CN106999573A

CN106999573A - 佐剂组合物

Info

Publication number: CN106999573A
Application number: CN201580065778.3A
Authority: CN
Inventors: 濑谷司; 松本美佐子
Original assignee: Hokkaido University NUC
Current assignee: Advanced Immunotherapy Institute
Priority date: 2014-12-02
Filing date: 2015-12-01
Publication date: 2017-08-01
Anticipated expiration: 2035-12-01
Also published as: EP3228322A1; JP2016108250A; US10105385B1; CA2969024A1; CN106999573B; AU2015356078A1; WO2016088784A1; EP3228322B1; CA2969024C; EP3228322B8; JP6453063B2; AU2015356078B2; US20180280425A1; EP3228322A4

Abstract

本发明提供一种佐剂组合物以及含有该佐剂组合物和抗原或抗原性成分的疫苗组合物，该佐剂组合物含有由序列编号1所示的碱基序列及其互补序列构成的双链RNA与包含序列编号2所示的碱基序列的单链DNA结合而成的核酸。该佐剂组合物含有具有强佐剂活性和高安全性、且可通过化学合成进行制造的核酸。

Description

佐剂组合物

技术领域

本发明涉及新型佐剂组合物及含有该佐剂组合物的疫苗组合物。

背景技术

癌症免疫疗法以给药作为癌抗原的肽疫苗的方法为主流，作为提高有效率的方法，提倡在给药癌抗原的同时给药使树突细胞活化的佐剂的方法。本发明人们对用于癌症免疫疗法的佐剂进行了研究，发现来源于麻疹病毒的diRNA(defective interferenceRNA，缺陷干扰RNA)具有佐剂的功能。具体而言，发现：该diRNA对人细胞诱导IFN-β表达，使NK细胞的NK活性增强，与癌抗原表位共同给药于移植有B16黑色素瘤细胞的荷瘤小鼠时显示出显著的肿瘤萎缩效果(专利文献1)。另外，本发明人们发现了抑制多聚IC的TLR3介导的IFN-β表达诱导的寡聚DNA，并报道了该寡聚DNA与多聚IC通过共同的受体被摄取到细胞内，被摄取的寡聚DNA的一部分局部存在于TLR3(非专利文献1)。此外，本发明人们还发现，基于非专利文献1记载的寡聚DNA和专利文献1记载的diRNA设计而成的新核酸到达内体上的TLR3，具有强佐剂活性(专利文献2)。

另一方面，为了将具有佐剂活性的核酸作为药品进行供给，需要遵守GMP标准来进行制造，因此，通过化学合成来制造核酸是必不可缺的。但是，对超过100mer这样的长链RNA进行化学合成的技术尚未确立，要专门通过体外转录来合成。因此，为了开发作为适用于人的药品的佐剂制剂，迫切要求创制具有强佐剂活性和高安全性、且可通过化学合成进行制造的核酸。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开WO2008/065752号

专利文献2：国际公开WO2012/014945号

非专利文献

非专利文献1：The Journal of Immunology,2008,181:5522-5529

发明内容

发明所要解决的问题

本发明的课题在于提供含有具有强佐剂活性和高安全性、且可通过化学合成进行制造的核酸的佐剂组合物、以及含有该佐剂组合物和抗原或抗原性成分的疫苗组合物。

用于解决问题的手段

为了解决上述课题，本发明包含下述的各发明。

[1]一种佐剂组合物，其特征在于，含有由包含序列编号3所示的碱基序列的单链核酸A和序列编号4所示的单链核酸B形成的双链核酸。

[2]如上述[1]所述的佐剂组合物，其特征在于，单链核酸A和单链核酸B均为化学合成核酸。

[3]如上述[1]或[2]所述的佐剂组合物，其特征在于，单链核酸A和单链核酸B是通过连接反应将化学合成的多个片段连接而制作的。

[4]如上述[1]～[3]中任一项所述的佐剂组合物，其特征在于，单链核酸A和单链核酸B中任一者的末端均未结合磷酸基。

[5]如上述[1]～[4]中任一项所述的佐剂组合物，其特征在于，构成单链DNA的核苷酸全部进行了硫代磷酸化修饰(ホスホロチオエート修飾)。

[6]一种疫苗组合物，其含有上述[1]～[5]中任一项所述的佐剂组合物和抗原或抗原性成分。

[7]如上述[6]所述的疫苗组合物，其中，上述抗原为癌抗原。

发明效果

根据本发明，能够提供含有通过化学合成进行制造、具有强佐剂活性和高安全性的核酸的佐剂组合物。该核酸与通过体外转录制造的核酸相比，稳定性高、副作用少，因此，作为适用于人的佐剂是非常有用的。另外，通过将该佐剂组合物与抗原或抗原性成分组合，能够提供优良的疫苗组合物。

附图说明

图1(A)是示出cM362-140的结构的图，图1(B)是示出将cM362-140的有义RNA和反义RNA供于含有7％尿素的8％PAGE的结果的图。

图2是示出cM362-139的结构的图。

图3是示出对cM362-140和cM362-139在添加有血清的PBS中的稳定性进行研究的结果的图，(A)为cM362-140的结果、(B)为cM362-139的结果。

图4是示出对cM362-140和cM362-139在添加有血清的无RNase水中的稳定性进行研究的结果的图。

图5是示出利用报告基因检测对cM362-140所致的IFN-β启动子活化进行评价的结果的图。

图6是示出使用野生型小鼠和TLR3敲除小鼠来源的脾脏树突细胞在体外对cM362-140所致的细胞因子产生诱导进行评价的结果的图。

图7是示出对野生型小鼠和TLR3敲除小鼠腹腔内给药cM362-140、在体内对细胞因子产生诱导进行评价的结果的图。

图8是示出使用EG7细胞的荷瘤野生型小鼠对cM362-140和/或OVA产生的萎缩效果进行评价的结果的图。

图9是示出对EG7细胞的荷瘤野生型小鼠给药cM362-140和/或OVA并对脾脏细胞的OVA特异性CD8阳性T细胞进行检测的结果的图。

图10是示出对EG7细胞的荷瘤野生型小鼠给药cM362-140和/或OVA并对脾脏细胞的IFN-γ产生量进行测定的结果的图。

图11是示出使用B16黑色素瘤细胞(B16D8)荷瘤小鼠(野生型小鼠或TICAM-1敲除小鼠)对cM362-140产生的萎缩效果进行评价的结果的图。

具体实施方式

[佐剂组合物]

本发明提供一种佐剂组合物，其含有由序列编号1所示的碱基序列及其互补序列构成的双链RNA与包含序列编号2所示的碱基序列的单链DNA结合而成的核酸。本发明的佐剂组合物中含有的核酸(以下记作“本发明的核酸”)只要是由序列编号1所示的碱基序列及其互补序列构成的双链RNA与包含序列编号2所示的碱基序列的单链DNA结合而成的核酸即可。确认了本发明的核酸的双链RNA部分具有TLR3活化能力，单链DNA部分被递送到树突细胞的内体。因此，本发明的核酸被高效地递送到树突细胞的内体，通过活化TLR3能够激活免疫功能。

序列编号1所示的碱基序列是驯化麻疹病毒株Edmonston(ED)株来源的diRNA的有义链的碱基序列(序列编号5)的第1位～第140位的碱基序列。其互补序列为序列编号4所示的碱基序列。包含序列编号2所示的碱基序列的单链DNA可以与双链RNA中的任意一个链连接。单链DNA与双链RNA可以直接连接，也可以经由其他核酸(例如，接头核酸)而连接，优选直接连接。另外，可以是单链DNA的3’侧与RNA链的5’侧结合，也可以是单链DNA的5’侧与RNA链的3’侧结合。更优选单链DNA的3’末端与RNA链的5’末端直接共价结合，进一步优选单链DNA的3’末端与RNA有义链(序列编号1)的5’末端直接共价结合。即，本发明的核酸优选由包含序列编号3所示的碱基序列的单链核酸A(单链DNA与RNA有义链的嵌合核酸)和序列编号4所示的单链核酸B(RNA反义链)形成。

构成单链DNA的核苷酸优选进行了硫代磷酸化修饰(也称为“S化修饰”)。进行了硫代磷酸化修饰的核苷酸可以是构成单链DNA的核苷酸的一部分，也可以是全部，更优选全部进行了硫代磷酸化修饰。通过硫代磷酸化修饰，显示出核酸酶耐性，并且向内体的递送性提高。

本发明的核酸优选由通过化学合成而制造的两条核酸链形成。即，上述单链核酸A和单链核酸B优选为化学合成的核酸链。通常，长链RNA的合成使用体外转录法，但本发明的核酸不使用体外转录法而通过化学合成进行序列特异性的制造，由此，例如在以冷冻干燥状态稳定地提供、以及所合成的碱基序列准确等方面有用性高。核酸的化学合成法没有特别限定，可以优选使用公知的一般化学合成法。可以列举例如亚磷酰胺法等。

各单链核酸可以一次性地化学合成全长，也可以分成若干片段进行合成后通过连接反应使各片段连接。片段的长度(碱基数)没有特别限定，优选约30mer～约80mer，更优选约35mer～约70mer，进一步优选约40mer～约60mer。连接反应可以使用公知的连接方法，优选使用例如Moore等(Moore MJ,&Sharp PA.Site-specific modification of pre-mRNA:the 2’-hydroxyl groups at the splice sites.Science 256:992-997(1992))、Jing等(Jing Xu,Lapham J,&Crothers DM.Determining RNA solution structure bysegmental isotopic labeling and NMR:Application to Caenorhabditis elegansspliced leader RNA 1.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:44-48(1996))等中记载的由夹板DNA(スプリントDNA)介导的连接反应(参考实施例1)。

形成本发明的核酸的各单链核酸优选在任意末端均未结合磷酸基。在通过体外转录合成的RNA链的5’末端附加有三磷酸，但由于本发明的核酸能够通过化学合成进行制造，因此可以使用在5’末端和3’末端均没有结合磷酸基的单链核酸来制造。在5’末端残留有磷酸基时，会由于生物体内的大量给药而使细胞质内RIG-I途径活化，诱导大量的细胞因子产生而导致副作用(Robinson RA,DeVita VT,Levy HB,Baron S,Hubbard SP,Levine AS.Aphase I-II trial of multiple-dose polyriboinosic-polyribocytidylic acid inpatients with leukemia or solid tumors.J Natl Cancer Inst.1976Sep；57(3):599-602)，因此，如果使用本发明的核酸，则能够提供安全性高的佐剂组合物。

另外，与多聚IC不同，本发明的核酸选择性地使TLR3下游的TICAM-1介导的信号转导系统活化，而不使TLR3以外的细胞内RNA传感器活化，因此，确认到在不存在引起细胞因子风暴的担忧的方面安全性高(参考实施例5、7等)。此外确认到，与使用通过体外转录合成的RNA链形成的类似结构的核酸相比，本发明的核酸的稳定性更优良(参考实施例2)。

如此，本发明的核酸能够被递送到树突细胞的内体而活化TLR3，因此，能够增强各种免疫反应。此外，本发明的核酸的安全性和稳定性高，因此，作为佐剂组合物的有效成分非常有用。本发明的佐剂组合物可以适当配合本发明的核酸和药学上可接受的载体或添加剂而进行制剂化。具体而言，可以制成片剂、包衣片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、液剂、混悬剂、乳剂等口服剂；注射剂、输液、栓剂、软膏、贴剂等非口服剂。关于载体或添加剂的配合比例，基于药品领域中通常采用的范围适当设定即可。可配合的载体或添加剂没有特别限制，可以列举例如水、生理盐水、其他水性溶剂、水性或油性基剂等各种载体；赋形剂、粘结剂、pH调节剂、崩解剂、吸收促进剂、润滑剂、着色剂、矫味剂、香料等各种添加剂。

作为片剂、胶囊剂等中可混和的添加剂，可以使用例如明胶、玉米淀粉、黄蓍胶、阿拉伯树胶之类的粘结剂、微晶纤维素之类的赋形剂、玉米淀粉、明胶、海藻酸等之类的膨化剂、硬脂酸镁之类的润滑剂、蔗糖、乳糖或糖精之类的甜味剂、胡椒薄荷、白珠树(Gaultheria adenothrix)油或樱桃之类的香味剂等。在制剂单元形态为胶囊的情况下，可以在上述类型的材料中进一步含有油脂之类的液态载体。用于注射的无菌组合物可以按照溶解或悬浮到注射用水之类的溶剂中的活性物质、芝麻油、椰油等之类的天然产植物油等中等通常的制剂方法来配置。作为注射用的水性液，可以使用例如生理盐水、含有葡萄糖和其他辅助药的等渗液(例如，D-山梨糖醇、D-甘露醇、氯化钠等)等，可以与适当的助溶剂、例如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子性表面活性剂(例如聚山梨醇酯80^TM、HCO-50)等并用。作为油性液，可以使用例如芝麻油、大豆油等，可以与作为助溶剂的苯甲酸苄酯、苄醇等并用。另外，可以与缓冲剂(例如磷酸盐缓冲液、乙酸钠缓冲液)、舒缓剂(例如苯扎氯胺、盐酸普鲁卡因等)、稳定剂(例如人血清白蛋白、聚乙二醇等)、防腐剂(例如苄醇、苯酚等)、抗氧化剂等配合。

如此得到的制剂可以给药于例如人或其他哺乳动物(例如，大鼠、小鼠、兔、羊、猪、牛、猫、狗、猴等)。本发明的佐剂组合物的给药量、给药频率可以考虑给药目的、给药对象的年龄、体重、性别、既往史、给药方法等来适当设定。

[疫苗组合物]

本发明提供含有上述本发明的佐剂组合物和抗原或抗原性成分的疫苗组合物。作为抗原或抗原性成分，可以列举病毒抗原、细菌抗原、癌抗原和它们的成分等。优选为癌抗原。对皮下移植癌细胞而形成了肿瘤的小鼠合并给药本发明的核酸和癌抗原后，结果能够使肿瘤显著萎缩，由此确认了本发明的疫苗组合物作为癌疫苗非常有用。本发明的疫苗组合物可以通过向上述本发明的佐剂组合物中添加抗原或抗原性成分而制造。另外，本发明的疫苗组合物可以与上述本发明的佐剂组合物同样地制剂化来实施。

作为病毒抗原，可以列举例如腺病毒、逆转录病毒、小核糖核酸病毒、疱疹病毒、轮状病毒、汉坦病毒、冠状病毒、披盖病毒、黄病毒、弹状病毒、副粘液病毒、正粘液病毒、布尼亚病毒、沙粒病毒、肠孤病毒、乳头瘤病毒、细小病毒、痘病毒、肝炎病毒、海绵状病毒、HIV、CMV、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、流感病毒、麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒、天花病毒、风疹病毒、单纯疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒、EB病毒、乙型脑炎病毒、狂犬病病毒、流感病毒等病毒抗原或它们的组合。

作为细菌抗原，可以列举例如芽孢杆菌属、埃希氏菌属、李斯特菌属、奈瑟菌属、诺卡氏菌属、沙门氏菌属、葡萄球菌属、链球菌属等的细菌抗原或它们的组合。

作为癌抗原，可以列举例如白血病、淋巴瘤、星形细胞瘤、神经胶质母细胞瘤、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、头颈部癌、消化系统肿瘤、胃癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、子宫癌、卵巢癌、阴道癌、睾丸癌、前列腺癌、阴茎癌、骨肿瘤、血管肿瘤、食道癌、胃癌、直肠癌、大肠癌、胰腺癌、胆囊癌、胆管癌、喉癌、肺癌、支气管癌、膀胱癌、肾癌、脑肿瘤、甲状腺癌、霍奇金氏病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髄瘤等的癌抗原或它们的组合。

本发明进一步包含下述发明。

(1)一种核酸，其特征在于，由包含序列编号3所示的碱基序列的单链核酸A和序列编号4所示的单链核酸B形成。

(2)一种癌症的治疗方法，其特征在于，对哺乳动物给药上述(1)所述的核酸和癌抗原。

(3)如上述(1)所述的核酸，其用于癌症的治疗。

(4)上述(1)所述的核酸在制造癌症治疗药中的应用。

实施例

以下，利用实施例详细地对本发明进行说明，但本发明并不限定于这些实施例。

[实施例1：核酸的制作]

(1)cM362-140(化学合成核酸)的制作

表1中记载的各单链核酸(S1、S2、S3、AS1、AS2和AS3)委托株式会社GeneDesign进行合成。RNA部分的化学合成使用tBDMS RNA amidite，DNA部分的化学合成使用一般的DNAamidite，S化(硫代磷酸酯)部分使用PADS。合成方法以使用固相载体的亚磷酰胺法(Scaringe,S.A.et al,；J Am Chem 1998；120:11820-11821)为基本，使用优化后的参数来执行。合成完成后，使用通常的方法将碱基部分和存在于2’位的保护基除去，利用反相HPLC进行纯化后脱盐，得到各单链核酸。

[表1]

小写字母的碱基为寡聚脱氧核苷酸。

硫代磷酸酯；5’-p，5’磷酸酯。

作为化学合成长链RNA的cM362-140通过由夹板DNA介导的连接反应(参考文献：Moore MJ,&Sharp PA.Site-specific modification of pre-mRNA:the 2’-hydroxylgroups at the splice sites.Science 256:992-997(1992)、Jing Xu,Lapham J,&Crothers DM.Determining RNA solution structure by segmental isotopic labelingand NMR:Application to Caenorhabditis elegans spliced leader RNA1.Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:44-48(1996))来制作。

cM362-140的有义RNA(单链核酸A)通过两阶段的连接反应来制作。作为第一连接，将S2片段(序列编号7、40nmol)、S3片段(序列编号8、40nmol)和对连接部位具有特异性的夹板DNA(序列编号12、40-48nmol)进行混合，在95℃下加热5分钟后，缓慢冷却至4℃，使其杂交。接着，添加T4DNA连接酶(宝生物)，在室温下温育16～22小时。连接反应混合物包含15.4μM的退火复合物、66mM的Tris-HCl(pH7.6)、6.6mM的MgCl₂、10mM的DTT、0.1mM的ATP和～31单位/μL的T4DNA连接酶。作为第二连接，向第一连接反应混合物中添加S1片段(序列编号6、40nmol)和对第二连接部位具有特异性的夹板DNA(序列编号13、40-48nmol)，与第一连接同样地进行杂交，添加T4DNA连接酶并在室温下温育16～22小时。第二连接反应混合物包含8.9μM的退火复合物、66mM的Tris-HCl(pH7.6)、6.6mM的MgCl₂、10mM的DTT、0.1mM的ATP和～31单位/μL的T4DNA连接酶。利用含有7M尿素的8％PAGE将所得到的全长165mer的有义RNA(单链核酸A)进行分离，通过UV照射使其可见化后，切出目的条带，利用0.3M乙酸钠将其溶出。对溶出的RNA进行乙醇沉淀，重悬于无RNA酶的水中。为了大规模制备RNA，使用D-TubeDialyzer Maxi透析管(Novagen公司)实施电溶出，对溶出的RNA进行透析、浓缩，利用乙醇使其沉淀。RNA的浓度通过用分光光度计测定260nm的吸光度来确定。收率为8～10％。

为了制作cM362-140的反义RNA(单链核酸B)，将AS1(序列编号9、33nmol)、AS2(序列编号10、33nmol)和AS3(序列编号11、33nmol)这3个片段以及对两处连接部位具有特异性的两种夹板DNA(序列编号14和15、各33nmol)进行混合、杂交，然后添加T4DNA连接酶，在室温下温育16～22小时。连接反应混合物包含15μM的退火复合物、66mM的Tris-HCl(pH7.6)、6.6mM的MgCl₂、10mM的DTT、0.1mM的ATP和～31单位/μL的T4DNA连接酶。通过与上述有义RNA同样的程序对所得到的全长140mer的反义RNA(单链核酸B)进行纯化。收率为15～22％。

使所得到的有义RNA(单链核酸A)和反义RNA(单链核酸B)退火，得到cM362-140。图1示出了cM362-140的结构(A)以及将所合成的165mer的有义RNA(单链核酸A)和140mer的反义RNA(单链核酸B)供于8％PAGE的结果(B)。有义RNA和反义RNA在与其各自的碱基长度相应的位置检测到单一的条带。

(2)对照核酸cM362-139的制作

将cM362-139的结构示于图2，将构成cM362-139的核酸的碱基序列示于表2。

[表2]

^：硫代磷酸酯

单链DNA(ODN+接头DNA)委托株式会社GeneDesign进行合成。作为双链RNA的模板，使用驯化麻疹病毒株Edmonston(ED)株来源的diRNA(defective interference RNA，缺陷干扰RNA)。覆盖MV基因组的该区域和T7启动子序列的DNA片段通过使用质粒pCR-T7MV作为模板的PCR进行扩增。使用的引物如下所示。

ODN-139有义RNA(5’引物)

5’-tgtaatacgactcactatagggaccagacaaagctggga-3’(序列编号19)

下划线部为T7启动子序列

ODN-139有义RNA(3’引物)

5’-ggatacagtgccctgattaa-3’(序列编号20)

ODN-139反义RNA(5’引物)

5’-tgtaatacgactcactataggatacagtgccctgattaa-3’(序列编号21)

下划线部为T7启动子序列

ODN-139反义RNA(3’引物)

5’-ccgtggtcatgctccgggaccagacaaagctggga-3’(序列编号22)

使用AmpliScribe^TMT7转录试剂盒(Epicentre Technologies)，按照制造商的操作规程由PCR产物分别利用体外转录制作有义RNA和反义RNA。利用含有7M尿素的8％PAGE对所得到的转录产物进行分离，利用与上述实施例1相同的方法进行纯化。最后，将单链DNA(ODN+接头DNA)、有义RNA和反义RNA混合并退火，得到cM362-139。

[实施例2：核酸的稳定性]

(1)在添加有血清的PBS中的稳定性

将cM362-140和cM362-139分别以20μg/mL的浓度溶解于不含血清的PBS、含有10％热灭活FBS(胎牛血清)、10％MS(小鼠血清)或10％HS(人血清)的PBS中，在37℃或42℃下温育60分钟。在温育开始前(0分钟、仅不含血清的PBS)、5分钟后、15分钟后、30分钟后和60分钟后，取含0.1μg的核酸的溶液，与10×上样染料(宝生物)混合，在含有溴化乙锭的4％琼脂糖凝胶(Nusieve 3:1Agarose，Ronza)中进行电泳。

将结果示于图3。(A)为cM362-140的结果，(B)为cM362-139的结果。在37℃下温育30分钟的情况下，任何一种核酸均是稳定的，但在42℃下温育30分钟的情况下，通过体外转录制作的cM362-139在含有血清(FBS、MS、HS)的PBS中稍有分解。

(2)在添加有血清的无RNA酶的水中的稳定性

使用无RNA酶的水代替PBS，电泳使用3％琼脂糖凝胶，除此以外，利用与上述相同的条件研究稳定性。

将结果示于图4。(A)为cM362-140的结果，(B)为cM362-139的结果。cM362-140在任一种条件下均稳定，但cM362-139在血清(FBS、MS、HS)存在下观察到部分的分解。

由以上结果表明，与cM362-139相比，cM362-140的稳定性更优良。

[实施例3：IFN-β启动子活化]

将HEK293细胞(8×10⁵细胞/孔)接种到6孔培养板中。使用Lipofectamine2000(Invitrogen)，将人TLR3表达载体(400ng/孔)或空载体(400ng/孔)与报告质粒p-125(400ng/孔)和作为内部对照载体的phRL-TK(20ng/孔、Promega)共同转染到HEK293细胞中。包含人IFN-β启动子(-125～+19)的报告质粒p-125由东京大学的谷口博士提供。培养基使用含有10％热灭活胎牛血清(FCS、Invitrogen)和抗生素的杜氏改良伊格尔培养基(DMEM、Invitrogen)。

自转染起24小时后回收细胞，重悬于培养基中并接种到96孔培养板中。在下述条件下添加cM362-140、cM362-139、多聚IC(Amersham)或cM362-140的双链RNA部分(dsRNA140)，使核酸浓度为10μg/mL。

(A)向表达人TLR3的HEK293细胞的培养基中直接添加核酸

(B)向表达人TLR3的HEK293细胞的培养基中添加核酸和DOTAP脂质体型转染试剂(Roche)

(C)向HEK293细胞的培养基中添加核酸和Lipofectamine2000(Invitrogen)

荧光素酶活性的测定使用双萤光素酶报告基因检测系统(Promega)。上述(A)和(B)在核酸添加起6小时后进行荧光素酶活性的测定，上述(C)在核酸添加起24小时后进行荧光素酶活性的测定。

将结果示于图5。左边为上述(A)的结果，中央为上述(B)的结果，右边为上述(C)的结果。数据以n＝3的平均值和标准偏差来表示。在向表达人TLR3的HEK293细胞外(培养基中)单纯添加cM362-140的情况(A)下和将cM362-140递送至表达人TLR3的HEK293细胞的内体的情况(B)下，cM362-140均与cM362-139同样地有效活化了IFN-β启动子(图5左边和中央)。另一方面，在将cM362-140递送至不表达人TLR3的HEK293细胞的细胞质的情况(C)下，未使IFN-β启动子活化。该结果显示，cM362-140通过TLR3使IFN-β启动子活化，不诱导其他RNA/DNA传感器介导的IFN-β启动子活化。

[实施例4：体外细胞因子产生诱导]

从C57BL/6J小鼠(野生型：WT)和TLR3敲除小鼠(TLR3KO、由大阪大学的审良博士提供)分别摘取脾脏，进行胶原酶处理。从过滤器中通过并使其溶血后，用培养基进行清洗，利用使用了抗CD11c微珠的MACS系统(miltenyi biotech)分离出CD11c阳性细胞，作为脾脏DC。培养基使用含有10％热灭活胎牛血清(FCS、Invitrogen)和抗生素的杜氏改良伊格尔培养基(DMEM、Invitrogen)。需要说明的是，本说明书中记载的全部动物实验按照北海道大学动物实验委员会制订的指南来实施。

将脾脏DC以5×10⁵个/500μL培养基/孔分注到24孔板中，(A)单独、(B)与DOTAP脂质体型转染试剂(Roche)一同、或(C)与Lipofectamine2000(Invitrogen)一同添加核酸(cM362-140、cM362-139、多聚IC或dsRNA140)20μg/mL，培养24小时。24小时后，回收培养上清，测定TNF-α、IL-6和IFN-β的产生量。TNF-α和IL-6的测定使用BD CBA Flex Set系统。IFN-β的测定使用小鼠IFN-β用ELISA试剂盒(PBL Assay Science)。

将结果示于图6。左列为(A)向培养基中单独添加核酸的情况，中央列为(B)向培养基中添加核酸和DOTAP脂质体型转染试剂的情况，右列为(C)向培养基中添加核酸和Lipofectamine2000的情况，上部为TNF-α、中部为IL-6、下部为IFN-β。数据以独立的3次试验的平均值和标准偏差来表示。由左列的结果可知，通过单独向脾脏DC的细胞外添加cM362-140，在野生型小鼠来源的脾脏DC中，TNF-α、IL-6和IFN-β的产生稍有增加。作为对照，由中央列的结果可知，使用DOTAP脂质体型转染试剂将cM362-140递送至内体时，在野生型小鼠来源的脾脏DC中，TNF-α、IL-6和IFN-β的产生量增加。另一方面，由右列的结果可知，在使用Lipofectamine2000将cM362-140递送至细胞质的情况下，与递送至内体的情况相比，TNF-α、IL-6和IFN-β的产生量减少。在任意一种情况下，在TLR3KO小鼠的脾脏DC中均未观察到由cM362-140引起的细胞因子产生。由这些结果显示，cM362-140以内体的TLR3为标靶而不以细胞质的RNA/DNA传感器为标靶。

[实施例5：体内细胞因子产生诱导]

对野生型C57BL/6J小鼠(9周龄、雌性)或TLR3KO小鼠(9周龄、雌性)腹腔内给药50μg的cM362-140、cM362-139或多聚IC。每一组使用3只小鼠。各核酸溶液使用无RNA酶的水进行制备。在核酸给药后、第1小时、第3小时和第6小时从尾静脉采血，测定血清中的TNF-α、IL-6和IL-10。测定使用BD CBA Flex Set系统。

将结果示于图7。左列为多聚IC的结果，中央列为cM362-139的结果，右列为cM362-140的结果，上部为TNF-α的结果，中部为IL-6的结果，下部为IL-10的结果。数据以n＝3的平均值±SE来表示。由图7表明，与多聚IC相比，cM362-140的体内细胞因子产生量显著少。由该结果认为，cM362-140在给药于生物体时不存在细胞因子风暴等副作用担忧，安全性高。

[实施例6：抗原特异性的CTL的诱导]

(1)肿瘤萎缩效果

将C57BL/6J小鼠的背部剃毛，向皮下移植2×10⁶细胞/200μL(PBS)的EG7细胞(使来源于C57BL/6小鼠的胸腺种的EL4细胞表达卵清蛋白抗原而得到的癌细胞)而形成肿瘤，经时测定肿瘤体积(cm³)(长径×短径²×0.4)。在移植后第8天(肿瘤体积：约0.6cm³)，向肿瘤周边的皮下单独给药cM362-140、单独给药OVA或给药cM362-140+OVA。作为对照，同样地仅给药PBS(-)。每一组使用4只小鼠。cM362-140的用量设定为50μg，OVA的用量设定为100μg，均溶解于PBS(-)中进行制备。给药容量设定为50μL。在第一次给药起7天后(移植后第15天)进行第二次给药。OVA使用无内毒素的OVA(Hyglos)。

将结果示于图8。在cM362-140单独给药组中肿瘤几乎未萎缩，而在cM362-140+OVA给药组中肿瘤显著萎缩(*：p<0.05)。需要说明的是，数据以平均值±SE表示，统计分析使用单因素方差分析和Bonferroni检验。

(2)四聚体检测

为了评价cM362-140的佐剂活性，从EG7荷瘤小鼠制备脾脏细胞，进行了四聚体检测。在上述(1)中，在PBS、cM362-140单独、OVA单独或cM362-140+OVA的第二次给药起7天后(移植后第22天)，按照常规方法制备脾脏细胞。利用FITC-CD8α(BioLegend)、PerCP/Cy5.5-7AAD(BD Biosciences)、APC-CD3ε(BioLegend)和PE-OVA-四聚体(MBL)对所得到的脾脏细胞进行染色，检测OVA特异性的CD8阳性T细胞(四聚体⁺/CD8⁺/CD3⁺细胞)，求出其比例。

将结果示于图9。由图9表明，cM362-140+OVA给药组与其他组相比脾脏细胞中的OVA特异性的CD8阳性T细胞的比例显著增加(**：p<0.01)。需要说明的是，统计分析使用单因素方差分析和Bonferroni检验。

(3)IFN-γ产生

将上述(2)中制备的脾脏细胞(2×10⁶细胞/200μL/孔)接种到96孔培养板中，在OVA肽(SL8)100nM存在下培养3天后，使用BD CBA Flex Set系统测定培养上清中的IFN-γ量。

将结果示于图10。由图10表明，cM362-140+OVA给药组与其他组相比脾脏细胞的IFN-γ产生量显著增加(**：p<0.01)。需要说明的是，数据以平均值±SE表示，统计分析使用单因素方差分析和Bonferroni检验。

(4)小结

由实施例6的各结果表明，cM362-140诱导抗原特异性的细胞杀伤性T细胞的增殖和活化，通过与癌抗原并用，发挥出优良的佐剂效果。

[实施例7：由NK细胞的活化导致的肿瘤萎缩效果]

使用C57BL/6-B16同系NK敏感性肿瘤移植模型(Akazawa T.,T.Ebihara,M.Okuno,Y.Okuda,K.Tsujimura,T.Takahashi,M.Ikawa,M.Okabe,T.Ebihara,M,Shingai,N.Inoue,M.Tanaka-Okamoto,H.Ishizaki,J.Miyoshi,M.Matsumoto,and T.Seya.2007.AntitumorNK activation induced by the Toll-like receptor3-TICAM-1(TRIF)pathway inmyeloid dendritic cells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.104:252-257.)，对由NK细胞的活化导致的移植癌的萎缩效果进行评价。将C57BL/6J小鼠(野生型：WT)和TICAM-1敲除小鼠(TICAM-1KO、由发明人制作)的背部剃毛，向皮下移植6×10⁵细胞/200μL(PBS)的B16黑色素瘤细胞(B16D8)而形成肿瘤，经时测定肿瘤体积(cm³)(长径×短径²×0.4)。在移植后第12天，向肿瘤周边的皮下给药与in vivo-JetPEI混合的150μg的cM362-140或蒸馏水(DW)。每一组使用3只小鼠。

将结果示于图11。左边为野生型小鼠的结果，右边为TICAM-1KO小鼠的结果。由图11表明，cM362-140在野生型小鼠中与蒸馏水(DW)给药相比显示出显著的肿瘤萎缩效果，但在TICAM-1KO小鼠中未显示出肿瘤萎缩效果。由该结果显示，本发明的核酸在TICAM-1介导的信号转导中发挥效果。

需要说明的是，本发明并不限定于上述各实施方式和实施例，可以在权利要求所示的范围内进行各种变更，将不同实施方式中分别公开的技术手段适当组合而得到的实施方式也包含在本发明的技术范围内。另外，本说明书中记载的学术文献和专利文献全部作为参考援用于本说明书中。

序列表

<110>

国立大学法人北海道大学（National University Corporation HokkaidoUniversity）

<120> 佐剂组合物（Adjuvant Compositions）

<130> H30F5479

<150> JP 2014-244421

<151> 2014-12-02

<160> 22

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 140

<212> RNA

<213> Measles virus

<400> 1

accagacaaa gcugggaaua gaaacuucgu auuuucaaag uuuucuuuaa uauauugcaa 60

auaaugccua accaccuagg gcaggauuag gguuccggag uucaaccaau uaguccuuaa 120

ucagggcacu guauccgacu 140

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic DNA

<400> 2

tgctgctgct tgcaagcagc ttgat 25

<210> 3

<211> 165

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> DNA/RNA chimeric molecule for cM362-140

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(165)

<223> RNA

<400> 3

tgctgctgct tgcaagcagc ttgataccag acaaagcugg gaauagaaac uucguauuuu 60

caaaguuuuc uuuaauauau ugcaaauaau gccuaaccac cuagggcagg auuaggguuc 120

cggaguucaa ccaauuaguc cuuaaucagg gcacuguauc cgacu 165

<210> 4

<211> 140

<212> RNA

<213> Measles virus

<400> 4

agucggauac agugcccuga uuaaggacua auugguugaa cuccggaacc cuaauccugc 60

ccuagguggu uaggcauuau uugcaauaua uuaaagaaaa cuuugaaaau acgaaguuuc 120

uauucccagc uuugucuggu 140

<210> 5

<211> 1152

<212> RNA

<213> Measles virus

<400> 5

accagacaaa gcugggaaua gaaacuucgu auuuucaaag uuuucuuuaa uauauugcaa 60

auaaugccua accaccuagg gcaggauuag gguuccggag uucaaccaau uaguccuuaa 120

ucagggcacu guauccgacu aacuugccua acaaagauac uauagagaag cuagaggaau 180

uggcagccau cuuaucgaug gcucugcucc ugggcaaaau aggaucaaua cuggugauua 240

agcuuaugcc uuucagcggg gauuuuguuc agggauuuau aaguuaugua gggucucauu 300

auagagaagu gaaccuugua uacccuagau acagcaacuu cauaucuacu gaaucuuauu 360

ugguuaugac agaucucaag gcuaaccggc uaaugaaucc ugaaaagauu aagcagcaga 420

uaauugaauc aucugugagg acuucaccug gacuuauagg ucacauccua uccauuaagc 480

aacuaagcug cauacaagca auugugggag acgcaguuag uagaggugau aucaauccua 540

cucugaaaaa acuuacaccu auagagcagg ugcugaucaa uugcggguug gcaauuaacg 600

gaccuaagcu gugcaaagaa uugauccacc augauguugc cucagggcaa gauggauugc 660

uuaauucuau acucauccuc uacagggagu uggcaagauu caaagacaac caaagaaguc 720

aacaagggau guuccacgcu uaccccguau ugguaaguag caggcaacga gaacuuauau 780

cuaggaucac ccgcaaauuu ugggggcaca uucuucuuua cuccgggaac agaaaguuga 840

uaaauaaguu uauccagaau cucaaguccg gcuaucugau acuagacuua caccagaaua 900

ucuucguuaa gaaucuaucc aagucagaga aacagauuau uaugacgggg gguuugaaac 960

gugagugggu uuuuaaggua acagucaagg agaccaaaga augguauaag uuagucggau 1020

acagugcccu gauuaaggac uaauugguug aacuccggaa cccuaauccu gcccuaggug 1080

guuaggcauu auuugcaaua uauuaaagaa aacuuugaaa auacgaaguu ucuauuccca 1140

gcuuugucug gu 1152

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> DNA/RNA chimeric molecule for cM362-140

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(39)

<223> RNA

<400> 6

tgctgctgct tgcaagcagc ttgataccag acaaagcug 39

<210> 7

<211> 60

<212> RNA

<213> Measles virus

<400> 7

ggaauagaaa cuucguauuu ucaaaguuuu cuuuaauaua uugcaaauaa ugccuaacca 60

<210> 8

<211> 66

<212> RNA

<213> Measles virus

<400> 8

ccuagggcag gauuaggguu ccggaguuca accaauuagu ccuuaaucag ggcacuguau 60

ccgacu 66

<210> 9

<211> 52

<212> RNA

<213> Measles virus

<400> 9

agucggauac agugcccuga uuaaggacua auugguugaa cuccggaacc cu 52

<210> 10

<211> 40

<212> RNA

<213> Measles virus

<400> 10

aauccugccc uaggugguua ggcauuauuu gcaauauauu 40

<210> 11

<211> 48

<212> RNA

<213> Measles virus

<400> 11

aaagaaaacu uugaaaauac gaaguuucua uucccagcuu ugucuggu 48

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> splint DNA

<400> 12

cgaagtttct attcccagct ttgtctggta 30

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> splint DNA

<400> 13

taatcctgcc ctaggtggtt aggcattatt 30

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> splint DNA

<400> 14

acctagggca ggattagggt tccggagttc 30

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> splint DNA

<400> 15

ttcaaagttt tctttaatat attgcaaata 30

<210> 16

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic DNA for cM362-139

<400> 16

tgctgctgct tgcaagcagc ttgataccgt ggtcatgctc c 41

<210> 17

<211> 139

<212> RNA

<213> Artificial

<220>

<223> in vitro transcriptional RNA for cM362-139

<400> 17

gggaccagac aaagcuggga auagaaacuu cguauuuuca aaguuuucuu uaauauauug 60

caaauaaugc cuaaccaccu agggcaggau uaggguuccg gaguucaacc aauuaguccu 120

uaaucagggc acuguaucc 139

<210> 18

<211> 154

<212> RNA

<213> Artificial

<220>

<223> in vitro transcriptional RNA for cM362-139

<400> 18

ggauacagug cccugauuaa ggacuaauug guugaacucc ggaacccuaa uccugcccua 60

ggugguuagg cauuauuugc aauauauuaa agaaaacuuu gaaaauacga aguuucuauu 120

cccagcuuug ucuggucccg gagcaugacc acgg 154

<210> 19

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 19

tgtaatacga ctcactatag ggaccagaca aagctggga 39

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 20

ggatacagtg ccctgattaa 20

<210> 21

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 21

tgtaatacga ctcactatag gatacagtgc cctgattaa 39

<210> 22

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 22

ccgtggtcat gctccgggac cagacaaagc tggga 35

Claims

1.一种佐剂组合物，其特征在于，含有由包含序列编号3所示的碱基序列的单链核酸A和序列编号4所示的单链核酸B形成的双链核酸。

2.如权利要求1所述的佐剂组合物，其特征在于，单链核酸A和单链核酸B均为化学合成核酸。

3.如权利要求1或2所述的佐剂组合物，其特征在于，单链核酸A和单链核酸B是通过连接反应将化学合成的多个片段连接而制作的。

4.如权利要求1～3中任一项所述的佐剂组合物，其特征在于，单链核酸A和单链核酸B的任意末端均未结合磷酸基。

5.如权利要求1～4中任一项所述的佐剂组合物，其特征在于，构成单链DNA的核苷酸全部进行了硫代磷酸化修饰。

6.一种疫苗组合物，其含有权利要求1～5中任一项所述的佐剂组合物和抗原或抗原性成分。

7.如权利要求6所述的疫苗组合物，其中，所述抗原为癌抗原。