CN107001450A

CN107001450A - 特异于脑膜炎奈瑟球菌的血清群x的多克隆抗体及其在诊断中的用途

Info

Publication number: CN107001450A
Application number: CN201580062544.3A
Authority: CN
Inventors: M-K·塔哈; A·阿涅梅米尔; F·特拉卡德; L·米拉尔
Original assignee: Institut Pasteur
Current assignee: Institut Pasteur
Priority date: 2014-11-18
Filing date: 2015-11-17
Publication date: 2017-08-01
Also published as: US10822398B2; US20210095009A1; ES2846794T3; MA40974B1; US11618781B2; WO2016079157A1; US20170334975A1; EP3221348B1; EP3221348A1; BR112017009931A2

Abstract

特异于脑膜炎奈瑟球菌的血清群X的多克隆抗体及其在诊断中的用途。本发明涉及特异于脑膜炎奈瑟球菌血清群X(NmX)的荚膜多糖的多克隆抗体，其中所述抗体适用于在不进行培养的情况下体外检测生物流体中的脑膜炎奈瑟球菌血清群X。为了检测NmX，本发明还涉及不同诊断测试和方法中的所述多克隆抗体。本发明还公开了用于检测生物流体中的NmX的快速诊断测试，以及用于获得可用于检测生物液体例如脑脊髓液、血清和尿液中的NmX的多克隆抗体的方法。

Description

特异于脑膜炎奈瑟球菌的血清群X的多克隆抗体及其在诊断中的用途

本发明涉及细菌检测领域，具体地涉及检测脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis,Nm)血清群X，以及允许检测所述血清群(优选生物样品中的)的诊断试剂盒。

脑膜炎奈瑟球菌(Nm)是可以引起严重侵袭性感染如脑膜炎和败血病的专属性人类荚膜细菌(1)。由于潜在的流行病传播，脑膜炎球菌病仍然是一个主要的公共卫生问题。虽然这种疾病在欧洲和北美洲偶尔发生，但它导致非洲主要的复发性流行病，一般在小集群中发生，呈季节性变化。

脑膜炎球菌病的最大患病率发生在撒哈拉以南非洲地区，被称为非洲脑膜炎带(2)，其从塞内加尔西部延伸到埃塞俄比亚东部。在干旱季节，尘风、寒冷的夜晚和上呼吸道感染结合损害鼻咽粘膜，增加脑膜炎球菌病的风险。此外，过度拥挤的住房和区域层面的由于朝圣和传统市场的大的人群迁移可能会促进脑膜炎奈瑟球菌的传播。这些因素的组合解释了脑膜炎带中干燥季节期间发生的大型流行病。

细菌荚膜多糖确定了目前描述的12个Nm血清群。六个血清群(A，B，C，Y，W和X)对全世界绝大多数脑膜炎球菌病的病例负责。然而，它们的全球频率和地理分布不同(3)。这种分布影响疫苗接种策略，其中大部分涉及已建立的针对血清群A、C、Y和W的多糖基疫苗。此外，一种创新的基于重组蛋白的疫苗最近在欧洲和澳大利亚被许可，其针对脑膜炎球菌的血清群B(4)。这种多组分疫苗靶向脑膜炎球菌中的保守蛋白质，而不论其血清群。因此，它具有覆盖非血清群B分离株(例如血清群X的那些)的潜力(5)。在脑膜炎带中，脑膜炎奈瑟球菌血清群A(NmA)在引入NmA多糖-蛋白质结合疫苗(MenAfriVac^TM)之前占主导地位(6)，而其它血清群(主要是血清群W(NmW)和X(NmX))也被且仍然被检测到。特别令人担忧的是，非洲最近报道了由于NmW和NmX的分离株引起的爆发(7-9)。因此，监测脑膜炎球菌血清群的分布是重要的，其全面性将受益于可在床边广泛使用的诊断工具。

事实上，世卫组织控制流行性脑膜炎球菌疾病的战略(特别是在脑膜炎带中的)是基于早期和准确的检测和使用针对适当血清群的疫苗快速实施大规模免疫接种。因此，为了选择最合适的疫苗，必须快速可靠地鉴定脑膜炎球菌感染中牵涉的血清群。这种适当的疫苗接种允许控制流行性克隆传播，从而在限制疫情暴发患病率方面发挥重要作用。血清群检测的错误会损害并延缓这种控制的功效，从而强调了血清群测定的灵敏度和特异性的重要性。

通常应用两种策略来检测脑膜炎球菌感染中牵涉的脑膜炎奈瑟球菌血清群。第一个是传统培养，随后用特异性抗血清鉴定血清群。第二个是基于来自经诊断的或受影响的个体的生物样品中血清群的直接检测。

关于培养物分离，这种通过免疫特异性抗血清进行菌株血清学分类的技术通常被认为是鉴定脑膜炎奈瑟球菌血清群的参考标准之一，因为该技术通常被认为是特异性的。然而，它需要用于培养的具有专业技术人员的设备齐全的实验室，使这种技术难以适应现场检测，特别是在非洲，实验室设施距离采样区域可能是相距一定距离的，从而需要样品的特殊的运输和保存条件。样品转移所需的时间以及脑膜炎季节期间经历的炎热、多尘的条件可能导致高水平的样品污染。此外，在疑似感染的情况下推荐的早期抗生素治疗会降低该方法的疗效。据报道，用于菌株血清群鉴定的特异性抗血清不能精确检测血清群X和/或产生假阳性结果(Afssaps报告，2009年11月25日，Natacha Charler-Bret博士发表)。

关于非培养测试，它们依赖于免疫检测或遗传检测。遗传检测一般采用多重PCR法进行。这种方法是非常特异和非常灵敏的。然而，需要几个小时才能获得结果。此外，这种技术是昂贵的，并且需要具有专门技术人员的设备齐全的实验室；因此，该方法不适合现场条件。

基于脑膜炎奈瑟球菌免疫检测的非培养测试直到最近基本上限于对脑脊髓液(CSF)的乳胶凝集测试，如Pastorex(Bio-Rad Laboratories，Inc.)。乳胶凝集测试是快速、灵敏、劳动密集度低且比常规培养测试便宜得多。然而，这些测试不是常规推荐的，因为它们不区分血清群W(以前称为W135)和Y，不检测血清群X，并且在缺乏基本实验室设备的现场条件下其表现可能很弱。此外，这些试剂盒需要冷藏和训练有素的技术人员进行读取，并可能导致一些不确定性、假阴性和假阳性。

最近，已经开发并验证了用于鉴定脑膜炎奈瑟球菌血清群A、C、Y和W的免疫色谱试纸快速诊断测试(RDT)(10-11)。这一重大成就是改善尼日尔(脑膜炎带内的一个国家)的脑膜炎球菌感染的床边诊断的第一步(10,12)。然而，该测试不识别血清群X。

虽然NmX在欧洲仍然罕见(13)，但其在脑膜炎带中增加的重要性有利于针对NmX感染的有效诊断装置的许可以及对NmX多糖基疫苗的持续研究(14)。

因此，需要提供脑膜炎奈瑟球菌的血清群X的可靠检测的方法，特别是快速的方法，其优选不需要具有专门技术人员的设备齐全的实验室，并且还优选不昂贵，因此可以有利地用于现场条件。还需要提供能够以高灵敏度和特异性检测脑膜炎奈瑟球菌群X的抗体。

本发明人出人意料地获得了高度特异于脑膜炎奈瑟球菌血清群X的荚膜多糖并且可以以提高的灵敏度检测这些多糖的多克隆抗体。这些抗体特别地高度适合于检测体液中的这种血清群，而不需要培养，从而允许用于检测NmX分离株的快速诊断测试(RDT)。这种RDT可用于脑膜炎带中脑膜炎奈瑟球菌脑膜炎的诊断和监测。

根据第一方面，本发明因此涉及特异于脑膜炎奈瑟球菌血清群X(NmX)的荚膜多糖的多克隆抗体，特别是能够在溶液中检测这些多糖的多克隆抗体。这些多克隆抗体对于检测NmX特征性的可溶性多糖确实足够灵敏。因此，根据本发明的这些多克隆抗体适合于体外检测生物流体中的脑膜炎奈瑟菌血清群X，而不需要任何培养步骤。因此，多克隆抗体适合于检测NmX的可溶性抗原，特别是在生物流体中的。

根据本发明的多克隆抗体包含至少两种不同的抗体，其特异性靶向NmX的荚膜多糖，优选NmX特征性的这些多糖的不同表位。本发明的多克隆抗体优选包含超过10、20、50或甚至100种不同的抗体，其靶向NmX的荚膜多糖。

根据本发明的优选实施方案，定义的多克隆抗体是免疫球蛋白G(IgG)抗体。尽管可以存在其它类型的免疫球蛋白，但是根据本发明的多克隆抗体主要是免疫球蛋白G，例如多于80％的根据本发明的多克隆抗体是IgG，优选大于85％、90％或95％，甚至优选多于98％或99％的多克隆抗体是IgG。

本发明的多克隆抗体可以例如通过免疫动物优选非人动物获得。根据本实施方案的合适动物是鸡或哺乳动物，特别是兔，小鼠，山羊，豚鼠，仓鼠，马，大鼠，羊驼或绵羊。根据本发明的最优选实施方案，抗体是兔、马或羊驼多克隆抗体，最优选是兔多克隆抗体；因此，多克隆抗体从经免疫的非人动物中分离，所述动物优选为兔、马或羊驼，最优选为兔。多克隆抗体可以从一种或多于一种动物分离；例如，多克隆抗体可以是从2、3或更多只兔子，或2、3或更多只小鼠分离的多克隆抗体的混合物。在本发明的上下文中还设想了，从至少2种不同类型的动物中分离出多克隆抗体，例如从经免疫的羊驼和经免疫的兔分离。

根据本发明的优选实施方案，多克隆抗体确实可以通过用完整NmX细菌免疫动物优选哺乳动物，然后通过使用NmX的荚膜多糖的亲和色谱纯化从所述动物优选哺乳动物分离的血清来获得。根据该实施方案，用于免疫的动物或哺乳动物优选为非人动物；优选的动物如上所述，特别是鸡，兔，小鼠，山羊，豚鼠，仓鼠，马，大鼠，羊驼或绵羊。

用于免疫步骤的NmX细菌优选在给予动物之前灭活，例如通过加热、化学或辐射灭活。

关于亲和色谱步骤，优选使用纯的脑膜炎奈瑟球菌血清群X荚膜多糖作为配体，即在没有蛋白质和核酸的情况下，在不存在来自其它细菌的多糖的情况下，使用NmX多糖。

如上所述，根据优选的实施方案，本发明的多克隆抗体很可能通过免疫一只或几只兔子，优选用完全失活的NmX免疫，然后对纯化的NmX多糖进行亲和色谱，优选在带有纯化的NmX多糖的柱子上纯化来获得。可以如实验部分所示纯化NmX多糖，并且可以例如通过NMR如下文实施例中所述检查其纯度。

根据本发明的多克隆抗体不与其它类型的细菌交叉反应；特别是它们不与大肠杆菌(E.coli)、流感嗜血杆菌(H.influenza)、肺炎链球菌(S.pneumonia)交叉反应。多克隆抗体也不与血清群X以外的任何脑膜炎奈瑟球菌血清群交叉反应。特别地，它们不与针对脑膜炎奈瑟球菌鉴定的11种其它血清群(即血清群A，B，C，Y，W(以前称为W135)，Z，E(以前称为29E)，H，I，K和L)中的任何一种交叉反应。

因此，本发明的多克隆抗体高度特异性于脑膜炎奈瑟菌的血清群X，并因此允许特异性检测该血清群和允许区分该血清群和任何其它血清群。在这方面，应当指出，本发明的多克隆抗体的特异性是构成这些多克隆抗体的所有抗体共享的特征，即它们都特异于NmX并且不与任何其它细菌或脑膜炎奈瑟球菌的任何其它血清群交叉反应。

相比之下，在本发明之前已知的针对NmX的抗体对于NmX并不完全特异，因此被公开为与脑膜炎奈瑟球菌的其它血清群交叉反应(Afssaps报告，2009年11月25日，NatachaCharler-Bret博士发表)。

此外，以前的抗体都没有被验证用于检测来自NmX的可溶性抗原，因此灵敏度比本发明的抗体低得多。

本发明还涉及诊断试剂，其对应于与检测标记连接的NmX特异性的本发明的多克隆抗体。多克隆抗体和检测标记之间的连接可以是任何类型的连接，可以是直接或间接的，例如通过另一个分子或支持体。连接可以是非共价连接，例如基于静电力，或者可以是共价连接。根据本发明的优选实施方案，多克隆抗体或至少50％的所述抗体通过共价键与检测标记物连接。

本文所用的检测标记优选包含选自例如酶、底物、辅因子、抑制剂、染料、放射性同位素、发光基团、荧光团、比色指示剂、金颗粒、胶乳颗粒和生物素的报告基团或由其组成。还可以有利地使用任何其它报告基团。这样的报告基团允许检测标记的揭示，从而允许与所述检测标记相连的抗体的揭示。揭示报告基团的方式当然取决于报告基团。

在本发明的上下文中，多克隆抗体或至少大多数抗体优选与金颗粒连接，特别是当它们用于快速诊断测试(例如试纸测试(dipstick test))时。以这种方式，它们可以毫无困难地在固体支持物上可视化，而不需要特定的设备，并且是非常快速的。

根据本发明的多克隆抗体确实特别适用于NmX的抗原的可溶性检测，从而允许特异性检测NmX，即允许鉴别血清群X与其它血清群。

根据第二方面，本发明涉及用于检测NmX的不同方法，所述检测对血清群X是特异性的，从而允许区分该血清群与脑膜炎奈瑟菌的其它血清群。

根据所述方法的优选实施方案，检测应在生物流体中进行，特别是从患有脑膜炎或怀疑受脑膜炎感染影响的患者获得；即没有培养步骤。这种方法包括使流体与根据本发明的多克隆抗体或本发明的诊断试剂接触的步骤，以及确定流体中NmX抗原的存在或不存在的步骤。

所述方法优选体外或离体进行。因此，使流体与多克隆抗体接触的第一步是在体外或离体进行的。如上所述，多克隆抗体有利地与检测标记连接。

NmX的抗原是NmX的多糖，特别是NmX的荚膜多糖。可能与本发明的多克隆抗体反应的抗原有利地是存在于生物流体中的NmX的可溶性抗原。

NmX抗原的存在或不存在可以通过本领域技术人员已知的任何适当方式来确定；这主要取决于附着至本发明的多克隆抗体的检测标记。根据优选的实施方案，NmX的可溶性抗原的存在或不存在可以通过简单目视检查例如在多克隆抗体存在下的流体样品或通过目视检查先前与生物样品和多克隆抗体接触的固体支持物来确定。或者，可以使用任何其它适当的方法，例如为了量化多克隆抗体和生物流体之间的相互作用。

根据该方法的优选实施方案，通过检测在多克隆抗体和NmX的可溶性抗原之间形成的复合物特别是免疫复合物的存在或不存在来进行确定NmX的存在或不存在的第二步骤。

在一个实施方案中，方法包括使用对本发明的多克隆抗体特异的检测组分，因此允许检测所述抗体(即使与其靶相结合)。作为说明，如果使用兔多克隆抗体进行本发明，则检测组分例如是小鼠或山羊抗兔抗体，因此允许检测本发明的多克隆抗体的存在。根据该实施方案，样品中存在的NmX的抗原优选是固定化的，使得在洗涤步骤之后本发明的多克隆抗体的检测表明存在NmX抗原。

在另一个替代实施方案中，方法包括使用对NmX抗原特异的检测组分，例如这种组分可以包含根据本发明的多克隆抗体。作为说明，如果在第一接触步骤中使用与检测标记物连接的多克隆抗体，则未标记但固定在固体支持物上的相同多克隆抗体可例如用于检测本发明的标记的多克隆抗体和NmX的可溶性抗原之间的复合物的存在。

本发明的方法用于特异性检测NmX，即该方法允许确定所考虑的生物流体中是否存在或不存在NmX抗原，独立于也可能存在于所述流体中的脑膜炎奈瑟球菌的任何其它血清群或任何其它细菌。

用于实施该方法的生物流体是在脑膜炎感染的情况下其中可能发现NmX抗原的任何合适的生物流体。合适的液体是例如脑脊髓液，血液，血清，尿液，关节液，心包液和胸膜液。检测手段被调整以适用于所考虑的流体和可能存在的NmX抗原的浓度。优选的生物流体是脑脊髓液，血液，血清和尿液，最优选脑脊髓液。

根据优选实施方案，本发明涉及用于诊断受试者脑膜炎奈瑟球菌血清群X感染的体外方法，其包括在所述受试者的生物流体样品上进行如上定义的方法。优选地，所述受试者受脑膜炎的影响或怀疑受到影响，因为受试者呈现指示脑膜炎的一些症状，或者因为受试者已经与受影响的人接触。

根据这种诊断方法，样品中脑膜炎奈瑟球菌血清群X的抗原的存在表明脑膜炎奈瑟球菌血清群X感染。

样品优选是如上所述的生物流体样品，特别是脑脊髓液样品，血样或尿液样品。样品的体积可以非常小，只要根据本发明的诊断方法不需要从所述样品培养细菌的任何步骤，几毫升可以是足够的或甚至是更少的量。例如，如实施例所述，当进行诊断方法时，样品为150μL生物流体。

用于实施本发明方法的样品优选在无菌条件下从受试者获得。非常优选的是，该方法在流体取样之后的数小时内进行。或者，样品可以在无菌条件下储存，优选在冷的条件下储存，直至进行本发明的诊断方法。

根据第三方面，本发明涉及用于检测脑膜炎奈瑟球菌血清群X的诊断试剂盒。这种诊断试剂盒包含本发明的多克隆抗体或直接或间接地共价或非共价连接至检测标记的所述多克隆抗体(对应于如上所述的诊断剂)。根据本发明的多克隆抗体是游离的、可溶的形式或固定在支持物上。

根据优选实施方案，试剂盒还包含用于检测所述抗体与NmX的抗原之间的免疫复合物的产生的工具。这样的工具可以是任何类型的，其可以是例如特异于免疫复合物的一个或另一个配偶体的抗体，即针对NmX的荚膜多糖的抗体，或针对该试剂盒的多克隆抗体的抗体。合适的工具还包括基于形成的免疫复合物的性质(例如其重量，其大小等)检测复合物的形成的任何工具。

根据本发明的诊断试剂盒的优选实施方案，该试剂盒用于检测生物流体样品中的NmX，而没有任何培养步骤，特别是没有细菌培养。这样的试剂盒可以例如在采样之后立即使用，而没有在本发明之前在血清群X检测的情况下由于严格必要的培养而导致的通常的延迟。

上面已经详细说明了足够的生物液体样品，包括脑脊髓液，血液，血清，尿液，关节液，心包液和胸膜液。用于本发明诊断试剂盒的优选液体是脑脊髓液，血液，血清和尿液，更优选脑脊髓液。

根据本发明的诊断试剂盒的优选实施方案，通过免疫测定进行检测，利用NmX抗原与本发明的多克隆抗体的免疫反应。

在这方面，可以在本发明的上下文中使用任何免疫测定法，以定性(阳性或阴性)或定量(量的测量)方式检测生物流体样品中的NmX的抗原。已经开发了许多不同的免疫测定方法，它们是高度适应性的，并且可以应用于许多不同的形式，这取决于最终用户的需要；利用本发明的多克隆抗体的高特异性和灵敏度，这些不同的测试都适用于本发明的上下文。

除了使用的抗体，即本发明的多克隆抗体之外，免疫测定的第二个特征是用于检测多克隆抗体与靶分析物(即NmX的可溶性抗原)的结合的技术和系统。

最初来自免疫测定的信号是由与由抗体和靶抗原形成的复合物结合的酶产生的，所述酶作用于底物以产生有色溶液，其中着色强度指示靶抗原在测试溶液中的量。

最近已经开发了新的免疫测定法，将先前设计的免疫测定的许多步骤压缩成用于最终用户的简化形式。这样的简化形式之一是硝化纤维素试纸。以这种形式，可以通过肉眼直接观察到抗体与靶抗原的结合，这是由于在待测试溶液中存在靶抗原的情况下将结合到硝酸纤维素上的特定位置的染色的微珠的积累，从而产生着色线。

已经开发了其它免疫测定法，其中测定的灵敏度得到改善，允许检测体内样品中的单个分子。为此，将包被有抗体的微珠加入到待分析的体内样品中，以便捕获靶抗原；由此形成的免疫复合物然后用能产生荧光产物的酶报告物进行标记(27)。

众所周知的并且可以在本发明的上下文中使用的其它经典免疫测定是放射免疫测定和荧光免疫测定。关键变量是用于检测“检测”抗体(即本发明的多克隆抗体)和NmX的可溶性抗原的结合的生物化学技术。

现代的基于荧光的免疫测定法使用荧光化合物作为检测试剂，其吸收特定波长的光或能量，然后发射不同波长的光或能量。最近出现了许多技术改进，使得能够实施高灵敏度荧光免疫测定系统。

免疫测定因此被设计成许多形式，并且技术人员将知道如何根据样品类型包括血清、血浆、全血、尿液或脑脊髓液来确定最合适的免疫测定。

优选的免疫测定法是可以快速进行的免疫测定法和非常灵敏的免疫测定法。

可有利地用于根据本发明的诊断试剂盒的免疫测定法是依赖于凝集的那些。在本发明的上下文中的凝集测试中，将颗粒(胶乳珠或细菌)与本发明的多克隆抗体偶联。将所得的颗粒复合物与要分析的生物流体样品混合；如果靶抗原(即NmX的可溶性抗原)存在于样品中，则其交联颗粒，产生可测量的凝集。

如果结果为阳性，则将生物流体连续稀释并测试。使用更稀的溶液的凝集表明较高浓度的靶抗原(即NmX的荚膜多糖)。

通常，凝集测试是快速的，但不如许多其它方法灵敏。

特别优选的凝集测试是胶乳凝集测试。该测试使用涂覆本发明的多克隆抗体或与本发明的多克隆抗体偶联的胶乳颗粒。NmX的多糖的存在导致涂覆的胶乳颗粒的凝集，其可以在几分钟甚至更少的时间内目视观察。因此，根据该实施方案的本发明的试剂盒包含涂覆在胶乳颗粒上的本发明的多克隆抗体。

根据另一个实施方案，本发明的诊断试剂盒基于酶联免疫吸附测定(ELISA)测试。在ELISA测试中，潜在地包含NmX的抗原的样品被固定在固体支持物(通常是聚苯乙烯微量滴定板)上。在抗原固定后，本发明的多克隆抗体用作检测抗体，与NmX的抗原(如果存在)形成复合物。检测多克隆抗体可以直接共价连接到酶上，或者可以通过与酶连接的第二抗体来检测。在每个加入步骤之间，处理固体支持物以除去任何非特异性结合的蛋白质或抗体。通过添加酶底物以产生通常在视觉上可检测的信号来显影固体支持物，所述信号指示样品中NmX抗原的潜在存在，并且如果合适，指示其数量。

在这种情况下，存在于根据本发明的试剂盒中的多克隆抗体优选与酶连接，或者试剂盒包含特异于本发明的多克隆抗体并与酶连接的抗体。根据具体实施方案，试剂盒包含本发明的兔多克隆抗体和与酶连接的山羊抗兔抗体。

根据具体实施方案，试剂盒适用于Simoa^TM(单分子阵列)技术(27)。为了这个目的，用作捕获抗体的根据本发明的多克隆抗体连接到顺磁珠的表面。根据该技术，然后将这些珠与样品接触，所述样品潜在地包含可溶性NmX抗原。然后洗涤珠以除去非特异性结合的蛋白质，并用与酶连接的检测抗体孵育。这样的检测抗体优选为根据本发明的多克隆抗体。

在这种情况下，根据本实施方案的本发明的试剂盒包含与珠粒优选顺磁性珠连接的本发明的多克隆抗体作为捕获抗体，以及与酶连接的本发明的多克隆抗体作为检测抗体。

根据另一个实施方案，本发明的试剂盒适用于快速诊断测试，特别是横向或垂直流动测定，也称为免疫色谱测定；更优选地，它们被认为是试纸测试。根据该实施方案，试剂盒因此包含与金颗粒连接的本发明的多克隆抗体作为检测抗体，以及固定在支持物的特定区域中的不与金颗粒连接的本发明的多克隆抗体作为捕获抗体。

本发明的诊断试剂盒优选在至多30℃，优选至多45℃的温度下是稳定的。

许多其它技术可用于本发明的诊断测试，并且上面详述的技术仅用于举例说明目的。

取决于用于使用本发明的多克隆抗体证明样品中NmX的可溶性抗原的存在的技术，可以在所述的诊断试剂盒中存在若干另外的组分。

根据优选的实施方案，本发明的试剂盒另外包含固体支持物，在其上可以固定连接或未连接至检测标记的本发明的多克隆抗体，但这不是必需的。根据本发明的诊断试剂盒可以特别地包含微量滴定板、诊断平台、硝酸纤维素膜或小型侧向或垂直流动装置。

关于诊断平台，这样的平台可以包括膜，例如带电膜，塑料，珠，条，微量滴定孔，微通道，或其组合。

本发明的试剂盒可以包含免疫色谱测试条、小型侧向或垂直流动装置或酶联免疫吸附测定平台。

取决于用于揭示NmX的可溶性抗原的潜在存在的技术，本发明的试剂盒还可以包含优选在诊断平台中或诊断平台上的流体接收区或室。

技术人员将根据选择用于检测待测生物流体样品中NmX的可溶性多糖的存在的技术，毫不费力地调整试剂盒的组分。

根据本发明的优选实施方案，诊断试剂盒允许通过酶联免疫吸附测定法在亚细胞浓度下进行检测，例如浓度为1fM或更低，例如在样品中NmX的多糖的浓度为0.5fM，或甚至更低。为了获得这样低的检测浓度，用于检测NmX的可溶性抗原的技术优选为如上所述的Simoa TM技术。这种高灵敏度的优点是可以进行非常早期的检测，例如在出现任何症状之前。这对于检测已与受影响的患者接触的人中的感染特别有用。

根据特别优选的实施方案，本发明涉及用于NmX的试纸诊断测试。这种测试包含膜，其优选为硝酸纤维素膜。这种膜有利地包含以下区域：

a.包含直接或间接地共价或非共价连接至检测标记的本发明的多克隆抗体的第一区；

b.任选包含固定化的对照多肽的对照区，

c.包含作为捕获抗体的固定化的本发明的多克隆抗体的捕获区。

要测试的生物流体样品与膜的一个末端接触。然后样品沿着膜垂直或横向移动(取决于系统)，首先通过第一区，其中如果存在于样品中，NmX的可溶性抗原将结合多克隆抗体。当样品流经捕获区时，由多克隆抗体和NmX的抗原形成的免疫复合物将与固定化的多克隆抗体结合，前提是NmX的可溶性抗原存在于样品中，从而捕获并固定与多克隆抗体连接的检测标记到膜的特定区域中。否则，捕获抗体不会捕获检测标记。当样品流经对照区时，与检测标记连接的多克隆抗体将结合对照区，无论它们是否与NmX的可溶性抗原结合。

因此，在流经捕获或对照区域之前，样品必须流经第一区；捕获和对照区域的各自配置并不重要。

根据优选实施方案，如上所定义的第一区包含如本发明上下文中定义的诊断剂。特别优选根据本发明的多克隆抗体优选通过共价结合缀合至金颗粒用于检测。

对于对照区，固定化的对照多肽有利地是对照抗体，特别是能够识别第一区的多克隆抗体的抗体，而不论所述抗体是否与金颗粒缀合，并且不论这些抗体是否连接至其特异性抗原，即连接至NmX的多糖。根据优选的实施方案，当通过免疫特定哺乳动物(例如通过免疫兔子)获得本发明的多克隆抗体时，对照多肽是特异性针对所述哺乳动物的抗体的抗体，例如它们是山羊或小鼠抗兔抗体。当然，取决于在膜的第一区中使用的多克隆抗体，为了识别这些抗体，需要调整对照多肽。

关于膜的捕获区，其包含根据本发明的多克隆抗体，其与第一区中存在的抗体的检测标记不连接。优选地，它们不与任何类型的任何检测分子连接。

用于固定对照区的对照多肽和捕获区的抗体的合适方法是本领域技术人员所熟知的。根据定义，第一区的抗体不固定在膜上并构成流动相。

试纸测试的不同区域优选是不同的，并且在使用试纸之前不重叠。

本发明的试纸测试是简单、方便、操作快捷简便的，且不需要专门的设备和设施以及专业培训。此外，试纸具有清晰和容易鉴别的结果，操作简单，且易于普及，适用于矩阵，大规模应急现场测试和流行病学研究，可有助于感染诊断。

根据本发明的诊断测试或试纸测试优选的特征在于灵敏度(Se)为至少90％，优选至少92％，至少93％或至少94％。优选地，灵敏度的95％置信区间为86％至98％。这种灵敏度优选在脑脊髓液样品中诊断的情况下获得。

根据另一个优选实施方案，根据本发明的诊断试剂盒或测试具有至少90％，优选至少95％，至少98％或至少99％的特异性(Sp)，特别是当应用于现场条件时。优选地，特异性的95％置信区间为99％至100％。在脑脊髓液样品中诊断的情况下，优选获得该特异性。

优选本发明的试纸测试的性能为至少86％的灵敏度和至少98％的特异性，优选至少92％的灵敏度和至少99％的特异性。

还优选的是，所描述的诊断试剂盒，特别是试纸，具有以下一个或几个参数：

-32至8252的阳性似然比；和/或

-0.03至0.15的阴性似然比；和/或

-0.96至1的阳性预测值；和/或

-0.95至0.99的阴性预测值和/或

-诊断比值比为379至118420。

阳性似然比LR+(LR+＝Se/[1-Sp])表示在具有目标病症(NmX感染)的样本中比在没有目标病症的样本中更可能被观察到阳性结果的次数。阴性似然比LR-(LR-＝[1-Se]/Sp)表示在具有目标病症(NmX感染)的样本中比在没有目标病症的样品中更可能观察到阴性结果的次数。

测试越准确，LR与1相差越大。LR+10以上和LR-0.1以下被认为是令人信服的诊断证据。

诊断比值比(DOR)定义为具有目标病症(NmX感染)的样本中阳性测试结果的几率相对于没有目标病症的样本中阳性测试结果的几率的比例，其计算如下：DOR＝(Se/[1-Se])/([1-Sp]/Sp)。

DOR不依赖于患病率，其值范围为0到无穷大，较高的值表示更好的区分性测试性能。

阳性预测值(PPV)表示真实呈现目标病症(NmX感染)的检测阳性样本的比例，而阴性预测值(NPV)表示真实不呈现目标病症的测试阴性样本的比例：

PPV＝(Prev x Se)/(PrevxSe)+([1-Prev]x[1-Sp])和

NPV＝([1-Prev]x Sp)/([(1-Prev)x-Sp]+[Prev x(1-Se)])。

“Prev”是应用测试的样本群体中目标病症(NmX感染)的患病率。

根据本发明的另一个优选实施方案，诊断试剂盒或测试具有约1ng/mL，优选小于1ng/mL的NmX荚膜多糖的检测限，特别是在使用Simoa^TM技术的情况下。

根据本发明的另一个优选实施方案，诊断试剂盒或测试具有约10⁵CFU/ml的NmX细菌的检测限。

根据另一方面，本发明还涉及如上定义的诊断试剂盒或测试的用途，优选用于体外诊断受试者生物样品中的NmX感染。所述受试者可能怀疑患有脑膜炎感染，或者可能已与受感染的患者接触。

在此上下文中可以使用的生物样品如本发明的其它方面所定义，尤其优选为脑脊髓液，尿液，血清或血液样品。

关于本发明的其它方面，其它优选实施方案也如上所述。

根据另一方面，本发明还涉及制备本发明的多克隆抗体(即，其高度特异于和敏感于NmX的多糖，并且可用于在不进行培养的情况下检测NmX)的方法。

根据本发明的这种方法优选包括以下步骤：

a.用包含完整的脑膜炎奈瑟球菌血清群X细菌的免疫原性组合物免疫动物宿主；和

b.通过使用脑膜炎奈瑟球菌血清群X的荚膜多糖的亲和色谱从所述动物宿主的血清分离特异于脑膜炎奈瑟球菌血清群X的抗体。

根据所述方法的优选实施方案，在步骤a)中用于免疫的动物是非人动物。优选地，它是哺乳动物或鸡。优选的哺乳动物在本发明的其它实施方案的上下文中已被详细描述；最优选的哺乳动物是马、羊驼和兔，优选兔。

根据本发明的优选实施方案，用完全灭活的细菌进行免疫步骤。失活优选通过加热进行，但使NmX灭活的其它手段是本领域技术人员所熟知的。

对于第二步骤，从所述动物宿主的血清中分离特异于脑膜炎奈瑟球菌血清群X的抗体使用纯化的NmX荚膜多糖进行，优选负载在色谱柱上。

本发明的方法不限于上述步骤，并且可以包括在所描述的步骤之前、之后或之间执行的补充步骤。该方法尤其可以包括从所述动物宿主的血清中分离免疫球蛋白G的另一步骤。该分离步骤可以例如通过使用蛋白G配体的亲和色谱进行，如实验部分所详述的。这样类型的分离是本领域技术人员公知的，并且可以毫无困难地进行。优选地，在方法的分离步骤b)之前，即在步骤a)和b)之间进行分离IgG的这样的步骤。

关于用于色谱柱的NmX多糖的纯化，优选在负载在亲和色谱柱上之前进行纯化直到达到至少95％，优选至少99％的纯度。步骤b)因此涉及在纯度为至少95％，优选至少99％的固定化NmX多糖上进行的色谱法。

如实验部分所示，本发明的多克隆抗体的分离通过亲和色谱分两步进行。首先，将动物血清通过蛋白G柱，并用合适的溶液洗脱，例如使用pH为2.7的0.1M的甘氨酸-HCl。然后将级分在缓冲液优选Tris-HCl中恢复。然后将合并的级分通过经由色谱柱的树脂与荚膜多糖的化学偶联获得的荚膜NmX多糖亲和色谱，然后用合适的溶液洗脱。

然后可以通过Elisa将洗脱级分针对纯化的NmX荚膜多糖和完全失活的NmX细菌进行检测，以进行验证。

本发明人已经发现，该方法提供特异于NmX的荚膜多糖的多克隆抗体，不与脑膜炎球菌的其它血清群交叉反应，并且不与其它细菌交叉反应，特别是当动物是兔时。此外，本发明人已经证实，通过在另一种动物上重复该方法可以可重复地获得这种多克隆抗体。由此获得的多克隆抗体具有几乎相同的性质，证实了该方法的再现性。

图例

图1：兔血清斑点印迹分析。在免疫前(第0天)和注射第三剂量的NmX菌株19504后7天(第28天)的来自两只兔子的血清以1:1000稀释度用于免疫印迹。以2.10⁵菌落形成单位CFU/mL(1：菌株19404；2：菌株23557，3：菌株24196，4：菌株24287)点样4个脑膜炎球菌分离株。

图2：特异性识别纯化的兔抗cpsX IgG抗体。(A)针对全细菌的斑点印迹分析。血清群在点上方指示，并且每个斑点中负载的细菌的量在右侧指示(以菌落形成单位CFU表示)。使用终浓度为500pg/mL的抗体。(B)使用包被的纯化荚膜多糖用于血清群A、B、C、Y、W和X的ELISA分析(表1)。数据表示为每种抗体浓度(pg/mL)的OD 492nm吸光度。数据对应于两次独立实验的平均值。相应的血清群在右边指示。(C)纯化的cpsX的检测截止值。量在每个试纸上方以ng指示。使用前的试纸在左侧显示。上面的两个箭头表示对应于山羊抗兔IgG的捕获对照线。较低的两个箭头表示对应于抗cpsX特异性IgG的捕获线(cpsX线)。

图3：脑膜炎奈瑟球菌诊断的预测值。根据0-100％的疾病患病率计算用于诊断NmX的阳性预测值和阴性预测值(分别为PPV和NPV)。

图4：图4A：脑膜炎球菌血清群X的荚膜多糖的结构：14-连接的N-乙酰基-D-葡糖胺1-磷酸的均聚物。图B：在Bruck Avance 400光谱仪类型上记录的1H NMR光谱，频率为400MHz。将样品溶解在氧化氘(D₂O)中。化学位移(δ)以百万分之几(ppm)表示，所用参照是4,4-二甲基-4-亚戊基1-磺酸(DSS)。偶合常数以赫兹(Hz)给出。峰值根据cpsX的重复单元上的位置(1至6)指示(见图4A)。

图5：使用血清群X试纸检测尿液和血清中的脑膜炎球菌血清群X。实施例2中公开的试纸用于在不同浓度的脑膜炎球菌(即0CFU/mL(左侧标记为“阴性”)，10⁵CFU/mL(中)和10⁶CFU/mL(右侧))下检测尿液样品(上方)和血清样品(下方)上的NmX。检测线由箭头指示。

实施例：

本发明人已经开发并评估了用于检测该新出现的血清群的荚膜多糖(cps)抗原的新的快速诊断测试(RDT)。全灭活的NmX细菌用于免疫兔子。通过亲和色谱纯化后，使用cpsX特异性IgG抗体开发NmX特异性免疫色谱试纸RDT。该测试针对纯化的cpsX和不同血清群的脑膜炎球菌菌株进行了验证。对来自生活在脑膜炎带内的国家(喀麦隆，科特迪瓦和尼日尔)或法国的患者的369例脑脊髓液(CSF)样品的集合评估其针对PCR的性能。RDT对NmX菌株具有高度的特异性。对于参考NmX菌株和纯化的cpsX分别观察到10⁵CFU/mL和1ng/mL的截留值。灵敏度和特异性分别为94％和100％。观察到PCR和RDT之间的高度一致性(Kappa系数为0.98)。RDT测试给出了高阳性似然比和低阴性似然值(0.07)，表明当测试分别为阳性或阴性时宣告疾病或不宣告疾病的概率为几乎100％。这种独特的NmX特异性测试可以添加到可用的集合RDT测试中，用于检测非洲脑膜炎球菌脑膜炎，作为在引入NmA缀合疫苗后加强流行病学监测的主要工具。

实施例1：材料和方法

细菌菌株和样品

本研究中使用的脑膜炎奈瑟菌分离株是来自脑膜炎球菌病病例的分离株(详见表1)。细菌在补充有Kellogg补充剂的GCB培养基(GC Agar Base，Difco，Detroit MI，USA)上培养(15)。根据标准程序通过使用血清群特异性抗血清的凝集测定血清群(16)。使用针对上述的脑膜炎球菌蛋白PorA和PorB的单克隆抗体进行进一步的表型分型(血清分型和血清亚分型)(17)。本研究中测试的脑脊髓液(CSF)样品对应于疑似的细菌性脑膜炎病例。它们获自位于科特迪瓦的巴斯德研究所和法国巴黎巴斯德研究所的脑膜炎球菌国家参考实验室，以及获自尼日利亚尼亚美市的梅特里奇和西奈特中心(Centre de Recherche Médicale et Sanitaire，CERMES)，以及获自喀布隆加卢阿巴斯德中心。这些样品是这些中心在巴斯德研究所内部委员会批准下在相应国家中监测脑膜炎球菌疾病的任务的框架内接受，以收集、表征和使用这些全匿名的样品。

这些样品的PCR分析用作参考方法以检测脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌和流感嗜血杆菌以及基因分类脑膜炎球菌阳性样本。PCR条件和引物是如先前所述的(8)。不使用培养，因为它不断被显示比PCR更不灵敏(26)。只有369个测试的CSF样品中的26个获得培养数据。

NT：不可分型的，NST：不可亚分型的

*用于荚膜多糖纯化的菌株

表1.研究中使用的菌株及其特征

从NmX纯化荚膜多糖

通过如前所述的Cetavlon提取方法(18)，从NmX株19504(当在具有Kellogg补充剂的GCB培养基上培养时给出最高的产率)纯化血清群X(cpsX，参见图4A的结构定义)的荚膜多糖。简言之，处于生长的晚期对数期的细菌(1L)被甲醛灭活(1％v/v)，然后用Cetavlon(0.1％w/v)(Sigma Aldrich，France)处理。离心后，将沉淀溶于冷的CaCl₂水溶液(0.9M)中。溶解的物质通过在25％乙醇水溶液中沉淀而清除，剩余的上清液用80％乙醇水溶液沉淀。将沉淀溶解在磷酸盐缓冲液(Na₂HPO₄，NaH₂PO₄，0.2M)中，用DNA酶和RNA酶处理，随后进行蛋白酶K处理(Sigma Aldrich，France)和冷酚提取。将提取液针对蒸馏水充分透析，冻干，得到粗荚膜多糖。将10mg的制剂溶于2mL磷酸盐缓冲液(Na₂HPO₄，NaH₂PO₄，0.05M，pH7)中，并在用相同缓冲液平衡的Biosep-SEC-S3000柱(300×21.2cm，Phenomenex，France)上通过凝胶过滤纯化。用相同的磷酸盐缓冲液以5mL/min进行洗脱，并在214nm和280nm处监测。合并含有高分子量范围内的cpsX的空隙体积级分，并使用截留大小为10K-15K的透析膜在4℃下针对蒸馏水透析，并将残余物冻干。产率为约20mg/L的培养物。如先前所述的(19)，通过质子核磁共振(¹H NMR)检查纯化的cpsX的特征谱(图4B)。从五个菌株的血清群A、B、C、Y和W(分别为菌株21524、21721、22639、16366和19995，表1)中类似地纯化CpsA、cpsB、cpsC、cpsY和cpsW。

兔免疫和特异性抗cpsX IgG抗体的纯化

将2只新西兰雌性白兔(3公斤)在第0、7和21天用剂量为1mL的新鲜热灭活的Nmx菌株19504(56℃30分钟)的10⁹菌落形成单位(CFU)的悬浮液静脉内免疫3次。在免疫前和在第一次注射后第28天采集血清，以采用ELISA法评估免疫应答(见下文)。如前所述(20)，使用Amersham ECL试剂盒(GE Healthcare Life Sciences Velizy-Villacoublay，France)进行兔血清(1：1000血清稀释)的斑点印迹。根据欧盟关于保护用于科学目的的动物的导则2010/63/EU(及其修订版86/609/EEC)进行兔免疫。发明人的实验室具有动物实验行政许可(许可证号75-1554)，该协议经巴斯德研究组织审查委员会批准，该委员会是巴黎地区动物实验伦理学区域委员会(CETEA2013-0190)的一员。

通过亲和色谱分两步进行IgG抗体纯化。首先，将兔的血清通过HiTrap Protein GHP柱(GE Healthcare，France)，并用0.1M pH 2.7的甘氨酸-HCl洗脱。在50μLTris-HCl缓冲液(1M，pH9)中恢复1mL级分。通过测量它们在280nm处的吸光度来测试级分的蛋白质含量。使合并的级分通过根据制造商的建议(Thermo Scientific，Rockford，IL.USA)由CarboxyLink树脂的胺官能团和来自cpsX的磷酸酯官能团的化学偶联获得的cpsX亲和柱。通过ELISA针对纯化的cpsX和完全灭活的NmX细菌测试洗脱级分。为此，将ELISA孔用100μL含有2μg/mL纯化的cpsX的溶液或100μL的3.10⁸细菌/mL(NmX菌株19504)的细菌悬浮液包被过夜。在斑点印迹实验中针对来自血清群A、B、C、Y、W和X的细菌的连续稀释液测试纯化的抗体(在500pg/ml浓度下)，然后在以2μg/mL浓度涂覆cps的对应物上的ELISA中测试抗体的连续稀释液。

针对NmX的RDT的产生和验证

如前所述(21)，使用与金颗粒缀合的纯化的cpsX-pAb(British BiocellInternational，Cardiff，UK)建立一步垂直流动免疫色谱试纸。使用未缀合的cpsX-pAb作为捕获抗体，并使用山羊抗兔IgG(ICN Biomedicals，Aurora，Ohio，United States)作为对照抗体。将两种类型的抗体分别以2μg和1μg/厘米线喷在硝酸纤维素(Schleicher&SchuellBioscience，Ecquevilly，France)上。为了进行测试评估，将试纸蘸在含有细菌悬浮液或CSF样品的100μL PBS中，室温下进行10-15分钟。

数据分析

使用2×2列联表计算灵敏度(Se)，特异性(Sp)，阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)。还计算了阳性似然比LR(LR⁺＝Se/[1-Sp])和阴性LR(LR^-＝[1-Se]/Sp)(22)。这些值指示在测试前样品为阳性或阴性的可能性。诊断比值比(DOR)定义为具有NmX的样本中阳性测试结果的几率对NmX阴性样本中的阳性测试结果的几率的比例，计算如下DOR＝(Se/[1-Se])/([1-Sp/Sp](23)。最后，计算Cohen’sκ(j)统计量，以测量PCR和RDT之间的一致性(24)。κ可以在0到1之间，j值高于0.8被认为是反映几乎完美的。

实施例2：结果和讨论

兔抗脑膜炎球菌血清群X兔血清的表征

在使用完全NmX细菌的三剂量免疫接种方案后，在斑点印迹分析中针对斑点细菌测试兔血清。虽然用对照免疫前血清没有获得细菌检测，但是用免疫兔的血清获得了强烈的检测(图1)。合并来自两只反应兔子的血清，并在NmX cps活化的柱上通过亲和色谱纯化抗cpsX特异性IgG。纯化IgG的应答针对来自血清群A、B、C、Y、W和X的细菌的增加的数量(每个斑点5x10⁵至5x10³个细胞)的点图分析显示抗体仅识别血清群X菌株(图2A)。通过针对对应于六个血清群的包被的(1μg/mL)纯化cps的抗体应答的ELISA分析，独立地进一步确认了不能识别其它血清群(A，B，C，Y和W)(图2B)。

产生了用于NmX的试纸快速诊断测试(参见材料和方法)，建立了且检测限。对于纯化的cpsX，该检测限为1ng/mL(图2C)，对于NmX细菌(菌株19504)检测限为10⁵CFU/mL。将截断分析重复3次，均发现在25℃下不受试纸储存3周的影响。本发明人还在细菌悬浮液(表1)的集合上以10⁶CFU/mL测试了RDT。只有血清群X分离株才能被检测到。

1ng CpsX/ml的检测限与ELISA测定相似，且低于乳胶凝集测定的检测限(10-100ng CpsX/ml)，解释了RDT与凝集试剂盒相比更高的特异性和灵敏度。

在临床样品中使用NmX试纸

NmX试纸在从四个不同国家(差别是脑膜炎患病率不同(喀麦隆，科特迪瓦，法国和尼日尔))的国家参考中心/实验室的历史收藏中选出的369个CSF组上进行了测试。值得注意的是，四个实验室中有三个位于脑膜炎带内的国家。CSF样品对应于急性细菌性脑膜炎的疑似病例。他们通过用于病因诊断的PCR进行表征(表2)。培养结果仅可存在于26个样品(8个肺炎链球菌阳性样品，4个脑膜炎奈瑟球菌阳性样品(2个血清群B和2个血清群W)，1个流感嗜血杆菌阳性样品，1个无乳链球菌(S.agalactiae)阳性样品和12个CSF样品，其通过培养灭菌)。

在这些分离株中，52％(n＝191)对于Nm为阳性，8％(n＝28)对其它细菌物种为阳性，即肺炎链球菌，流感嗜血杆菌和无乳链球菌，40％(n＝150)对用于这些物种的PCR是阴性的。在Nm阳性CSF中，参与侵袭性脑膜炎球菌感染的六个脑膜炎球菌荚膜群表示为：群A(n＝27)，群B(n＝8)，群C(n＝7)，群Y(n＝2)，群W(n＝38)和群X(n＝92)。此外，通过PCR，17个CSF样品对于Nm是阳性的，尽管它们对于群A、B、C、Y、W和X是阴性的。通过PCR对于NmX阴性的所有样品通过新的NmX-特异性RDT对于该群也是阴性的。在通过PCR对NmX阳性的92例CSF中，86例通过RDT也是阳性的。具有培养数据的所有26个CSF样品通过NmX特异性RDT测试为阴性。

在实验室条件下的这种验证是在流行病季节在位于脑膜炎带的国家中的三个实验室进行的。因此，本发明人利用了流行病季节，并对喀麦隆、科特迪瓦和尼日尔的三个实验室中收到的所有153个CSF样品测试了新的NmX特异性RDT。在任何样品中通过PCR或RDT没有检测到NmX。相比之下，几个样品对于肺炎链球菌(14％)、NmW(7％)和流感嗜血杆菌(3％)的PCR检测呈阳性。

*针对脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌和流感嗜血杆菌为PCR阴性

CSF：脑脊髓液；RDT：快速诊断测试；IP，巴斯德研究所；CP：巴斯德中心；Nm：脑膜炎奈瑟球菌；NG：不可分群的

表2通过PCR和RDT获得的CSF样品的结果

NmX特异性RDT的性能：灵敏度，特异性，似然比和预测值

RDT数据与PCR数据显示良好的相关性，指示κ相关系数为98％。对于记录的369个CSF样品获得的RDT的灵敏度、特异性和95％CI(置信区间)数据总结在表3中。NTX感染的CSF的RDT的特异性为100％，灵敏度为94％。由于Sp值为100％，所以计算阳性似然LR⁺和DOR是不可行的。因此，使用对应于特异性的较低95％置信区间(0.99)的特异性值计算LR⁺和DOR值(表3)。

测试参数	值	95％置信区间
			灵敏度(Se)	0.94	0.86to 0.98
特异性(Sp)	1	0.99to 1
			阳性似然比(LH⁺)*	94	32to 8252
阴性似然比(LH^-)	0.07	0.03to 0.15
			阳性预测值(PPV)	1	0.96to 1
阴性预测值(NPV)	0.98	0.95to 0.99
			诊断比值比(DOR)*	1567	379to 118420

除以零；使用对应于较低95％置信区间(0.99)的特异性值计算LH⁺和DOR的值。

表3NmX的RDT性能

369例测试的脑脊髓液中NmX的患病率为25％。因此，NPV和PPV在该患病率值下列于表3中。然而，测试样品是从参与实验室的集合中选出的，可能不能反映该疾病的真正患病率。此外，NMX脑膜炎的频率也可能会随着时间的流逝和在脑膜炎带和其它地方的国家间变化。因此，我们使用本研究中从CSF样品获得的Se和Sp，根据0至100％的患病率计算阴性和阳性预测值(NPV和PPV)(图3)。

讨论

用于鉴定脑膜炎球菌性脑膜炎病例和血清群测定的可靠测试对于确保适当的个体(个案分析)以及病例的集体管理和流行病学监测至关重要。培养脑膜炎奈瑟菌可能由于早期抗生素治疗和这种细菌物种的脆弱性而经常失败(25)。在过去二十年中，已经开发了基于PCR的非培养方法，可以显著改善细菌性脑膜炎的管理和监测(26)。基于PCR的方法需要特定的实验室设备和训练有素的工作人员，并且不能用作床边方法(即用于医生对个体治疗作出决定)。尽管如此，PCR技术在位于非洲脑膜炎带内的国家的几个参考实验室中实施(26)。然而，PCR可能无法充分设置，以确保全国范围的监测，特别是在偏远地区的人群中。其它测试，例如目前可用的乳胶凝集试剂盒，需要经过培训的人员和不间断的冷链来储存和分发试剂盒。用于血清群A、C、Y和W的脑膜炎球菌的RDT的最近实施是非洲脑膜炎带中的个体诊断和脑膜炎球菌疾病监测的重大突破(12)。这些测试至少在高达45℃的温度下是稳定的。它们在没有广泛的培训的情况下易于使用和解释，因此适用于床边使用。血清群X的脑膜炎球菌分离株的出现促使开发用于该血清群的RDT测试，以完善目前的RDT工具。我们首先分析了这种血清群X特异性检测的固有质量。在实验室条件下使用选定的一组相关CSF样品来评估特异性和灵敏度参数。新RDT的良好质量反映在其对NmX的高灵敏度和特异性，对于阳性测试具有非常高的似然比(表3)。本发明人还评估了其不仅取决于测试质量，而且还取决于测试人群中NmX脑膜炎患病率的有用性。用于评估RDT特异性和灵敏度的CSF样品组中NmX的患病率为25.7％。它可能无法正确反映在风险地区的NmX的真正患病率。有用性通常使用两个参数即PPV和NPV进行评估。当NmX患病率被迫使在0和100％之间变化时，PPV保持稳定在1，表明测试在判定病例中仍然非常精通。此外，当NmX的患病率非常低时，NPV保持高的值。此外，如果这种患病率增加到50％，测试仍然精通(NPV为0.95或更高)。这些考虑似乎是现实的，并反映出引入与NmA显著降低有关的MenAfriVac^TM后脑膜炎带中的当前流行病学情况(9)。事实上，本文所披露的位于该地区的三个中心(阿比让，加鲁瓦和尼亚美)的新RDT的小规模预期使用表明，基于RDT和PCR的灵敏度(小于100％)，NmX可能存在，虽然不是主要的病原体。相比之下，NmW是最常见分离的Nm种类，而大多数病例与肺炎链球菌有关。然而，比较PCR和所有可用的RDT(A，C，Y，W，Y和X)的大规模多位点前瞻性研究在未来是有必要的。这里描述的新的RDT对于使用可以靶向NmX的可用的广泛血清群覆盖疫苗(5)或使用正在开发的NmX特异性疫苗(14)来实施大规模疫苗接种的疫苗接种决策至关重要。

实施例3：使用血清群X试纸检测尿液和血清中的脑膜炎球菌血清群X

未感染的尿液样品和血清样品以终浓度为10⁵和10⁶CFU/ml的血清群X的脑膜炎奈瑟球菌菌株(LNP19504)加标；该技术确实经常用于验证用于细菌检测的试剂盒，包括用于脑膜炎奈瑟球菌检测的试剂盒，因为已知使用加标样品获得的灵敏度数据与对感染患者的相应体液获得的灵敏度数据良好相关。然后通过之前在实施例2中描述的试纸测试这些样品以检测脑膜炎球菌血清群X(也参见28)。

如图5所示，对于尿液中的两种浓度都检测到血清群X，并且在未感染的尿液中没有检测到条带。这些数据与实施例2中的CSF样品中获得的数据类似。

在血清中，以10⁶CFU/ml而不是10⁵CFU/ml的浓度检测到血清群X，表明血清中的灵敏度较低。

这些结果证明了在待测试个体的血清和尿液样品中诊断脑膜炎奈瑟菌感染的可行性。

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Claims

1.特异于脑膜炎奈瑟球菌血清群X(NmX)的荚膜多糖的多克隆抗体，其中所述抗体适用于在不进行培养的情况下体外检测生物流体中的脑膜炎奈瑟球菌血清群X，并且其中所述抗体不与脑膜炎奈瑟球菌血清群A、B、C、Y、W、Z、E、H、I、K和L交叉反应。

2.权利要求1的多克隆抗体，其中所述抗体可通过用完全失活的脑膜炎奈瑟球菌血清群X免疫哺乳动物，然后通过使用纯化的脑膜炎奈瑟球菌血清群X荚膜多糖的亲和色谱纯化哺乳动物血清来获得。

3.权利要求1至2中任一项的多克隆抗体，其中所述抗体分离自经免疫的非人哺乳动物血清，优选兔血清。

4.一种诊断剂，其特征在于其包含权利要求1至3中任一项所定义的多克隆抗体，所述多克隆抗体直接或间接地共价或非共价连接至检测标记。

5.一种用于体外或离体检测生物流体中的脑膜炎奈瑟球菌血清群X的方法，所述方法包括

a.使所述流体与权利要求1至3中任一项的多克隆抗体或权利要求4的诊断剂体外接触，

b.确定所述流体中脑膜炎奈瑟球菌血清群X的抗原的存在或不存在。

6.权利要求5的方法，其中步骤b)通过检测所述多克隆抗体和NmX的可溶性抗原之间形成的复合物的存在或不存在来进行，优选通过特异于所述多克隆抗体的检测组分来进行。

7.一种用于诊断受试者中的脑膜炎奈瑟球菌血清群X感染的体外方法，包括对所述受试者的生物流体样品进行权利要求5至6中任一项的方法，其中脑膜炎奈瑟球菌血清群X在所述液体中的存在表示脑膜炎奈瑟球菌血清群X感染。

8.一种用于检测脑膜炎奈瑟球菌血清群X的诊断试剂盒，其包含权利要求1-3中任一项的多克隆抗体和/或权利要求4的诊断剂，以及用于检测所述抗体与NmX的抗原之间的免疫复合物的产生的工具。

9.权利要求8的诊断试剂盒，用于在不进行培养的情况下检测生物流体样品中的NmX，所述样品优选来自脑脊髓液、血液、血清或尿液。

10.权利要求8至9中任一项的诊断试剂盒，其允许通过免疫测定进行检测，其中所述免疫测定优选为快速诊断测试、凝集测试或酶联免疫吸附测定(ELISA)测试。

11.一种针对NmX的试纸诊断测试，其包含膜，优选硝酸纤维素膜，其中所述膜包含：

a.包含缀合至检测标记的权利要求1至3中任一项的多克隆抗体或权利要求4的诊断试剂的第一区；

b.包含固定化的对照多肽优选对照抗体的对照区，

c.包含作为捕获抗体的固定化的权利要求1至3中任一项的多克隆抗体的捕获区。

12.权利要求11的试纸诊断测试，其中所述固定化的对照多肽是识别权利要求1至3中任一项的多克隆抗体的抗体。

13.权利要求12的试纸诊断测试，其中所述多克隆抗体是兔抗体，并且其中所述固定化的对照多肽是抗兔抗体，优选是山羊或小鼠抗兔抗体。

14.权利要求8至13中任一项的诊断试剂盒或测试，其特征在于灵敏度为至少90％，优选至少92％、93％或94％，并且特异性为至少90％，优选为至少95％、98％或99％。

15.权利要求8至14中任一项的诊断试剂盒或测试用于体外诊断受试者生物样品中的NmX感染的用途。

16.用于产生权利要求1至3中任一项的多克隆抗体的方法，包括：

a.用包含完全灭活的脑膜炎奈瑟球菌血清群X细菌的免疫原性组合物免疫非人动物宿主；

b.通过使用脑膜炎奈瑟球菌血清群X的纯化的荚膜多糖的亲和色谱从所述动物宿主的血清中分离特异于脑膜炎奈瑟球菌血清群X的抗体。