CN107007832A - 一种ClfA-A靶位的金黄色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗的制备方法 - Google Patents
一种ClfA-A靶位的金黄色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种ClfA‑A靶位的金黄色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗的制备方法，提取金黄色葡萄球菌DNA，根据GenBank上已提交的ClfA基因序列，分别设计上游引物与下游引物，且向上游引物与下游引物中分别引入Bam H I和Hind III酶切位点，制得重组质粒pET‑ClfA‑A；进行PCR扩增，将重组质粒pET‑ClfA‑A转入感受态细胞BL21(DE3)中，用IPTG进行诱导，对目的蛋白进行大量表达和纯化；取家兔，免疫后采血获取血清，进行检测；经过免疫程序后采血获取血清，测定抗体效价后，制得金黄色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗。本发明建立的有效的金黄色葡萄球菌凝集因子蛋白(ClfA‑A)的制备，为以ClfA‑A为靶位的疫苗研究，对金黄色葡萄球菌性奶牛乳房炎疫苗的研究提供试验依据。
Description
技术领域
本发明涉及动物基因技术领域，具体是一种ClfA-A靶位的金黄色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗的制备方法。
背景技术
奶牛乳房炎(Bovine Mastitis)是奶牛的常见疾病，是奶牛乳腺组织的炎症，主要为乳腺组织感染病原微生物所致，是奶牛的常见病、多发病。几十年来，国内外针对奶牛乳房炎的防治作了很多努力，但该病一直是困扰我国奶牛业养殖发展最为严重的疾病之一。它使奶牛泌乳和生殖机能受到损伤，不仅降低奶牛的产奶量，使奶牛淘汰，影响乳的品质造成严重的经济损失，严重时甚至影响到人类健康。
S.aμreus感染的第一步就是在宿主体内定植，而实现定植的前提是细菌在宿主的组织和细胞表面的黏附，细菌有可以黏附到组织表面的组分成为黏附素，S.aureus黏附素有纤维蛋白原凝集素A、B(Fibronectin-binding proteins clumping factor A and B，ClfA，ClfB)，纤维蛋白A、B(Fibronectin-binding protein A and B，FnBPA，FnBPB)，胶原结合蛋白(collagen-binding protein Can)和A蛋白(protein A)，ClfA是金黄色葡萄球菌主要的黏附素之一，能够介导金黄色葡萄球菌结合于细胞表面的纤维素连接蛋白原，使细菌黏附于宿主细胞表面，促进细胞对寄主组织的入侵。ClfA是将细菌黏附到纤维蛋白和可溶及不溶性纤维蛋白原上的决定性因子。
发明内容
本发明的目的在于提供一种ClfA-A靶位的金黄色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗的制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种ClfA-A靶位的金黄色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗的制备方法，由以下步骤组成：
1)重组质粒pET-ClfA-A的构建
提取金黄色葡萄球菌DNA，根据GenBank上已提交的ClfA基因序列，分别设计上游引物与下游引物，且向上游引物与下游引物中分别引入Bam HI和Hind III酶切位点，制得重组质粒pET-ClfA-A；
上游引物P1序列如SEQ ID NO：1所示，
下游引物P2序列如SEQ ID NO：2所示，
然后对重组质粒pET-ClfA-A进行PCR扩增，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测；经蓝白斑筛选及双酶切鉴定得到的阳性克隆进行序列测定分析；
2)诱导的表达产物
将上述重组质粒pET-ClfA-A转入感受态细胞BL21(DE3)中，用终浓度为0.8-1.2mM的IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)进行诱导，取不同时间段的表达产物进行SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)检测；
3)目的蛋白的大量表达及纯化
根据SDS-PAGE检测确定的最佳诱导时间和IPTG的浓度，对目的蛋白进行大量表达和纯化；
4)免疫动物的筛选
选取体重2～2.5kg家兔，免疫后采血获取血清，进行检测；
5)免疫程序：
首次免疫：目的蛋白与弗氏完全佐剂乳化后免疫家兔，每只家兔注射650-750μg上述目的蛋白，背部皮下多点注射；
首次免疫后每隔15d加强免疫一次，以弗氏不完全佐剂为佐剂，每只家兔250-350μg目的蛋白，第3次免疫后第10d采血获取血清，测定抗体效价后，制得金黄色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗。
作为本发明进一步的方案：PCR扩增条件：94℃5min；94℃30s、62℃45s、72℃1min30s，35个循环；72℃10min。
作为本发明进一步的方案：步骤2)中IPTG的终浓度为1.0mM。
作为本发明进一步的方案：首次免疫：目的蛋白与弗氏完全佐剂乳化后免疫家兔，每只家兔注射700μg目的蛋白。
作为本发明进一步的方案：首次免疫后每隔15d加强免疫一次，以弗氏不完全佐剂为佐剂，每只家兔300μg目的蛋白。
根据上述方法制得金黄色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明建立的有效的金黄色葡萄球菌凝集因子蛋白(ClfA-A)的制备，为以ClfA-A为靶位的疫苗研究，对金黄色葡萄球菌性奶牛乳房炎疫苗的研究提供试验依据。
附图说明
图1是ClfA-A区基因的扩增图，M：DNA分子质量标准，1：PCR产物；
图2是目的蛋白的SDS-PAGE分析图，M：蛋白质分子质量标准，1：IPTG诱导下pET-32a-ClfA-A在BL21中的表达，2：无IPTG诱导时pET-32a-ClfA-A在BL21中的表达，3：IPTG诱导下的空载体。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明实施例中，一种ClfA-A靶位的金黄色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗的制备方法，具体操作步骤：
1、重组质粒pET-ClfA-A的构建
根据参考文献提取金黄色葡萄球菌DNA，GenBank登录的ClfA基因序列(Z18852)，用Primer5.0设计上下游引物，
上游引物P1序列：5’-CGCGGATCCGTAGCTGCAGATGCACC-3’；
下游引物P2序列：5’-CCCAAGCTTCTCATCAGGTTGTTCAGG-3’。
为了方便其定向克隆，于上下游分别引入Bam HI和Hind III酶切位点(下划线部分)，PCR扩增条件：94℃5min；94℃30s、62℃45s、72℃1min30s，35个循环；72℃10min，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测。经蓝白斑筛选及双酶切鉴定得到的阳性克隆进行序列测定分析。
经测序正确后进行表达。(见图1)
2、诱导的表达产物
将上述构建的重组质粒转入感受态细胞BL21(DE3)中，用终浓度为1.0mM的IPTG进行诱导，取不同时间段的表达产物进行SDS-PAGE检测。
3、蛋白的大量表达及纯化
经鉴定，目的蛋白以可溶性形式存在，扩大培养后，根据预实验确定的最佳诱导时间和IPTG的浓度，进行大量表达和纯化。(见图2)
4、免疫动物的筛选
选取体重2～2.5kg家兔，免疫后采血获取血清，进行检测。
5、免疫程序：
首次免疫：目的蛋白与弗氏完全佐剂乳化后免疫家兔，每只700μg上述重组蛋白，背部皮下多点注射。
首次免疫后每隔15d加强免疫一次，以弗氏不完全佐剂为佐剂，每只家兔300μg蛋白，第3次免疫后第10d采血获取血清，测定抗体效价，
6、表达产物ELISA检测
100μL牛纤维蛋白原(4μg/mL)包被96孔酶标板，4℃过夜；200μL明胶(1g/L)封闭，37℃孵育2h；加入100μL的目的蛋白(5μg/mL)，以不加目的蛋白的孔为对照，37℃孵育2h；加入自制的一抗(1∶4000稀释的家兔血清)100μL，37℃孵育2h；加入羊抗兔的酶标二抗(1∶1000稀释)100μL，37℃孵育2h；加入显色液100μL，37℃孵育10～30min；加入终止液100μL；测定490nm处OD值。
7、抗体抗粘附能力检测
4μg/mL牛纤维蛋白原100μL包被96孔酶标板，4℃过夜，TBST缓冲液洗涤2次后，轻柔拍干；加入100μL明胶(1g/L)封闭，37℃孵育2h；对数生长期的金黄色葡萄球菌，加入等体积的自制一抗，37℃孵育30min；包被好的酶标孔选孔数的1/2加入经自制血清孵育的金黄色葡萄球菌100μL，剩下的1/2加入不经血清孵育的对数生长期的金黄色葡萄球菌，37℃孵育2h；TBST缓冲液洗涤3次后，轻柔拍干；加入250mL/L甲醛，室温放置10～30min；TBST缓冲液洗涤3次后，轻柔拍干；加入结晶紫染色30min，TBST缓冲液洗涤3次后，轻柔拍干；加入乙醇脱色20min，尽量使结晶紫全部脱出；测定583nm处OD值。
8、结果
抗体黏附能力的检测表明，加入未经血清孵育的金黄色葡萄球菌的酶标孔的OD583(1.031±0.23，n＝13)明显高于加入经血清孵育的金黄色葡萄球菌的酶标孔的OD583(0.693±0.23，n＝13)，即未经血清孵育的金黄色葡萄球菌黏附至牛纤维蛋白原上的能力较强，经血清孵育后的金黄色葡萄球菌黏附至牛纤维蛋白原的能力明显下降。
因此，通过上述方法，可以制备ClfA-A靶位的金黄色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗，为今后奶牛乳房炎的防治提供了基础。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (6)
1.一种ClfA-A靶位的金黄色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗的制备方法，其特征在于，由以下步骤组成：
1)重组质粒pET-ClfA-A的构建
提取金黄色葡萄球菌DNA，根据GenBank上已提交的ClfA基因序列，分别设计上游引物与下游引物，且向上游引物与下游引物中分别引入Bam H I和Hind III酶切位点，制得重组质粒pET-ClfA-A；
上游引物P1序列如SEQ ID NO：1所示，
下游引物P2序列如SEQ ID NO：2所示，
然后对重组质粒pET-ClfA-A进行PCR扩增，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测；经蓝白斑筛选及双酶切鉴定得到的阳性克隆进行序列测定分析；
2)诱导的表达产物
将上述重组质粒pET-ClfA-A转入感受态细胞BL21(DE3)中，用终浓度为0.8-1.2mM的IPTG进行诱导，取不同时间段的表达产物进行SDS-PAGE检测；
3)目的蛋白的大量表达及纯化
根据SDS-PAGE检测确定的最佳诱导时间和IPTG的浓度，对目的蛋白进行大量表达和纯化；
4)免疫动物的筛选
选取体重2～2.5kg家兔，免疫后采血获取血清，进行检测；
5)免疫程序：
首次免疫：目的蛋白与弗氏完全佐剂乳化后免疫家兔，每只家兔注射650-750μg上述目的蛋白，背部皮下多点注射；
首次免疫后每隔15d加强免疫一次，以弗氏不完全佐剂为佐剂，每只家兔250-350μg目的蛋白，第3次免疫后第10d采血获取血清，测定抗体效价后，制得金黄色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗。
2.根据权利要求1所述的ClfA-A靶位的金黄色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗的制备方法，其特征在于，PCR扩增条件：94℃5min；94℃30s、62℃45s、72℃1min 30s，35个循环；72℃10min。
3.根据权利要求1所述的ClfA-A靶位的金黄色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗的制备方法，其特征在于，步骤2)中IPT6的终浓度为1.0mM。
4.根据权利要求1所述的ClfA-A靶位的金黄色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗的制备方法，其特征在于，首次免疫：目的蛋白与弗氏完全佐剂乳化后免疫家兔，每只家兔注射700μg目的蛋白。
5.根据权利要求1所述的ClfA-A靶位的金黄色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗的制备方法，其特征在于，首次免疫后每隔15d加强免疫一次，以弗氏不完全佐剂为佐剂，每只家兔300μg目的蛋白。
6.根据权利要求1-5任一所述的制备方法制得金黄色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗。
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| EP1109577A4 (en) * | 1998-08-31 | 2002-03-13 | Inhibitex Inc | MULTI-COMPONENT VACCINE |
| CN102847172A (zh) * | 2012-10-17 | 2013-01-02 | 西北农林科技大学 | 预防山羊葡萄球菌乳房炎的基因工程疫苗制备方法及应用 |
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2016
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1109577A4 (en) * | 1998-08-31 | 2002-03-13 | Inhibitex Inc | MULTI-COMPONENT VACCINE |
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| 姜晓娟: "奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌凝聚因子A A区基因的克隆表达", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 * |
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