CN107001417B - 靶向肽及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种化合物，其包含与可检测的部分偶联的至少一个靶向肽。所述的靶向肽与EDB‑FN或EDA‑FN结合，并且包含选自SEQ ID NO:1‑30中的至少一个氨基酸序列。

Description

靶向肽及其使用方法

相关申请

本申请要求2014年8月4日提交的美国临时申请No.62/032,945的优先权，该申请的主题以引用方式全文并入本文。

政府资助

本发明是由美国国立卫生研究院授予的、在Grant No.EB000489的政府支持下进行的。美国政府具有本发明的某些权利。

背景技术

癌症的检测和治疗受阻于不能区分癌细胞和正常细胞。对于癌症的早期诊断，需要用于癌症或肿瘤成像的较好的检测工具。肿瘤细胞的分子识别促进了引导性手术切除。为了改进手术切除，被靶向的成像工具不仅必须特异性地标记主要肿瘤中的肿瘤细胞，而且还必须沿着肿瘤的边缘和在小的肿瘤细胞簇(分散于整个肌体中)中特异性地标记肿瘤细胞。被靶向的成像工具(其被设计用于标记在肿瘤微环境中累积的分子)还可以有利地作为治疗靶向试剂，这是因为它们可以识别主要的肿瘤细胞群体，以及具有浸润细胞(其有助于肿瘤的复发)的区域。直接靶向肿瘤细胞和/或其微环境的能力会增加目前治疗的特异性和敏感性，由此降低化疗(会影响整个肌体中的细胞)的非特异性副作用。

发明概述

本发明所述的实施方案涉及可以特异性结合EDB-FN或EDA-FN的靶向肽。靶向肽可以与可检测部分偶联从而形成分子探针。分子探针可以用于检测受试对象组织中癌细胞的位置和/或分布，受试对象中癌症的侵入性，和/或癌症治疗学(cancer therapeutic)和/或癌症治疗(给予有需要的受试对象)的效力。

在一些实施方案中，靶向肽可以选自SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQID NO:22,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQID NO:28,SEQ ID NO:29,和SEQ ID NO:30。

在其他的实施方案中，可检测部分可以包含成像试剂，并且分子探针可以是通过γ成像,正电子发射断层(PET)成像,计算机断层(CT)成像,磁共振成像,近红外成像或荧光成像的至少一种方法给予受试对象时是可检测的。可检测部分可以为例如光学染料、MRI造影剂、PET试剂、SPECT试剂、CT造影剂、放射性标记或超声造影剂中的至少一者。

在一些实施方案中，靶向肽可以通过连接体与可检测的部分共价连接。连接体可以为例如肽连接体或聚合物连接体。

在其他的实施方案中，可以将分子探针系统性地给予受试对象，从而检测受试对象中癌症的分布和/或位置，以及癌症的侵入性。癌症可以包括例如乳腺癌,肝癌,胃癌,结肠癌,胰腺癌,卵巢癌,肺癌,肾癌,前列腺癌,睾丸癌,成胶质细胞瘤,肉瘤,骨癌,脑癌,头部和颈部癌症或皮肤癌中的至少一者。

附图简述

图1(A-D)示出：(A)示意图示出EDB表达质粒的构建。将编码EDB片段的DNA插入至T7启动子的控制下，并且在N-末端具有融入10xHis标签。Lac操作子(lacO)允许使用IPTG诱导对EDB的表达进行控制。(B)由表达EDB的E.coli得到的裂解物的SDS-PAGE。泳道如下标记：M：蛋白质梯带；1,在使用IPTE诱导前的E.coli细胞裂解物；2,在诱导后1.5h；3,诱导后3h；4,由诱导后3小时获得的裂解物纯化得到的EDB溶液。(C)序列为CTVRTSADC的ZD2肽的MALDI-TOF质谱，[m/z M+]＝954.23(观察值),954.39(计算值)。(D)用于定量ZD2余EDB蛋白质之间的结合亲和力的肽ELISA。

图2(A-D)示出：(A)在TGFβ1诱导下以及未在TGFβ1诱导下的PC3细胞的形态学。通过相差显微镜在10×和40×(插入物)下取得图像。(B)相对于未诱导的细胞，在TGFβ1诱导后的细胞中，对EDA,EDB,E-Cad和N-Cad的表达进行RT-PCR分析。(C)当TGFβ1诱导的PC3细胞在包含0.25μM ZD2-Cy5的生长培养基中生长时，与细胞周边结合的ZD2-Cy5的代表性图像。未诱导的细胞用作对照。使用共聚焦荧光显微镜在10×和40×(插入物)下取得图像。(D)ZD2-Cy5与游离的Cy5染色之间的活细胞染色的比较(放大100x)。

图3(A-D)示出：(A)在静脉注射10nmol ZD2-Cy5或非特异性对照CERAK-Cy5后1.5h，携带PC3的小鼠的代表性荧光图像(Cy5，左侧面板；GFP，右侧面板；白色箭头指肿瘤)。(B)作为时间函数的肿瘤与正常组织之间的荧光强度比(T/N比)，其得自注射有ZD2-Cy5或CERAK-Cy5的小鼠得到(N＝3)。(C)在注射ZD2-Cy5或CERAK-Cy5后的5h，由携带PC3-GFP肿瘤的小鼠收获得到的器官的代表性荧光图像。示出Cy5通道(左侧)，GFP通道(中间)和明视野图像(右侧)。使用数字表达器官：1，肿瘤；2，肝脏；3，肌肉；4，心脏；5，脑；6，肺；7，脾。(D)由携带PC3肿瘤的小鼠收获的肿瘤、肝脏和肺裂解物的Western印迹分析。

图4(A-C)示出：(A)由注射ZD2-Cy5或CERAK-Cy5的PC3肿瘤模型得到的肿瘤切片的代表性荧光图像。(B)由相同的小鼠得到的肝脏和肺切片的代表性荧光图像。比例尺：20μm。(C)在PC3肿瘤切片中，ZD2分布与EDB-FN(BC-1)分布和血管分布(抗-CD31)的相关性。比例尺：20μm。

图5(A-E)示出：(A)GS7(3+4)和GS9(4+5)的人类前列腺BPH切片和前列腺肿瘤切片的H&E染色、BC-1的免疫荧光染色和ZD2-Cy5染色。比例尺：100μm。(B)代表性Cy5直方图表明A中所示图像中Cy5像素强度的分布。直方图的标记部分为Cy5像素值的百分像素计数，其值为50至255(上方面板)。还示出不同Gleason得分的各个前列腺切片中直方图分布的分析。箱式图表示在直方图分析中获得的数据的分布(下方面板)。(C)包含高染色腺区和低染色区的GS7前列腺区域的图像，其示出染色水平与腺体形态学之间的关系。使用白色箭头标记低染色腺体，并使用箭头标记高染色腺体。使用Olympus Virtual Slide Microscopy系统获得图像。比例尺：40μm。(D)由正常和癌症前列腺组织GS7(3+4)得到的前列腺裂解物的Western印迹分析。通过BC-1测定EDB-FN表达，并将β-肌动蛋白用作加载对照。柱状图表明通过Western印迹表明的EDB-FN表达水平的差异(n＝3；***,p<0.001)。(E)使用BC-1(绿色)和ZD2(红色)的竞争性染色。BC-1结合阻断了ZD2-Cy5的结合。比例尺：100μm。

图6(A-B)示出：(A)A图显示，与未诱导的细胞(对照)相比，在使用TGFβ的4T1细胞系中，EDB FN的相对mRNA表达。(B)在由不同器官收集得到的肿瘤组织中，EDB FN表达的Western印迹分析。β-肌动蛋白用作加载对照。

图7(A-C)示出：(A)l-ZD2-Gd(HP-DO3A)的一种合成方法。(B)l-ZD2-Gd(HP-DO3A)的Maldi-Tof质谱。(C)l-ZD2-Gd(HP-DO3A)的弛豫(T₁和T₂)的测量。

图8(A-C)示出：(A)由注射ZD2-Cy5或CREKA-Cy5的小鼠收获的肺和脑的明视野、GFP和Cy5图像。不携带肿瘤的正常小鼠用作对照。使用亮黑色色彩表来表示Cy5信号。下方示出用于各组色彩表的显示键。(B)肌肉、淋巴结转移瘤(LN Mets)和肾上腺肿瘤(AG Mets)的Maestro荧光图像。使用亮黑色色彩表来表示Cy5信号。下方示出显示键。还示出GFP图像。(C)由注射l-ZD2-Cy5的小鼠得到的肿瘤冷冻切片的共聚焦显微图像。示出核染色(DAPI,a),GFP(b),Cy5(c)和合并后的图像。

图9(A-C)示出：(A)在淋巴结、肾上腺和胸腔中发展成转移瘤的代表性小鼠以及在MRI图像识别的相应肿瘤的生物发光图像。(B)MRI和BLI的共区域化从而证明l-zd2-Gd(HP-DO3A)对不同器官上转移瘤的靶向。(C)CERAK-Gd(HP-DO3A)的转移瘤的MRI。

图10示出在携带PC-3前列腺癌异种移植物的小鼠中，在静脉注射前(pre)和静脉注射0.1mmol-Gd/kg的ZD2-Gd(HP-DO3A)和Gd-(HP-DO3A)后的5、15、30min的T1加权2D轴向自旋回波MR图像。圆圈，肿瘤；B，膀胱。

图11为根据应用实施方案的分子探针的示意图。

发明详述

本发明描述了涉及传统的分子生物学技术的方法。此类技术是本领域公知的，并且在方法学专著中详细地描述，例如Current Protocols in Molecular Biology,ed.Ausubel et al.,Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York,1992(周期性更新)。除非另外定义，否则本发明使用的所有技术术语均具有本申请所属领域的任一普通技术人员通常理解的相同的含义。分子生物学术语的通常理解的定义在例如Rieger etal.,Glossary of Genetics:Classical and Molecular,5th Edition,Springer-Verlag:New York,1991,and Lewin,Genes V,Oxford University Press:New York,1994中找到。

冠词“a”和“an”在本发明中用于指一个或多于一个(即，至少一个)的冠词的语法对象。例如“an element”是指一个元件或多于一个的元件。

术语动词性的“包含”、动名词性的“包含”、动词性的“包括”、动名词性的“包括”、动词性的“具有”和动名词性的“具有”以包含一切的开放式含义使用，是指其他的元件可以包含在内。如本文所用，术语“诸如”、“例如”是非限定性的，仅是为了说明的目的。“包括”和“包括但不限于”可交换使用。

如本文所用，术语“或”应该理解为是指“和/或”，除非内容中另外清楚地指示。

术语“试剂”在本发明中用于指化学化合物、化学化合物的混合物、生物大分子或由生物材料制得的提取物。

术语“癌症”或“肿瘤”是指受试对象中任何赘生物的生长，包括最初的肿瘤和任何转移。癌症可以为液体或实体肿瘤类型。液体肿瘤包括血液起源的肿瘤，例如包括骨髓瘤(例如多发性骨髓瘤),白血病(例如Waldenstrom综合征,慢性淋巴细胞白血病,其他白血病),和淋巴瘤(例如B-细胞淋巴瘤,非霍奇金淋巴瘤)。实体肿瘤可以起源于器官，并且包括肺、脑、乳腺、前列腺、卵巢、结肠、肾和肝脏的癌症。

术语“癌细胞”或“肿瘤细胞”可以指以异常(即，增加)的速率分化的细胞。癌细胞包括但不限于癌,例如鳞状细胞癌,非小细胞癌(例如非小细胞肺癌),小细胞癌(例如小细胞肺癌),基底细胞癌,汗腺瘤,皮脂腺癌,腺癌,乳头状癌,乳尾状腺癌,囊腺癌,髓样癌,未分化癌,支气管癌,黑素瘤,肾细胞癌,肝细胞瘤-肝细胞癌,胆管癌,肝胆管型肝癌,乳头状癌,移行细胞癌,绒毛膜癌,精原细胞瘤,胚胎癌,乳癌,胃肠道癌,结肠癌,膀胱癌,前列腺癌,以及颈部和头部的鳞状细胞癌；肉瘤,例如纤维肉瘤,粘液肉瘤,脂肪肉瘤,软骨肉瘤,骨原性肉瘤,脊索肉瘤,恶性血管皮内细胞瘤,内皮肉瘤,淋巴肉瘤,滑膜肉瘤和间皮肉瘤；血液肿瘤,例如骨髓瘤,白血病(例如急性骨髓性白血病,慢性淋巴细胞白血病,粒细胞性白血病,单核细胞性白血病,淋巴细胞性白血病),淋巴瘤(例如滤泡性淋巴瘤,套细胞淋巴瘤,弥漫性大B细胞淋巴瘤,恶性淋巴瘤,浆细胞瘤,网状细胞肉瘤,或Hodgkin病)；以及神经系统的肿瘤，包括神经胶质瘤,多形性成胶质细胞瘤,脑脊膜瘤,成神经管细胞瘤,神经鞘瘤和脑室膜瘤。

术语“嵌合蛋白质”或“融合蛋白质”是编码多肽的第一氨基酸序列与定义了结构域(例如多肽部分)的第二氨基酸序列的融合物，其中所述的结构域对于第一多肽的任何结构域而言是外源的并且是基本不同源的。嵌合蛋白质可以存在外源结构域，该结构域在有机体中发现(但是在不同的蛋白质中)，并且其还可以表达所述的第一蛋白质，或者所述的嵌合蛋白质可以是不同种类的有机体表达的蛋白质结构的“种间”、“基因间”等的融合物。

对于核酸(例如DNA或RNA)或者氨基酸，如本文所用，术语“分离的”是指分别与其他DNA或RNA、多肽或蛋白质分离的分子，而该分子存在于大分子的天然来源中。如本文所用，术语分离的是指这样的核酸或肽，当通过重组DNA技术生产所述的核酸或肽时，其基本不含细胞材料或培养物的培养基，或者当通过化学合成所述的核酸或肽时，其基本不含化学前体或其他化学品。此外，“分离的核酸”或“分离的肽”是指包括核酸片段或肽片段，其并非天然形成的片段并且不能在天然状态下发现。

术语“突变体”是指有机体的遗传物质的任何变化，特别是野生型多核苷酸序列的变化(即，删除、取代、加入或改变)，或者野生型蛋白质的任何变化。术语“变体”与“突变体”可交换使用。尽管通常假设遗传物质的变化使得蛋白质功能变化，但是术语“突变体”和“变体”是指不管所述的变化是否改变了蛋白质的功能(例如增加、降低、赋予新功能)，或者所述的变化是否对蛋白质的个功能不具有影响(例如突变或变化是沉默的)，野生型蛋白质的序列都发生变化。

术语“核酸”是指多核苷酸，例如脱氧核糖核苷酸(DNA)，并且在合适的情况下，为核苷酸(RNA)。所述的术语还应该理解为包括由核苷酸类似物制得的RNA或DNA的类似物作为等价物，以及单链(正义或反义)和双链多核苷酸适用于所述的实施方案。

短语“肠胃外给予”和“以肠胃外方式给予”是本领域公认的术语，并且包括除了肠和局部给予以外的给予方式，例如注射，并且包括但不限于静脉内、经肌肉、胸膜内、血管内、心包内、动脉内、膜内、囊内、眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经器官的、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内和胸骨内注射和输注。

术语“患者”、“受试对象”、“哺乳动物宿主”等在本文中可交换使用，并且是指哺乳动物，包括人类和兽医的受试对象。

术语“肽(多种)”、“蛋白质(多种)”和“多肽(多种)”在本文中可交换使用。如本文所用，“多肽”是指包含2种或多种氨基酸的任何肽或蛋白质，其中所述的2种或多种氨基酸通过肽键或修饰的肽键彼此连接(即，肽异构体)。“多肽(多种)”是指短链(常称为肽、寡肽或寡聚体)和更长的链(常称为蛋白质)。

术语“多核苷酸序列”和“核苷酸序列”在本文中还可以交换使用。

如本文所用，“重组”是指蛋白质衍生自原核或真核表达系统。

如本文所用，短语“系统性给予”、“以系统的方式给予”、“外周给予”和“以外周的方式给予”是指除了直接进入待治疗受试对象的特定组织、器官或区域(例如脑)以外，化合物、试剂或其他物质的给予，使得所述的化合物、试剂或其他物质进入动物的系统中，并由此经过新陈代谢和其他类似的过程，例如皮下给予。

术语“野生型”是指分别编码蛋白质或其部分、蛋白质序列或其部分(如同其在体内正常存在的那样)的天然形成的多核苷酸序列。

在整个说明书中，在组合物描述成具有、包括或包含特定成分的情况下，认为该组合物还基本上由、或者由所述的成分组成。类似地，在方法或工艺描述为具有、包括或包含特定的处理步骤的情况下，所述的工艺还基本上由、或者由所述的处理步骤组成。此外，应该理解的是步骤的顺序或者用于实施某种行为的顺序是不重要的，只要本发明所述的组合物和方法保持可操作即可。此外，2个或多个步骤或行为可以同时实施。

本文所述的实施方案涉及用于检测、监测和/或成像受试对象中癌细胞分别和/或位置和/或癌细胞转移、迁移和/或侵袭，检测和/或监测受试对象中癌细胞侵入性和/或恶性，和/或测定和/或监测给予有需要的受试对象的癌症治疗学和/或癌症治疗的效力的靶向肽。

本发明所述的靶向肽包括与型纤连蛋白(onfFN)同种型,额外结构域-B纤连蛋白(EDB-FN)或者额外结构域-A(EDA-FN)纤连蛋白特异性结合和/或复合的肽序列。癌症，特别是恶性癌症，具有独特的肿瘤微环境，其有利于癌细胞的生存、增殖和转移。在多种类型的人类癌症(包括前列腺癌和乳腺癌)中，已经显示onfFN的存在。onfFN,EDB-FN和/或EDA-FN的高表达与癌症侵入性和患者的生成呈负相关。已经发现包含目标肽(其特异性地结合EDB-FN和/或EDB-FN)的造影剂或分子探针可以用于检测、监测和/或成像受试对象组织中的癌细胞，以及测定癌细胞的侵入性、恶性、转移、迁移、散布和/或侵袭。

包含靶向肽的分子探针可以系统性地给予受试对象，例如通过静脉内或肠胃外给予，并且容易地靶向细胞外基质蛋白质EDB-FN和/或EDA-FN，从而定义受试对象中癌细胞的位置、分布和/或侵入性、以及肿瘤细胞的边缘。

在一些实施方案这，靶向肽可以特异性地结合EDB-FN。特异性地结合EDB-FN的靶向肽可以包括具有以下氨基酸序列的线性态：TVRTSAD(SEQ ID NO:1),NWGDRIL(SEQ IDNO:2),NWGKPIK(SEQ ID NO:3),SGVKSAF(SEQ ID NO:4),GVKSYNE(SEQ ID NO:5),IGKTNTL(SEQ ID NO:6),IGNSNTL(SEQ ID NO:7),IGNTIPV(SEQ ID NO:8),和LYANSPF(SEQ ID NO:9)；或者具有以下氨基酸序列的环状肽：CTVRTSADC(SEQ ID NO:10),CNWGDRILC(SEQ IDNO:11),CNWGKPIKC(SEQ ID NO:12),CSGVKSAFC(SEQ ID NO:13),CGVKSYNEC(SEQ ID NO:14),CIGKTNTLC(SEQ ID NO:15),CIGNSNTLC(SEQ ID NO:16),CIGNTIPVC(SEQ ID NO:17),或CLYANSPFC(SEQ ID NO:18)。在其他的实施方案中，靶向肽可以特异性地结合EDA-FN。特异性地结合EDA-FN的靶向肽可以包括具有以下氨基酸序列的线性肽：WNYPFRL(SEQ ID NO:19),SNTSYVN(SEQ ID NO:20),SFSYTSG(SEQ ID NO:21),WSPAPMS(SEQ ID NO:22),TREHPAQ(SEQ ID NO:23),或ARIIDNA(SEQ ID NO:24)；或者具有以下氨基酸序列的环状肽：CWNYPFRLC(SEQ ID NO:25),CSNTSYVNC(SEQ ID NO:26),CSFSYTSGC(SEQ ID NO:27),CWSPAPMSC(SEQ ID NO:28),CTREHPAQC(SEQ ID NO:29),或CARIIDNAC(SEQ ID NO:30)。

靶向肽可以经历多种变化、取代、插入和删除，其中此类变化在其用途中提供某些益处。就此而言，与EDB-FN和/或EDA-FN结合和/或复合的靶向肽可以与所述的肽的序列是基本同源的，而不是一致的，其中形成一种或多种变化，并且其保持了发挥特异性结合和/或复合EDB-FN和/或EDA-FN的能力。

靶向肽可以为多种形式的多肽衍生物的任意一种，其包括酰胺、与蛋白质形成的缀合物、环状多肽、聚合的多肽、类似物、片段、化学修饰的多肽和类似的衍生物。

术语“类似物”包括具有与本发明特异示出的序列基本一致的氨基酸残基序列的任何肽，其中一个或多个残基已经被功能相似的残基保守性地取代，并且其特意地结合和/或复合本发明所述的EDB-FN和/或EDA-FN。保守性取代的实例包括一种非极性(疏水性)残基(例如异亮氨酸,缬氨酸,亮氨酸或蛋氨酸)取代另一种非极性的残基，一种极性(亲水性)残基取代另一种亲水性残基(例如精氨酸和赖氨酸之间、谷氨酰胺和天冬酰氨之间、甘氨酸和丝氨酸之间)，一种碱性残基(例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸)取代另一种碱性残基，或者一种酸性残基(例如天冬氨酸或谷氨酸)取代另一种酸性残基。

短语“保守性取代”还包括使用化学衍生的残基替代非衍生的残基，前提条件是此类肽展示必需的结合活性。

“化学衍生物”是指具有一个或多个残基的题述肽，其中所述的残基是通过功能侧基基团的反应而化学衍生的。如此衍生的分子例如包括以下这些分子，其中游离的氨基基团经衍生而形成胺盐酸盐、对甲苯磺酰基基团、苯氧羰基基团、叔丁氧基羰基基团、氯乙酰基基团或甲酰基基团。游离的羧基基团可以衍生而形成盐、甲基和乙基酯或其他类型的酯、或者酰肼。游离的羟基基团可以衍生而形成邻酰基或邻烷基衍生物。组氨酸的咪唑氮可以衍生而形成N-苄基组氨酸。此外，以下这些多肽作为化学衍生物也被包含在内，其中所述的多肽包含20种标准氨基酸的一种或多种天然形成的氨基酸衍生物。例如4-羟基脯氨酸可以取代脯氨酸；5-羟基赖氨酸可以取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可以取代组氨酸；高丝氨酸可以取代丝氨酸；以及鸟氨酸可以取代赖氨酸。本发明所述的肽还包括相对于肽(其序列本发明已示出)的序列而言具有一个或多个加入和/或删除或者多个残基的任何肽，只要必需的结合特异性或活性得到保持即可。

术语“片段”是指具有比多肽(其氨基酸残基序列本发明已示出)更短的氨基酸残基序列的任何题述肽。

靶向肽可以通过多肽领域那些技术人员已知的任何技术合成，包括重组DNA技术。鉴于纯度、抗原特异性、与不需要的副产物的锅里、生产的容易些等原因，可以使用合成化学技术(例如固相Merrifield-型合成)。可利用的许多技术的概括可以在Steward etal.,"Solid Phase Peptide Synthesis",W.H.Freeman Co.,San Francisco,1969；Bodanszky,et al.,"Peptide Synthesis",John Wiley&Sons,Second Edition,1976；J.Meienhofer,"Hormonal Proteins and Peptides",Vol.2,p.46,Academic Press(NewYork),1983；Merrifield,Adv.Enzymol.,32:221-96,1969；Fields et al.,int.J.PeptideProtein Res.,35:161-214,1990；和美国专利No.4,244,946(用于固相肽合成),和Schroder et al.,"The Peptides",Vol.1,Academic Press(New York),1965(用于传统的溶液合成)中发现，这些文献的每一份均以引用方式并入本文。

通常，所考虑的固相合成方法包括向生长中的肽链依次加入一种或多种氨基酸残基或适当保护的氨基酸残基。一般而言，第一氨基酸残基的氨基或羧基基团被合适的可选择性除去的保护基团保护。不同的可选择性除去的保护基团用于包含反应性侧基基团的氨基酸中，例如赖氨酸。

使用固相合成作为实例，被保护的或衍生的氨基酸可以通过其未被保护的羧基或氨基基团附着在惰性固体支撑体上。然后，可以选择性地除去氨基或羧基基团的保护基团，并且在适用于与已经附着在固体支撑体上的残基形成酰胺键的条件下使序列(具有被适当保护的互补性基团，氨基或羧基)中的下一个氨基酸预混并反应。然后，可以由该新加入的氨基酸残基除去氨基或羧基基团的保护基团，并接着加入下一个氨基酸(被适当保护)等等。终究，所需的氨基酸以合适的序列连接，可以依次或同时除去任何保留的末端和侧基的保护基团(和固体支撑体)，从而提供最终的线性多肽。

此外，本发明所述的靶向肽可以用作起点以用于研发具有相似的配体结合能力的、亲和力更高的小分子、肽、抗体和/或抗体片段。可以容易地实施使用(例如)计算机模拟(in silico)筛选由肽的药效团研发并筛选小分子，并且使用本发明所述的测试，可以针对靶向肽而容易地筛选此类识别分子的结合亲和力，从而选择小分子试剂。

为了提供“连接体”，还可以在肽的任一末端加入其它的残基，通过所述的连接体，所述的肽可以以常规方式连接，和/或固定于其它的多肽、蛋白质、可检测的部分、标记、固体基质或载体上。

氨基酸残基连接体通常至少一个残基，并且可以为40或更多的残基，更通常为1至10个残基。用于连接的典型的氨基酸残基为甘氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酸和精氨酸等。此外，题述靶向肽试剂的序列可以不同，其中所述的序列是通过末端-NH₂酰化作用(例如乙酰化作用或)或氢硫基醋酸酰胺化、通过末端-羧基酰胺化作用(例如使用氨、甲胺)和类似的末端修饰而进行修饰的。如公知的那样，末端修饰用于通过蛋白酶消化而降低易感性，并由此延长多肽在溶液中的半衰期，特别是在其中可以存在蛋白酶的生物流体中。就此而言，多肽环化作用也是有用的末端修饰，并且由于通过环化作用而形成的稳定的结果以及由针对此类环状肽(如本发明所述)所观察到的生物活性的观点来看，多肽环化作用也是特别优选的。

在一些实施方案中，连接体可以是挠性肽连接体，其连接靶向肽与其他的多肽、蛋白质和/或分子，例如可检测的部分、标记、固体基质或载体。挠性肽连接体的长度可以为大约20个或更少的氨基酸。例如肽连接体可以包含大约12个或更少的氨基酸残基，例如1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11和12。在一些情况下，肽连接体包含以下氨基酸的2种或多种：甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸。

备选地，连接分子可以为非肽连接体。如本发明所用，用于本发明所述的化合物的非肽连接体为生物相容性聚合物，其包含2个或多个彼此连接的重复单元。非肽聚合物的实例包括但不限于：聚乙二醇(PEG),聚丙二醇(PPG),共聚(乙二醇/丙二醇),聚氧乙烯(POE),聚氨酯,聚磷腈,多糖,右旋糖苷,聚乙烯醇,聚乙烯吡咯烷酮,聚乙烯醚,聚丙烯酰胺,聚丙烯酸酯,聚腈基丙烯酸酯,脂质聚合物,几丁质,透明质酸和肝素。为了更详细地描述非肽连接体，例如参见WO/2006/107124，该文献以引用方式并入本文。典型的此类连接体的分子量范围为大约1kDa至50kDa，其取决于具体的连接体。例如典型的PEG的分子量为大约1至5kDa，而聚乙二醇的分子量为大约5kDa至50kDa，并且更优选为大约10kDa至40kDa。

在一些实施方案中，可以使用可检测的部分直接或间接标记靶向肽，从而形成分子探针或造影剂。可检测的部分的作用是通过使包含靶向肽的分子探针与EDB-FN和/或EDA-FN的结合而形成的复合物可视而促进检测或诊断方法的检测步骤。可以选择可检测的部分，使得其产生信号，该信号可以测量，并且其强度与待分析的组织结合的分子探针的量有关(优选为成比例)。标记生物分子(例如肽)的方法是本领域公知的。

多种可检测部分的任意一种可以与本发明所述的靶向肽一起使用。可检测部分的实例包括但不限于各种配体、放射性核、荧光染料、化学发光试剂、微颗粒(例如量子点、纳米晶体、磷等)、酶(例如在ELISA中使用的那些，即，辣根过氧化物酶,β-半乳糖苷酶,荧光素酶,碱性磷酸酶)、比色标记、磁标记、生物素、地高辛核苷酸、或者对其可以使用抗血清或单克隆抗体的其他半抗原和蛋白质。

在一些实施方案中，本发明所述的分子探针可以与用于分子探针体内成像或γ成像(例如正电子发射断层(PET),单光子发射计算体层摄影(SPECT),CT反差图像或超声成像)的非侵袭性成像技术(例如磁共振光谱(MRS)或成像(MRI))协同使用。术语“体内成像”是指允许检测标记靶向肽的任何方法，如上文所述。就γ成像而言，测量由检查器官或区域发出的辐射，并表示为总结合情况或比例，其中在同一的体内成像过程中，在一个组织中的总结合情况对相同受试对象的另一个组织中的总结合情况归一化(例如除以)。体内总结合情况定义为通过体内成像技术在组织中检测的完整信号，而无需通过二次注射相同量的分子探针连同大量过量的未标记的、但是其他方面是化学一致的化合物进行校正。

在一个实例中，可检测的部分可以包括放射性标记，其使用一般的有机化学技术与靶向肽偶联(例如附着或复合)。诸如¹²³I,¹³¹I,¹²⁵I,¹⁸F,¹¹C,⁷⁵Br,⁷⁶Br,¹²⁴I,¹³N,⁶⁴Cu,³²P,³⁵S之类的放射性标记可以用于本领域公知的PET技术成像，并且由Fowler,J.和Wolf,A.在POSITRON EMISSION TOMOGRAPHY AND AUTORADIOGRAPHY(Phelps,M.,Mazziota,J.,andSchelbert,H.eds.)391-450(Raven Press,NY 1986)中进行描述，该文献的内容以引用方式并入本文。可检测的部分还可以包括用于SPECT的¹²³I。¹²³I可以通过本领域已知的多种技术的任意一种与靶向肽偶联。例如参见Kulkarni,Int.J.Rad.Appl.&Inst.(Part B)18:647(1991)，该文献的内容以引用方式并入本文。此外，可检测的部分可以包括放射活性的碘的同位素，例如但不限于¹³¹I,¹²⁵I或¹²³I。放射活性的碘的同位素可以通过重氮碘直接碘化重氮化氨基衍生物，参见Greenbaum,F.Am.J.Pharm.108:17(1936)；或者通过不稳定的重氮化胺转化成稳定的三嗪；或者通过非放射活性的卤化前体转化成稳定的三烷基锡衍生物(其随后可以通过本领域公知的多种方法转化成碘代化合物)；而与靶向肽偶联。

为了进行体内成像，可利用的检测设备的类似在选择给定的可检测部分中是重要因素。例如所用设备的类型将指导稳定的同位素的选择。半衰期应该足够长，使得其在被靶物最大吸收时仍是可检测的，并且还足够短，使得宿主不会维持不利的作用。

可检测的部分可以进一步包括已知的金属放射性标记，例如用于PET成像的锝-99m(^99mTc),¹⁵³Gd,¹¹¹In,⁶⁷Ga,²⁰¹Tl,⁶⁸Ga,⁸²Rb,⁶⁴Cu,⁹⁰Y,¹⁸⁸Rh,T(氚),¹⁵³Sm,⁸⁹Sr,和²¹¹At以及¹⁸F修饰的金属放射性标记。例如18F修饰的放射性标记可以具有图11所示的结构，其中靶向肽与放射性标记偶联。放射性标记领域的任一普通技术人员可以在无需过度试验的条件下实施引入配体(其结合所述的金属离子)的靶向肽的修饰。金属放射性标记的分子探针则可以用于检测癌症，例如受试对象中的前列腺癌。制备Tc99m的放射性标记的衍生物是本领域公知的。例如参见Zhuang et al.,"Neutral and stereospecific Tc-99m complexes:[99mTc]N-benzyl-3,4-di-(N-2-mercaptoethyl)-amino-pyrrolidines(P-BAT)"NuclearMedicine&Biology 26(2):217-24,(1999)；Oya et al.,"Small and neutral Tc(v)OBAT,bisaminoethanethiol(N2S2)complexes for developing new brain imagingagents"Nuclear Medicine&Biology 25(2):135-40,(1998)；and Hom et al.,"Technetium-99m-labeled receptor-specific small-molecule radiopharmaceuticals:recent developments and encouraging results"Nuclear Medicine&Biology 24(6):485-98,(1997)。

荧光标记试剂和红外试剂包括本领域已知的那些，其中很多通常都是市售可得的，例如荧光团，例如ALEXA 350,PACIFIC BLUE,MARINA BLUE,ACRIDINE,EDANS,COUMARIN,BODIPY 493/503,CY2,BODIPY FL-X,DANSYL,ALEXA 488,FAM,OREGON GREEN,RHODAMINEGREEN-X,TET,ALEXA 430,CAL GOLD.TM.,BODIPY R6G-X,JOE,ALEXA 532,VIC,HEX,CALORANGE.TM.,ALEXA 555,BODIPY 564/570,BODIPY TMR-X,QUASAR.TM.570,ALEXA 546,TAMRA,RHODAMINE RED-X,BODIPY 581/591,CY3.5,ROX,ALEXA 568,CAL RED,BODIPY TR-X,ALEXA 594,BODIPY 630/650-X,PULSAR 650,BODIPY 630/665-X,ALEXA 647,IR800和QUASAR 670。荧光标记试剂可以包括其他已知的荧光团，或本领域已知的蛋白质，例如绿色荧光蛋白。所公开的靶向肽可以与荧光标记试剂偶联，给予受试对象或样品，以及通过荧光光谱或成像来检查受试对象/样品从而检测标记的化合物。

如Gao,et al"In vivo cancer targeting and imaging with semiconductorquantum dots",Nature Biotechnology,22,(8),2004,969-976中所述，可以使用量子点，例如半导体颗粒，其中所述的文献的全部教导以引用方式并入本文。所公开的靶向肽可以与量子点偶联，给予受试对象或样品，以及通过荧光光谱或成像来检查受试对象/样品从而检测标记的化合物。

多种磁共振成像(MRI)造影剂是本领域已知的，例如阳性造影剂和阴性造影剂。所公开的靶向肽可以与MRI试剂偶联，给予受试对象或样品，以及通过MRI或成像来检查受试对象/样品从而检测标记的化合物。阳性造影剂(通常在MRI上主要显示为明亮)通常可以包括小分子量的有机化合物，其螯合或包含具有未配对的外层电子自旋的活性元素，例如钆,锰,氧化铁等。典型的造影剂包括钆(III)螯合物，例如钆喷酸葡胺,加多利道,钆特酸葡甲胺,锰福地吡三钠,钆双胺和本领域已知的其他物质。阴性造影剂(通常在MRI上主要显示为黑暗)可以包括小微粒聚集体，其由超顺磁性材料构成，例如超顺磁性氧化铁(SPIO)的颗粒。阴性造影剂还可以包括缺乏与MRI成像中的信号有关的氢原子的化合物，例如全氟化碳(全氟化学品)。

在某些方面中，可检测的部分包括螯合试剂和金属离子。螯合试剂通常具有能够与所述的肽形成共价键的一个或多个基团。本发明中可以使用本领域已知的大量不同的螯合试剂。在一个方面中，螯合试剂包括非环状的或环状的化合物，其包含至少一个杂原子(例如氧、氮、硫、磷)，该杂原子具有能够与成像试剂配合的孤对电子。非环状螯合试剂的实例包括乙二胺。环状螯合试剂的实例包括二乙烯三胺五乙酸盐(DTPA)或其衍生物,1,4,7,10-四氮杂环十二烷四乙酸盐(DOTA)及其衍生物,1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸盐(DO3A)及其衍生物,乙二胺四乙酸盐(EDTA)及其衍生物,1,4,7,10-四阿扎环十三烷四乙酸(TRITA)及其衍生物,1,4,8,11-四阿扎环十四烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)及其衍生物,1,4,7,10-四氮杂环十二烷四甲基乙酸盐(DOTMA)及其衍生物,1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三甲基乙酸盐(DO3MA)及其衍生物,N,N',N”,N”'-四膦酸基甲基-1,4,7,10-四氮杂环十二烷(DOTP)及其衍生物,1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四(亚甲基甲基膦酸)(DOTMP)及其衍生物,1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四(亚甲基苯基膦酸)(DOTPP)及其衍生物,或者N,N'-亚乙基二-L-半胱氨酸或其衍生物。术语“衍生物”在本发明中定义为螯合试剂的相应的盐及其酯。

金属离子的选择可以根据检测技术(例如MRI、PET等)而改变。在一个方面中，用于磁共振成像的金属离子包括Gd⁺³,Eu⁺³,Tm⁺³,Dy⁺³,Yb⁺³,Mn⁺²或Fe⁺³离子。在另一个方面中，用于PET和SPECT成像的离子包括⁵⁵Co,⁶⁴Cu,⁶⁷Cu,⁴⁷Sc,⁶⁶Ga,⁶⁸Ga,⁹⁰Y,⁹⁷Ru,⁹⁹mTc,¹¹¹h,¹⁰⁹Pd,¹⁵³Sm,¹⁷⁷Lu,¹⁸⁶Re,¹⁸⁸Re。在另一个方面中，成像试剂包括MRI试剂，其中MRI试剂包括螯合试剂和金属离子(包括Gd⁺³,Eu⁺³,Tm⁺³,Dy⁺³,Yb⁺³,Mn⁺²或Fe⁺³离子)。

在一些实施方案中，可以使用连接分子使靶向肽与可检测的部分偶联。连接分子可以是肽连接体。备选地，连接分子可以是非肽连接体，例如聚合物或单体连接体。

在其他的实施方案中，靶向肽可以与IgG的Fc区域偶联，从而形成可以特异性结合EDB-FN和/或EDA-FN的靶向肽-Fc嵌合体。备选地，靶向肽-Fc嵌合体可以诱导免疫应答，例如补体依赖的裂解和抗体依赖的细胞毒性，其靶向肿瘤细胞，从而激发抗肿瘤活性。

可以结合IgG的Fc区域与另一种蛋白质(例如多种细胞因子和可溶性受体)的一个或多个结构域的嵌合蛋白质是已知的。这些嵌合蛋白质可以为人类Fc区域与另一种蛋白质的人类结构域的融合物。这些嵌合蛋白质则是“人源化的Fc嵌合体”。例如参见Capon etal.,Nature,337:525-531,1989；Chamow et al.,Trends Biotechnol.,14:52-60,1996)；美国专利No.5,116,964和5,541,087。嵌合蛋白质可以是通过IgG Fc铰链区中的半胱氨酸残基连接的同源二聚体蛋白质，从而得到类似于IgG分子的不具有C_H1结构域和轻链的分子。由于结构同源性，此类Fc融合蛋白质在体内展现出与人类IgG(具有相似的同种型)相当的药代动力学概况。该方法已经用于多种具有治疗重要性的细胞因子(例如IL-2和IFN-α)和可溶性受体(例如TNF-Rc和IL-5-Rc)(例如参见美国专利No.5,349,053,6,224,867和7,250,493)。

在一些实施方案中，靶向肽-Fc嵌合体为嵌合分子，其包含编码本发明所述的靶向肽(与人类Fc片段融合)的人类序列，并且能够与EDB-FN和/或EDA-FN(其由癌细胞，或者癌细胞微环境中的另一种细胞表达)结合或复合。

多肽-Fc嵌合体的靶向肽部分(类似于上文所述的靶向肽)可以经历多种变化、取代、插入和删除，其中此类变化为其应用提供某些益处。就此而言，目标肽部分可以相当于或者基本上与所述的靶向肽序列是同源的，但是不是一致的，其中可以形成一个或多个变化，并且其保留了发挥特异性结合和/或复合Ig超家族细胞粘附分子的蛋白酶切割的细胞外部分的能力。

靶向肽-Fc嵌合体的Fc部分为结合激活Fc的受体的结构域，例如激活Fc Ig的结构域，并且包含允许二聚化的铰链区。靶向肽-Fc嵌合体的Fc部分可以容易地适用于提供其物种特异性。就鼠科系统(例如衍生自小鼠的细胞)的用途而言，用于生成靶向肽-Fc的Fc片段可以为鼠科来源的Fc片段。在一些实施方案中，可以使用鼠科IgG2a的Fc片段。

就人类受试对象的用途而言，例如用于癌症治疗，用于生成靶向肽-Fc嵌合体的Fc片段为人类来源的。在一些实施方案中，靶向肽-Fc嵌合体包含激活Fc Ig的结构域。在4种人类IgG同种型中，IgG₁的激活Fc的结构域可以用于制备多肽-Fc嵌合体。

应该理解的是，不同的抗体同种型具有不同程度的体内细胞毒性潜力(例如参见Nimmerjahn F.&Ravetch J V.,2006,Immunity,24:19-28)。例如鼠科IgG2a和IgG2b同种型在清除感染(例如细菌感觉和病毒感染)和杀死肿瘤细胞方面比它们的IgG₁或IgG₃相对物更有效。这至少部分归因于体内存在的激活与抑制FcR的不同比例。类似地，对于人类IgG同种型而言，IgG₁和IgG₃具有比IgG₂和IgG₄更强的与FcR的相互作用。此外，给定同种型的某些多态异型可以影响对Fc受体的亲和力。事实上，存在激活FcR的等位基因变体，其中所述的激活FcR会显著影响对某些抗体同种型的亲和力。例如FcγRIIIa受体158V异型展示对人类免疫球蛋白G₁的更高的亲和力，和增加的抗体依赖的细胞毒性(Cartron G.et al.,2002,Blood,99:754-758)。

因此，技术人员清楚的是，可以通过策略性地选择或修饰用于制备多肽-Fc嵌合体的Fc等位基因来优化靶向肽-Fc嵌合体的Fc部分与其相应Fc受体之间的相互作用。因此，Fc片段的突变体或异型在此可以用于本发明所述的多肽-Fc嵌合体。已经描述了大量Fc结构域内的有用的突变，其可以影响Fc与其受体的相互作用、Fc的受体功能以及包含Fc的分子的半衰期。这些包括Fc中碳水化合物部分的特定的氨基酸取代和/或修饰。例如参见Liu etal.,2008,Immunological Reviews,222:9-27；Nimmerjahn&Ravetch,2007,Curr.Opin.Immunol.,19(2):239-45。

在其他的实施方案中，靶向肽-Fc嵌合体可以经改造而具有增强的补体活性。通常，补体可以通过至少3个途径激活，从而形成膜攻击复合物(MAC)C5b-9，该复合物在靶细胞的质膜上形成孔并导致它们裂解。Clq与Fc结构域结合是该过程中的重要步骤。在人类IgG亚类中，仅IgG1和IgG3可以引起补体级联。在一些实施方案中，在多肽-Fc嵌合体的Fc结构域中引入突变，从而促进C1q的募集和C1q-Fc的相互作用。被靶向用于此类突变的Fc的残基包括但不限于Asp270,Lys322,Pro329和Pro331。这些突变涉及相应残基(多个)被非极性中性氨基酸取代，例如Ala,Met或Trp。在具体的实施方案中，多肽-Fc包含突变Lys326Trp和/或Glu333Ser。

此外，应该注意的是当具有人工序列和活性的嵌合或融合蛋白质用于诊断用途时，在一些环境下给予此类嵌合或融合蛋白质的患者会引发不需要的免疫应答，例如发展出针对所述的试剂的抗体。Fc片段的某些结构修饰已经显示会降低治疗融合蛋白质的免疫原性。例如参见美国专利No.6,992,174B2(该文献以引用方式并入本文)；Liu et al.,2008,Immunological Reviews,222:9-27。此类修饰可以用于本发明所述的靶向肽-Fc嵌合体的有效设计。

用于所述的方法中的靶向肽-Fc嵌合体可以包括连接靶向肽部分与Fc片段的连接部分。在一些情况下，Fc融合蛋白质分子的铰链区起到Fc区域与融合的多肽(例如可溶性受体)之间的间隔的作用，从而允许分子的这2个部分分别发挥功能。

在一些实施方案中，包含嵌合分子的Fc部分和靶向肽部分通过连接分子连接，其中所述的连接分子并非多肽或Fc部分的相邻部分，并且其以共价方式将多肽的氨基酸与Fc的氨基酸连接起来。如本文所用，作为“并非相邻的部分”的连接分子是指嵌合体的靶向肽部分和Fc部分通过其他的元件连接，该元件并非多肽或免疫球蛋白的一部分，其实质上与嵌合部分的任一部分相邻，并发挥连接体的作用。

在一些实施方案中，连接分子可以为肽连接体。在连接体为肽连接体的情况下，可以使用传统的分子生物学/重组DNA方法以单一的重组多肽的形式生产多肽-Fc嵌合体。

用于制备Fc嵌合体的分子生物学和生物化学技术是已知的。在一些实施方案中，靶向肽-Fc嵌合体可以通过传统的重组DNA方法生产。在其他的实施方案中，靶向肽-Fc嵌合体可以以单一的(例如相邻的)重组多肽的形式生产。在其他的实施方案中，靶向肽-Fc的2个或多个部分可以以分开的片段的形式生产，并且随后连接在一起从而产生靶向肽-Fc嵌合体。例如靶向肽-Fc嵌合体的多肽部分和靶向肽-Fc嵌合体的Fc部分均可以以分开的重组多肽的形式生产，然后通过化学连接手段融合在一起，从而产生靶向肽-Fc。该生产的方法学是优选的，特别是在使用非肽连接分子的情况下更是如此。类似地，当嵌合靶向肽-Fc以单一的连续的多肽形式制备时，如果其不能正确折叠(例如不能适当地结合配体)，则所述的生产方法学也可以是优选的。

对于重组多肽的生产而言，可以使用多种宿主有机体。宿主的实例包括但不限于细菌，例如E.coli、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞。宿主有机体的选择取决于靶向肽-Fc嵌合体的特定用途。技术人员将理解的是在选择用于生产重组多肽的合适的宿主中，如何考虑某些标准。影响宿主选择的因素包括例如翻译后修饰(例如磷酸化和糖基化模式)，以及技术因素(例如一般预计的产率以及纯化的容易程度)。应该仔细地考虑靶向肽-Fc嵌合体(将在体内使用)的宿主特异性翻译后修饰，这是因为已知某些翻译后修饰是高度免疫原性的(抗原性的)。

可以通过例如系统性的、局部的和/或肠胃外的给予方法将包含本发明所述的靶向肽的分子探针给予受试对象。这些方法包括例如注射、输注、沉积、移植或局部给予，或者任何其他的给予方法(在需要通过分子探针接近组织的情况下)。在一个实例中，分子探针的给予可以为通过在受试对象中静脉内注射分子探针。可以进行探针的单次或多次给予。如本文所用，“给予的”是指在有效标记受试对象中的癌细胞的量(多个)和时期(多个)内提供或传递分子探针。

包含本发明所述的靶向肽的分子探针可以以可检测的量的药物组合物给予受试对象，其中所述的药物组合物包含给予患者的分子探针或其药物可接受的水溶性盐。

“可检测的量”是指所给予的分子探针的量足以能够检测探针与EDB-FN和/或EDA-FN的结合或复合，其中所述的EDB-FN和/或EDA-FN是由癌细胞或癌细胞微环境中的其他细胞表达的。“成像有效量”是指所给予的分子探针的量足以能够成像分子探针与癌细胞或癌细胞微环境中的其他细胞的EDB-FN和/或EDA-FN的结合或复合。

待给予的分子探针的配方将根据所选的给予途径而改变(例如溶液、乳液、胶囊等)。合适的药物可接受的载体可以包含惰性组分，其不会不适地抑制化合物的生物活性。药物可接受的载体在给予受试对象时应该是生物相容性的，例如无毒性、非炎性的、非免疫原性的并且缺乏其他不需要的反应。可以使用标准的药物配制技术，例如在Remington'sPharmaceutical Sciences,ibid中所述的那些。用于肠胃外给予的合适的药物载体包括例如无菌水、生理盐水、抑菌盐水(包含大约0.9％mg/ml苯甲醇的盐水)、磷酸盐缓冲的盐水、Hank溶液、Ringer乳酸盐等。

药理组合物(其包含溶解于或分散于其中的活性组分)的制备是本领域公知的。通常，此类组合物制备成可注射的液体溶液或悬液，但是还可以制备成适用于溶液或悬液的固体形式(使用前配制于液体中)。配方将根据所选的给予途径而改变(例如溶液、乳液、胶囊)。

任何多肽或化合物还可以以药物可接受的盐的形式使用。能够与所述的多肽形成盐的酸包括无机酸，例如三氟乙酸(TFA),盐酸(HCl),氢溴酸,高氯酸,硝酸,硫氰酸,硫酸,磷乙酸(phosphoric acetic acid),丙酸,乙醇酸,乳酸,丙酮酸,草酸,丙二酸,琥珀酸,马来酸,富马酸,邻氨基苯甲酸,肉桂酸,萘磺酸,磺胺酸等。

能够与所述的多肽形成盐的碱包括无机碱，例如氢氧化钠,氢氧化铵,氢氧化钾等；以及有机碱，例如单-,二-和三-烷基和芳基-胺(例如三乙胺,二异丙基胺,甲基胺,二甲基胺等)以及可任选的取代的乙醇胺(例如乙醇胺,二乙醇胺等)。

方法中可以使用分子探针，从而检测和/或测定表达EDB-FN和/或EDA-FN的癌细胞在受试对象的器官、组织或肌体区域中的存在情况、位置和/或分布。分子探针在动物的组织(例如前列腺组织)中的存在情况、位置和/或分布可以可视化(例如使用上文所述的体内成像模式)。如本文所用，“分布”是散落于区域或体积中的空间性质。在这种情况下，“癌细胞的分布”是癌细胞散落于动物组织(例如前列腺组织)所包含的区域或体积中的空间性质。分子探针的分布则可以与组织中癌细胞的存在或缺乏情况有关。对于癌细胞的存在或缺乏情况而言，分布可能是决定性的，或者本领域的任意技术人员可以其他因素和症状结合，从而明确地检测迁移或分散癌细胞的存在或缺乏情况，癌症转移，或定义受试对象中肿瘤的边缘。

在一个方面中，可以将分子探针给予受试对象，从而评估恶性或转移癌细胞在受试对象中的分布，并将所述的分布与特定的位置相关联。外科医生在手术切除中通常使用立体定向技术和术中MRI(iMRI)。这允许他们明确地识别样品组织与肿瘤的不同区域，例如肿瘤边缘或肿瘤中心。通常，他们还对肿瘤边缘上的组织区域取样，所述的区域位于肿瘤边缘的外部，其显示是非常正常的，但是通过在组织检查时分散肿瘤细胞而是浸润的。

特异性结合和/或复合EDB-FN和/或EDA-FN(与恶性或转移细胞有关)的分子探针可以用于术中成像技术，从而指导手术切除，并通过手术来消除肿瘤边缘位置的“有根据的推测”。之前的研究已经确定更广泛的手术切除会改善患者的生存。因此，发挥诊断分子成像试剂作用的分子探针具有增加患者成活率的潜力。

在一些实施方案中，为了识别和促进癌细胞的除去，可以将显微术中成像(IOI)技术与系统性给予的或局部给予的本发明所述的分子探针结合。分子探针在给予受试对象时可以靶向和检测和/或测定患者器官或肌体区域中癌细胞的存在情况、位置和/或分布，即，与EDB-FN和/或EDA-FN表达有关的癌细胞。在一个实例中，分子探针可以与IOI结合，从而识别已经浸润的和/或在肿瘤边缘开始浸润的恶性细胞。可以在手术过程中实时实施所述的方法。该方法可以包括分子探针的局部或系统性应用，其中所述的分子探针包含可检测的部分，例如PET、荧光或MRI造影部分。成像方式则可以用于检测并随后汇集图像数据。所得的图像数据可以用于至少部分确定手术和/或放射学治疗。备选地，该图像数据可以用于至少部分控制自动化的手术设备(例如激光、外科手术刀、微型机器)，或有助于手术的人工指导。此外，图像数据可以用于计划和/或控制治疗试剂的传递(例如通过微电子机器或微型机器)。

本发明所述的另一个实施方案涉及测定受试对象中癌细胞的侵入性或恶性的方法。发现分子探针与癌症的结合强度与癌症的侵入性有关。增强的结合与更高侵入的癌症有关，而较低的或降低的结合与较低侵入的或良性肿瘤有关。在一个实例中，分子探针与前列腺肿瘤部分的结合与基于肿瘤侵入性的Gleason得分有关，其中分子探针的增强的结合强度与侵入的或恶性的前列腺癌有关，并且其与良性的前列腺肥大不同，良性的前列腺肥大展示出探针的较低的结合强度。本发明所述的方法和分子探针可以用于监测和/或比较受试对象中在给予癌症治疗学或癌症治疗之前、在给予过程中或治疗学方案之后癌症的侵入性。

本发明所述的另一个实施方案涉及监测给予受试对象的癌症治疗学或癌症治疗的效力。本发明所述的方法和分子探针可以用于监测和/或比较受试对象中在给予癌症治疗学或癌症治疗之前、在给予过程中或治疗学方案之后癌症的侵入性、侵袭、迁移、分散和转移。

如本文所用，“癌症治疗学”或“癌症治疗”可以包括任何试剂或治疗方案，其能够例如通过杀死癌细胞，诱导癌细胞凋亡，降低癌细胞的生长速率，减少转移的发生率或数量，减小肿瘤大小，抑制肿瘤生长，减少供入肿瘤或癌细胞的血液，促进针对癌细胞或肿瘤的免疫应答，预防或抑制癌症的进展或者增加患癌动物的寿命而不利地影响动物的癌症。癌症治疗学可以包括一种或多种治疗，例如但不限于化学、放疗、激素治疗和/或生物治疗/免疫治疗。受试对象中例如癌症体积、生长、迁移和/或散步的减少可以表明给定治疗的效力。这可以提供癌症治疗学的直接临床效力终点量度。因此，在另一个方面中，提供了监测癌症治疗学的效力的方法。更具体而言，应用的实施方案提供了监测癌症治疗的效力的方法。

监测癌症治疗学效力的方法包括以下步骤：向动物体内给予本发明所述的分子探针；然后观察动物中分子探针的分布(例如使用本发明所述的体内成像模式)；接着将分子探针的分布与癌症治疗学的效力相关联。应该考虑到可以在治疗学方案过程之前、过程中和之后实施给予步骤，从而确定所选的治疗学方案的效力。一种评估癌症治疗学效力的方式是比较分子探针在癌症治疗之前和之后的分布。

在一些实施方案中，检测受试对象中与EDB-FN和/或EDA-FN结合和/或复合的分子探针，从而检测和/或提供癌细胞在受试对象中的侵入性、位置和/或分布。然后可以将受试对象中癌细胞的侵入性、位置和/或分布与对照比较，从而测定癌症治疗学和/或癌症治疗的效力。所述的对照可以为受试对象在给予癌症治疗学和/或癌症治疗之前癌细胞的位置和/或分布。可以通过将分子探针给予受试对象并检测受试对象在给予癌症治疗学和/或癌症治疗之前与癌细胞结合和/或复合的分子探针来测定受试对象中在给予癌症治疗学和/或癌症治疗之前癌细胞的位置和/或分布。

在某些实施方案中，本发明所述的方法和分子探针可以用于测量给予受试对象以用于治疗转移的或侵入的癌症的治疗学的效力。在这种实施方案中，可以在给予治疗学方案之前、过程中或之后将分子探针给予受试对象，并且可以将癌细胞的分布成像从而测定治疗学方案的效力。在一个实例中，治疗学方案可以包括转移癌症的手术切除，并且分子探针可以用于定义转移癌症术前和术后的分布，从而测定手术切除的效力。可任选地，所述的方法和分子探针可以用于术中手术过程，例如手术肿瘤切除，从而更容易地定义和/或成像在手术过程中癌细胞的质量或体积。

在其他的实施方案中，靶向肽可以与治疗试剂缀合，并给以受试对象以用于治疗癌症，例如转移癌症。在这种实施方案中，可以在给予治疗试剂之前、过程中或之后将靶向肽给予受试对象，并且可以使用治疗试剂靶向转移细胞的分布。

治疗试剂可以包括抗增殖试剂，其通过直接施加在肿瘤细胞上(例如通过抑制细胞或杀死细胞的作用)以及非间接地通过诸如生物应答修饰之类的机制而赋予抗赘生物、化疗、抗病毒、抗有丝分裂、抗肿瘤发生和/或免疫治疗作用，例如预防赘生物细胞的发展、成熟或散播。具有大量的抗增殖试剂可以用于商业用途、临床评价和临床前研发。为了便于讨论，将抗增殖试剂分成以下种类、亚型和种：ACE抑制剂,烷化剂,血管生成抑制剂,血管增生抑制素,蒽环类抗生素/DNA插入剂,抗癌抗生素或抗生素型试剂,抗代谢物,抗转移化合物,天冬酰胺酶,二碳磷酸盐化合物,cGMP磷酸二酯酶抑制剂,碳酸钙,环氧合酶-2抑制剂,DHA衍生物,DNA拓扑异构酶,内皮他丁,epipodophylotoxins,金雀异黄素,激素类抗癌试剂,亲水性胆汁酸(URSO),免疫调控剂或免疫试剂,整合素拮抗剂,干扰素拮抗剂或试剂,MMP抑制剂,混合抗肿瘤试剂,单克隆抗体,亚硝基脲,NSAID,鸟氨酸脱羧酶抑制剂,pBATT,放射性/化学感光剂/保护剂,类维生素A,内皮细胞增殖和迁移的选择性抑制剂,硒,间质溶素抑制剂,紫杉烷,疫苗以及长春花生物碱。

一些抗增殖试剂所属的主要类别包括抗代谢物试剂,烷化剂,抗生素型试剂,激素类抗癌试剂,免疫试剂,干扰素型试剂以及混合抗肿瘤试剂的类别。一些抗增殖试剂通过多重或未知的机制操作，并由此分成超过一种的类别。

在一些实施方案中，可以使用连接分子将靶向肽与治疗试剂偶联。连接分子可以为肽连接体。备选地，连接分子可以为非肽连接体。

实施例

实施例1

我们识别出多个小肽序列，其特异性地结合onfFN同种型，以用于前列腺癌的分子成像。尽管文献中已经报告蛋白质的特异性抗体，但是多种小肽因缺乏免疫原性、制造成本有效性和翻译研发(translational development)预备性而是有利的。在本实施例中，我们描述了通过噬菌体展示而识别的EDB-FN特异性小肽。合成肽-Cy5缀合物以用于生物标志物的分子成像。使用肽-Cy5缀合物在体外、体内和人类前列腺癌样本中研究所述的肽与EDB-FN的结合性质。

材料和方法

材料

除非另外陈述，否则所有试剂均未进一步纯化而使用。2-氯三苯甲基氯树脂和所有Fmoc保护的氨基酸均购自Chem-Impex International,Inc。Fmoc-12-氨基-4,7,10-三氧杂十二酸购自EMD Chemicals Inc.(Gibbstown,New Jersey,USA)。磺基-Cy5.0NHS酯购自Lumiprobe(Hallandale Beach,FL)。无水N,N-二异丙基乙基胺(DIPEA)和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)购自alfa Aesar(Ward Hill,MA,USA)。三氟乙酸(TFA)购自Oakwood Products,Inc(West Columbia,SC)。用于质粒构建的FastDigest酶购自Fermantas(Thermo ScientificCo.,Rockford,IL,USA)。

使用E.coli的EDB的表达

优化并合成EDB的DNA序列(GeneArt,Regensburg,Germany)，然后根据用户说明书，利用NdeI和PstI限制性位点，将所述的序列克隆至pQE-T7-1表达载体(Qiagen,Valencia,CA,USA)中。在中对数期生长的E.coli菌株BL21(Sigma-Aldrich,St Louis,MO,USA)通过1mM IPTG诱导EDB的生产。使用Ni Sepharose 6Fast Flow(GE healthcare,Waukesha,WI,USA)通过10×His标签对EDB进行纯化，然后对水进行透析，并冻干。使用SDS-PAGE评价表达和纯化。

噬菌体筛选

Ph.D C7C文库(New England Biolabs,Beverly,MA,USA)用于筛选EDB特异性九肽。通过实施4轮淘选过程来选择候选肽。在各轮中，将纯化的EDB片段(100μg/ml)固定在未处理的96孔板上(Corning Costar,Tewksbury,MA,USA)，并在4℃下过夜涂敷。0.5％BSA用于封闭非特异性的结合(1hr，室温)，然后在室温下与噬菌体温育1hr。使用PBST(0.1％,0.3％,0.5％BSA分别用于1-3轮)的充分洗涤用于除去未结合的噬菌体，然后通过0.1M甘氨酸-HCl(pH 2.2)洗脱结合的噬菌体，并使用Tris-HCl(pH 9.1)中和。对洗脱的噬菌体进行滴定，并根据用户说明书使用E.coli(ER2758)扩增。通过超滤和PEG/NaCl沉淀来纯化培养基中扩增的噬菌体。在第4轮结束时，在LB/IPTG/Xgal平板上培养适当稀释的噬菌体，并将由29个随意挑取的蓝色噬菌体得到的DNA用于测序(使用提供的引物)(New EnglandBiolabs)。由相应的DNA序列的翻译得到肽序列。

肽合成

基因标准的固相合成，由2-氯三苯甲基氯树脂上Fmoc保护的氨基合成具有CTVRTSADC序列的ZD2肽。PEG(Fmoc-12-氨基-4,7,10-三氧杂十二酸),和磺基-Cy5.0NHS酯依次与肽的N末端缀合，从而形成荧光ZD2探针(ZD2-Cy5)。通过将所述的肽在10％DMSO/PBS中暴露于空气来实施肽的环化作用。使用RP-HPLC然后通过冻干对环状肽进行纯化。通过MALDI-TOF质谱来表征肽与肽ZD-2缀合物。

肽ELISA

合成线性形式的ZD2(CTVRTSADA)，使得半胱氨酸上的硫氢基基团可以用于与马来酰亚胺活化的过氧化物(Sigma-Aldrich)缀合。根据说明书的指导进行缀合。在使用纯化的EDB涂敷96孔板后，使用缀合产物ZD2-HRP来进行肽ELISA测试。PBS中0.5％BSA用于在最后的步骤中封闭非特异性结合。将0.39μM至50μM ZD2-HRP与涂敷的EDB温育1小时，然后使用TBST(0.1％)充分洗涤。随后加入ABTS底物，使其反应30min，然后在415nm下测量各孔中溶液的吸光率。加有ABTS的未涂敷的孔用作空白对照。

体外细胞结合

PC3细胞系购自American Type Culture Collection(ATCC,Manassas,VA,USA)，并保持在RPMI/10％FBS培养基中。使用慢病毒转染细胞，使其在收获前至少48h表达绿色荧光蛋白(GFP)。为了诱导EMT，在TGFβ1(5ng/ml)存在下，将PC3细胞培养5天。为了进行体外结合测试，使用Hoechst 33342(Life Technologies,Brooklyn,NY,USA)将细胞的核染色24h，然后加入500nM ZD2-Cy5。将细胞在包含ZD2-Cy5的培养基中保持24h，并使用共聚焦显微镜监测。为了进行活细胞研究避免进行强烈的摇动，从而保持分泌的EDB-FN处于玻璃上。

在小鼠肿瘤模型中进行体内结合

根据the Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)批准的动物方案，将4-5周龄的NIH无胸腺雄性裸鼠保持在Case Western Reserve University的theAthymic Animal Core Facility。为了进行整体荧光成像研究，构建侧腹部肿瘤模型。向各小鼠的两侧的侧腹部中皮下植入2×10⁶PC3-GFP细胞(其与等体积的PBS混合物混合(50μL培养物的培养基和50μL PBS))。在接种后2至3周，肿瘤直径的平均大小为0.5cm。将小鼠用于Maestro FLEX In vivo Imaging System(Cambridge Research&Instrumentation,Inc.Woburn,MA,USA)的成像，从而在0至24小时内监测ZD2的靶向作用。向小鼠静脉内注射ZD2-Cy5或CERAK-Cy5(0.3μmol/kg体重)。在5h后，处死小鼠，并使用the Maestro FLEX Invivo Imaging System对肿瘤和各器官成像。

人类前列腺切片的组织学染色

由OriGene(Rockville,MD,USA)获得人类前列腺切片。本研究中使用的抗体包括小鼠单克隆抗-纤连蛋白抗体(BC-1,ab154210,Abcam,Cambridge,UK)，罗丹明红-X缀合的山羊多克隆抗兔IgG(H+L)(Jackson Immuno Research Lab.West Grove,PA,USA)，以及FITC缀合的山羊多克隆抗小鼠Fc(ab97264,Abcam)。包埋在OCT中的冷冻的组织切片(5nm)用于免疫染色和肽染色。将石蜡包埋的样品脱石蜡，并使用一般的方法使用抗原修复进行处理。将切片渗透，并使用冷的丙酮固定，然后在室温下通过0.5％BSA封闭1hr。在浓度5uM下进行肽染色。使用DAPI对载玻片进行复染色，并使用Prolong Gold regent(Invitrogen)用盖玻片固定，然后成像。在Olympus FV1000共聚焦激光扫描显微镜上将染色的组织成像。使用405nm激光观察GFP，并读取480至495nm下的发射波长，呈现为绿色。使用405nm激光观察DAPI，并读取450至470nm下的发射波长，并表示为蓝色。使用635nm激光观察Cy5.0，并读取655nm至755nm下的发射波长，并表示为红色。

qPCR

由细胞样品收集总RNA，并使用RNeasy Plus Kit(Qiagen)分离。然后，使用theHigh Capacity cDNA Transcription Kit(Applied Biosystems,Foster City,CA)将RNA逆转录成cDNA。根据制造商的建议，使用SYBR Green Master Mix(Life Technologies)进行半定量实施PCR。将用于所检查的单个基因的RNA浓度针对它们相应的GAPDH RNA信号归一化。在the Mastercycler realplex2(VWR International,West Chester,PA,USA)上实施cDNA合成和实施PCR。使用2^-ΔΔCT方法计算相对的mRNA表达水平。寡核苷酸引物对序列为：用于EDB正义，5’-GCAGCCCACAGTGGAGTAT-3’(SEQ ID NO:31)，用于EDB反义，5’-GGAGCAAGGTTGATTTCTTT-3’(SEQ ID NO:32)；用于EDA正义，5’-GCAGCCCACAGTGGAGTAT-3’(SEQID NO:33)，用于EDA反义，5’-GGA GCAAGGTTGATTTCTTT-3’(SEQ ID NO:34)；用于GAPDH正义，5’-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3’(SEQ ID NO:35)，用于GAPDH反义，5’-TCTAGACGGCAGGTCAGGTC-3’(SEQ ID NO:36)；用于E-cadherin正义，5’-TGCCCAGAAAATGAAAAAGG-3’(SEQ ID NO:37)，用于E-钙黏着蛋白反义，5’-GTGTATGTGGCAATGCGTTC-3’(SEQI D NO:38)；以及用于N-钙黏着蛋白正义，5’-ACAGTGGCCACCTACAAAGG-3’(SEQ ID NO:39)，用于N-钙黏着蛋白反义，5’-CCGAGATGGGGTTGATAATG-3’(SEQ ID NO:40)。所述的引物购自Invitrogen。

Western印迹

根据制造商的指示，使用补充有PMSF(Sigma)和蛋白酶抑制剂(Sigma)的T-PERTissue Protein Extraction Reagent(Thermo scientific)裂解得自小鼠的组织。由OriGene获取人类前列腺裂解物，并根据制造商的指示使用。加载20μg蛋白质用于电泳和印迹。凝胶、PVDF膜和其他相关试剂购自Biorad(Hercules,CA,USA)，并根据制造商的指示使用。General Electric Typhoon Phosphor成像仪用于处理使用FITC缀合的二级抗体印迹的膜。

统计学分析

除非另外陈述，所有数据均表示为平均值±SEM。当比较2个组时，使用双尾Student’s t检验(认为p<0.05有意义)。

结果

EDB-FN结合肽

EDB是具有91个氨基酸序列(由单一的外显子编码)的III型同源重复序列，其在脊椎动物中是一致的。通过将EDB密码子优化的DNA序列克隆至表达载体pQE-T7-1中(处于T7启动子调节之下，如图1A所示)来表达EDB片段。通过DNA测序证明质粒中EDB DNA的连接。如图1B所示，通过SDS-PAGE证明EDB片段的表达和纯化。展示环状九肽(在其pIII蛋白质上具有2个半胱氨酸残基的侧翼)的M13噬菌体文库用于筛选EDB结合肽。4轮淘选产生富集的噬菌体文库，其包含具有高的EDB结合能力(通过噬菌体ELISA测试测定)的噬菌体。在29种识别的噬菌体克隆子中，CTVRTSADC(SEQ ID NO:10)的肽序列出现5次，并命名为ZD2。

使用标准的固相肽化学来合成环状ZD2肽(CTVRTSADC)(SEQ ID NO:10)，并通过MALDI-TOF质谱表征(图1C)。然后，使用荧光发色团青色素5(Cy5)通过短的PEG连接体(NH₂-(CH₂CH₂O)₃-CH₂CH₂COOH)标记所述的肽，从而得到肽荧光探针ZD2-Cy5。所述的肽还与过氧化物酶(ZD2-HRP)缀合，并使用肽ELISA测试来测定肽与EDB片段的结合亲和力。图1D显示ZD2-HRP与EDB片段的浓度依赖的结合曲线，其给出ZD2-HRP与EDB之间的结合亲和力为4.52±2.68(K_D，平衡解离常数)。

肽与TGFβ1-诱导的PC3癌细胞所分泌的EDB-FN的体外结合

升高的onfFN表达是前列腺癌细胞的EMT的标志物。使用TGFβ1处理PC3人类前列腺癌细胞与未诱导的细胞相比，得到延长的间叶细胞表现型，如图2A所示。EDB-FN表达的上调节伴有E-Cad下调节和N-Cad上调节，通过定量PCR测定(图2B)。结果，ZD2-Cy5显示，与未处理的细胞相比，基本上更多地结合使用TGFβ1处理的PC3细胞的外周，这是因为TGFβ1-诱导的细胞生产并分泌EDB-FN，如图2C所示。

在小鼠PC3前列腺肿瘤模型中ZD2-Cy5的体内结合

携带PC3-GFP侧腹部肿瘤异种移植物的小鼠的整体荧光成像显示肿瘤中ZD2-Cy5显著高的累积(图3A)。在静脉内注射后1.5h，在Cy5荧光图像中清楚地强调注射ZD2-Cy5的小鼠肿瘤。与注射非特异性的对照CERAK-Cy5的小鼠相比，对于注射ZD2-Cy5的小鼠而言，Cy5信号的相对高的肿瘤与正常(T/N)之比保持至多24小时(图3B)。收集肿瘤和主要器官，从而在注射后5小时将Cy5信号成像。结果证明肿瘤中Cy5标记的ZD2发生特定的累积，而对于注射CERAK-Cy5的小鼠而言，观察到较少的肿瘤累积(图3C)。由肿瘤、肝脏和肺得到的蛋白质裂解物的Western印迹分析表明与肝脏和肺相比，PC3肿瘤表达基本更多的EDB-FN，如图3D所示。

由携带肿瘤的小鼠(注射ZD2-Cy5或CERAK-Cy5)得到的组织切片的成像进一步证明肿瘤中ZD-Cy5的特异性结合，并且Cy5信号分布于肿瘤的ECM中。在肝脏或肺中，发现较少的ZD2-Cy5累积(图4A)。由于EDB-FN为血管再生的生物标志物，所以我们使用EDB-FN和CD31的特异性抗体在这些肿瘤切片上进行免疫荧光染色。选择BC-1作为参照，从而将ZD2的粉笔与EDB-FN的表达相关联，而抗-CD31抗体用于关联血管再说。图4B种的免疫荧光图像证明ZD2-Cy5结合与FN表达和血管再生之间的重叠。

在不同侵入性的前列腺癌中ZD2-Cy5的结合

在不同Gleason得分的人类前列腺肿瘤切片中进一步评估ZD2-Cy5的结合活性。人类前列腺BPH切片用作对照。如图5A和图5C所示，具有高Gleason得分的肿瘤在基质和腺体区域中展示强的ZD2-Cy5染色，而正常的腺体未染色。相似的趋势在BC-1免疫荧光染色中也观察到。由ZD2染色的切片获得的Cy5荧光图像的直方图分析表明由于肿瘤的Gleason得分由GS7升高至GS9，像素值的分布由低强度值迁移至高强度值(图5B)。在直方图分析中，在8位图像上像素强度范围为50至255表明在较高的Gleason得分的切片上ZD2结合增多。还使用Western印迹来分析由正常前列腺和癌症前列腺得到的蛋白质裂解物(GS＝3+4)，由此证明癌症样品中高的EDB-FN表达(图5D)。通过使用BC-1封闭切片的竞争性染色抑制肿瘤结合ZD2-Cy5(图5E)。该结果表明BC-1和ZD2共享相同的分子靶物。

我们使用噬菌体展示识别了对EDB-FN具有良好结合亲和力的环状九肽ZD2。在后-EMT PC3前列腺癌细胞中，使用荧光探针ZD2-Cy5首次体外证明肽的结合特异性。ZD2-Cy5在后-EMT PC3细胞中显示强结合，而在未诱导的细胞中显示未结合。ZD2-Cy5与诱导的PC3细胞的强结合定位于细胞的周围，其符合FN为ECM蛋白质的事实。通过TGFβ1对PC3细胞进行EMT诱导得到后-EMT PC3前列腺癌细胞中EDB-FN的大幅上调节和强结合。EMT通常与侵袭型癌症有关。结果表明EDB-FN是侵入性前列腺癌的潜在生物标志物，而ZD2肽为用于生物标志物的可行的探针。在携带PC3-GFP前列腺癌异种移植物的小鼠中进一步证明肿瘤的结合特异性。

在不同Gleason得分的人类前列腺肿瘤切片中进一步检验ZD2的结合活性。在前列腺癌的临床管理中，Gleason得分是最常用的病理学评级系统。我们的组织学染色试验显示ZD2-Cy5具有强的结合前列腺肿瘤(GS7和GS9)，而在BPH肿瘤切片中并非如此。ZD2-Cy5在肿瘤切片中的结合强度显示与基于肿瘤侵入性的Gleason得分有关，这符合之前的研究，该研究显示与BPH相比，EDB-FN在前列腺癌种过表达。结果表明EDB-FN为用于区分前列腺癌与BPH的理想的标志物。

目前，针吸活检Gleason评分常用于前列腺癌的风险分层管理和决策中。这种风险分层管理策略的目标是使对患者(其未受益于治疗)产生的治疗相关的危害最小。然而，诊断过程的精确性通常受到相同前列腺中癌症的不均一性和由针吸活检取样的前列腺的不充分性损害。因此，分子成像技术(具有在整个前列腺中非侵袭性地绘制前列腺癌的侵入性的潜力)优于侵袭性的活检，并且能提供更精确的差异诊断。诊断前列腺癌分子诊断已经检验了大量的分子靶物。例如细胞表面生物标志物PSMA,N-钙黏着蛋白和hepsin、以及细胞内标志物DD3/PCA3和GalNAc-T3已经作为用于前列腺癌的标志物进行了研究。但是，仍不清楚这些靶物是否可以用作癌症侵入性的指示剂。EDB-FN为分子标志物前列腺癌血管再生和EMT(癌症侵入性的特征)。分子成像EDB-FN可以提供前列腺癌的非侵袭性的差异诊断。EDB-FN在肿瘤ECM中的充分表达更接近于分子探针，其得到成像探针的改进的结合。

实施例2

在本实施例中，我们研发了用于微转移的分子成像的靶向EDB-FN的造影剂l-ZD2-Gd(HP-DO3A)。该造影剂是基于EDB靶向肽ZD2(其是通过噬菌体展示技术发现的)而合理设计的。已经针对所述的肽的靶向能力评价了线性形式的这种肽l-ZD2。用于钆络合的模块细胞用于与l-ZD2缀合。这种小的钆-基造影剂靶向癌细胞和成纤维细胞等分泌的EDB-FN，并且在正常组织中最少地累积。细胞水平的EDB-FN的过表达可以非常有助于早期且敏感地检测微转移。在本实施例中，我们评估了在肿瘤接种后的早期阶段l-ZD2-Gd(HP-DO3A)在检测微转移中的效力。这些结果证明靶向EDB-FN的造影剂可以更高效地检测具有更小尺寸的微转移，由此增加敏感性以用于更好的诊断。

用于EDB-FN靶向的线性ZD2的用途

我们之前报告了特异性靶向EDB-FN的环状九肽ZD2(CTVRTSADC)(SEQ ID NO:10)。但是，ZD2使用二硫键的环化作用往往使化学修饰进一步复杂，并具有分子内键合的可能性。因此，我们评估线性形式的l-ZD2(TVRTSAD)(SEQ ID NO:1)的可能性，并且预计l-ZD2可以类似于环状ZD2发挥作用。为了测量l-ZD2与EDB蛋白质之间的结合亲和力，固相合成序列为NH₂-TVRTSADC-COOH(SEQ ID NO:41)的肽。半胱氨酸上的巯基基团用于缀合马来酰亚胺活化的辣根过氧化物酶(HRP)，从而得到l-ZD2-HRP。类似地，CERAK-HRP作为对照合成。ELISA(酶联免疫吸附测试)显示l-ZD2-HRP与EDB蛋白质结合，其亲和力为xxxμmol^-1，这相当于环状ZD2，并且亲和力稍微升高，而CERAK-HRP显示未观察到与EDB结合。未观察到l-zd2-HRP与EDA之间的结合。由于据信环状肽在体内具有更高的结构稳定性，我们使用HPLC在24小时内评价l-ZD2在人类血清中的稳定性。由光谱可见，在24小时内未观察到l-ZD2发生降解。由此，我们可以推断线性形式的ZD2还可以用于EDB-FN靶向。

EDB-FN的上调节为乳腺癌转移的标志

4T1细胞显示，转化生长因子-β(TGFβ)诱导的结果使得纤连蛋白的表达受到上调节。TGFβ是上皮细胞间质转型(EMT)的重要调节因子，其被认为是转移的驱动力。为了证明EDB-FN作为用于转移靶向的生物标志物的用途，我们比较了EDB-FN在正常4T1细胞中和在TGFβ诱导的5天的4T1细胞中的mRNA水平。值得注意的是，TGFβ诱导的结果是EDB-FN在4T1细胞中受到3倍的上调节(图6A)。与原发性肿瘤相比，由不同器官得到的转移肿瘤的蛋白质提取物的Western印迹分析还显示组织水平的EDB-FN的上调节(图6B)。在正常组织(例如脑、肺和肝脏)中观察到最低的EDB-FN表达。总之，这些结果支持以下假设：EDB-FN可以用作用于靶向转移肿瘤的有效的生物标志物。

由于肿瘤细胞产生EDB-FN从而促进其迁移，我们进一步证明Cy5标记的l-ZD2(l-ZD2-Cy5)是否可以在体外结合TGFβ诱导的4T1细胞。我们的结果表明l-ZD2-Cy5在3小时内与诱导的4T1细胞结合，但是未观察到在诱导的4T1细胞上CREKA-Cy5之间的结合。为了解释这种情况，我们假设，在这种形式的细胞培养物中，不能采取形成凝块(clot)来提供用于CREKA-Cy5的结合位点。为了证明我们的假设，我们进一步生产3D培养物系统，其模拟了转移肿瘤的“土壤”。在3D培养物系统中，在包含TGFβ、胶原蛋白和纤维蛋白的微环境中培养4T1细胞。发现从第1天开始，l-ZD2-Cy5在细胞外周中累积。总体而言，这些证件指明以下结论：使用靶向微转移的EDB-FN比纤连蛋白-纤维蛋白复合物是有利的，这是因为在转移前微环境中，EDB-FN比纤连蛋白-纤维蛋白出现的更早。

靶向EDB-FN的钆-基磁共振探针的设计

靶向EDB-FN的MRI试剂的设计是基于模块系统，其形成了与l-ZD2缀合的小分子造影剂。图7A种的化合物是通过以下过程制备的：加入短的PEG连接体，然后与5-乙炔酸反应，从而得到通过点击化学而用于缀合的炔基基团。使用HPLC纯化由化合物1和2的反应而得到的最终产物，并使用Maldi-Tof光谱来表征。(图7B)弛豫(T1和T2)的测量显示所得的化合物在3T时具有相对高的弛豫(图7C)。

在乳腺癌转移肿瘤模型中，使用l-zd2-Cy5体内检测微转移

为了构建转移肿瘤模型，通过心脏左心室注射进行5天TGFβ诱导的0.2×10⁶4T1肿瘤细胞，使得肿瘤细胞主要在脑、肺、肝脏、淋巴结、肾上腺、胸腔和骨髓中散播。2周龄的小鼠的生物发光图像用于监测肿瘤的生长。为了评估l-ZD2-Cy5的靶向能力，在注射10nmoll-ZD2-Cy5后3小时，由小鼠收获脑和肺。由l-ZD2-Cy5发出的信号清楚地概括了在脑和肺上生长的微转移，由4T1产生的GFP信号加强在肿瘤的位置。(图8A)相反，CERAK-Cy5未显示在小的转移肿瘤上结合。由正常小鼠(注射l-ZD2-Cy5)收获的正常脑和肺用作阴性对照。如图8B所示，淋巴结和肾上腺中较大转移肿瘤的检查进一步支持了l-ZD2-Cy5的靶向效力。冷冻切片的肿瘤的共聚焦激光扫描显微镜证明l-ZD2-Cy5分布于细胞的ECM中，并且形成纤维网。总之，这些结果铺设了通向检测MRI探针的路(基于用于转移的体内成像的l-zd2)。

使用l-ZD2-Gd(HP-DO3A)的乳腺癌转移的体内磁共振成像

在2周内将乳腺癌转移肿瘤模型成像，以证明l-ZD2-Gd(HP-DO3A)在检测乳腺癌微转移中的性质。在图9A中，在注射l-ZD2-Gd(HP-DO3A)后，在MRI中成像在淋巴结、肾上腺和胸腔发展出转移肿瘤的小鼠，并配合BLI证明的肿瘤位置。所有5个肿瘤均表明BLI显示MRI增强，并且所有的肿瘤的位置均精确地反应。在腿、肩和肺中肿瘤的代表性图像均示于图9B中。注射CERAK-Gd(HP-DO3A)的小鼠的成像显示最低的肿瘤增强。肿瘤、肝脏、肾、膀胱和肌肉的CNR测量证明肿瘤中l-ZD2-Gd(HP-DO3A)明显更高的信号增强(图9C)。

相同的造影剂可以用于前列腺癌成像。然后，我们使用用于前列腺癌MRI的造影剂在携带原发PC-3人类前列腺癌异种移植物的雄性裸鼠中测试靶向EDB-FN的效力。如图10所示，在静脉内注射剂量0.1mmol-Gd/kg靶向试剂后，在至少30min内，该靶向试剂产生强效的肿瘤增强，而临床对照Gd(HP-DO3A)在相同的条件下在肿瘤中产生较少的对比增强。结果表明在肿瘤ECM中EDB-FN特异性的靶向小分子肽的造影剂有效地用于前列腺癌的对比增强的MRI，而EDB-FN是使用分子MRI的用于非侵袭性检测前列腺癌的可行的分子靶物。

由本发明的上述描述来看，本领域的那些技术人员将理解改良、变化和修饰。本领域技术范围内的这些改良、变化和修饰都将涵盖在所附的权利要求书中。在本申请中引用的所有参考文献、公开和专利均以引用方式全文并入本文。

Claims (8)

1.化合物在制备用于靶向前列腺癌的探针的用途，所述探针、所述化合物包含包含：

与可检测的部分偶联的至少一个靶向肽，该靶向肽与EDB-FN结合，并且具有选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 10。

2.权利要求1所述的用途，所述的可检测的部分包含成像试剂，并且所述的化合物在给予所述的受试对象时可通过γ成像, 正电子发射断层(PET)成像, 计算机断层(CT)成像,磁共振成像, 近红外成像或荧光成像中的至少一者检测。

3.权利要求1所述的用途，所述的可检测的部分包括光学染料、MRI造影剂、PET试剂、SPECT试剂、CT造影剂、放射性标记或超声造影剂中的至少一者。

4.权利要求1所述的用途，所述的至少一个靶向肽与所述的可检测的部分共价连接。

5.权利要求1所述的用途，其进一步包含将所述的靶向肽与所述的可检测的部分偶联的连接体。

6.权利要求5所述的用途，其中所述的连接体为肽连接体或聚合物连接体。

7.权利要求1所述的用途，当将其系统性给予患有肿瘤的受试对象时，所述的化合物与所述的肿瘤的细胞外基质中的EDB-FN结合或复合。

8.权利要求1所述的用途，所述的探针检测前列腺癌和/或前列腺癌侵入性。

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