gly Gln Leu Gly His Val Ser Asn Leu Phe Ala Ser Arg Pro Val

65 70 75 80

Val Glu Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Arg Phe Ser Leu Asp Asp Ala

85 90 95

Thr Leu Ala Ala Gln Thr Arg Val Phe Phe Cys Asn Ser Gly Ala Glu

100 105 110

Ala Asn Glu Ala Ala Phe Lys Ile Ala Arg Leu Thr Gly Arg Ser Arg

115 120 125

Ile Leu Ala Ala Val His Gly Phe His Gly Arg Thr Met Gly Ser Leu

130 135 140

Ala Leu Thr Gly Gln Pro Asp Lys Arg Glu Ala Phe Leu Pro Met Pro

145 150 155 160

Ser Gly Val Glu Phe Tyr Pro Tyr Gly Asp Thr Asp Tyr Leu Arg Lys

165 170 175

Met Val Glu Thr Asn Pro Thr Asp Val Ala Ala Ile Phe Leu Glu Pro

180 185 190

Ile Gln Gly Glu Thr Gly Val Val Pro Ala Pro Glu Gly Phe Leu Lys

195 200 205

Ala Val Arg Glu Leu Cys Asp Glu Tyr Gly Ile Leu Met Ile Thr Asp

210 215 220

Glu Val Gln Thr Gly Val Gly Arg Thr Gly Asp Phe Phe Ala His Gln

225 230 235 240

His Asp Gly Val Val Pro Asp Val Val Thr Met Ala Lys Gly Leu Gly

245 250 255

Gly Gly Leu Pro Ile Gly Ala Cys Leu Ala Thr Gly Arg Ala Ala Glu

260 265 270

Leu Met Thr Pro Gly Lys His Gly Thr Thr Phe Gly Gly Asn Pro Val

275 280 285

Ala Cys Ala Ala Ala Lys Ala Val Leu Ser Val Val Asp Asp Ala Phe

290 295 300

Cys Ala Glu Val Thr Arg Lys Gly Glu Leu Phe Lys Glu Leu Leu Ala

305 310 315 320

Lys Val Asp Gly Val Val Asp Val Arg Gly Arg Gly Leu Met Leu Gly

325 330 335

Val Val Leu Glu Arg Asp Val Ala Lys Gln Ala Val Leu Asp Gly Phe

340 345 350

Lys His Gly Val Ile Leu Asn Ala Pro Ala Asp Asn Ile Ile Arg Leu

355 360 365

Thr Pro Pro Leu Val Ile Thr Asp Glu Glu Ile Ala Asp Ala Val Lys

370 375 380

Ala Ile Ala Glu Thr Ile Ala

385 390

<210> 26

<211> 1176

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒状杆菌argD

<400> 26

atgagcacgc tggaaacttg gccacaggtc attattaata cgtacggcac cccaccagtt 60

gagctggtgt ccggcaaggg cgcaaccgtc accgatgacc agggcaaagt ctacatcgac 120

ttgctcgcgg gcatcgcagt caacgcgttg ggccacgccc acccggcgat catcgaggcg 180

gtcaccaacc agatcggcca acttggtcac gtctcaaact tgttcgcatc caggcccgtc 240

gtcgaggtcg ccgaggagct catcaagcgt ttttcgcttg acgacgccac cctcgccgcg 300

caaacccggg ttttcttctg caactcgggc gccgaagcaa acgaggctgc tttcaagatt 360

gcacgcttga ctggtcgttc ccggattctg gctgcagttc atggtttcca cggccgcacc 420

atgggttccc tcgcgctgac tggccagcca gacaagcgtg aagcattcct gccaatgcca 480

agcggtgtgg agttctaccc ttacggcgac accgattact tgcgcaaaat ggtagaaacc 540

aacccaacgg atgtggctgc tatcttcctc gagccaatcc agggtgaaac gggcgttgtt 600

ccagcacctg aaggattcct caaggcagtg cgcgagctgt gcgatgagta cggcatcttg 660

atgatcaccg atgaagtcca gactggcgtt ggccgtaccg gcgatttctt tgcacatcag 720

cacgatggcg ttgttcccga tgtggtgacc atggccaagg gacttggcgg cggtcttccc 780

atcggtgctt gtttggccac tggccgtgca gctgaattga tgaccccagg caagcacggc 840

accactttcg gtggcaaccc agttgcttgt gcagctgcca aggcagtgct gtctgttgtc 900

gatgacgctt tctgcgcaga agttacccgc aagggcgagc tgttcaagga acttcttgcc 960

aaggttgacg gcgttgtaga cgtccgtggc aggggcttga tgttgggcgt ggtgctggag 1020

cgcgacgtcg caaagcaagc tgttcttgat ggttttaagc acggcgttat tttgaatgca 1080

ccggcggaca acattatccg tttgaccccg ccgctggtga tcaccgacga agaaatcgca 1140

gacgcagtca aggctattgc cgagacaatc gcataa 1176

Claims

1.一种棒状杆菌属微生物，其具有以增强活性的精氨酸操纵子和鸟氨酸氨甲酰基转移酶生产L-精氨酸的能力，

其中所述精氨酸操纵子由N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶(ArgC)、N-乙酰谷氨酸转移酶(ArgJ)、N-乙酰谷氨酸激酶(ArgB)、乙酰鸟氨酸转氨酶(ArgD)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶(ArgF)和精氨酸阻遏物(ArgR)组成，

其中所述鸟氨酸氨甲酰基转移酶由argF或argF2基因编码，并且所述鸟氨酸氨甲酰基转移酶为由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3表示的氨基酸序列，

并且其中所述微生物为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。

2.一种生产L-精氨酸的方法，包括：

在培养基中培养根据权利要求1所述的棒状杆菌属微生物；和

从所述微生物或所述培养基中回收L-精氨酸。