CN106998666A - 低或无饱和脂肪酸的转基因卡诺拉 - Google Patents

Abstract

组合物和方法包括在植物细胞中遗传编码并表达一种新的Δ‑9去饱和酶。在一些实施方案中，在植物细胞中表达核酸的方法利用该Δ‑9去饱和酶的活性，使得植物种子中饱和脂肪酸的百分比组成降低，并且同时有？9脂肪酸的增加。在其他实施方案中，氨基酸序列具有Δ‑9去饱和酶活性。方法可涉及在植物细胞、植物材料和全植物中表达Δ‑9去饱和酶，用于增加全植物、植物种子和植物材料例如种子中单不饱和脂肪酸的量的目的。

Description

低或无饱和脂肪酸的转基因卡诺拉

技术领域

一些实施方案通常涉及某些Δ-9去饱和酶，编码这些酶的核酸，以及在植物细胞中表达该酶的方法。一些实施方案涉及利用某些Δ-9去饱和酶的活性降低植物材料(例如种子)中饱和脂肪酸的组成百分比，并增加ω-7脂肪酸的组成百分比。另外的实施方案涉及利用种子特异性启动子优先在种子中表达Δ-9去饱和酶。本文还公开了通过特定实施方案中的方法制备的植物和植物材料，以及由那些含有小于3.5％或小于2.7％的饱和脂肪酸的植物产生的油。

背景

植物源油(vegetable-derived oils)已逐渐取代了动物来源的油脂作为饮食脂肪摄入的主要来源。然而，大多数工业化国家的饱和脂肪摄入量仍然保持在总热量消耗的15％至20％左右。为了推广更健康的生活方式，美国农业部(USDA)最近建议，饱和脂肪含量低于每日热量摄入量的10％。为了促进消费者意识，美国农业部颁布的现行标注指南现在要求总饱和脂肪酸水平低于每14克1.0克方可获得“低饱和”标注，低于每14克0.5克方可获得“无饱和”标注。这意味着植物油要获得“低饱和”或“无饱和”标注，饱和脂肪酸含量需要分别低于7％和3.5％。自从这些指南发布以来，消费者对“低饱和”和“无饱和”油的需求激增。到目前为止，这一需求主要是由卡诺拉油来满足的，葵花油和红花油也有贡献，但小得多。

虽然不饱和脂肪(单不饱和及多不饱和)是有益的(特别是在适度消费时)，但饱和脂肪和反式脂肪不是。饱和脂肪和反式脂肪会增加血液中不想要的低密度脂蛋白胆固醇水平。膳食胆固醇即使在不提高低密度脂蛋白的情况下也会增加低密度脂蛋白胆固醇，并可能导致心脏病。因此，建议选择低饱和脂肪、低反式脂肪和低胆固醇食物作为健康饮食的一部分。

油，无论是植物还是动物来源，其特征主要由油分子中的碳原子数和氢原子数以及脂肪酸链中包含的双键的数量和位置决定。大多数来自植物的油是由不同量的棕榈酸(16:0)，硬脂酸(18:0)，油酸(18:1)，亚油酸(18:2)和亚麻酸(18:3)脂肪酸组成的。通常，棕榈酸和硬脂酸被称为“饱和的”，因为它们的碳链被氢原子饱和，因此没有双键；它们含有最大可能数量的氢原子。然而，油酸，亚油酸和亚麻酸分别是具有一个、两个和三个双键的18碳脂肪酸链。油酸通常被认为是单不饱和脂肪酸，而亚油酸和亚麻酸被认为是多不饱和脂肪酸。美国农业部“无饱和”油产品的定义(意思是具有小于3.5％饱和脂肪酸含量的油产品)以组合的饱和脂肪酸重量含量(与脂肪酸总量相比)计算。

卡诺拉油的饱和脂肪酸水平是所有植物油中最低的。“卡诺拉”是指这样的油菜(芸苔属)，其芥子酸(C22:1)含量为至多2重量％，基于种子的总脂肪酸含量(优选至多0.5重量％，最优选基本上为0重量％)，并在破碎后产生在脱脂(无油)粕中含有少于30μmol/g硫代葡萄糖苷的风干粕。这些类型的油菜与该物种的传统品种相比具有优异的可食性。

据推测，在油用种子中，脂肪酸合成主要发生在质体中。脂肪酸合成的主要产物是棕榈酸(16:0)，其似乎被高效地延伸成为硬脂酸(18:0)。然后，当其还在质体中时，饱和脂肪酸可以被一种称为酰基-ACPΔ-9去饱和酶的酶去饱和，从而引入一个或多个碳-碳双键。具体来说，硬脂酸可以被质体Δ-9去饱和酶快速去饱和而产生油酸(18:1)。事实上，棕榈酸也可以被质体Δ-9去饱和酶去饱和而成为棕榈油酸(16:1)，但在大多数植物油中，这种脂肪酸仅微量存在(0-0.2％)。因此，质体中的脂肪酸合成的主要产物是棕榈酸、硬脂酸和油酸。在大多数油中，油酸是合成的主要脂肪酸，因为饱和脂肪酸以低得多的比例存在。

新合成的脂肪酸从质体转运到细胞质。随后在细胞质中去饱和的植物脂肪酸似乎限于油酸，其可以通过作用于酯化至磷脂酰胆碱(PC)的油酰基或线基油基底物上的微粒体去饱和酶而被去饱和至亚油酸(18:2)和亚麻酸(18:3)。此外，依植物不同，可以通过延伸(至20:1、22:1和/或24:1)或通过添加官能团进一步修饰油酸。然后这些脂肪酸，与棕榈酸和硬脂酸等饱和脂肪酸一起，在内质网膜中被组装成甘油三酯。

植物酰基-ACPΔ-9去饱和酶是可溶的。它位于质体基质中，并使用被酯化到ACP的新合成的脂肪酸，主要是硬脂酰-ACP，作为底物。这与其他Δ-9去饱和酶形成对照：其他Δ-9去饱和酶位于内质网膜(ER或微粒体)中，使用被酯化到Co-A的脂肪酸作为底物，并使棕榈酸和硬脂酸等两种饱和脂肪酸均饱和。美国专利5,723,595和6,706,950涉及植物去饱和酶。

酵母Δ-9去饱和酶基因已经从酿酒酵母中分离、克隆并测序。Stukey et al.(1989)J.Biol.Chem.264:16537-44；Stukey et al.(1990)J.Biol.Chem.265:20144-9。该酵母基因已被引入烟草叶组织(Polashcok et al.(1991)FASEB J.5:A1157；Polashok etal.(1992)Plant Physiol.100:894-901)中，并且似乎在该组织中表达。此外，在番茄中表达了该酵母基因。参见Wang et al.(1996)J.Agric.Food Chem.44:3399-402；和Wang etal.(2001)Phytochemistry 58:227-32。尽管在烟草和番茄中使用这种酵母Δ-9去饱和酶基因都报告了某些不饱和脂肪酸的某些增加以及某些饱和脂肪酸的某些降低，但烟草和番茄显然不是油料作物。此酵母基因也已被引入欧洲油菜。美国专利5,777,201。

另一种不同的真菌酰基辅酶A Δ-9去饱和酶，来自构巢曲霉，已经被引入到卡诺拉中，在种子油中实现了降低的饱和脂肪酸水平。美国专利申请公开US 2008/0260933 A1。构巢曲霉酰基辅酶A Δ-9去饱和酶对硬脂酸酯的消耗(61-90％)比对更富的棕榈酸脂肪酸的消耗(36-49％)更多。

公开

本文公开了新型真菌Δ-9去饱和酶；包含至少一个编码此类去饱和酶的核苷酸序列的核酸；包含上述任何一种的植物、植物材料(例如种子)、植物部分和植物商品。一些实施方案的方面的例子是从灰色大角间座壳(Magnaporthe grisea)，颖枯小球腔菌(Leptosphaeria nodorum)和美洲棉铃虫(Helicoverpa zea)分离的真菌Δ-9去饱和酶。一些实例包括对棕榈酸或硬脂酸具有底物偏好的天然和合成的Δ-9去饱和酶。

一些实施方案包括编码Δ-9去饱和酶的分离的核酸分子，其包含与选自SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的序列至少80％相同的氨基酸序列。在具体实例中，核酸分子包含与选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25至少60％相同的序列。这些实施方案和进一步的实施方案可以包括分离的Δ-9去饱和酶多肽，其包含与选自SEQID NO:1、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的序列至少80％相同的氨基酸序列。

还公开了在植物细胞中表达上述核酸和/或多肽中的至少一种的方法。特定的实施方案利用Δ-9去饱和酶的活性，使得在包含所述植物细胞的植物、植物材料(例如种子)和/或植物部分、和/或由上述任何一种生产的植物商业产品中的饱和脂肪酸的组成百分比可以降低。在某些实施方案中，所述植物、植物材料、植物部分和/或植物商业产品中的ω-7脂肪酸可以同时增加。另外的实施方案利用种子特异性表达来进一步降低种子油中饱和脂肪酸的水平。

一些实施方案包括减少植物，植物材料，植物部分和/或植物商业产品的饱和脂肪酸的量的方法，所述方法包括用编码Δ-9去饱和酶多肽的核酸分子转化植物细胞本发明使得该细胞中的饱和脂肪酸的量减少。一些实施方案包括用于产生基因工程化植物的方法，所述植物与相同物种的野生型植物相比在该植物中包含减少量的饱和脂肪酸。这样的方法可以包括用编码一种或多种Δ-9去饱和酶多肽的核酸分子或本发明的Δ-9去饱和酶多肽的一个或多个拷贝转化植物材料(或植物细胞)，并培养转化的植物材料(或植物细胞)获得植物。在具体实例中，可以用编码本发明的Δ-9去饱和酶多肽的核酸分子转化来自拟南芥属物种的植物细胞和/或植物材料。在其它具体实例中，可以转化Δ-9去饱和酶基因的两个或更多个拷贝，其中每个Δ-9去饱和酶基因由一个不同的启动子控制。在其它具体实例中，所述两个或更多个启动子是种子特异性启动子。

从以下参考附图进行的几个实施例的详细描述，上述和其它特征将变得更加清晰。

附图说明

图1显示pDAB7305的质粒图谱。

图2示出了与NEXERA 710^TM卡诺拉对照植物和由218-11.30HL转基因卡诺拉植物组成的阳性对照植物相比，分离的T₁卡诺拉植物的大批T₂种子中TSFA(％)的分布。

图3显示了与阴性对照NEXERA 710^TM卡诺拉植物相比，来自三个选择的转基因事件的T₂种子群体中TSFA的分布。暗点代表TSFA低于3.5％的种子后代(暗线)。如图所示，TSFA低于3.5％的植物产生不同量的产量，并且具有2至10个拷贝的pat转基因，这些转基因包含在与AnD9DS转基因相同的T链整合体中。

图4示出了卡诺拉单一种子中的TSFA分布和饱和脂肪酸百分比(野生型对照植物被排除，以便该图表示转基因卡诺拉事件的TSFA值)。

序列表

使用37C.F.R.§1.822中定义的核苷酸碱基的标准字母缩写表示所附序列表中列出的核酸序列。仅显示每个核酸序列的一条链，但互补链被理解为通过任何提及所显示的链包括。在随附的序列表中：

SEQ ID NO:1显示构巢曲霉酰基辅酶A Δ-9去饱和酶(在某些地方称为AnD9DS)蛋白质的氨基酸序列。

SEQ ID NO:2显示了构巢曲霉酰基辅酶A Δ-9去饱和酶基因(在某些地方称为AnD9DS)的v3的核酸序列。

SEQ ID NO:3显示pDAB7305的第一植物转录单位(PTU)的核酸序列。

SEQ ID NO:4显示pDAB7305的第二PTU的核酸序列。

SEQ ID NO:5显示pDAB7305的第三PTU的核酸序列。

SEQ ID NO:6-11显示了在一些实施方案中可能有用的引物和探针的序列。

SEQ ID NO:12是通过PCR扩增的灰色大角间座壳酰基辅酶A Δ-9去饱和酶基因(在一些地方称为MgD9DS)的示例性片段。

SEQ ID NO:13是示例性的无内含子MgD9DS克隆。

SEQ ID NO:14显示了编码第一种颖枯小球腔菌酰基辅酶A Δ-9去饱和酶(在一些地方称为LnD9DS-1)的示例性核酸序列。

SEQ ID NO:15显示了编码第二种颖枯小球腔菌酰基辅酶A Δ-9去饱和酶(在一些地方称为LnD9DS-2)的示例性核酸序列。

SEQ ID NO:16显示了来自灰色大角间座壳的示例性天然Δ-9去饱和酶基因(标记为MgD9DS v1)的编码区。

SEQ ID NO:17显示了来自美洲棉铃虫的示例性天然Δ-9去饱和酶基因(标记为HzD9DS v1)的编码区。

SEQ ID NO:18显示了来自颖枯小球腔菌的示例性天然Δ-9去饱和酶(LnD9DS-2v1)基因的编码区。

SEQ ID NO:19显示了来自灰色大角间座壳(MgD9DS v2)的示例性卡诺拉优化的Δ-9去饱和酶基因的序列。

SEQ ID NO:20显示了来自美洲棉铃虫的示例性卡诺拉优化的Δ-9去饱和酶基因(HzD9DS v2)的序列。

SEQ ID NO:21显示了来自颖枯小球腔菌的示例性卡诺拉优化的Δ-9去饱和酶基因(LnD9DS-2v2)的序列。

SEQ ID NO:22显示了来自颖枯小球腔菌的另一示例性卡诺拉优化的Δ-9去饱和酶基因(LnD9DS-2v3)的序列。

SEQ ID NO:23显示了来自美洲棉铃虫的另一示例性的卡诺拉优化的Δ-9去饱和酶基因(HzD9DS v3)的序列。

SEQ ID NO:24显示了一种编码构巢曲霉Δ-9去饱和酶的示例性核酸序列(在一些地方称为AnD9DS v2)。

SEQ ID NO:25显示了第二种编码构巢曲霉Δ-9去饱和酶的示例性核酸序列(在一些地方称为AnD9DS v3)。

SEQ ID NO:26显示了来自灰色大角间座壳(MgD9DS)的示例性天然Δ-9去饱和酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO:27显示了来自美洲棉铃虫的示例性天然Δ-9去饱和酶(HzD9DS)的氨基酸序列。

SEQ ID NO:28显示了来自颖枯小球腔菌的示例性天然Δ-9去饱和酶(LnD9DS-2)的氨基酸序列。

SEQ ID NO:29显示了由SEQ ID NO:24-25(AnD9DS)所例示的核酸编码的氨基酸序列。

SEQ ID NO:30显示另一示例性AnD9DS去饱和酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO:31显示来自酿酒酵母的示例性天然Δ-9去饱和酶(ScOLE1)的氨基酸序列。

SEQ ID NO:32显示了示例性AnD9DS去饱和酶的N-末端68个残基(1-68)。

SEQ ID NO:33显示了示例性AnD9DS去饱和酶的C末端175个残基(281-455)。

具体实施方式(S)

I.几个实施例的概述

我们以前将来自构巢曲霉的真菌酰基辅酶AΔ-9去饱和酶引入油菜籽，从而在种子油中实现降低的饱和脂肪酸水平。美国专利申请公开US2008/0260933A1。构巢曲霉Δ-9去饱和酶提供的硬脂酸耗竭(61-90％)比种子油中更丰富的棕榈酸脂肪酸的耗竭(36-49％)更多。已经发现，提供多个拷贝的构巢曲霉Δ-9去饱和酶能够将卡诺拉中的饱和脂肪酸水平降低到3.5％以下。

本文公开了编码Δ-9去饱和酶多肽的核酸分子，其包含与选自SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25的序列至少60％相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸分子还可以包含可操作地连接到Δ-9去饱和酶多肽编码序列的基因调节元件。在特定实施方案中，基因调节元件可以是菜豆蛋白启动子、菜豆蛋白5'非翻译区、菜豆蛋白3'非翻译区(“UTR”)、根癌土壤杆菌ORF1 3'非翻译区、木薯叶脉花叶病毒启动子、烟草RB7基质附着区、T链边界序列、LfKCS3启动子和FAE 1启动子。

在一些实施方案中，可以存在编码Δ-9去饱和酶多肽的核酸分子的几个拷贝，并且每个拷贝可能处于一组不同的调节元件的调节控制之下。更具体地说，基因调节元件可以是菜豆蛋白启动子和菜豆蛋白5'UTR，和Lesquerella fenderi LfKCS3启动子，从而有两个拷贝的AND9DS存在，一个拷贝由菜豆蛋白启动子和5'UTR控制，第二个拷贝由LfKCS3启动子控制。在其它实施方案中，编码Δ-9去饱和酶多肽(或多个Δ-9去饱和酶多肽)的核酸的几个拷贝可以在其他调节元件的控制下，包括酿酒酵母Δ-9去饱和酶启动子、Δ-9去饱和酶3'UTR/终止子、ole1基因启动子、菜豆菜豆蛋白3'非翻译区、菜豆菜豆蛋白基质附着区，根癌土壤杆菌甘露氨酸合酶启动子，根癌土壤杆菌ORF23 3'非翻译区，木薯叶脉花叶病毒启动子、根癌土壤杆菌ORF1 3'非翻译区、烟草RB7基质附着区，过驱动(Overdrive)、T-链边界序列、LfKCS3启动子、FAE 1启动子、Myc标签和血凝素标签。

还公开了包含与选自SEQ ID NO:1的序列至少80％相同的氨基酸序列的Δ-9去饱和酶多肽以及编码这种Δ-9去饱和酶多肽的核酸分子，例如SEQ ID NO:2。

在一些实施方案中，核酸分子和Δ-9去饱和酶多肽可以在植物材料、细胞、组织或整个植物中表达，以减少植物材料、细胞、组织或整个植物中的饱和脂肪酸的量(相对于在同一物种的野生型植物中观察到的量)。本发明的替代实施方案包括减少植物材料、细胞、组织或整个植物中的饱和脂肪酸的量的方法。这样的方法可以包括用至少一种上述的核酸分子转化植物材料、细胞、组织或整个植物，使得植物材料、细胞、组织或整个植物中的饱和脂肪酸的量减少。具体实施方案包括用于优先降低植物材料，细胞，组织或整个植物中的棕榈酸和/或硬脂酸的方法。

本文公开的方法可以例如在植物或源自植物(例如拟南芥属植物或卡诺拉)的植物材料中进行。一个具体实施方案涉及用于产生或再生基因工程植物的方法，所述植物与相同物种的野生型植物相比在植物中包含减少量的饱和脂肪酸，所述方法包括用至少一种上述核酸分子转化植物细胞或材料的；并培养经转化的植物材料以获得植物。还公开了通过任何上述方法获得的植物、植物材料、植物细胞和种子。

II.缩写

x:yΔ^z 含有x个碳原子和位于自羧基端数起第z位的y个双键的脂肪酸

ACP 酰基载体蛋白

CoA 辅酶A

FA 脂肪酸

FAS 脂肪酶合酶

FAME 脂肪酸甲酯

KASII β-酮脂酰-ACP合酶II

MUFA 单不饱和脂肪酸

PUFA 多不饱和脂肪酸

WT 野生型

III.术语

脂肪酸：如本文中使用的，术语“脂肪酸”指例如从约C12至C22的不同链长的长链脂肪族酸(链烷酸)，尽管更长和更短链长的酸两者是已知的。脂肪酸的结构以符号x:yΔ^z表示，其中“x”是特定脂肪酸中碳(C)原子的总数，且“y”是碳链中如从该酸的羧基端开始数起的第“z”位中的双键数目。

代谢途径：术语“代谢途径”指细胞内存在的、由酶催化以实现代谢产物转化或另一代谢途径启动的一系列化学反应。代谢途径可以牵涉几个或许多步骤，并且可以与不同代谢途径竞争特定反应底物。类似地，一种代谢途径的产物可以是又一代谢途径的底物。

代谢工程：出于本发明的目的，“代谢工程”指改变细胞中的一种或多种代谢途径，使得在细胞中运行的总代谢途径的总体方案内实现将初始底物逐步修饰为具有期望的精确化学结构的产物的理性策略设计。

去饱和酶：如本文中使用的，术语“去饱和酶”指可以在一种或多种脂肪酸中去饱和(即，引入双键)以生成感兴趣的脂肪酸或前体的多肽。植物可溶性脂肪酸去饱和酶酶可以将双键区域专一性引入饱和的酰基-ACP底物中。酰基-CoA去饱和酶将双键区域专一性引入饱和的脂肪酰基-CoA底物中。该反应牵涉通过由形成去饱和酶构造核心的四螺旋束配位的两电子还原性二铁中心活化分子氧。一些实施方案中特别感兴趣的是酰基-CoA delta-9去饱和酶。

delta-9-18:0¹-ACP去饱和酶是所有植物维持膜流动性需要的。虽然此酶主要使硬脂酰-ACP去饱和，但是它在棕榈酰-ACP的情况中也在微小的程度上有活性。

后代植物：为本发明的目的，“后代植物”指可以通过植物育种方法获得的任何植物，或自其获得的植物材料。植物育种方法是本领域中公知的，并且包括天然育种、人工育种、牵涉DNA分子标志分析的选择育种、转基因学、和商业育种。

植物材料：如本文中使用的，术语“植物材料”指自植物获得的任何细胞或组织。

核酸分子：核苷酸的聚合形式，其可以包括RNA的有义和反义链两者、cDNA、基因组DNA、和上述物质的合成形式和混合的聚合物。核苷酸指核糖核苷酸、脱氧核苷酸、或任一类核苷酸的经修饰形式。如本文中使用的，“核酸分子”与“核酸”和“多核苷酸”是同义的。该术语包括DNA的单链和双链形式。核酸分子可以包括通过天然存在的和/或非天然存在的核苷酸联接连接在一起的天然存在的和经修饰的核苷酸之任一或两者。

核酸分子可以经过化学或生物化学修饰，或者可以含有非天然的或衍生化的核苷酸碱基，如本领域普通技术人员容易领会的。此类修饰包括例如标记物、甲基化、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰，诸如不带电荷的连接(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯，等等)、带电荷的连接(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯，等等)、悬垂的模块(moiety)(例如，肽)、插入剂(例如，吖啶、补骨脂素，等等)、螯合剂、烷化剂(alkylator)、和经修饰的连接(例如，alpha异头核酸，等等)。术语“核酸分子”还包括任何拓扑学构象，包括单链、双链，部分双链体、三联体、发夹、环形和挂锁构象。

可操作连接的：当第一核酸序列在与第二核酸序列的功能性关系中时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作连接。例如，若启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列可操作连接。在重组生成时，可操作连接的核酸序列一般是连续的，且在必需连接两个蛋白质编码区时，在同一阅读框中。然而，核酸为了可操作连接不需要是连续的。

调节元件：如本文中使用的，术语“调节元件”指具有基因调节活性的核酸分子；即具有影响可操作连接的可转录核酸分子的转录或翻译的能力的核酸分子。调节元件诸如启动子、前导物、内含子和转录终止区是具有基因调节活性的非编码核酸分子，其在活细胞的总体基因表达中发挥不可或缺的作用。因此，在植物中发挥功能的分离的调节元件可用于经由分子工程化技术修饰植物表型。“调节元件”意指决定是否表达特定基因、何时表达特定基因、及以何种水平表达特定基因的一系列核苷酸。调节DNA序列与调节蛋白或其它蛋白质特异性相互作用。

如本文中使用的，术语“基因调节活性”指能够影响可操作连接的核酸分子的转录或翻译的核酸分子。具有基因调节活性的分离的核酸分子可以提供可操作连接的核酸分子的时间或空间表达或调控表达水平和速率。具有基因调节活性的分离的核酸分子可以包括启动子、内含子、前导物、或3’转录终止区。

启动子：如本文中使用的，术语“启动子”指牵涉RNA聚合酶II或其它蛋白质诸如转录因子(调节转录的反式作用蛋白因子)的识别和结合以启动可操作连接的基因转录的核酸分子。启动子可以自身含有招致可操作连接的基因转录的亚元件诸如顺式元件或者增强子域。“植物启动子”是在植物细胞中功能性的天然的或非天然的启动子。可以使用植物启动子作为5’调节元件以调控一种或多种可操作连接的基因表达。植物启动子可以以其时间、空间、或发育表达模式限定。本文中所描述的核酸分子可以包含含有启动子的核酸序列。

序列同一性：如本文中在两种核酸或多肽序列的背景中所使用的，术语“序列同一性”或“同一性”可以指两种序列中在规定的比较窗里为了实现最大对应性而比对时相同的残基。

两种核酸序列间或两种氨基酸序列间的相似性按照序列间共享的序列同一性水平表示。序列同一性通常按照百分比同一性表示；百分比越高，两种序列越相似。用于比对比较序列的方法在下文详细描述。

在提及蛋白质使用序列同一性百分比时，认可的是，不相同的残基位置经常相差保守的氨基酸取代，其中氨基酸残基用具有类似化学特性(例如，电荷、疏水性或空间效应)的其它氨基酸残基取代，并且因此不改变分子的功能特性。

因此，在序列相差保守取代时，百分比序列同一性可以向上调节以校正不相同残基位点处取代的保守性质。相差此类保守取代的序列被说成具有“序列相似性”或“相似性”。用于进行此调节的技术是本领域普通技术人员公知的。通常，此类技术牵涉将保守取代评分为部分的，而不是完全的匹配，由此增加百分比序列同一性。例如，在对相同的氨基酸给予0-1的得分，而对非保守取代给予0得分的情况中，对保守取代给予0-1的得分。可以计算保守取代的得分，例如如程序PC/GENE(Intelligenetics,Mountain View,CA)中执行的。

如本文中所使用的，术语“序列同一性百分比”可以指在比对窗里比较两个最佳比对序列时测定的数值，其中为了两个序列的最佳比对，比较窗中序列的部分与参照序列(其不包含添加或缺失)相比可以包含添加或缺失(即，缺口)。通过测定两个序列中存在相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置数目，将匹配位置的数目除以比较窗中位置的总数，并将结果乘以100以产生序列同一性百分比来计算百分比。

氨基酸序列中的类似位置：可以通过前述段落中所描述的方法比对核酸和氨基酸序列。在比对时，若各位置在共有序列内是相同的，则一个序列中的位置与比对序列中的位置在“类似位置”中。

用于比对比较序列的方法是本领域中公知的。各种程序和比对算法记载于：Smith和Waterman,Adv.Appl.math.2:482,1981；Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970；Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444,1988；Higgins和Sharp,Gene 73:237-44,1988；Higgins和Sharp,CABIOS 5:151-3,1989；Corpet等,Nucleic AcidsResearch 16:10881-10890,1988；Huang,等,Computer Applications in theBiosciences 8:155-65,1992；Pearson等,Methods in Molecular Biology 24:307-31,1994；Tatiana等,FEMS Microbiol.Lett.,174:247-50,1990.Altschul等,J.Mol.Biol.215:403-10,1990(关于序列比对方法和同源性计算的详细讨论)。

美国国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation,NCBI)基本局部比对搜索工具(BLAST)在因特网上可获得(于blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，其与序列分析程序，例如blastp和blastn结合使用。关于如何使用此程序测定序列同一性的描述在因特网上经由NCBI于blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？CMD＝Web&PAGE_TYPE＝BlastDocs可获得。

为了比较氨基酸序列，使用缺省参数采用BLAST程序的“Blast 2种序列(Blast2sequence)”功能(bl2seq)。特定参数可以在本领域技术人员的判断内调节，以例如提供错配罚分或匹配奖励。

经转化的：如本文中使用的，术语“经转化的”指已经接受外来核酸分子，诸如构建体导入的细胞、组织、器官、或生物体。可以将导入的核酸分子整合入接受细胞、组织、器官或生物体的基因组DNA中，使得导入的多核苷酸分子得到后续后代继承。“转基因”或“经转化”细胞或生物体还包括所述细胞或生物体的后代和自在例如杂交中采用此类转基因植物作为亲本的育种程序生成并展现出源自存在外来核酸分子的改变的表型的后代。

IV.减少宿主细胞、组织、或生物体中饱和脂肪酸的代谢工程方法

A.概述

本发明的一个实施方案包括在植物种子中引入具有特定酰基-CoA偏爱(例如，对于棕榈酸或硬脂酸)的delta-9去饱和酶。delta-9去饱和酶的特定酰基-CoA偏爱实现对某些特定饱和脂肪酸集合(例如，棕榈酸酯，用于转化成单不饱和产物)的靶向。选择酰基-CoAdelta-9去饱和酶来降低植物中的饱和脂肪酸含量，因为它们通常不以任何可察觉的程度在植物系统中生成。

B.多肽

依照本发明的一些实施方案的多肽包含如下的氨基酸序列，其在与选自下组的序列比对时显示增加的百分比同一性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33。这些和其它实施方案内的特定氨基酸序列可以包含与前述序列具有例如至少约70％,约75％,约80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％96％,97％,98％,99％或100％同一性的序列。在许多实施方案中，在与前述序列比对时具有前述序列同一性的氨基酸序列编码具有delta-9-18:0-ACP去饱和酶酶促活性的肽，或此类肽的部分。

C.核酸

一些实施方案包括编码上文所描述的多肽的核酸分子。例如，一些实施方案中的核酸序列在与选自下组的序列比对是显示增加的百分比同一性：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25。这些和其它实施方案内的特定核酸序列可以包含与选自下组的序列具有例如至少约60％,约65％,约70％,约75％,约80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％96％,97％,98％,99％或100％同一性的序列：SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQID NO:5,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:15,SEQ IDNO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:45,SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49。本领域普通技术人员理解的是，可以例如通过依照密码子简并性引入可允许的核苷酸取代在不实质性改变编码多肽的氨基酸序列的情况中修饰核酸分子。

在一些实施方案中，本发明的核酸分子包含基因调节元件(例如，启动子)。启动子可以基于会接受载体构建体插入的细胞类型选择。在细菌、酵母和植物中发挥功能的启动子是本领域中公知的。启动子也可以基于其调节特征进行选择。此类特征的例子包括增强转录活性、可诱导性、组织特异性、和发育阶段特异性。在植物中，已经描述了病毒或合成起源的诱导型、组成性活性、时间调节性、和空间调节性启动子。见例如Poszkowski等(1989)EMBO J.3:2719；Odell等(1985)Nature 313:810；及Chau等(1989)Science 244:174-81)。

有用的诱导型启动子包括例如由通过应用安全剂(取代的苯磺酰胺除草剂)诱导的水杨酸或聚丙烯酸诱导的启动子、热休克启动子、自菠菜硝酸盐还原酶可转录核酸分子序列衍生的硝酸盐诱导型启动子、激素诱导型启动子、和与RuBP羧化酶的小亚基和LHCP家族结合的光诱导型启动子。

有用的组织特异性、发育调节性启动子的例子包括β-伴大豆球蛋白(conglycinin)7Sα启动子和种子特异性启动子。可用于在种子质体中优先表达的植物功能性启动子包括那些来自牵涉含油种子中脂肪酸生物合成的蛋白质和来自植物储存蛋白的。此类启动子的例子包括来自可转录核酸分子序列诸如菜豆蛋白、油菜籽蛋白、玉米醇溶蛋白、大豆胰蛋白酶抑制剂、ACP、硬脂酰-ACP去饱和酶、和油质蛋白的5’调节区。另一种例示性的组织特异性启动子是种子组织特异性的凝集素启动子。

更具体地说，启动子可以包括菜豆(Phaseolus vulgaris)菜豆蛋白启动子(单独的或与菜豆菜豆蛋白3'非翻译区和菜豆菜豆蛋白3'基质附着区域联用)，Lesquerellafendleri KCS3启动子或根癌土壤杆菌曼甘露氨酸合酶启动子。

其它有用的启动子包括胭脂氨酸合酶、甘露氨酸合酶、和章鱼碱合酶启动子(其在根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的肿瘤诱导质粒上携带)；花椰菜花叶病毒(CaMV)19S和35S启动子；增强型CaMV 35S启动子；玄参花叶病毒35S启动子；来自核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO)小亚基的光诱导型启动子；来自烟草的EIF-4A启动子(Mandel等,(1995)Plant Mol.Biol.29:995-1004)；玉米蔗糖合成酶；玉米醇脱氢酶I；玉米光收获复合物(light harvesting compolex)；玉米热休克蛋白；来自拟南芥的几丁质酶启动子；LTP(脂质转移蛋白)启动子；矮牵牛查耳酮异构酶；豆富含甘氨酸的蛋白1；马铃薯patatin；泛素启动子；和肌动蛋白启动子。优选地，有用的启动子是种子选择性的、组织选择性的、或诱导型的。种子特异性调节在例如EP 0 255 378中有讨论。

为了获得更高的异源基因表达，可以优选的是再工程化改造基因，使得它在表达宿主细胞(例如，植物细胞，例如，卡诺拉、稻、烟草、玉米、棉、和大豆)中更有效地表达。因此，设计植物表达的编码delta-9去饱和酶的基因中任选的额外步骤(即，在提供一种或多种基因调节元件外)是为了最佳表达而再工程化改造异源基因蛋白质编码区。具体的实施方案包括再设计的基因，其经过优化以提高在转基因卡诺拉植物细胞或拟南芥植物细胞中，而不是在用天然存在的异源基因序列转化的卡诺拉植物细胞或拟南芥植物细胞中的表达水平(即，生成更多蛋白质)。

由于由遗传密码的冗余性/简并性提供的可塑性(即，一些氨基酸由超过一种密码子规定)，不同生物体或生物体类中的基因组进化已经导致同义密码子的差别选择。此“密码子偏爱”在蛋白质编码区的平均碱基组成中得到反映。例如，具有含相当较低G+C含量的基因组的生物体利用更多的在同义密码子的第三位具有A或T的密码子，而那些具有较高G+C含量的生物体利用更多的在第三位具有G或C的密码子。此外，认为mRNA内“次要”密码子的存在可以降低所述mRNA的绝对翻译速率，尤其在与次要密码子对应的带电荷的tRNA的相对丰度较低时。此推理的延伸是通过个别次要密码子降低翻译速率对于多种次要密码子至少会是叠加的。因此，在特定表达宿主中具有相对较高次要密码子含量的mRNA会具有相应较低的翻译速率。此速率可以通过编码蛋白质的相应低水平反映。

在工程化改造编码delta-9去饱和酶的优化基因以在卡诺拉或拟南芥(或其它植物，诸如稻、烟草、玉米、棉或大豆)中表达中，若已经测定预期的宿主植物的密码子偏爱，则其是有帮助的。存在多种公众可用的DNA序列数据库，其中可以寻找关于植物基因组的密码子分布或各种植物基因的蛋白质编码区的信息。

密码子偏爱是表达宿主(例如，植物，诸如卡诺拉或拟南芥)使用以编码其蛋白质的氨基酸的密码子的统计学分布。密码子偏爱可以以单一密码子相对所有氨基酸的密码子的使用频率计算。或者，密码子偏爱可以以单一密码子用于编码特定氨基酸，相对于所述氨基酸的所有其它密码子(同义密码子)的频率计算。

在为delta-9去饱和酶基因的植物表达设计优化的编码区中，应当确定植物优选的主要(“第一选择”)密码子，及优选密码子的第二、第三、第四选择等等(在存在多种选择时)。然后，可以设计新的编码delta-9去饱和酶基因氨基酸序列的DNA序列，其中新的DNA序列与天然DNA序列(编码去饱和酶)不同之处在于取代编码宿主优选性(第一优选性、第二优选性、第三优选性、或第四优选性，等等)密码子以规定氨基酸序列内每个位置处的氨基酸。然后，对新的序列分析限制酶位点，其可以已经通过修饰创建。通过将这些密码子用下一优选性密码子替换来进一步修饰鉴定的推定限制性位点以除去限制性位点。序列中可以影响异源序列的转录或翻译的其它位点是外显子:内含子接合(5’或3’)、多聚-A添加信号、和/或RNA聚合酶终止信号。可以进一步分析序列，并将其进行修饰以降低TA或CG双联体的频率。在这些双联体外，具有相同的超过约6个G或C核苷酸的序列区组也可以不利地影响序列的转录或翻译。因此，有利地，通过将第一或第二选择的密码子，等等用选择的下一优选性密码子替换来修饰这些区组。

上文所描述的方法使本领域技术人员能够修饰对于特定植物而言外来的基因，使得基因在植物中最佳地表达。所述方法在PCT申请WO 97/13402中进一步例示。如此，可以使用与一些实施方案的去饱和酶/基因在功能上等同的经优化的合成基因来转化宿主，包括植物。关于生成合成基因的更多指导可以参见例如美国专利5,380,831。

一旦在纸上或在计算机芯片中设计出经植物优化的DNA序列，可以在实验室中合成实际的DNA分子以在序列上精确对应于设计的序列。可以将此类合成的DNA分子克隆，并以其它方式操作，完全就像它们源自自然或天然来源那样。

D.用于遗传转化植物材料的方法

一些实施方案涉及生成包含一种或多种核酸分子的经转化的细胞的方法，所述核酸分子包含与选自下组的序列至少60％相同的核酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25。此类核酸分子还可以包含例如非编码调节元件，诸如启动子。也可以将其它序列与非编码调节元件和可转录核酸分子序列一起导入细胞中。这些其它序列可以包含3’转录终止子、3’多聚腺苷酸化信号、其它非翻译序列、转运或靶向序列、选择标志、增强子、和操纵基因。

一般地，转化方法包括下列步骤：选择合适的宿主细胞，用重组载体转化宿主细胞，并获得经转化的宿主细胞。用于将DNA导入细胞中的技术是本领域技术人员公知的。一般地，这些方法可以分成5类：(1)化学方法(Graham和Van der Eb(1973)Virology 54(2):536-9；Zatloukal等(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.660:136-53)；(2)物理方法，诸如微注射(Capechi(1980)Cell 22(2):479-88)、电穿孔(Wong和Neumann(1982)Biochim.Biophys.Res.Commun.107(2):584-7；Fromm等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82(17):5824-8；美国专利5,384,253)、和颗粒加速(Johnston和Tang(1994)Methods CellBiol.43(A):353-65；Fynan等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(24):11478-82；(3)病毒载体(Clapp(1993)Clin.Perinatol.20(1):155-68；Lu等(1993)J.Exp.Med.178(6):2089-96；Eglitis和Anderson(1988)Biotechniques 6(7):608-14)；(4)受体介导的机制(Curiel等(1992)Hum.Gen.Ther.3(2):147-54；Wagner等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89(13):6099-103)；和(5)细菌介导的机制，诸如用土壤杆菌。或者，可以通过直接注射植物的生殖器官来将核酸直接导入花粉中。Zhou等(1983)Methods in Enzymology 101:433；Hess(1987)Intern.Rev.Cytol.107:367；Luo等(1988)Plant Mol.Biol.Reporter 6:165；Pena等(1987)Nature 325:274。其它转化方法包括例如原生质体转化，如美国专利5,508,184中例示的。也可以将核酸分子注射入未成熟的胚中。Neuhaus等(1987)Theor.Appl.Genet.75:30。

最常使用的用于转化植物细胞的方法是：土壤杆菌介导的DNA转移方法(Fraley等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4803)(如美国专利5,824,877；美国专利5,591,616；美国专利5,981,840；和美国专利6,384,301中例示的)和生物射弹或微粒轰击介导的方法(即，基因枪)(诸如记载于美国专利5,550,318；美国专利5,538,880；美国专利6,160,208；美国专利6,399,861；和美国专利6,403,865)。通常，核转化是期望的，但是在期望特异性转化质体，诸如叶绿体或造粉体的情况中，可以对某些植物物种诸如拟南芥、烟草、马铃薯和卡诺拉物种利用期望的核酸分子的微粒介导的递送来转化植物质体。

经由使用属于土壤杆菌属的遗传工程化土壤细菌实现土壤杆菌介导的转化。几种土壤杆菌物种介导转移称为“T-DNA”的特定DNA，其可以遗传工程化改造为将任何期望的DNA部分携带入许多植物物种中。标记T-DNA介导的发病机制过程的主要事件是：诱导毒力基因、和加工并转移TDNA。此过程是许多综述的主题。见例如Ream(1989)Ann.Rev.Phytopathol.27:583-618；Howard和Citovsky(1990)Bioassays 12:103-8；Kado(1991)Crit.Rev.Plant Sci.10:1-32；Zambryski(1992)Annual Rev.PlantPhysiol.Plant Mol.Biol.43:465-90；Gelvin(1993)于Transgenic Plants,Kung和Wu编,Academic Press,San Diego,CA,第49页-第87页；Binns和Howitz(1994)于Bacterical Pathogenesis of Plants and Animals,Dang编,Berlin:Springer Verlag.,第119-38页；Hooykaas和Beijersbergen(1994)Ann.Rev.Phytopathol.32:157-79；Lessl和Lanka(1994)Cell77:321-4；及Zupan和Zambryski(1995)Annual Rev.Phytopathol.27:583-618。

为了对经转化的植物细胞选择或评分(不管转化方法如何)，导入细胞中的DNA可以含有在可再生的植物组织中发挥功能以生成化合物的基因，所述化合物对植物组织赋予对否则有毒性的化合物的抗性。作为选择、筛选、或评分标准物使用的感兴趣的基因包括但不限于β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、绿色荧光蛋白(GFP)、萤光素酶、和抗生素或除草剂耐受性基因。抗生素抗性基因的例子包括赋予对青霉素、卡那霉素(和新霉素、G418、博来霉素)；甲氨蝶呤(和甲氧苄啶)；氯霉素；和四环素的抗性的基因。例如，草甘膦(glyphosate)抗性可以由除草剂抗性基因赋予。Della-Cioppa等(1987)Bio/Technology 5:579-84。也可以执行其它选择装置，包括例如但不限于对膦丝菌素(phosphinothricin)、双丙氨磷和正向选择机制的耐受性(Joersbro等(1998)Mol.Breed.4:111-7)，并且认为在本发明的实施方案的范围内。

然后，可以容许通过选择或筛选鉴定并在支持再生的合适培养基中培养的经转化的细胞成熟成植物。

目前公开的方法可以与任何可转化的植物细胞或组织一起使用。如本文中使用的，可转化的细胞和组织包括但不限于能够进一步增殖以产生植物的那些细胞或组织。本领域技术人员认可许多植物细胞或组织是可转化的，其中在插入外源DNA和适当的培养条件后植物细胞或组织可以形成分化的植物。适合于这些目的的组织可以包括但不限于未成熟的胚、小盾(scutellar)组织、悬浮细胞培养物、未成熟的花序、枝分生组织、节外植体、愈伤组织、下胚轴组织、子叶、根、和叶。

自经转化的植物原生质体或外植体再生、发育、和培养植物是本领域中已知的。Weissbach和Weissbach(1988)Methods for Plant Molecular Biology,(编)AcademicPress,Inc.,San Diego,CA；Horsch等(1985)Science 227:1229-31。此再生和生长方法通常包括下列步骤：选择经转化的细胞，并将那些细胞培养到胚发育的通常阶段到生根的小植物阶段。类似地，再生转基因的胚和种子。在此方法中，一般将转化体在存在选择培养基的情况中培养，所述选择培养基选择成功转化的细胞并诱导植物幼芽(shoot)的再生。Fraley等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4803。这些幼芽通常在2至4个月内获得。此后，将所得的转基因生根幼芽在合适的植物生长培养基诸如土壤中种植。可以将幸免于暴露于选择剂的细胞，或已经在筛选测定法中得分为正的细胞在支持植物再生的培养基中培养。然后，可以将幼芽转移至合适的根诱导培养基中，所述根诱导培养基含有选择剂和防止细菌生长的抗生素。许多幼芽会形成根。然后，将这些移植至土壤或其它培养基以容许根的继续发育。一般地，如上文概述的方法会根据采用的特定植物品系而不同，并且因此，方法的细节在本领域技术人员的判断内。

再生的转基因植物可以自花传粉以提供纯合转基因植物。或者，可以将自再生的转基因植物获得的花粉与非转基因植物，优选地，农艺学重要的物种的近交系杂交。相反，可以使用来自非转基因植物的花粉来给再生的转基因植物传粉。

转基因植物可以将转化的核酸序列传递给其后代。优选地，转基因植物是在转化的核酸序列方面是纯合的，并在有性繁殖后且由于有性繁殖而将所述序列遗传给所有其后代。可以自由转基因植物生成的种子培养后代。然后，可以将这些其它植物自花传粉以生成真正的植物育种株系。

可以对来自这些植物的后代评估基因表达，等等。可以通过几种常见的方法诸如Western印迹、Northern印迹、免疫沉淀、和ELISA(酶联免疫吸附测定法)检测基因表达。也可以对经转化的植物分析导入的DNA的存在和由本发明的核酸分子和氨基酸分子赋予的表达水平和/或脂肪酸谱。本领域技术人员知道可用于分析经转化的植物的许多方法。例如，用于植物分析的方法包括但不限于Southern印迹或Northern印迹、基于PCR的方法、生物化学测定法、表型筛选法、田间评估、和免疫诊断测定法。

用于特异性转化双子叶植物的方法是本领域技术人员公知的。已经对许多作物，包括但不限于拟南芥属的成员、棉(棉(Gossypium hirsutum))、大豆(大豆(Glycinemax))、花生(落花生(Arachis hypogaea))、和芸苔属的成员描述了使用这些方法的转化和植物再生。已经对棉(美国专利5,004,863；美国专利5,159,135；美国专利5,518,908)；大豆(美国专利5,569,834；美国专利5,416,011；McCabe等(1988)Biotechnology 6:923；Christou等(1988)Plant Physiol.87:671-4)；(美国专利5,463,174)；花生(Cheng等(1996)Plant Cell Rep.15:653-7；McKently等(1995)Plant Cell Rep.14:699-703)；蕃木瓜；和豌豆(Grant等(1995)Plant Cell Rep.15:254-8)发表了主要通过使用根癌土壤杆菌转化双子叶植物并获得转基因植物的方法。

用于转化单子叶植物的方法也是本领域中公知的。已经对许多作物，包括但不限于大麦(大麦(Hordeum vulgarae))；玉蜀黍(玉蜀黍(Zea mays))；燕麦(燕麦(Avenasativa))；野茅(野茅(Dactylis glomerata))；稻(稻(Oryza sativa)，包括印度和日本变种)；高粱(高粱(Sorghum bicolor))；甘蔗(甘蔗(Saccharum sp))；苇状羊茅(苇状羊茅(Festuca arundinacea))；草地草(turfgrass)物种(例如，匍茎剪股颖(Agrostisstolonifera)、草地早熟禾(Poa pratensis)、锥穗钝叶草(Stenotaphrum secundatum))；小麦(小麦(Triticum aestivum))；和苜蓿(苜蓿(Medicago sativa))描述了使用这些方法的转化和植物再生。对于本领域技术人员显而易见的是，可以使用并修改许多转化方法以对许多感兴趣的目标作物生成稳定的转基因植物。

可以选择任何植物在目前公开的方法中使用。依照本发明修饰的优选的植物包括例如但不限于含有种子植物、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、琉璃苣(琉璃苣属(Borago)物种)、卡诺拉(Canola)(芸苔属(Brassica)物种)、蓖麻(蓖麻(Ricinus communis))、可可豆(可可(Theobroma cacao))、玉米(玉蜀黍)、棉(棉属(Gossypium)物种)、两节荠属(Crambe)物种、萼距花属(Cuphea)物种、亚麻(亚麻属物种)、小滨菊属(Lesquerella)和鲸油草(Limnanthes)物种、Linola、旱金莲(旱金莲属(Tropaeolum)物种)、月见草属(Oenothera)物种、橄榄(olive)(木樨榄属(Olea)物种)、棕榈(油棕属(Elaeis)物种)、花生(花生属(Arachis)物种)、油菜籽(rapeseed)、红花(红花属(Carthamus)物种)、大豆(大豆属(Glycine)和野生大豆(Soja)物种)、向日葵(向日葵属(Helianthus)物种)、烟草(烟草属(Nicotiana)物种)、斑鸠菊属(Vernonia)物种、小麦(小麦属(Triticum)物种)、大麦(大麦属(Hordeum)物种)、稻(稻属(Oryza)物种)、燕麦(燕麦属(Avena)物种)、高粱(高粱属(Sorghum)物种)、和黑麦(黑麦属(Secale)物种)或禾本科(Gramineae)的其它成员。

对于本领域技术人员显而易见的是，可以使用并修改许多转化方法以对许多感兴趣的目标作物生成稳定的转基因植物。

E.转基因种子

在一些实施方案中，转基因种子可以包含delta-9去饱和酶多肽，其包含与选自下组的序列至少80％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33。在这些和其它实施方案中，转基因种子可以包含与选自下组的序列至少60％相同的核酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25。在一些实施方案中，转基因种子可以展现出降低的饱和脂肪酸(例如，棕榈酸脂肪酸和/或硬脂酸脂肪酸)水平。可以自能育转基因植物收获种子，并可以用于培养经转化植物的后代世代，包括包含如上文所列的至少一种核酸序列，和任选地至少一种别的感兴趣的基因或核酸构建体的杂种植物株系。

提供以下实施例来例示某些具体的特征和/或实施方案。这些实施例不应解释为将本发明限于所描述的具体特征或实施方案。

实施例

实施例1：pDAB7305的构建体设计

构巢曲霉Δ-9去饱和酶(AnD9DS)酶先前在美国专利申请序列号2008/0260933中公开，在本文中为SEQ ID NO:1。合成包含AnD9DS v3编码序列的多核苷酸序列(SEQ ID NO:2)，并将其引入质粒构建体pDAB7305中用于土壤杆菌介导的植物转化(图1)。所得的构建体含有三个植物转录单元(也被描述为基因表达盒，二者可互换使用)。第一植物转录单元(PTU)(SEQ ID NO:3)由RB7基质附着区(RB7MAR；国际专利申请号WO9727207)、菜豆菜豆蛋白启动子(Pv Phas启动子；美国专利号5,504,200)、AnD9DS编码序列(AnΔ9去饱和酶v3)、菜豆菜豆蛋白3'非翻译区(Pv Phas 3'UTR；美国专利号5,504,200)和菜豆菜豆蛋白3'基质附着区(Pv Phas 3'MAL；美国专利号5,504,200)构成。第二个PTU(SEQ ID NO:4)由Lesquerella fendleri KCS3启动子(LfKCS3启动子；美国专利号7,253,337)、AnD9DS编码序列(AnΔ9去饱和酶v3)和根癌土壤杆菌ORF 233'非翻译区(AtuORF23 3'UTR；美国专利号5,428,147)构成。第三个PTU(SEQ ID NO:5)由根癌土壤杆菌甘露氨酸合酶启动子(AtuMas启动子；Barker,R.F.,Idler,K.B.,Thompson,D.V.,Kemp,J.D.,(1983),a polynucleotidesequence of the T-DNA region from the Agrobacterium tumefaciens octopine Tiplasmid pTi15955,Plant Molecular Biology,2(6),335-50)、膦丝菌素乙酰转移酶基因(PAT；Wohlleben等，(1988)Gene，70：25-37)、和根癌土壤杆菌ORF 1 3'非翻译区(AtuORF13′UTR；Huang et al.,(1990)J.Bacteriol.,172:1814-1822)构成。通过限制酶消化和测序证实该构建体。最后，将该构建体转化到根癌土壤杆菌中并作为甘油储储存。

实施例2：土壤杆菌介导的对卡诺拉(Brassica napus)下胚轴的转化

土壤杆菌制备

使用含有pDAB7305二元质粒的土壤杆菌菌株在含有链霉素(100mg/mL)和壮观霉素(50mg/mL)的YEP培养基(Bacto Peptone^TM(20.0g/L)和酵母提取物(10.0g/L))板上划线，并于28℃温育2天。使用无菌接种环从2日划线平板上刮取含有pDAB7305二元质粒经增殖的土壤杆菌菌株。然后将刮下的含有pDAB7305二元质粒的土壤杆菌菌株接种入150mL进入无菌500mL带有挡板的烧瓶中的具有链霉素(100mg/mL)和壮观霉素(50mg/mL)的改良YEP液体中，并以200rpm于28℃摇动。将培养物离心后重悬在M-培养基(LS盐；3％葡萄糖；改良的B5维生素；1μM细胞分裂素；1μM 2,4-D；pH 5.8)中，并稀释至合适的浓度(50个Klett单位，用分光光度计测得)，之后转化卡诺拉下胚轴。

卡诺拉转化：

种子萌发：将卡诺拉种子(品种Nexera 710^TM)在10％Clorox中表面灭菌10分钟，并用无菌蒸馏水漂洗三次(在该过程中种子盛放在钢制滤网中)。将种子种植在Phytatray^TM中含有的1/2MS卡诺拉培养基(1/2MS、2％蔗糖、0.8％琼脂)(每个Phytatray^TM为25粒种子)上以进行萌发，并放置在设置为25℃和16小时光照/8小时黑暗光周期的生长方案的Percival^TM生长室中5天以供萌发。

预处理：在第5天，在无菌情况下切出长度约3mm的下胚轴节段，弃去剩余的根和芽部分(通过在切出过程期间将下胚轴节段浸入10mL无菌milliQ^TM水中来防止它们干燥)。在具有设置为22-23℃和16小时光照/8小时黑暗光周期的生长方案的Percival^TM生长室中预处理前，将下胚轴节段在无菌滤纸上在愈伤组织诱导培养基MSK1D1(MS；1mg/L细胞分裂素；1mg/L 2,4-D；3％蔗糖；0.7％植物琼脂(Phytagar))上水平放置3天。

与土壤杆菌的共培养：在土壤杆菌共培养前一天，用含有pDAB7305二元质粒的土壤杆菌菌株接种含有合适抗生素的YEP培养基的烧瓶。将下胚轴节段从滤纸愈伤组织诱导培养基MSK1D1转移至含有10mL液体M培养基的空100x25mm Petri^TM培养皿，以防止下胚轴节段干燥。在此阶段使用刮刀舀出节段，并转移至新的培养基。用移液管除去液体M培养基，并将40mL土壤杆菌悬浮液添加至Petri^TM培养皿(500个段及40mL土壤杆菌溶液)。将各下胚轴节段在周期性涡旋振荡下胚轴节段培养皿的条件下处理30分钟，使得下胚轴在土壤杆菌溶液中保持浸没。在处理期结束时，将土壤杆菌溶液移液入废物烧杯中，用高压灭菌器处理，并弃去(将土壤杆菌溶液完全除去以放置土壤杆菌生长过度)。将经处理的下胚轴用镊子返回转移至含有用滤纸覆盖的MSK1D1培养基的初始平板，注意确保各节段不干燥。将经转化的下胚轴节段与未转化的对照下胚轴节段一起放回到降低光强(通过用铝箔覆盖平板)下的Percival^TM生长室，并将经处理的下胚轴节段与土壤杆菌共培养3天。

在选择培养基上的愈伤组织诱导：在共培养3天后，将下胚轴节段用镊子个别地转移至愈伤组织诱导培养基MSK1D1H1(MS；1mg/L细胞分裂素；1mg/L 2,4-D；0.5g/L MES；5mg/L AgNO₃；300mg/L特美汀(Timentin)；200mg/L羧苄西林(Carbenicillin)；1mg/LHerbiace^TM；3％蔗糖；0.7％植物琼脂)上，生长方案设定为22-26℃。将下胚轴节段在培养基上锚定，但是不深埋到培养基中。

选择和芽再生：在愈伤组织诱导培养基上7天后，将生成愈伤组织的(callusing)下胚轴段转移至具有选择的芽再生培养基1MSB3Z1H1(MS；3mg/L BAP；1mg/L玉米素；0.5gm/L MES；5mg/L AgNO₃；300mg/L特美汀^TM；200mg/L羧苄西林；1mg/L Herbiace；3％蔗糖；0.7％植物琼脂)上。在14天后，将已发出芽的下胚轴节段转移至具有增强的选择的再生培养基2MSB3Z1H3(MS；3mg/L BAP；1mg/L玉米素；0.5gm/L MES；5mg/L AgNO₃；300mg/l特美汀^TM；200mg/L羧苄西林；3mg/L Herbiace^TM；3％蔗糖；0.7％植物琼脂)，生长方案设定为22-26℃。

芽伸长：在14天后，将具有已生发芽的下胚轴节段从再生培养基2转移至芽伸长培养基MSMESH5(MS；300mg/L特美汀^TM；5mg/L Herbiace^TM；2％蔗糖；0.7％TC琼脂)，生长方案设定为22-26℃。从下胚轴节段分离已经伸长的芽，并转移至MSMESH5。14天后，将在伸长培养基的第一轮培养中未伸长的剩余芽转移到新鲜的芽延长培养基MSMESH5。在这个阶段，丢弃所有剩下的未产生芽的下胚轴片段。

根诱导：在芽伸长培养基上培养14天后，将分离的芽转移至MSMEST培养基(MS；0.5g/L MES；300mg/L特美汀^TM；2％蔗糖；0.7％TC琼脂)以在22-26℃进行根诱导。将任何在第一次转移MSMEST培养基的过程中在温育后未生根的芽转移到MSMEST培养基上的第二或第三轮温育，直至芽生出根。

PCR分析：经转化的卡诺拉下胚轴片段再生成有根的芽后，用PCR分子确认测定法对其进一步分析。从绿芽获得叶组织，通过PCR测试是否存在pat选择标志物基因。丢弃任何褪绿芽，不进行PCR分析。鉴定为pat选择标志物基因存在为阳性的样品在MSMEST培养基上保存并培养，以继续发出和伸长芽和根。丢弃根据PCR分析鉴定为阴性不含pat选择标志物基因的样品。

将包含选择标志物基因存在PCR阳性的芽和根的经转化的卡诺拉植物移植到温室中的土壤中。卡诺拉植物在土壤中定植之后，进一步分析卡诺拉植物，通过Invader^TM定量PCR测定法和Southern印迹法定量pat基因表达盒的拷贝数。证实含有至少一个pat基因表达盒拷贝的转基因T₀卡诺拉植物推进进一步分析种子脂肪酸谱。通过FAME分析方法分析从这些转基因T₀卡诺拉植物获得的种子(即T₁卡诺拉种子)，以鉴定与对照植物相比总饱和脂肪酸减少的事件(总饱和脂肪酸含量通过将所有饱和脂肪酸，包括短链和长链脂肪酸加和来确定)。

实施例3：从转基因pDAB7305卡诺拉植物获得的T₁卡诺拉种子的FAME分析

对于发生分离的(segregating)T₁卡诺拉种子，通过FAME分析方法分析以鉴定这样的T₀卡诺拉事件：其产生的T₁卡诺拉种子的总饱和脂肪酸(C14:0，C16：0，C18：0，C20:0，C22:0，C24:0)与从相同条件下生长的对照植物获得的种子相比降低。对所有总饱和脂肪酸(TSFA)的总和进行定量，并与阴性对照植株进行比较。使用下面描述的方案对单个T₁卡诺拉种子完成FAME分析。对来自每个单独的卡诺拉T₀事件的总共24个单一T₁卡诺拉种子进行测定，并且对来自每个个体的TSFA结果进行定量。

使用钢球磨机将单一卡诺拉种子样品在庚烷中均质化，其中庚烷中含有十七烷酸三甘酯(triheptadecanoin)(Nu-Chek prep)作为三酰基甘油内标。在均质化之前，加入0.25M新鲜制备的甲醇钠(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)在甲醇中的溶液。萃取在40℃恒定震摇下进行。内源性脂肪酸回收率用甲基化的替代物C17脂肪酸的回收率来归一化。重复3次FAME(脂肪酸甲酯)萃取，将庚烷层合并后分析。所得的FAME通过GC-FID进行分析，使用来自SGE的毛细管柱BPX 70(15m×0.25mm×0.25μm)。根据保留时间鉴定每种FAME，并通过注入来自Matreya LLC(Pleasant Gap，PA)菜籽油参考预混物作为校准标准，同时添加适当的长链脂肪酸(Nu-Chek Prep，Elysian MN)，来加以定量。

大批种子分析由50mg等分试样(10至15个种子组合)组成，并按照上述相同方案加以少许修改后实施。为了推动衍生化反应完全，首先用庚烷萃取油三次。然后，将合并的油提取物的对应于1个种子的等分试样如上述单种子方案所述衍生化成FAME。通过在第四次萃取/衍生化中检查内源FAME的存在来验证反应的完全性。

基于表明与对照油菜植物TSFA相比显著减少的FAME结果，鉴定并选择了三个转基因卡诺拉事件(事件2182[12]-138.001，事件2182[12]-125.001和事件2182[12]-156.001)推进到T₁代。测定了另外两个植物脂肪酸内含物范畴。这些范畴包括单不饱和脂肪酸(MUFA：C16:1，C18:11和C20:11)和多不饱和脂肪酸(PUFA：C18:12和C18:13)浓度，列出这些范畴以显示T₁种子中降低的TSFA的效果(表1)。

表1：与几个Nexera 710^TM非转化对照植物相比，从三个转基因卡诺拉事件获得的单个T₁种子TSFA、MUFA和PUFA含量总结。N*表示对每个植物后代分析的单T₁种子的数量。

与Nexera 710^TM非转化对照植物相比，转基因卡诺拉事件的平均TSFA显著降低。在TSFA的降低的同时，观察到MUFA含量(C18:1和C16:1)的增加。MUFA含量的增加是AnD9DS过表达而在饱和脂肪酸自羧酸官能团起的第9个碳(Δ9)处引入双键的直接结果。有趣的是，PUFA含量并未随着磷酸甘油酯去饱和酶FAD2的合成C18:2的底物MUFA的积累而增加。

将T₁卡诺拉植物事件在温室中生长并自受精，以将渗入的转基因固定在后代植物中。对来自每个转基因事件的多个T₁卡诺拉植物完成了Invader^TM定量PCR检测。这些结果表明，从三个事件中获得的T₁卡诺拉植物均含有约2或3个拷贝的pDAB7305 T链整合(图3顶部小图)。无法具体确定拷贝数，因为pDAB7305 T链整合体在三个事件中以不同的拷贝数分离。让T₁卡诺拉植物事件在温室中生长成熟并自受精。收获产生的T₂卡诺拉种子用于通过FAME测定法进行脂肪酸谱分析。

实施例4：从转基因pDAB7305卡诺拉植物获得的T₂卡诺拉种子的FAME分析

通过先前描述的FAME分析方法分析大批T₂卡诺拉种子，以鉴定与对照植物(Nexera 710^TM)相比总饱和脂肪酸有所减少的T₁卡诺拉植物株系(图2)。每株植物的产量作为每株植物的种子克数记录。将产量结果与含有稳定整合的构巢曲霉Δ-9去饱和酶转基因的转基因阳性对照事件218-11.30(参见WO2006/042049)(本文也描述为218-11.30HS50或218-11.30HL)的产量进行比较，对照植物与本发明的转基因植物一起种植。218-11.30植物和本主题公开的转基因卡诺拉植物都表达相似的转基因。然而，本主题公开中用于转化2182[12]-125.Sx001、2182[12]-138.Sx001和2182[12]-156.Sx00卡诺拉植物的构建体是不同的，因为它包含第二个PTU，该PTU由Lesquerella fendleri KCS3启动子及该启动子驱动表达的AnD9DS编码序列组成，并且被根癌土壤杆菌ORF23 3'非翻译区所侧翼。

定量对本主题公开的转基因植物的TSFA(％)，并与从阳性对照218-11.30HL转基因卡诺拉植物和阴性对照Nexera 710^TM植物获得的TSFA(％)进行比较。鉴别出少数本主题公开的转基因植物含有较高水平的TSFA，其水平近似于阴性对照的Nexera 710^TM植物。这些植物是由于转基因在自受精期间发生分离而产生的同胞无效体(sibling nulls)，并且不包含任何积极表达的本主题公开的转基因的拷贝。这些结果证实，在鉴别出T₁卡诺拉植物中，大批T₂卡诺拉种子的总饱和脂肪酸含量降低到3.5％以下。

进一步分析T₂卡诺拉株系，以确定哪一个卡诺拉株系含有低拷贝数的pDAB7305T链整合体，并产生高T₂种子产量。(图3)。

选择这样的本主题公开的卡诺拉植物个体：含有的TSFA少于3.5％，产生的产量超过10g，并且含有的T链拷贝数最低。基于这三个标准(TSFA水平低于3.5％，高种子产量和低拷贝数)，选择了七个卡诺拉植物并推进以进一步表征TSFA谱。使用Invader Assay从每个T₁株系的一个植物确定拷贝数。表2。将这些T₂卡诺拉植物株系转移到温室，生长成熟并自受精。进一步分析T₂卡诺拉植物株系，并通过FAME测定法收获T₃种子进行脂肪酸谱分析。

表2：列出了基于最高产量(种子重量)，最低PAT拷贝数(T1植物)和最低TSFA选择的T₂卡诺拉株系。

实施例5：T₂卡诺拉株系的分子确认

对于选出的含有pat基因表达盒(和紧密连锁的AnD9DS基因表达盒)的T2卡诺拉事件，使用定量PCR和Southern印迹分析表征分子整合模式。

通过水解探针测定法确认AnD9DS整合

通过水解探针测定证实AnD9DS基因表达盒的存在。首先通过水解探针测定(类似于TAQMAN^TM)筛选分离的T2卡诺拉植物，以确认pat转基因的存在。从这些研究中产生的数据用于确定转基因拷贝数，并用于选择用于回交和推进到后代的转基因卡诺拉事件。

将组织样品收集在96孔板中，使用KLECO^TM组织粉碎机和不锈钢珠(HooverPrecision Products，Cumming，GA)，在Qiagen RLT^TM缓冲液中进行组织浸渍。在组织浸渍后，根据制造商的建议方案，使用Biosprint 96^TM植物试剂盒(Qiagen，Germantown，MD)以高通量形式分离基因组DNA。基因组DNA用Quant-IT Pico Green DNA assay kit^TM(MolecularProbes，Invitrogen，Carlsbad，CA)定量。使用BIOROBOT3000^TM自动液体处理器(Qiagen，Germantown，MD)，将定量后的基因组DNA调节至约2ng/μL用于水解探针测定。通过使用480系统(Roche Applied Science，Indianapolis，IN)的实时PCR进行类似于测定的水解探针测定的转基因拷贝数确定。使用Probe Design Software 2.0设计用于pat和内部参考基因HMG1(Weng等(2005).J.AOACInt.88(2):577-84)的测定。为了扩增，在10μL体积多重反应中制备1×终浓度的480探针主混合物(含有0.4μM的每种用于AnD9DS和pat的引物，和0.2μM的每种探针)(表3)。进行两步扩增反应，在60℃下延伸40秒，捕获荧光。运行所有样品，并将平均循环阈值(Ct)值用于每个样品的分析。实时PCR数据的分析使用相对量化模块使用软件版本1.5进行，并基于ΔΔCt方法。对照包括：来自单一拷贝校准品的基因组DNA样品，以及每次运行中包括的已知的二拷贝检查品。表4列出了水解探针测定的结果。使用qPCR测定从每个T₁株系的N株(并平均，给出表4中的值)确定拷贝数。

表3：用于pat和内部参考(HMG1)的水解探针测定的引物和探针序列。

表4:利用水解探针测定法确定的AnD9DS事件(T₂植物)的拷贝量结果

水解探针测定的结果确定了两个株系(2182[12]-138.Sx001.Sx094和2182[12]-138.SX001.Sx090)，其具有与阳性对照植物(218-11.30(HL))相当的相对标准偏差(如表4所示为SD)和变异系数(如表4所示为CV％)的组合。218-11.30(HL)对照植物先前被鉴定为含有两个固定拷贝的AnD9DS基因插入(WO 2006042049)。通过将选定的卡诺拉株系(2182[12]-138.Sx001.Sx094和2182[12]-138.SX001.Sx090)与218-11.30(HL)对照植物进行比较，鉴定出将会含有固定拷贝的pDAB7305T链整合体的特定卡诺拉株系。

通过Southern印迹分析确认AnD9DS基因组整合。

使用Southern印迹分析建立证明T链DNA片段的整合模式，并鉴定含有全长AnD9DS基因表达盒的卡诺拉株系。产生了可证明在卡诺拉基因组内的转基因插入物的整合和完整性的数据。使用特异于AnD9DS基因表达盒的PCR扩增探针进行详细的Southern印迹分析。该探针与经过特异性限制酶消化的基因组DNA的杂交鉴定出具有特定分子量的基因组DNA片段，用这些片段的模式来表征用于推进到下一代的转基因事件。

将组织样品收集在2mL锥形管中并冻干2天。用KLECKO^TM组织粉碎机和钨珠进行组织浸渍。在组织浸渍后，使用CTAB分离程序分离基因组DNA。使用Qiagen Genomic Tips^TM试剂盒进一步纯化基因组DNA。用Quant-IT Pico Green DNA TM测定试剂盒(MolecularProbes，Invitrogen，Carlsbad，CA)定量基因组DNA。将经定量的基因组DNA调节至一致的浓度。

对于每个样品，用限制酶BamHI(New England Biolabs，Beverley，MA)充分消化4μg基因组DNA。使用Quick Precipitation Solution^TM(Edge Biosystems，Gaithersburg，MD)，根据制造商的建议方案通过沉淀来浓缩消化的DNA。然后将基因组DNA在65℃下重悬浮于25μL水中1小时。将重悬浮的样品加载到1X TAE中制备的0.8％琼脂糖凝胶上，并以1.1V/cm在1X TAE缓冲液中电泳过夜。对凝胶依次进行变性(0.2M NaOH/0.6M NaCl)30分钟，及中和(0.5M Tris-HCl(pH7.5)/1.5M NaCl)30分钟。

利用层析纸捻和纸巾，使20X SSC溶液被动地穿透凝胶吸引到经处理的IMMOBILON^TMNY+转移膜(Millipore，Billerica，MA)上，来将DNA片段转移到尼龙膜上。转移后，将膜用2X SSC短暂洗涤，与STRATALINKER^TM1800(Stratagene，LaJolla，CA)交联，并在80℃下真空烘烤3小时。

使用400型杂交培养箱(Robbins Scientific，Sunnyvale，CA)，将印迹与预杂交溶液(Perfect Hyb plus，Sigma，St.Louis，MO)在65℃下在玻璃滚瓶中温育1小时。从含有整个编码序列的PCR片段制备探针。使用QIAEX II gel extraction kit^TM纯化PCR扩增子，并用DIG DNA Labeling Kit^TM(Roche Applied BioSciencse，Indianapolis，IN)标记。印迹在65℃下杂交过夜，变性探针直接加入到杂交缓冲液中。杂交后，在65℃用0.1×SSC/0.1％SDS依次洗涤印迹40分钟。最后，将印迹暴露于储磷成像屏，并使用Molecular DynamicsStorm 860^TM成像系统成像。

本研究中完成的Southern印迹分析用于确定拷贝数，并确认所选择的事件在卡诺拉基因组中含有AnD9DS基因表达盒。表5提供了来自基于上述表2中定义的标准选定的株系的多个T₂植物的条带分布。对照株系不含有选择标志物，这确认了PCR数据。从三个事件中选择的大多数株系显示均一的条带模式(数目和大小)，除了来自事件2182[12]-125.Sx001.Sx014的株系外。事件2182[12]-138.Sx001的所有三个T₂系显示具有一致条带模式的T₂群体。

表5：对来自四个转基因事件的多个T₂卡诺拉株系以及NEXERA 710^TM卡诺拉对照植物完成的Southern分析的概述。通过与在琼脂糖凝胶上样品旁边运行的已知标准品进行比较来确定每个样品的观察到的条带的大小。

实施例6：选定的卡诺拉株系的T₃种子产量

来自T₂卡诺拉株系的选定植物在温室中生长成熟。从植物收获种子。清洗种子，并确定每个T₂卡诺拉株系的种子产量(表6)。将来自每一株系的种子的产量与来自在相同条件下生长的未转化的对照植物(Nexera^TM710GS)获得的种子的产量进行比较。表6给出了从每个T₂卡诺拉株系获得的不同植物的产量结果。这些结果表明，测试的每个植物和株系的产量是可变的。但是T₂卡那拉株系的平均产量(2182[12]-125.Sx001.Sx014,2182[12]-138.Sx001.Sx085、2182[12]-138.Sx001.Sx090、2182[12]-138.Sx001.Sx094、和2182[12]-156.Sx001.Sx049)相对近似，并且没有显著偏离对照植物(Nexera^TM710G5和218-11.30(HL))。

表6：来自卡诺拉转基因品株系和未转化的Nexera^TM710GS对照植物的种子产量(以总克数计)的ANNOVA分析。括号中连接相同字母的植物产量结果没有显著差异(p<0.05)。

事件/株系	植物数	比例	产量(g)
				218-11.30(HL)	12	0.06186	5.7233333(A,B)
2182[12]-125.Sx001.Sx014	35	0.18041	5.9874286(A,B)
				2182[12]-138.Sx001.Sx085	34	0.17526	6.8394118(A)
2182[12]-138.Sx001.Sx090	33	0.17010	6.4887879(A,B)
				2182[12]-138.Sx001.Sx094	35	0.18041	5.0302857(B)
2182[12]-156.Sx001.Sx049	33	0.17010	6.3715152(A,B)
				NexeraTM710G5	12	0.06186	7.1666667(A,B)
总计	194	1.00000	---

实施例7：从转基因pDAB7305卡诺拉植物获得的T₃卡诺拉种子的FAME分析

通过先前描述的FAME分析方法分析单个和大批的T₃卡诺拉种子，以表征各株系的脂肪酸谱，从而鉴定与对照植物相比导致总饱和脂肪酸减少的特定株系。定量总饱和脂肪酸的总和，并与阳性对照和阴性对照植物进行比较。结果证实，在所选的卡诺拉植物株系中，单个和大批T₃卡诺拉种子的总饱和脂肪酸和饱和脂肪酸(由棕榈酸和硬脂酸含量之和确定)含量降低到3.5％以下。

令人惊讶的是，两个株系，2182[12]-138.SX001.SX085和2182[12]-138.Sx001.Sx094，积累的TSFA水平平均在3.0％以下。首次描述了由包含小于3.0％饱和脂肪酸的大批种子构成的卡诺拉株系。表7和表8。

此外，将一个亚组的卡诺拉株系用于种子FAME分析，以确定在单个卡诺拉种子中能够获得的总饱和脂肪酸和饱和脂肪酸水平的最低水平。从基于大批种子的最低总饱和脂肪酸以及高水平的植物产量选择出的卡诺拉株系获得种子，用于单种子FAME分析。使用FAME方法，每个株系分析总共288个个体种子。分析的总结见表9。来自所选植物的所有单种子的平均TSFA低于2.8％，明显低于3.5％的TSFA水平。在单种子卡诺拉的水平上，最低的TSFA水平为2.25％。这显著低于Nexera^TM710G5对照植物获得的TSFA水平5.11％。最后，转基因卡诺拉株系中TSFA的最大百分比不超过3.5％，单种子的平均饱和水平为2.52％，远低于3.5％。表9和图4。

表7显示了与未转化的Nexera^TM710G5对照和转化的218-11.30(HL)阳性对照植物相比，5个遗传上均一的卡诺拉株系群体的T₂成熟种子大批FAME分析的分布。求出所有个体测量值(N)的平均值，以代表卡诺拉植物群体的TSFA和饱和百分比。用粗体字标明了2182[12]-138.Sx001.Sx085和2182[12]-138.Sx001.Sx094，因为这两个株系的平均TSFA百分比低于3.00％。

表7

表8显示了与Nexera^TM710G5对照相比，从事件2182[12]-138.Sx001获得的单个T₂后代植物的最低T₃成熟种子大批FAME和植物产量。显示的结果是油的百分比、TSFA的百分比、饱和脂肪酸的百分比(通过总结棕榈酸和硬脂酸含量确定)和种子产量。

表8

表9显示了来自选定的T₂株系的T₃单种子FAME分析结果的分布。与在相该表显示TSFA和饱和脂肪酸百分比的平均值(平均值)、最小值(最小)和最大值(最大)，与同条件下生长的Nexera^TM710G5对照卡诺拉籽植物相比。相比于Nexera^TM710G5对照卡诺拉植物，所选事件的T₃种子中的总饱和脂肪酸(TSFA)和饱和脂肪酸水平均有降低。

表9

序列表

<110> 美国陶氏益农公司

D·J·加乔迪

P·A·O·默洛

M·A·汤普森

T·A·沃尔什

B·R·威尔逊

M·维尔特

<120> 具有少于3.5%的总饱和脂肪酸的转基因卡诺拉的生成

<130> 71671

<160> 33

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 455

<212> PRT

<213> 构巢曲霉

<400> 1

Met Ser Ala Pro Thr Ala Asp Ile Arg Ala Arg Ala Pro Glu Ala Lys

1 5 10 15

Lys Val His Ile Ala Asp Thr Ala Ile Asn Arg His Asn Trp Tyr Lys

20 25 30

His Val Asn Trp Leu Asn Val Phe Leu Ile Ile Gly Ile Pro Leu Tyr

35 40 45

Gly Cys Ile Gln Ala Phe Trp Val Pro Leu Gln Leu Lys Thr Ala Ile

50 55 60

Trp Ala Val Ile Tyr Tyr Phe Phe Thr Gly Leu Gly Ile Thr Ala Gly

65 70 75 80

Tyr His Arg Leu Trp Ala His Cys Ser Tyr Ser Ala Thr Leu Pro Leu

85 90 95

Arg Ile Trp Leu Ala Ala Val Gly Gly Gly Ala Val Glu Gly Ser Ile

100 105 110

Arg Trp Trp Ala Arg Asp His Arg Ala His His Arg Tyr Thr Asp Thr

115 120 125

Asp Lys Asp Pro Tyr Ser Val Arg Lys Gly Leu Leu Tyr Ser His Leu

130 135 140

Gly Trp Met Val Met Lys Gln Asn Pro Lys Arg Ile Gly Arg Thr Asp

145 150 155 160

Ile Ser Asp Leu Asn Glu Asp Pro Val Val Val Trp Gln His Arg Asn

165 170 175

Tyr Leu Lys Val Val Phe Thr Met Gly Leu Ala Val Pro Met Leu Val

180 185 190

Ala Gly Leu Gly Trp Gly Asp Trp Leu Gly Gly Phe Val Tyr Ala Gly

195 200 205

Ile Leu Arg Ile Phe Phe Val Gln Gln Ala Thr Phe Cys Val Asn Ser

210 215 220

Leu Ala His Trp Leu Gly Asp Gln Pro Phe Asp Asp Arg Asn Ser Pro

225 230 235 240

Arg Asp His Val Ile Thr Ala Leu Val Thr Leu Gly Glu Gly Tyr His

245 250 255

Asn Phe His His Glu Phe Pro Ser Asp Tyr Arg Asn Ala Ile Glu Trp

260 265 270

His Gln Tyr Asp Pro Thr Lys Trp Ser Ile Trp Ala Trp Lys Gln Leu

275 280 285

Gly Leu Ala Tyr Asp Leu Lys Lys Phe Arg Ala Asn Glu Ile Glu Lys

290 295 300

Gly Arg Val Gln Gln Leu Gln Lys Lys Leu Asp Arg Lys Arg Ala Thr

305 310 315 320

Leu Asp Trp Gly Thr Pro Leu Asp Gln Leu Pro Val Met Glu Trp Asp

325 330 335

Asp Tyr Val Glu Gln Ala Lys Asn Gly Arg Gly Leu Val Ala Ile Ala

340 345 350

Gly Val Val His Asp Val Thr Asp Phe Ile Lys Asp His Pro Gly Gly

355 360 365

Lys Ala Met Ile Ser Ser Gly Ile Gly Lys Asp Ala Thr Ala Met Phe

370 375 380

Asn Gly Gly Val Tyr Tyr His Ser Asn Ala Ala His Asn Leu Leu Ser

385 390 395 400

Thr Met Arg Val Gly Val Ile Arg Gly Gly Cys Glu Val Glu Ile Trp

405 410 415

Lys Arg Ala Gln Lys Glu Asn Val Glu Tyr Val Arg Asp Gly Ser Gly

420 425 430

Gln Arg Val Ile Arg Ala Gly Glu Gln Pro Thr Lys Ile Pro Glu Pro

435 440 445

Ile Pro Thr Ala Asp Ala Ala

450 455

<210> 2

<211> 1368

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码构巢曲霉Delta 9去饱和酶v3的合成核苷酸

<400> 2

atgtctgctc caaccgctga catcagggct agggctccag aggctaagaa ggttcacatc 60

gctgataccg ctatcaacag gcacaattgg tacaagcacg tgaactggct caacgtcttc 120

ctcatcatcg gaatcccact ctacggatgc atccaagctt tctgggttcc acttcaactc 180

aagaccgcta tctgggctgt gatctactac ttcttcaccg gacttggaat caccgctgga 240

taccacaggc tttgggctca ctgctcatac tctgctactc ttccacttag gatctggctt 300

gctgctgttg gaggaggagc tgttgaggga tctatcagat ggtgggctag ggatcacagg 360

gctcatcata ggtacaccga taccgacaag gacccatact ctgttaggaa gggacttctc 420

tactctcacc ttggatggat ggtgatgaag cagaacccaa agaggatcgg aaggaccgac 480

atctctgatc tcaacgagga cccagttgtt gtttggcaac acaggaacta cctcaaggtt 540

gtgttcacca tgggacttgc tgttccaatg cttgttgctg gacttggatg gggagattgg 600

cttggaggat tcgtgtacgc tggaatcctt aggatcttct tcgttcaaca agctaccttc 660

tgcgtgaact ctcttgctca ctggcttgga gatcaaccat tcgatgatag gaactctcct 720

agggatcacg tgatcaccgc tcttgttacc cttggagagg gataccacaa cttccaccac 780

gagttcccat ctgactacag gaacgctatc gagtggcacc agtacgatcc taccaagtgg 840

tctatctggg cttggaagca acttggattg gcttacgatc tcaagaagtt cagggctaac 900

gagatcgaga agggaagggt tcaacaactt cagaagaagc ttgataggaa gagggctact 960

cttgattggg gaaccccact tgatcaactt ccagtgatgg aatgggatga ctacgttgag 1020

caagctaaga acggaagggg acttgttgct atcgctggag ttgttcacga tgttaccgac 1080

ttcatcaagg atcacccagg aggaaaggct atgatctctt ctggaatcgg aaaggatgct 1140

accgctatgt tcaacggagg agtgtactac cactctaacg cagctcacaa ccttcttagc 1200

accatgaggg tgggagtgat caggggagga tgcgaggttg agatctggaa gagggctcag 1260

aaggagaacg ttgagtacgt tagggatgga tctggacaaa gggtgatcag ggctggagag 1320

caaccaacca agatcccaga gccaatccca accgctgatg ctgcttga 1368

<210> 3

<211> 2912

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 包含构巢曲霉delta 9 去饱和酶v3的第一植物转录单位

<400> 3

ctcccagtat cattatagtg aaagttttgg ctctctcgcc ggtggttttt tacctctatt 60

taaaggggtt ttccacctaa aaattctggt atcattctca ctttacttgt tactttaatt 120

tctcataatc tttggttgaa attatcacgc ttccgcacac gatatcccta caaatttatt 180

atttgttaaa cattttcaaa ccgcataaaa ttttatgaag tcccgtctat ctttaatgta 240

gtctaacatt ttcatattga aatatataat ttacttaatt ttagcgttgg tagaaagcat 300

aatgatttat tcttattctt cttcatataa atgtttaata tacaatataa acaaattctt 360

taccttaaga aggatttccc attttatatt ttaaaaatat atttatcaaa tatttttcaa 420

ccacgtaaat ctcataataa taagttgttt caaaagtaat aaaatttaac tccataattt 480

ttttattcga ctgatcttaa agcaacaccc agtgacacaa ctagccattt ttttctttga 540

ataaaaaaat ccaattatca ttgtattttt tttatacaat gaaaatttca ccaaacaatg 600

atttgtggta tttctgaagc aagtcatgtt atgcaaaatt ctataattcc catttgacac 660

tacggaagta actgaagatc tgcttttaca tgcgagacac atcttctaaa gtaattttaa 720

taatagttac tatattcaag atttcatata tcaaatactc aatattactt ctaaaaaatt 780

aattagatat aattaaaata ttactttttt aattttaagt ttaattgttg aatttgtgac 840

tattgattta ttattctact atgtttaaat tgttttatag atagtttaaa gtaaatataa 900

gtaatgtagt agagtgttag agtgttaccc taaaccataa actataagat ttatggtgga 960

ctaattttca tatatttctt attgctttta ccttttcttg gtatgtaagt ccgtaactgg 1020

aattactgtg ggttgccatg acactctgtg gtcttttggt tcatgcatgg atgcttgcgc 1080

aagaaaaaga caaagaacaa agaaaaaaga caaaacagag agacaaaacg caatcacaca 1140

accaactcaa attagtcact ggctgatcaa gatcgccgcg tccatgtatg tctaaatgcc 1200

atgcaaagca acacgtgctt aacatgcact ttaaatggct cacccatctc aacccacaca 1260

caaacacatt gcctttttct tcatcatcac cacaaccacc tgtatatatt cattctcttc 1320

cgccacctca atttcttcac ttcaacacac gtcaacctgc atatgcgtgt catcccatgc 1380

ccaaatctcc atgcatgttc caaccacctt ctctcttata taatacctat aaatacctct 1440

aatatcactc acttctttca tcatccatcc atccagagta ctactactct actactataa 1500

taccccaacc caactcatat tcaatactac tctaggatcc aacaatgtct gctccaaccg 1560

ctgacatcag ggctagggct ccagaggcta agaaggttca catcgctgat accgctatca 1620

acaggcacaa ttggtacaag cacgtgaact ggctcaacgt cttcctcatc atcggaatcc 1680

cactctacgg atgcatccaa gctttctggg ttccacttca actcaagacc gctatctggg 1740

ctgtgatcta ctacttcttc accggacttg gaatcaccgc tggataccac aggctttggg 1800

ctcactgctc atactctgct actcttccac ttaggatctg gcttgctgct gttggaggag 1860

gagctgttga gggatctatc agatggtggg ctagggatca cagggctcat cataggtaca 1920

ccgataccga caaggaccca tactctgtta ggaagggact tctctactct caccttggat 1980

ggatggtgat gaagcagaac ccaaagagga tcggaaggac cgacatctct gatctcaacg 2040

aggacccagt tgttgtttgg caacacagga actacctcaa ggttgtgttc accatgggac 2100

ttgctgttcc aatgcttgtt gctggacttg gatggggaga ttggcttgga ggattcgtgt 2160

acgctggaat ccttaggatc ttcttcgttc aacaagctac cttctgcgtg aactctcttg 2220

ctcactggct tggagatcaa ccattcgatg ataggaactc tcctagggat cacgtgatca 2280

ccgctcttgt tacccttgga gagggatacc acaacttcca ccacgagttc ccatctgact 2340

acaggaacgc tatcgagtgg caccagtacg atcctaccaa gtggtctatc tgggcttgga 2400

agcaacttgg attggcttac gatctcaaga agttcagggc taacgagatc gagaagggaa 2460

gggttcaaca acttcagaag aagcttgata ggaagagggc tactcttgat tggggaaccc 2520

cacttgatca acttccagtg atggaatggg atgactacgt tgagcaagct aagaacggaa 2580

ggggacttgt tgctatcgct ggagttgttc acgatgttac cgacttcatc aaggatcacc 2640

caggaggaaa ggctatgatc tcttctggaa tcggaaagga tgctaccgct atgttcaacg 2700

gaggagtgta ctaccactct aacgcagctc acaaccttct tagcaccatg agggtgggag 2760

tgatcagggg aggatgcgag gttgagatct ggaagagggc tcagaaggag aacgttgagt 2820

acgttaggga tggatctgga caaagggtga tcagggctgg agagcaacca accaagatcc 2880

cagagccaat cccaaccgct gatgctgctt ga 2912

<210> 4

<211> 2517

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 包含构巢曲霉delta 9 去饱和酶v3的第二植物转录单位

<400> 4

gaattcggaa atgggccaag tgaaatggaa atagagcttc aatccattta gtcccactca 60

aaatggtgct cgaattatat ttagttacgt tcgaatcaga caaccaagta tttggttaat 120

aaaaaccact cgcaacaaag gaaaaacacc aagcgcgtgc gtccaacatc cgacggaagg 180

ggggtaatgt ggtccgaaaa ccttacaaaa atctgacgtc atctaccccc gaaaacgttg 240

aatcgtcaac gggggtagtt ttcgaattat ctttttttta ggggcagttt tattaatttg 300

ctctagaaat tttatgattt taattaaaaa aagaaaaaga atatttgtat atttattttt 360

tatactcttt ttttgtccaa ctatttctct tattttggca actttaacta gactagtaac 420

ttatgtcaat gtgtatggat gcatgagagt gagtatacac atgtctaaat gcatgcctta 480

tgaaagcaac gcaccacaaa acgaagaccc ctttacaaat acatctcatc ccttagtacc 540

ctcttactac tgtcccgaca caaactcaaa acaaggtacc ctgcagggat ccaacaatgt 600

ctgctccaac cgctgacatc agggctaggg ctccagaggc taagaaggtt cacatcgctg 660

ataccgctat caacaggcac aattggtaca agcacgtgaa ctggctcaac gtcttcctca 720

tcatcggaat cccactctac ggatgcatcc aagctttctg ggttccactt caactcaaga 780

ccgctatctg ggctgtgatc tactacttct tcaccggact tggaatcacc gctggatacc 840

acaggctttg ggctcactgc tcatactctg ctactcttcc acttaggatc tggcttgctg 900

ctgttggagg aggagctgtt gagggatcta tcagatggtg ggctagggat cacagggctc 960

atcataggta caccgatacc gacaaggacc catactctgt taggaaggga cttctctact 1020

ctcaccttgg atggatggtg atgaagcaga acccaaagag gatcggaagg accgacatct 1080

ctgatctcaa cgaggaccca gttgttgttt ggcaacacag gaactacctc aaggttgtgt 1140

tcaccatggg acttgctgtt ccaatgcttg ttgctggact tggatgggga gattggcttg 1200

gaggattcgt gtacgctgga atccttagga tcttcttcgt tcaacaagct accttctgcg 1260

tgaactctct tgctcactgg cttggagatc aaccattcga tgataggaac tctcctaggg 1320

atcacgtgat caccgctctt gttacccttg gagagggata ccacaacttc caccacgagt 1380

tcccatctga ctacaggaac gctatcgagt ggcaccagta cgatcctacc aagtggtcta 1440

tctgggcttg gaagcaactt ggattggctt acgatctcaa gaagttcagg gctaacgaga 1500

tcgagaaggg aagggttcaa caacttcaga agaagcttga taggaagagg gctactcttg 1560

attggggaac cccacttgat caacttccag tgatggaatg ggatgactac gttgagcaag 1620

ctaagaacgg aaggggactt gttgctatcg ctggagttgt tcacgatgtt accgacttca 1680

tcaaggatca cccaggagga aaggctatga tctcttctgg aatcggaaag gatgctaccg 1740

ctatgttcaa cggaggagtg tactaccact ctaacgcagc tcacaacctt cttagcacca 1800

tgagggtggg agtgatcagg ggaggatgcg aggttgagat ctggaagagg gctcagaagg 1860

agaacgttga gtacgttagg gatggatctg gacaaagggt gatcagggct ggagagcaac 1920

caaccaagat cccagagcca atcccaaccg ctgatgctgc ttgagtagtt agcttaatca 1980

cctaggtcac cagcataatt tttattaatg tactaaatta ctgttttgtt aaatgcaatt 2040

ttgctttctc gggattttaa tatcaaaatc tatttagaaa tacacaatat tttgttgcag 2100

gcttgctgga gaatcgatct gctatcataa aaattacaaa aaaattttat ttgcctcaat 2160

tattttagga ttggtattaa ggacgcttaa attatttgtc gggtcactac gcatcattgt 2220

gattgagaag atcagcgata cgaaatattc gtagtactat cgataattta tttgaaaatt 2280

cataagaaaa gcaaacgtta catgaattga tgaaacaata caaagacaga taaagccacg 2340

cacatttagg atattggccg agattactga atattgagta agatcacgga atttctgaca 2400

ggagcatgtc ttcaattcag cccaaatggc agttgaaata ctcaaaccgc cccatatgca 2460

ggagcggatc attcattgtt tgtttggttg cctttgccaa catgggagtc caaggtt 2517

<210> 5

<211> 1828

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 包含膦丝菌素乙酰转移酶的植物转录单位

<400> 5

cctgcaggga gatttttcaa atcagtgcgc tagacgtgac gtaagtatcc gagtcagttt 60

ttatttttct actaatttgg tcgtttattt cggcgtgtag gacatggcaa ccgggcctga 120

atttcgcggg tattctgttt ctattccaac tttttcttga tccgcagcca ttaacgactt 180

ttgaatagat acgtctaggg tcgagggggg atccgtcgag ggggtccacc aaaaacgtaa 240

gcgcttacgt acatggtcga gggggtccac caaaaacgta agcgcttacg tacatggtcg 300

agggggtcca ccaaaaacgt aagcgcttac gtacatggtc gagggggtcc accaaaaacg 360

taagcgctta cgtacatggt cgactagagc gtgacgctcg cggtgacgcc atttcgcctt 420

ttcagaaatg gataaatagc cttgcttcct attatatctt cccaaattac caatacatta 480

cactagcatc tgaatttcat aaccaatctc gatacaccaa atcgcagatc tggatcccaa 540

accatgtctc cggagaggag accagttgag attaggccag ctacagcagc tgatatggcc 600

gcggtttgtg atatcgttaa ccattacatt gagacgtcta cagtgaactt taggacagag 660

ccacaaacac cacaagagtg gattgatgat ctagagaggt tgcaagatag atacccttgg 720

ttggttgctg aggttgaggg tgttgtggct ggtattgctt acgctgggcc ctggaaggct 780

aggaacgctt acgattggac agttgagagt actgtttacg tgtcacatag gcatcaaagg 840

ttgggcctag gatctacatt gtacacacat ttgcttaagt ctatggaggc gcaaggtttt 900

aagtctgtgg ttgctgttat aggccttcca aacgatccat ctgttaggtt gcatgaggct 960

ttgggataca cagcccgggg tacattgcgc gcagctggat acaagcatgg tggatggcat 1020

gatgttggtt tttggcaaag ggattttgag ttgccagctc ctccaaggcc agttaggcca 1080

gttacccaaa tctgagtagt tagcttaatc acctagagct cgatcggcgg caatagcttc 1140

ttagcgccat cccgggttga tcctatctgt gttgaaatag ttgcggtggg caaggctctc 1200

tttcagaaag acaggcggcc aaaggaaccc aaggtgaggt gggctatggc tctcagttcc 1260

ttgtggaagc gcttggtcta aggtgcagag gtgttagcgg gatgaagcaa aagtgtccga 1320

ttgtaacaag atatgttgat cctacgtaag gatattaaag tatgtattca tcactaatat 1380

aatcagtgta ttccaatatg tactacgatt tccaatgtct ttattgtcgc cgtatgtaat 1440

cggcgtcaca aaataatccc cggtgacttt cttttaatcc aggatgaaat aatatgttat 1500

tataattttt gcgatttggt ccgttatagg aattgaagtg tgcttgaggt cggtcgccac 1560

cactcccatt tcataatttt acatgtattt gaaaaataaa aatttatggt attcaattta 1620

aacacgtata cttgtaaaga atgatatctt gaaagaaata tagtttaaat atttattgat 1680

aaaataacaa gtcaggtatt atagtccaag caaaaacata aatttattga tgcaagttta 1740

aattcagaaa tatttcaata actgattata tcagctggta cattgccgta gatgaaagac 1800

tgagtgcgat attatggtgt aatacata 1828

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Patv5正向引物

<400> 6

acaagagtgg attgatgatc tagagaggt 29

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> patv5反向引物

<400> 7

ctttgatgcc tatgtgacac gtaaacagt 29

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pat v5探针

<400> 8

ccagcgtaag caataccagc cacaacacc 29

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HMG1正向引物

<400> 9

cctctctacc accgtctcac atg 23

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HMG1反向引物

<400> 10

gatctggccg gactgtttca 20

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HMG1探针

<400> 11

cgctcctcag ctaccacctc aacca 25

<210> 12

<211> 1523

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MgD9Ds的PCR扩增片段

<400> 12

gaattcatgg cttcgtcatc ttcctccgtg ccggagttgg ctgccgcctt ccctgatggc 60

actaccgact tcaagcccat gaggaacacc aagggctacg acgtcagcaa gccgcacatt 120

tccgagacac ctatgacact caagaactgg cataagcacg tcaactggct caacaccacc 180

ttcatcttgt ttgtgcccct ggctggtctc atatccactt actgggtccc tctgcagtgg 240

aagacggctg tatgggctgt cgtctactac ttcaacaccg gcctgggaat tactgccggt 300

aagtggctct tgaacaaacg agctaggccg ccgccctgta tccaatcatc tgtatccatc 360

cctagatgct aactagaaaa cttgcgggtt accaccgact ttgggctcac agctcgtaca 420

aggcctcgct tccgctcaaa atctaccttg ccgccgttgg cgctggtgcc gtcgagggct 480

ccatcagatg gtggtccaac ggtcaccgcg cacaccaccg atacaccgat accgagaagg 540

acccctactc agtccgcaag ggtctcctgt actcacacat gggatggatg cttctgaagc 600

agaaccccaa gaagcagggc cgcaccgaca tcaccgacct gaacgaggac cccgttgtcg 660

tttggcagca ccgcaacttc ctcaagtgtg ttatcttcat ggccctcgtc ttccccacac 720

ttgtggctgg ccttggctgg ggtgactact ggggaggttt catctacgga ggtattctgc 780

gtgtcttctt cgtccagcag gccaccttct gcgtcaactc gcttgcccac tggctcggtg 840

accagccttt cgacgatcgc aactcgccgc gtgatcacgt catcacagcc ctggtcaccc 900

ttggagaggg ataccacaac ttccaccacg agttcccttc ggactaccgc aacgctattg 960

agtggtacca gtatgacccc accaagtggt caatctggat ctggaagcag cttggtcttg 1020

cccacaacct gaagcagttc cgccaaaacg agattgagaa gggacgcgtc cagcagctgc 1080

agaagaagct cgaccagaag cgcgccaagc ttgattgggg tattcccttg gagcagcttc 1140

ccgttgttag ctgggatgac tttgttgagc agtccaagaa cggaaaggct tggattgcag 1200

ttgccggtgt catccacgat gttggtgact tcatcaagga ccaccctggt ggcagagctc 1260

tcatcaactc ggccattggc aaggacgcaa ccgcaatctt caacggcggt gtttacaacc 1320

actccaacgc cgctcacaac ctgctctcga ctatgcgtgt gggtgttttg cgtggcggct 1380

gcgaggttga gatctggaag cgcgcccagt ccgaaaacaa ggacgtctca accgtcgttg 1440

attcttcggg taaccgcatc gtccgcgcgg gtgggcaagc gaccaaggtc gtccagcctg 1500

ttccgggtgc tcaggccgcg tga 1523

<210> 13

<211> 1428

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 无内含子的MgD9Ds克隆

<400> 13

atggcttcgt catcttcctc cgtgccggag ttggctgccg ccttccctga tggcactacc 60

gacttcaagc ccatgaggaa caccaagggc tacgacgtca gcaagccgca catttccgag 120

acacctatga cactcaagaa ctggcataag cacgtcaact ggctcaacac caccttcatc 180

ttgtttgtgc ccctggctgg tctcatatcc acttactggg tccctctgca gtggaagacg 240

gctgtatggg ctgtcgtcta ctacttcaac accggcctgg gaattactgc cggttaccac 300

cgactttggg ctcacagctc gtacaaggcc tcgcttccgc tcaaaatcta ccttgccgcc 360

gttggcgctg gtgccgtcga gggctccatc agatggtggt ccaacggtca ccgcgcacac 420

caccgataca ccgataccga gaaggacccc tactcagtcc gcaagggtct cctgtactca 480

cacatgggat ggatgcttct gaagcagaac cccaagaagc agggccgcac cgacatcacc 540

gacctgaacg aggaccccgt tgtcgtttgg cagcaccgca acttcctcaa gtgtgttatc 600

ttcatggccc tcgtcttccc cacacttgtg gctggccttg gctggggtga ctactgggga 660

ggtttcatct acggaggtat tctgcgtgtc ttcttcgtcc agcaggccac cttctgcgtc 720

aactcgcttg cccactggct cggtgaccag cctttcgacg atcgcaactc gccgcgtgat 780

cacgtcatca cagccctggt cacccttgga gagggatacc acaacttcca ccacgagttc 840

ccttcggact accgcaacgc tattgagtgg taccagtatg accccaccaa gtggtcaatc 900

tggatctgga agcagcttgg tcttgcccac aacctgaagc agttccgcca aaacgagatt 960

gagaagggac gcgtccagca gctgcagaag aagctcgacc agaagcgcgc caagcttgat 1020

tggggtattc ccttggagca gcttcccgtt gttagctggg atgactttgt tgagcagtcc 1080

aagaacggaa aggcttggat tgcagttgcc ggtgtcatcc acgatgttgg tgacttcatc 1140

aaggaccacc ctggtggcag agctctcatc aactcggcca ttggcaagga cgcaaccgca 1200

atcttcaacg gcggtgttta caaccactcc aacgccgctc acaacctgct ctcgactatg 1260

cgtgtgggtg ttttgcgtgg cggctgcgag gttgagatct ggaagcgcgc ccagtccgaa 1320

aacaaggacg tctcaaccgt cgttgattct tcgggtaacc gcatcgtccg cgcgggtggg 1380

caagcgacca aggtcgtcca gcctgttccg ggtgctcagg ccgcgtga 1428

<210> 14

<211> 1997

<212> DNA

<213> Leptosphaeria nodorum

<400> 14

cccgattcat taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg 60

caacgcaatt aatgtgagtt agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct 120

tccggctcgt atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta 180

tgaccatgat tacgccaagc tcgaaattaa ccctcactaa agggaacaaa agctggagct 240

ccaccgcggt ggcggccgct ctagaactag tggatccccc gggctgcagg aattcggcac 300

gagtatgcct tcccaccagg ctgttgctgg catgcaggcc atcgaccccg agtttgtcaa 360

gcagccgtct cctatggcga gcacctcgga gcccaaccgc aactccaagt acgatcctaa 420

gaagccgcac attacagaca tgcccatcac gcggtcaaac tggtaccagc atgtcaactg 480

gctcaacgtc atcttcatca tcggcgtgcc tctcgctggc tgcgtcgccg ccttctggac 540

ccctctgcag tggaagaccg ctgcgtgggc tgtcatctac tatttctgga ctggcctcgg 600

tatcaccgcc ggataccatc gtctctgggc acacaagtca tacaacgccg gtcttcctct 660

gaggatctgg ctcgccgccg tcggcgctgg tgctgttgag ggttccatcc gctggtggag 720

ccgtgaccac cgcgcccacc accgctacac cgacaccaac aaggacccct acagtgtccg 780

caagggcctt ctctacagcc atctcggatg gatggtcatg aagcagaacc ccaagcgtat 840

cggccgcacc gacatcaccg acttgaacga ggaccccgtt gtcgtctggc agcacaagaa 900

ctacatcaag gccgtcgtca ccatgggctt gatctttccc tctgccgtcg ccggtctcat 960

gtggggcgat tggatgggtg gcttcatcta cgctggtatc ctccgtatct tcttcgtcca 1020

gcaggccacc ttctgcgtca actcgcttgc tcactggctc ggtgaccagc ccttcgacga 1080

ccgcaactct cctcgtgacc acgtcattac cgctcttgtc actctcggag agggctacca 1140

caacttccac cacgagttcc cctccgacta ccgcaacgcc atcgagtggc accagtacga 1200

ccctaccaag tggtccatct ggctgtggag caagctcggc ctcgcctcca acctcaagca 1260

gttccgctcc aacgaaatcg agaagggtcg tgtccagcag ctccagaaga agattgacca 1320

gaagcgcgcc aagctcgact ggggtgtccc tctcgaccag ctgcctgtca tagaatggga 1380

cgactatgtc gagcaggcca agaacggccg tggtctcatc gctgtcgctg gtgtcgttca 1440

tgacgttacc gacttcatca acgagcaccc cggtggcaag acgcttatca agagcggcgt 1500

tggcaaggat gccaccgcca tgttcaacgg cggtgtctac ttccactcca acggagccca 1560

caacctcctt tctaccatga gggttggtgt catccgcggt ggctgtgaag ttgagatctg 1620

gaagcgcgct cagcgtgaga acaaggatgt cggtctggtc ctggacgacg caggcaaccc 1680

aatcatcagg gctggtaacc agattaccaa ggttgcgcaa cccattcaga gtgctagtgc 1740

agcatagatt ggatcttcat cttcacgagc gatgtatggc gtttggttgt ctctcttcct 1800

tggcggacag agtaatattc aatttcttag cgatcgttag aaagcatcat ggttacgatg 1860

ctcagtcatg ttagatggcg tatgtttgta gccttcctcg agtgattggs tatgaaaagt 1920

agcctcacgg cctagaccaa gaatgaaaac attcacgatt tcagaaaaaa aaaaaaaaaa 1980

aaactcgagg gggggcc 1997

<210> 15

<211> 1370

<212> DNA

<213> Leptosphaeria nodorum

<400> 15

ggatccatgg cggccttgga cagcattcca gaggataagg ctacctcgtc gaaatcgact 60

catattcaat atcaagaagt aacttttcgg aactggtata agaagataaa ttggctcaac 120

acgacgctgg tggtgctcat acccgctctt ggactctacc taacacgcac cacgccactt 180

acacgaccta cgctcatctg gtccgtcctg tactacttct gcacagcttt cggcatcaca 240

ggcggatatc atcgactatg gagtcatcgc agctactccg ctcgtctacc gctacgctta 300

ttcctagcct tcacaggcgc cggagccatc caaggtagtg ctcgatggtg gagcgcaaat 360

caccgcgccc accaccgatg gaccgacaca atgaaggacc cctactccgt tatgcgcggc 420

ctattattct cgcacatcgg atggatggta ttgaacagcg accccaaagt caaaggccga 480

acagacgtca gtgatctcga cagcgacccc gtcgtagtct ggcagcacaa gcactacggc 540

aagtgcctgc tgttcgccgc gtggatattc cccatgatcg tagccggcct cggatgggga 600

gattggtggg gaggccttgt ctacgccggc atcattcgag cgtgtttcgt ccagcaggcg 660

acattttgcg tgaactctct cgcgcattgg atcggcgagc agccgttcga cgacagacgc 720

acgcctcgag accacgtttt gacagcgttg gtaacgatgg gagaaggata tcataacttc 780

caccacgaat tcccaagcga ttatcgcaac gcgatcatct ggtaccaata cgaccctacc 840

aaatggctca tttacctctt ctccctcggc cccttccccc tcgcatactc gctcaaaacc 900

ttccggtcca atgagattga aaaagggcgg ttgcaacaac aacaaaaagc cctggacaag 960

aagcgctcag gacttgattg gggcctaccc ctcttccaac tccctgtcat atcgtgggac 1020

gacttccaag cgcgttgcaa agagtccggc gagatgctgg ttgctgtcgc aggtgtgatt 1080

cacgacgtca gccagtttat tgaagatcac cctggaggca ggagtttgat tcggagtgcg 1140

gtgggcaaag atgggacagg gatgtttaat ggaggcgtat atgagcacag taatgcggcg 1200

cataatctgt tgtcgacaat gagggtggga gtgcttagag gtgggcagga ggtggaggtg 1260

tggaagaagc agagagtgga tgttttaggg aagagcgaca ttttgagaca ggttacgcgg 1320

gtggagaggt tggttgaggg ggctgtggct gcgtagctaa ctgaccatgg 1370

<210> 16

<211> 1428

<212> DNA

<213> Magnaporthe grisea

<400> 16

atggcttcgt catcttcctc cgtgccggag ttggctgccg ccttccctga tggcactacc 60

gacttcaagc ccatgaggaa caccaagggc tacgacgtca gcaagccgca catttccgag 120

acacctatga cactcaagaa ctggcataag cacgtcaact ggctcaacac caccttcatc 180

ttgtttgtgc ccctggctgg tctcatatcc acttactggg tccctctgca gtggaagacg 240

gctgtatggg ctgtcgtcta ctacttcaac accggcctgg gaattactgc cggttaccac 300

cgactttggg ctcacagctc gtacaaggcc tcgcttccgc tcaaaatcta ccttgccgcc 360

gttggcgctg gtgccgtcga gggctccatc agatggtggt ccaacggtca ccgcgcacac 420

caccgataca ccgataccga gaaggacccc tactcagtcc gcaagggtct cctgtactca 480

cacatgggat ggatgcttct gaagcagaac cccaagaagc agggccgcac cgacatcacc 540

gacctgaacg aggaccccgt tgtcgtttgg cagcaccgca acttcctcaa gtgtgttatc 600

ttcatggccc tcgtcttccc cacacttgtg gctggccttg gctggggtga ctactgggga 660

ggtttcatct acggaggtat tctgcgtgtc ttcttcgtcc agcaggccac cttctgcgtc 720

aactcgcttg cccactggct cggtgaccag cctttcgacg atcgcaactc gccgcgtgat 780

cacgtcatca cagccctggt cacccttgga gagggatacc acaacttcca ccacgagttc 840

ccttcggact accgcaacgc tattgagtgg taccagtatg accccaccaa gtggtcaatc 900

tggatctgga agcagcttgg tcttgcccac aacctgaagc agttccgcca aaacgagatt 960

gagaagggac gcgtccagca gctgcagaag aagctcgacc agaagcgcgc caagcttgat 1020

tggggtattc ccttggagca gcttcccgtt gttagctggg atgactttgt tgagcagtcc 1080

aagaacggaa aggcttggat tgcagttgcc ggtgtcatcc acgatgttgg tgacttcatc 1140

aaggaccacc ctggtggcag agctctcatc aactcggcca ttggcaagga cgcaaccgca 1200

atcttcaacg gcggtgttta caaccactcc aacgccgctc acaacctgct ctcgactatg 1260

cgtgtgggtg ttttgcgtgg cggctgcgag gttgagatct ggaagcgcgc ccagtccgaa 1320

aacaaggacg tctcaaccgt cgttgattct tcgggtaacc gcatcgtccg cgcgggtggg 1380

caagcgacca aggtcgtcca gcctgttccg ggtgctcagg ccgcgtga 1428

<210> 17

<211> 1062

<212> DNA

<213> Helicoverpa zea

<400> 17

atggctccaa atatatcgga ggatgtgaac ggggtgctct tcgagagtga tgcagcgacg 60

ccggacctgg cgctgtccac gccgcctgtg cagaaggctg acaacaggcc caagcaactg 120

gtgtggagga acatactact gttcgcgtat cttcacttag cggctcttta cggaggttat 180

ctgttcctct tctcagctaa atggcagaca gacatatttg cctacatcct gtatgtgatc 240

tccgggcttg gtatcacggc tggagcacat cgcctgtggg cccacaagtc ctacaaagct 300

aaatggcctc tccgagttat cctggtcatc tttaacacag tggcattcca ggatgccgct 360

atggactggg cgcgcgacca ccgcatgcat cacaagtact cggaaaccga tgctgatcct 420

cataatgcga cccgaggatt cttcttctct cacattggct ggctgcttgt caggaaacat 480

cccgacctta aggagaaggg caagggactc gacatgagcg acttacttgc tgaccccatt 540

ctcaggttcc agaaaaaata ctacctgatc ctgatgccct tggcttgctt cgtgatgcct 600

accgtgattc ctgtgtactt ctggggtgaa acctggacca acgcattctt tgtggcggcc 660

atgttccgct acgcgttcat cctaaatgtg acgtggctcg tcaactctgc cgctcacaag 720

tggggagaca agccctacga caaaagcatt aagccttccg aaaacttgtc ggtcgccatg 780

ttcgctctcg gagaaggatt ccacaactac caccacactt tcccttggga ctacaaaact 840

gctgagctgg gcaacaacaa actcaacttc actaccacct ttattaactt cttcgctaaa 900

attggctggg cttacgacct gaagacagtg tctgatgata tcgtcaagaa cagggtgaag 960

cgcactggtg acggctccca ccacctgtgg ggctggggag acgaaaatca atccaaagaa 1020

gaaattgatg ccgctatcag aatcaatcct aaggacgatt aa 1062

<210> 18

<211> 1350

<212> DNA

<213> Leptosphaeria nodorum

<400> 18

atggcggcct tggacagcat tccagaggat aaggctacct cgtcgaaatc gactcatatt 60

caatatcaag aagtaacttt tcggaactgg tataagaaga taaattggct caacacgacg 120

ctggtggtgc tcatacccgc tcttggactc tacctaacac gcaccacgcc acttacacga 180

cctacgctca tctggtccgt cctgtactac ttctgcacag ctttcggcat cacaggcgga 240

tatcatcgac tatggagtca tcgcagctac tccgctcgtc taccgctacg cttattccta 300

gccttcacag gcgccggagc catccaaggt agtgctcgat ggtggagcgc aaatcaccgc 360

gcccaccacc gatggaccga cacaatgaag gacccctact ccgttatgcg cggcctatta 420

ttctcgcaca tcggatggat ggtattgaac agcgacccca aagtcaaagg ccgaacagac 480

gtcagtgatc tcgacagcga ccccgtcgta gtctggcagc acaagcacta cggcaagtgc 540

ctgctgttcg ccgcgtggat attccccatg atcgtagccg gcctcggatg gggagattgg 600

tggggaggcc ttgtctacgc cggcatcatt cgagcgtgtt tcgtccagca ggcgacattt 660

tgcgtgaact ctctcgcgca ttggatcggc gagcagccgt tcgacgacag acgcacgcct 720

cgagaccacg ttttgacagc gttggtaacg atgggagaag gatatcataa cttccaccac 780

gaattcccaa gcgattatcg caacgcgatc atctggtacc aatacgaccc taccaaatgg 840

ctcatttacc tcttctccct cggccccttc cccctcgcat actcgctcaa aaccttccgg 900

tccaatgaga ttgaaaaagg gcggttgcaa caacaacaaa aagccctgga caagaagcgc 960

tcaggacttg attggggcct acccctcttc caactccctg tcatatcgtg ggacgacttc 1020

caagcgcgtt gcaaagagtc cggcgagatg ctggttgctg tcgcaggtgt gattcacgac 1080

gtcagccagt ttattgaaga tcaccctgga ggcaggagtt tgattcggag tgcggtgggc 1140

aaagatggga cagggatgtt taatggaggc gtatatgagc acagtaatgc ggcgcataat 1200

ctgttgtcga caatgagggt gggagtgctt agaggtgggc aggaggtgga ggtgtggaag 1260

aagcagagag tggatgtttt agggaagagc gacattttga gacaggttac gcgggtggag 1320

aggttggttg agggggctgt ggctgcgtag 1350

<210> 19

<211> 1428

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 卡诺拉优化的去饱和酶序列

<400> 19

atggccagca gttcttcaag tgtgccagaa cttgccgcag ctttccctga tgggacaacg 60

gacttcaaac ccatgaggaa caccaaaggc tatgatgtct ccaaacctca catctctgaa 120

acaccgatga ctttgaagaa ctggcacaaa catgtgaact ggctcaacac cacattcatt 180

ctctttgttc cactggctgg gttgatctca acctattggg ttcctcttca atggaaaact 240

gcagtgtggg cagttgtgta ctacttcaac actggacttg ggatcactgc tggctaccat 300

agattgtggg cacattcctc ttacaaggcc agcttgcctc tcaaaatcta ccttgccgca 360

gttggtgctg gagccgttga aggttccata agatggtgga gcaacggaca cagagcacat 420

cacagataca cagacacaga gaaagatcct tactcagtga ggaagggatt gctctacagc 480

cacatgggtt ggatgctctt gaagcagaat ccaaagaagc aagggaggac ggacattact 540

gatctgaatg aggacccagt tgtggtctgg caacatagga actttctcaa gtgtgtgatc 600

ttcatggctt tggtctttcc cacccttgtt gctggcctgg gatggggaga ctactgggga 660

ggtttcatct atggagggat cttgagagtg ttctttgttc agcaagccac cttctgtgtc 720

aactcacttg cacattggct tggtgatcaa ccgtttgatg acagaaactc tccacgtgac 780

catgtcataa ctgctcttgt cacgctgggt gaaggctatc acaactttca ccatgagttt 840

ccgtcagact atagaaatgc gattgagtgg tatcagtatg accccacgaa gtggagcatt 900

tggatttgga agcaacttgg acttgctcac aatctcaagc agttcagaca gaatgagata 960

gagaagggaa gggttcaaca gttgcagaag aaactggatc agaagagagc gaaacttgat 1020

tggggaatac cgttggaaca actccctgtt gtgtcttggg atgactttgt tgaacagtca 1080

aagaatggca aggcatggat tgctgttgct ggtgtcattc acgatgttgg tgacttcatc 1140

aaggatcatc ctggtggacg tgctctcatc aactctgcga ttggcaaaga tgccacagcg 1200

atcttcaatg gaggtgtcta caatcattca aatgccgcac acaaccttct ctccaccatg 1260

agggttggtg tcctccgtgg agggtgcgaa gtggagatat ggaaacgtgc tcaaagtgag 1320

aacaaagatg tctctactgt ggttgatagt tctggcaacc gtattgtgag agctggtgga 1380

caagctacca aagtggttca gccagtccct ggtgctcaag cagcttga 1428

<210> 20

<211> 1062

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 卡诺拉优化的去饱和酶序列

<400> 20

atggctccca acatttctga ggatgtcaat ggtgttcttt ttgagtcaga tgcggcaacc 60

cctgatttgg ctctttccac accacctgtg caaaaagctg acaacagacc caagcaactt 120

gtgtggagga acattttgct tttcgcttac ttgcacctcg cagctctcta cggaggctat 180

ttgtttctct tcagtgcaaa atggcagacc gacattttcg cttacattct ttatgtcatc 240

tctggactgg ggataactgc tggggcacat agactctggg ctcacaagtc atacaaagcc 300

aagtggccac tcagagttat actggtcatc ttcaacacgg ttgcctttca agacgctgct 360

atggattggg ctcgtgacca tagaatgcat cacaagtaca gcgagaccga cgcggaccca 420

cacaatgcaa cgagaggttt cttcttctct cacattggct ggcttcttgt taggaaacat 480

cctgatctga aagaaaaagg gaagggactc gacatgagtg atctccttgc tgatccaata 540

ctccgttttc agaagaagta ctatctgatc ctcatgcctc tggcctgttt tgtgatgcca 600

accgttatcc cggtttactt ttggggagaa acttggacaa atgctttctt cgtggcagcc 660

atgttccgtt atgctttcat cctgaatgtt acctggttgg tgaactctgc cgcacacaag 720

tggggagaca aaccctatga caagtccatc aagccttccg aaaacctttc agttgcgatg 780

tttgctttgg gagaaggatt tcacaattac catcacactt ttccgtggga ctacaagaca 840

gcagagcttg gaaacaacaa gttgaacttc acaacaacgt tcatcaattt ctttgcgaaa 900

atcggttggg cctatgattt gaagactgtg agtgatgaca ttgtcaagaa cagggtcaag 960

agaactggcg atggaagcca tcatctctgg ggctggggtg atgagaatca gagcaaagaa 1020

gagatagatg cagccattag gatcaaccct aaagacgatt ga 1062

<210> 21

<211> 1350

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 卡诺拉优化的去饱和酶序列

<400> 21

atggctgcac ttgatagcat ccctgaggac aaagcaacta gctccaagtc aacccacata 60

cagtaccaag aggtcacgtt taggaactgg tacaagaaaa tcaactggct caacacgacc 120

cttgttgtcc tcattcctgc tcttgggttg tacttgacga gaaccacacc tctcaccaga 180

cctaccctca tttggtctgt tctctactat ttctgtacag cgtttggcat cactggtggc 240

taccacagac tttggtccca taggtcttac agtgcgaggt tgccattgag actcttcctg 300

gctttcactg gagctggtgc gatccaaggt tctgcaagat ggtggtcagc caatcatagg 360

gcacatcacc gttggacgga caccatgaag gacccctact ctgtgatgag aggactgctg 420

ttctcccaca taggttggat ggttctcaac tctgatccaa aggtcaaagg cagaacagat 480

gtttctgatc ttgactctga tcccgtcgtt gtgtggcaac acaaacacta tggcaagtgt 540

ttgctctttg ccgcttggat ctttccgatg atagtggctg ggctgggttg gggagattgg 600

tggggtggac ttgtctatgc tggcatcata cgtgcctgct ttgttcagca agccactttc 660

tgtgtcaact cattggcaca ttggataggt gaacaaccgt ttgatgacag acgtactcca 720

agggatcatg ttctgactgc gttggtcaca atgggagaag gataccacaa cttccaccat 780

gagtttccga gtgactacag aaatgccatc atttggtatc agtatgaccc tacaaagtgg 840

ctcatctatc tcttcagctt gggtcccttc ccattggcct actctctcaa gaccttccgt 900

tccaatgaga ttgagaaagg aaggcttcag caacagcaaa aggctcttga caagaaaaga 960

agtggtcttg attggggact tcctctcttc cagcttccag tgatctcatg ggatgacttt 1020

caagctcgtt gcaaagaaag tggagagatg cttgttgctg ttgctggagt gatccatgat 1080

gtctcccagt tcattgaaga tcatcctggt gggaggagcc tcattagaag tgctgttggg 1140

aaagatggga ctggcatgtt caatggtgga gtgtatgaac attcaaacgc cgcacacaac 1200

ttgctgagca caatgagagt tggagtcttg agaggtggac aagaagtgga ggtttggaag 1260

aaacagaggg tggatgttct tgggaagtca gacattcttc gtcaagtgac aagggtggag 1320

cgtctggtgg aaggagctgt tgcagcgtga 1350

<210> 22

<211> 1350

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 卡诺拉优化的去饱和酶

<400> 22

atggctgctc ttgattctat cccagaggat aaggctacct cttctaagtc tacccacatc 60

caataccaag aagttacctt caggaactgg tacaagaaga tcaactggct taacaccacc 120

cttgttgttc ttatcccagc tcttggactt taccttacca ggaccacccc acttaccagg 180

ccaaccctta tctggtctgt tctttactac ttctgcaccg ctttcggaat aaccggagga 240

taccacaggc tttggtctca caggtcttac tctgctaggc ttccacttag gcttttcctt 300

gctttcaccg gagctggagc tatccaagga tctgctagat ggtggtctgc taaccacagg 360

gctcaccaca ggtggaccga taccatgaag gacccatact ctgttatgag gggacttctt 420

ttctctcaca tcggatggat ggttcttaac tctgatccaa aggttaaggg aaggaccgat 480

gtttctgatc ttgattctga tccagttgtt gtttggcaac acaagcacta cggaaagtgc 540

cttcttttcg ctgcttggat cttcccaatg atcgttgctg gacttggatg gggagattgg 600

tggggaggac ttgtttacgc tggaatcatc agggcttgct tcgttcaaca agctaccttc 660

tgcgttaact ctcttgctca ctggatcgga gagcaaccat tcgacgatag gaggacccca 720

agggatcacg ttcttaccgc tcttgttacc atgggagagg gataccacaa cttccaccac 780

gagttcccat ctgattacag gaacgctatc atctggtacc aatacgatcc aaccaagtgg 840

cttatctacc ttttctctct tggaccattc ccacttgctt actctcttaa gaccttcagg 900

tctaacgaga tcgagaaggg aaggcttcaa caacaacaaa aggctcttga taagaagagg 960

tctggacttg attggggact tccacttttc caacttccag ttatctcttg ggatgatttc 1020

caagctaggt gcaaggagtc tggagagatg cttgttgctg ttgctggagt tatccacgat 1080

gtttctcaat tcatcgagga tcacccagga ggaaggtctc ttatcaggtc tgctgttgga 1140

aaggatggaa ccggaatgtt caacggagga gtttacgagc actctaacgc tgctcacaac 1200

cttctttcta ccatgagggt tggagttctt aggggaggac aagaggttga ggtttggaag 1260

aagcaaaggg ttgatgttct tggaaagtca gatatcctta ggcaagttac cagggttgag 1320

aggcttgttg agggagctgt tgctgcttga 1350

<210> 23

<211> 1062

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 卡诺拉优化的去饱和酶

<400> 23

atggctccaa acatctctga ggatgttaac ggagttcttt tcgagtctga tgctgctacc 60

ccagatcttg ctctttctac cccaccagtt caaaaggctg ataacaggcc aaagcaactt 120

gtttggagga acatccttct tttcgcttac cttcaccttg ctgctcttta cggaggatac 180

cttttccttt tctctgctaa gtggcaaacc gatatcttcg cttacatcct ttacgttatc 240

tctggacttg gaataaccgc tggagcacac aggctttggg ctcacaagtc ttacaaggct 300

aagtggccac ttagggttat ccttgttatc ttcaacaccg ttgctttcca agacgctgct 360

atggattggg ctagggatca caggatgcac cacaagtact ctgagaccga cgctgatcca 420

cacaacgcta ccaggggatt cttcttctct cacatcggat ggcttcttgt taggaagcac 480

ccagatctta aggagaaggg aaagggactt gatatgtctg atcttcttgc tgatccaatc 540

cttaggttcc aaaagaagta ctaccttatc cttatgccac ttgcttgctt cgttatgcca 600

accgttatcc cagtttactt ctggggagag acctggacca acgctttctt cgttgctgct 660

atgttcaggt acgctttcat ccttaacgtt acctggcttg ttaactctgc tgctcacaag 720

tggggagata agccatacga taagtctatc aagccatctg agaacctttc tgttgctatg 780

ttcgctcttg gagagggatt ccacaactac caccacacct tcccatggga ttacaagacc 840

gctgagcttg gaaacaacaa gcttaacttc accaccacct tcatcaactt cttcgctaag 900

atcggatggg cttacgatct taagaccgtt tctgatgata tcgttaagaa cagggttaag 960

aggaccggag atggatcaca ccacctttgg ggatggggag atgagaacca atctaaggag 1020

gagatcgatg ctgctatcag gatcaaccca aaggatgatt ga 1062

<210> 24

<211> 1368

<212> DNA

<213> 构巢曲霉

<400> 24

atgtctgctc caaccgctga catcagggct agggctccag aggctaagaa ggttcacatc 60

gctgataccg ctatcaacag gcacaattgg tacaagcacg tgaactggct caacgtcttc 120

ctcatcatcg gaatcccact ctacggatgc atccaagctt tctgggttcc acttcaactc 180

aagaccgcta tctgggctgt gatctactac ttcttcaccg gacttggaat caccgctgga 240

taccacaggc tttgggctca ctgctcttac tctgctactc ttccacttag gatctggctt 300

gctgctgttg gaggaggagc tgttgaggga tctatcagat ggtgggctag ggatcacagg 360

gctcatcata ggtacaccga taccgacaag gacccatact ctgttaggaa gggacttctc 420

tactctcacc ttggatggat ggtgatgaag cagaacccaa agaggatcgg aaggaccgac 480

atctctgatc tcaacgagga cccagttgtt gtttggcaac acaggaacta cctcaaggtt 540

gtgttcacca tgggacttgc tgttccaatg cttgttgctg gacttggatg gggagattgg 600

cttggaggat tcgtgtacgc tggaatcctt aggatcttct tcgttcaaca agctaccttc 660

tgcgtgaact ctcttgctca ctggcttgga gatcaaccat tcgatgatag gaactctcct 720

agggatcacg tgatcaccgc tcttgttacc cttggagagg gataccacaa cttccaccac 780

gagttcccat ctgactacag gaacgctatc gagtggcacc agtacgatcc taccaagtgg 840

tctatctggg cttggaagca acttggattg gcttacgatc tcaagaagtt cagggctaac 900

gagatcgaga agggaagggt tcaacaactt cagaagaagc ttgataggaa gagggctact 960

cttgattggg gaaccccact tgatcaactt ccagtgatgg aatgggatga ctacgttgag 1020

caagctaaga acggaagggg acttgttgct atcgctggag ttgttcacga tgttaccgac 1080

ttcatcaagg atcacccagg aggaaaggct atgatctctt ctggaatcgg aaaggatgct 1140

accgctatgt tcaacggagg agtgtactac cactctaacg cagctcacaa ccttcttagc 1200

accatgaggg tgggagtgat caggggagga tgcgaggttg agatctggaa gagggctcag 1260

aaggagaacg ttgagtacgt tagggatgga tctggacaaa gggtgatcag ggctggagag 1320

caaccaacca agatcccaga gccaatccca accgctgatg ctgcttga 1368

<210> 25

<211> 1368

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AnD9DS v3沉默突变体

<400> 25

atgtctgctc caaccgctga catcagggct agggctccag aggctaagaa ggttcacatc 60

gctgataccg ctatcaacag gcacaattgg tacaagcacg tgaactggct caacgtcttc 120

ctcatcatcg gaatcccact ctacggatgc atccaagctt tctgggttcc acttcaactc 180

aagaccgcta tctgggctgt gatctactac ttcttcaccg gacttggaat caccgctgga 240

taccacaggc tttgggctca ctgctcatac tctgctactc ttccacttag gatctggctt 300

gctgctgttg gaggaggagc tgttgaggga tctatcagat ggtgggctag ggatcacagg 360

gctcatcata ggtacaccga taccgacaag gacccatact ctgttaggaa gggacttctc 420

tactctcacc ttggatggat ggtgatgaag cagaacccaa agaggatcgg aaggaccgac 480

atctctgatc tcaacgagga cccagttgtt gtttggcaac acaggaacta cctcaaggtt 540

gtgttcacca tgggacttgc tgttccaatg cttgttgctg gacttggatg gggagattgg 600

cttggaggat tcgtgtacgc tggaatcctt aggatcttct tcgttcaaca agctaccttc 660

tgcgtgaact ctcttgctca ctggcttgga gatcaaccat tcgatgatag gaactctcct 720

agggatcacg tgatcaccgc tcttgttacc cttggagagg gataccacaa cttccaccac 780

gagttcccat ctgactacag gaacgctatc gagtggcacc agtacgatcc taccaagtgg 840

tctatctggg cttggaagca acttggattg gcttacgatc tcaagaagtt cagggctaac 900

gagatcgaga agggaagggt tcaacaactt cagaagaagc ttgataggaa gagggctact 960

cttgattggg gaaccccact tgatcaactt ccagtgatgg aatgggatga ctacgttgag 1020

caagctaaga acggaagggg acttgttgct atcgctggag ttgttcacga tgttaccgac 1080

ttcatcaagg atcacccagg aggaaaggct atgatctctt ctggaatcgg aaaggatgct 1140

accgctatgt tcaacggagg agtgtactac cactctaacg cagctcacaa ccttcttagc 1200

accatgaggg tgggagtgat caggggagga tgcgaggttg agatctggaa gagggctcag 1260

aaggagaacg ttgagtacgt tagggatgga tctggacaaa gggtgatcag ggctggagag 1320

caaccaacca agatcccaga gccaatccca accgctgatg ctgcttga 1368

<210> 26

<211> 475

<212> PRT

<213> Magnaporthe grisea

<400> 26

Met Ala Ser Ser Ser Ser Ser Val Pro Glu Leu Ala Ala Ala Phe Pro

1 5 10 15

Asp Gly Thr Thr Asp Phe Lys Pro Met Arg Asn Thr Lys Gly Tyr Asp

20 25 30

Val Ser Lys Pro His Ile Ser Glu Thr Pro Met Thr Leu Lys Asn Trp

35 40 45

His Lys His Val Asn Trp Leu Asn Thr Thr Phe Ile Leu Phe Val Pro

50 55 60

Leu Ala Gly Leu Ile Ser Thr Tyr Trp Val Pro Leu Gln Trp Lys Thr

65 70 75 80

Ala Val Trp Ala Val Val Tyr Tyr Phe Asn Thr Gly Leu Gly Ile Thr

85 90 95

Ala Gly Tyr His Arg Leu Trp Ala His Ser Ser Tyr Lys Ala Ser Leu

100 105 110

Pro Leu Lys Ile Tyr Leu Ala Ala Val Gly Ala Gly Ala Val Glu Gly

115 120 125

Ser Ile Arg Trp Trp Ser Asn Gly His Arg Ala His His Arg Tyr Thr

130 135 140

Asp Thr Glu Lys Asp Pro Tyr Ser Val Arg Lys Gly Leu Leu Tyr Ser

145 150 155 160

His Met Gly Trp Met Leu Leu Lys Gln Asn Pro Lys Lys Gln Gly Arg

165 170 175

Thr Asp Ile Thr Asp Leu Asn Glu Asp Pro Val Val Val Trp Gln His

180 185 190

Arg Asn Phe Leu Lys Cys Val Ile Phe Met Ala Leu Val Phe Pro Thr

195 200 205

Leu Val Ala Gly Leu Gly Trp Gly Asp Tyr Trp Gly Gly Phe Ile Tyr

210 215 220

Gly Gly Ile Leu Arg Val Phe Phe Val Gln Gln Ala Thr Phe Cys Val

225 230 235 240

Asn Ser Leu Ala His Trp Leu Gly Asp Gln Pro Phe Asp Asp Arg Asn

245 250 255

Ser Pro Arg Asp His Val Ile Thr Ala Leu Val Thr Leu Gly Glu Gly

260 265 270

Tyr His Asn Phe His His Glu Phe Pro Ser Asp Tyr Arg Asn Ala Ile

275 280 285

Glu Trp Tyr Gln Tyr Asp Pro Thr Lys Trp Ser Ile Trp Ile Trp Lys

290 295 300

Gln Leu Gly Leu Ala His Asn Leu Lys Gln Phe Arg Gln Asn Glu Ile

305 310 315 320

Glu Lys Gly Arg Val Gln Gln Leu Gln Lys Lys Leu Asp Gln Lys Arg

325 330 335

Ala Lys Leu Asp Trp Gly Ile Pro Leu Glu Gln Leu Pro Val Val Ser

340 345 350

Trp Asp Asp Phe Val Glu Gln Ser Lys Asn Gly Lys Ala Trp Ile Ala

355 360 365

Val Ala Gly Val Ile His Asp Val Gly Asp Phe Ile Lys Asp His Pro

370 375 380

Gly Gly Arg Ala Leu Ile Asn Ser Ala Ile Gly Lys Asp Ala Thr Ala

385 390 395 400

Ile Phe Asn Gly Gly Val Tyr Asn His Ser Asn Ala Ala His Asn Leu

405 410 415

Leu Ser Thr Met Arg Val Gly Val Leu Arg Gly Gly Cys Glu Val Glu

420 425 430

Ile Trp Lys Arg Ala Gln Ser Glu Asn Lys Asp Val Ser Thr Val Val

435 440 445

Asp Ser Ser Gly Asn Arg Ile Val Arg Ala Gly Gly Gln Ala Thr Lys

450 455 460

Val Val Gln Pro Val Pro Gly Ala Gln Ala Ala

465 470 475

<210> 27

<211> 353

<212> PRT

<213> Helicoverpa zea

<400> 27

Met Ala Pro Asn Ile Ser Glu Asp Val Asn Gly Val Leu Phe Glu Ser

1 5 10 15

Asp Ala Ala Thr Pro Asp Leu Ala Leu Ser Thr Pro Pro Val Gln Lys

20 25 30

Ala Asp Asn Arg Pro Lys Gln Leu Val Trp Arg Asn Ile Leu Leu Phe

35 40 45

Ala Tyr Leu His Leu Ala Ala Leu Tyr Gly Gly Tyr Leu Phe Leu Phe

50 55 60

Ser Ala Lys Trp Gln Thr Asp Ile Phe Ala Tyr Ile Leu Tyr Val Ile

65 70 75 80

Ser Gly Leu Gly Ile Thr Ala Gly Ala His Arg Leu Trp Ala His Lys

85 90 95

Ser Tyr Lys Ala Lys Trp Pro Leu Arg Val Ile Leu Val Ile Phe Asn

100 105 110

Thr Val Ala Phe Gln Asp Ala Ala Met Asp Trp Ala Arg Asp His Arg

115 120 125

Met His His Lys Tyr Ser Glu Thr Asp Ala Asp Pro His Asn Ala Thr

130 135 140

Arg Gly Phe Phe Phe Ser His Ile Gly Trp Leu Leu Val Arg Lys His

145 150 155 160

Pro Asp Leu Lys Glu Lys Gly Lys Gly Leu Asp Met Ser Asp Leu Leu

165 170 175

Ala Asp Pro Ile Leu Arg Phe Gln Lys Lys Tyr Tyr Leu Ile Leu Met

180 185 190

Pro Leu Ala Cys Phe Val Met Pro Thr Val Ile Pro Val Tyr Phe Trp

195 200 205

Gly Glu Thr Trp Thr Asn Ala Phe Phe Val Ala Ala Met Phe Arg Tyr

210 215 220

Ala Phe Ile Leu Asn Val Thr Trp Leu Val Asn Ser Ala Ala His Lys

225 230 235 240

Trp Gly Asp Lys Pro Tyr Asp Lys Ser Ile Lys Pro Ser Glu Asn Leu

245 250 255

Ser Val Ala Met Phe Ala Leu Gly Glu Gly Phe His Asn Tyr His His

260 265 270

Thr Phe Pro Trp Asp Tyr Lys Thr Ala Glu Leu Gly Asn Asn Lys Leu

275 280 285

Asn Phe Thr Thr Thr Phe Ile Asn Phe Phe Ala Lys Ile Gly Trp Ala

290 295 300

Tyr Asp Leu Lys Thr Val Ser Asp Asp Ile Val Lys Asn Arg Val Lys

305 310 315 320

Arg Thr Gly Asp Gly Ser His His Leu Trp Gly Trp Gly Asp Glu Asn

325 330 335

Gln Ser Lys Glu Glu Ile Asp Ala Ala Ile Arg Ile Asn Pro Lys Asp

340 345 350

Asp

<210> 28

<211> 449

<212> PRT

<213> Leptosphaeria nodorum

<400> 28

Met Ala Ala Leu Asp Ser Ile Pro Glu Asp Lys Ala Thr Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr His Ile Gln Tyr Gln Glu Val Thr Phe Arg Asn Trp Tyr Lys

20 25 30

Lys Ile Asn Trp Leu Asn Thr Thr Leu Val Val Leu Ile Pro Ala Leu

35 40 45

Gly Leu Tyr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Leu Thr Arg Pro Thr Leu Ile

50 55 60

Trp Ser Val Leu Tyr Tyr Phe Cys Thr Ala Phe Gly Ile Thr Gly Gly

65 70 75 80

Tyr His Arg Leu Trp Ser His Arg Ser Tyr Ser Ala Arg Leu Pro Leu

85 90 95

Arg Leu Phe Leu Ala Phe Thr Gly Ala Gly Ala Ile Gln Gly Ser Ala

100 105 110

Arg Trp Trp Ser Ala Asn His Arg Ala His His Arg Trp Thr Asp Thr

115 120 125

Met Lys Asp Pro Tyr Ser Val Met Arg Gly Leu Leu Phe Ser His Ile

130 135 140

Gly Trp Met Val Leu Asn Ser Asp Pro Lys Val Lys Gly Arg Thr Asp

145 150 155 160

Val Ser Asp Leu Asp Ser Asp Pro Val Val Val Trp Gln His Lys His

165 170 175

Tyr Gly Lys Cys Leu Leu Phe Ala Ala Trp Ile Phe Pro Met Ile Val

180 185 190

Ala Gly Leu Gly Trp Gly Asp Trp Trp Gly Gly Leu Val Tyr Ala Gly

195 200 205

Ile Ile Arg Ala Cys Phe Val Gln Gln Ala Thr Phe Cys Val Asn Ser

210 215 220

Leu Ala His Trp Ile Gly Glu Gln Pro Phe Asp Asp Arg Arg Thr Pro

225 230 235 240

Arg Asp His Val Leu Thr Ala Leu Val Thr Met Gly Glu Gly Tyr His

245 250 255

Asn Phe His His Glu Phe Pro Ser Asp Tyr Arg Asn Ala Ile Ile Trp

260 265 270

Tyr Gln Tyr Asp Pro Thr Lys Trp Leu Ile Tyr Leu Phe Ser Leu Gly

275 280 285

Pro Phe Pro Leu Ala Tyr Ser Leu Lys Thr Phe Arg Ser Asn Glu Ile

290 295 300

Glu Lys Gly Arg Leu Gln Gln Gln Gln Lys Ala Leu Asp Lys Lys Arg

305 310 315 320

Ser Gly Leu Asp Trp Gly Leu Pro Leu Phe Gln Leu Pro Val Ile Ser

325 330 335

Trp Asp Asp Phe Gln Ala Arg Cys Lys Glu Ser Gly Glu Met Leu Val

340 345 350

Ala Val Ala Gly Val Ile His Asp Val Ser Gln Phe Ile Glu Asp His

355 360 365

Pro Gly Gly Arg Ser Leu Ile Arg Ser Ala Val Gly Lys Asp Gly Thr

370 375 380

Gly Met Phe Asn Gly Gly Val Tyr Glu His Ser Asn Ala Ala His Asn

385 390 395 400

Leu Leu Ser Thr Met Arg Val Gly Val Leu Arg Gly Gly Gln Glu Val

405 410 415

Glu Val Trp Lys Lys Gln Arg Val Asp Val Leu Gly Lys Ser Asp Ile

420 425 430

Leu Arg Gln Val Thr Arg Val Glu Arg Leu Val Glu Gly Ala Val Ala

435 440 445

Ala

<210> 29

<211> 455

<212> PRT

<213> 构巢曲霉

<400> 29

Met Ser Ala Pro Thr Ala Asp Ile Arg Ala Arg Ala Pro Glu Ala Lys

1 5 10 15

Lys Val His Ile Ala Asp Thr Ala Ile Asn Arg His Asn Trp Tyr Lys

20 25 30

His Val Asn Trp Leu Asn Val Phe Leu Ile Ile Gly Ile Pro Leu Tyr

35 40 45

Gly Cys Ile Gln Ala Phe Trp Val Pro Leu Gln Leu Lys Thr Ala Ile

50 55 60

Trp Ala Val Ile Tyr Tyr Phe Phe Thr Gly Leu Gly Ile Thr Ala Gly

65 70 75 80

Tyr His Arg Leu Trp Ala His Cys Ser Tyr Ser Ala Thr Leu Pro Leu

85 90 95

Arg Ile Trp Leu Ala Ala Val Gly Gly Gly Ala Val Glu Gly Ser Ile

100 105 110

Arg Trp Trp Ala Arg Asp His Arg Ala His His Arg Tyr Thr Asp Thr

115 120 125

Asp Lys Asp Pro Tyr Ser Val Arg Lys Gly Leu Leu Tyr Ser His Leu

130 135 140

Gly Trp Met Val Met Lys Gln Asn Pro Lys Arg Ile Gly Arg Thr Asp

145 150 155 160

Ile Ser Asp Leu Asn Glu Asp Pro Val Val Val Trp Gln His Arg Asn

165 170 175

Tyr Leu Lys Val Val Phe Thr Met Gly Leu Ala Val Pro Met Leu Val

180 185 190

Ala Gly Leu Gly Trp Gly Asp Trp Leu Gly Gly Phe Val Tyr Ala Gly

195 200 205

Ile Leu Arg Ile Phe Phe Val Gln Gln Ala Thr Phe Cys Val Asn Ser

210 215 220

Leu Ala His Trp Leu Gly Asp Gln Pro Phe Asp Asp Arg Asn Ser Pro

225 230 235 240

Arg Asp His Val Ile Thr Ala Leu Val Thr Leu Gly Glu Gly Tyr His

245 250 255

Asn Phe His His Glu Phe Pro Ser Asp Tyr Arg Asn Ala Ile Glu Trp

260 265 270

His Gln Tyr Asp Pro Thr Lys Trp Ser Ile Trp Ala Trp Lys Gln Leu

275 280 285

Gly Leu Ala Tyr Asp Leu Lys Lys Phe Arg Ala Asn Glu Ile Glu Lys

290 295 300

Gly Arg Val Gln Gln Leu Gln Lys Lys Leu Asp Arg Lys Arg Ala Thr

305 310 315 320

Leu Asp Trp Gly Thr Pro Leu Asp Gln Leu Pro Val Met Glu Trp Asp

325 330 335

Asp Tyr Val Glu Gln Ala Lys Asn Gly Arg Gly Leu Val Ala Ile Ala

340 345 350

Gly Val Val His Asp Val Thr Asp Phe Ile Lys Asp His Pro Gly Gly

355 360 365

Lys Ala Met Ile Ser Ser Gly Ile Gly Lys Asp Ala Thr Ala Met Phe

370 375 380

Asn Gly Gly Val Tyr Tyr His Ser Asn Ala Ala His Asn Leu Leu Ser

385 390 395 400

Thr Met Arg Val Gly Val Ile Arg Gly Gly Cys Glu Val Glu Ile Trp

405 410 415

Lys Arg Ala Gln Lys Glu Asn Val Glu Tyr Val Arg Asp Gly Ser Gly

420 425 430

Gln Arg Val Ile Arg Ala Gly Glu Gln Pro Thr Lys Ile Pro Glu Pro

435 440 445

Ile Pro Thr Ala Asp Ala Ala

450 455

<210> 30

<211> 455

<212> PRT

<213> 构巢曲霉

<400> 30

Met Ser Ala Pro Thr Ala Asp Ile Arg Ala Arg Ala Pro Glu Ala Lys

1 5 10 15

Lys Val His Ile Ala Asp Thr Ala Ile Asn Arg His Asn Trp Tyr Lys

20 25 30

His Val Asn Trp Leu Asn Val Phe Leu Ile Ile Gly Ile Pro Leu Tyr

35 40 45

Gly Cys Ile Gln Ala Phe Trp Val Pro Leu Gln Leu Lys Thr Ala Ile

50 55 60

Trp Ala Val Ile Tyr Tyr Phe Phe Thr Gly Leu Gly Ile Thr Ala Gly

65 70 75 80

Tyr His Arg Leu Trp Ala His Cys Ser Tyr Ser Ala Thr Leu Pro Leu

85 90 95

Arg Ile Trp Leu Ala Ala Val Gly Gly Gly Ala Val Glu Gly Ser Ile

100 105 110

Arg Trp Trp Ala Arg Asp His Arg Ala His His Arg Tyr Thr Asp Thr

115 120 125

Asp Lys Asp Pro Tyr Ser Val Arg Lys Gly Leu Leu Tyr Ser His Leu

130 135 140

Gly Trp Met Val Met Lys Gln Asn Pro Lys Arg Ile Gly Arg Thr Asp

145 150 155 160

Ile Ser Asp Leu Asn Glu Asp Pro Val Val Val Trp Gln His Arg Asn

165 170 175

Tyr Leu Lys Val Val Phe Thr Met Gly Leu Ala Val Pro Met Leu Val

180 185 190

Ala Gly Leu Gly Trp Gly Asp Trp Leu Gly Gly Phe Val Tyr Ala Gly

195 200 205

Ile Leu Arg Ile Phe Phe Val Gln Gln Ala Thr Phe Cys Val Asn Ser

210 215 220

Leu Ala Leu Trp Leu Gly Asp Gln Pro Phe Asp Asp Arg Asn Ser Pro

225 230 235 240

Arg Asp His Val Ile Thr Ala Leu Val Thr Leu Gly Glu Gly Tyr His

245 250 255

Asn Phe His His Glu Phe Pro Ser Asp Tyr Arg Asn Ala Ile Glu Trp

260 265 270

His Gln Tyr Asp Pro Thr Lys Trp Ser Ile Trp Ala Trp Lys Gln Leu

275 280 285

Gly Leu Ala Tyr Asp Leu Lys Lys Phe Arg Ala Asn Glu Ile Glu Lys

290 295 300

Gly Arg Val Gln Gln Leu Gln Lys Lys Leu Asp Arg Lys Arg Ala Thr

305 310 315 320

Leu Asp Trp Gly Thr Pro Leu Asp Gln Leu Pro Val Met Glu Trp Asp

325 330 335

Asp Tyr Val Glu Gln Ala Lys Asn Gly Arg Gly Leu Val Ala Ile Ala

340 345 350

Gly Val Val His Asp Val Thr Asp Phe Ile Lys Asp His Pro Gly Gly

355 360 365

Lys Ala Met Ile Ser Ser Gly Ile Gly Lys Asp Ala Thr Ala Met Phe

370 375 380

Asn Gly Gly Val Tyr Tyr His Ser Asn Ala Ala His Asn Leu Leu Ser

385 390 395 400

Thr Met Arg Val Gly Val Ile Arg Gly Gly Cys Glu Val Glu Ile Trp

405 410 415

Lys Arg Ala Gln Lys Glu Asn Val Glu Tyr Val Arg Asp Gly Ser Gly

420 425 430

Gln Arg Val Ile Arg Ala Gly Glu Gln Pro Thr Lys Ile Pro Glu Pro

435 440 445

Ile Pro Thr Ala Asp Ala Ala

450 455

<210> 31

<211> 510

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 31

Met Pro Thr Ser Gly Thr Thr Ile Glu Leu Ile Asp Asp Gln Phe Pro

1 5 10 15

Lys Asp Asp Ser Ala Ser Ser Gly Ile Val Asp Glu Val Asp Leu Thr

20 25 30

Glu Ala Asn Ile Leu Ala Thr Gly Leu Asn Lys Lys Ala Pro Arg Ile

35 40 45

Val Asn Gly Phe Gly Ser Leu Met Gly Ser Lys Glu Met Val Ser Val

50 55 60

Glu Phe Asp Lys Lys Gly Asn Glu Lys Lys Ser Asn Leu Asp Arg Leu

65 70 75 80

Leu Glu Lys Asp Asn Gln Glu Lys Glu Glu Ala Lys Thr Lys Ile His

85 90 95

Ile Ser Glu Gln Pro Trp Thr Leu Asn Asn Trp His Gln His Leu Asn

100 105 110

Trp Leu Asn Met Val Leu Val Cys Gly Met Pro Met Ile Gly Trp Tyr

115 120 125

Phe Ala Leu Ser Gly Lys Val Pro Leu His Leu Asn Val Phe Leu Phe

130 135 140

Ser Val Phe Tyr Tyr Ala Val Gly Gly Val Ser Ile Thr Ala Gly Tyr

145 150 155 160

His Arg Leu Trp Ser His Arg Ser Tyr Ser Ala His Trp Pro Leu Arg

165 170 175

Leu Phe Tyr Ala Ile Phe Gly Cys Ala Ser Val Glu Gly Ser Ala Lys

180 185 190

Trp Trp Gly His Ser His Arg Ile His His Arg Tyr Thr Asp Thr Leu

195 200 205

Arg Asp Pro Tyr Asp Ala Arg Arg Gly Leu Trp Tyr Ser His Met Gly

210 215 220

Trp Met Leu Leu Lys Pro Asn Pro Lys Tyr Lys Ala Arg Ala Asp Ile

225 230 235 240

Thr Asp Met Thr Asp Asp Trp Thr Ile Arg Phe Gln His Arg His Tyr

245 250 255

Ile Leu Leu Met Leu Leu Thr Ala Phe Val Ile Pro Thr Leu Ile Cys

260 265 270

Gly Tyr Phe Phe Asn Asp Tyr Met Gly Gly Leu Ile Tyr Ala Gly Phe

275 280 285

Ile Arg Val Phe Val Ile Gln Gln Ala Thr Phe Cys Ile Asn Ser Met

290 295 300

Ala His Tyr Ile Gly Thr Gln Pro Phe Asp Asp Arg Arg Thr Pro Arg

305 310 315 320

Asp Asn Trp Ile Thr Ala Ile Val Thr Phe Gly Glu Gly Tyr His Asn

325 330 335

Phe His His Glu Phe Pro Thr Asp Tyr Arg Asn Ala Ile Lys Trp Tyr

340 345 350

Gln Tyr Asp Pro Thr Lys Val Ile Ile Tyr Leu Thr Ser Leu Val Gly

355 360 365

Leu Ala Tyr Asp Leu Lys Lys Phe Ser Gln Asn Ala Ile Glu Glu Ala

370 375 380

Leu Ile Gln Gln Glu Gln Lys Lys Ile Asn Lys Lys Lys Ala Lys Ile

385 390 395 400

Asn Trp Gly Pro Val Leu Thr Asp Leu Pro Met Trp Asp Lys Gln Thr

405 410 415

Phe Leu Ala Lys Ser Lys Glu Asn Lys Gly Leu Val Ile Ile Ser Gly

420 425 430

Ile Val His Asp Val Ser Gly Tyr Ile Ser Glu His Pro Gly Gly Glu

435 440 445

Thr Leu Ile Lys Thr Ala Leu Gly Lys Asp Ala Thr Lys Ala Phe Ser

450 455 460

Gly Gly Val Tyr Arg His Ser Asn Ala Ala Gln Asn Val Leu Ala Asp

465 470 475 480

Met Arg Val Ala Val Ile Lys Glu Ser Lys Asn Ser Ala Ile Arg Met

485 490 495

Ala Ser Lys Arg Gly Glu Ile Tyr Glu Thr Gly Lys Phe Phe

500 505 510

<210> 32

<211> 68

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> AnD9DS的N端残基1-68

<400> 32

Met Ser Ala Pro Thr Ala Asp Ile Arg Ala Arg Ala Pro Glu Ala Lys

1 5 10 15

Lys Val His Ile Ala Asp Thr Ala Ile Asn Arg His Asn Trp Tyr Lys

20 25 30

His Val Asn Trp Leu Asn Val Phe Leu Ile Ile Gly Ile Pro Leu Tyr

35 40 45

Gly Cys Ile Gln Ala Phe Trp Val Pro Leu Gln Leu Lys Thr Ala Ile

50 55 60

Trp Ala Val Ile

65

<210> 33

<211> 175

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C-terminal residues 281-455 of AnD9DS

<400> 33

Ser Ile Trp Ala Trp Lys Gln Leu Gly Leu Ala Tyr Asp Leu Lys Lys

1 5 10 15

Phe Arg Ala Asn Glu Ile Glu Lys Gly Arg Val Gln Gln Leu Gln Lys

20 25 30

Lys Leu Asp Arg Lys Arg Ala Thr Leu Asp Trp Gly Thr Pro Leu Asp

35 40 45

Gln Leu Pro Val Met Glu Trp Asp Asp Tyr Val Glu Gln Ala Lys Asn

50 55 60

Gly Arg Gly Leu Val Ala Ile Ala Gly Val Val His Asp Val Thr Asp

65 70 75 80

Phe Ile Lys Asp His Pro Gly Gly Lys Ala Met Ile Ser Ser Gly Ile

85 90 95

Gly Lys Asp Ala Thr Ala Met Phe Asn Gly Gly Val Tyr Tyr His Ser

100 105 110

Asn Ala Ala His Asn Leu Leu Ser Thr Met Arg Val Gly Val Ile Arg

115 120 125

Gly Gly Cys Glu Val Glu Ile Trp Lys Arg Ala Gln Lys Glu Asn Val

130 135 140

Glu Tyr Val Arg Asp Gly Ser Gly Gln Arg Val Ile Arg Ala Gly Glu

145 150 155 160

Gln Pro Thr Lys Ile Pro Glu Pro Ile Pro Thr Ala Asp Ala Ala

165 170 175

Claims (28)

1.一种编码Δ-9去饱和酶的分离的核酸分子，其包含与SEQ ID NO:2至少80％相同的氨基酸序列。

2.权利要求1的核酸分子，还包含至少一个基因调控元件。

3.权利要求2的核酸分子，其中所述基因调控元件选自下组：酿酒酵母Δ-9去饱和酶启动子、Δ-9去饱和酶3'UTR/终止子、ole1基因启动子、菜豆(Phaseolus vulgaris)菜豆蛋白启动子、菜豆菜豆蛋白5'非翻译区、菜豆菜豆蛋白3'非翻译区、菜豆菜豆蛋白基质附着区、Lesquerella fendleri KCS3启动子、根癌土壤杆菌甘露氨酸合酶启动子，根癌土壤杆菌ORF23 3'非翻译区，木薯叶脉花叶病毒启动子、根癌土壤杆菌ORF1 3'非翻译区、烟草RB7基质附着区，过驱动(Overdrive)、T-链边界序列、LfKCS3启动子、FAE 1启动子、Myc标签、和血凝素标签。

4.一种构建体，包含如权利要求3所述的第一核酸分子和如权利要求3所述的第二核酸分子，其中所述第一核酸分子还包含第一基因调控元件，所述第二核酸分子包含第二基因调控元件。

5.权利要求4的构建体，其中所述第一或第二核酸分子含有至少两个基因调控元件。

6.一种用于减少细胞中饱和脂肪酸的量的方法，所述方法包括：

用权利要求1的核酸分子转化细胞，使得细胞中的饱和脂肪酸的量减少。

7.一种用于减少细胞中饱和脂肪酸的量的方法，所述方法包括：

用权利要求5的构建体转化细胞，使得细胞中的饱和脂肪酸的量减少。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述细胞是酵母细胞。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述细胞是植物细胞。

10.根据权利要求9的方法，包括用多于一个权利要求1的核酸分子转化所述植物细胞。

11.根据权利要求9所述的方法，其中对植物细胞的转化将用于降低植物细胞中16:0-CoA水平的手段引入植物细胞。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述用于降低植物细胞中16:0-CoA水平的手段是质体外去饱和酶。

13.权利要求12的方法，其中所述质体外去饱和酶是选自下组的去饱和酶：LnD9DS去饱和酶，AnD9DS去饱和酶，HzD9DS去饱和酶，和MgD9DS去饱和酶的。

14.权利要求12的方法，其中质体外去饱和酶是AnD9DS去饱和酶。

15.根据权利要求9所述的方法，其中所述植物细胞获自选自下组的植物：拟南芥属(Arabidopsis)，琉璃苣属(Borago)，卡诺拉，蓖麻属(Ricinus)，可可属(Theobroma)，玉米属(Zea)，棉属(Gossypium)，两节荠属(Crambe)，萼距花属(Cuphea)，亚麻属(Linum)，小滨菊属(Lesquerella)，鲸油草属(Limnanthes)，Linola，旱金莲属(Tropaeolum)，月见草属(Oenothera)，木樨榄属(Olea)，油棕属(Elaeis)，花生属(Arachis)，油菜籽，红花属(Carthamus)，大豆属(Glycine)，野生大豆属(Soja)，向日葵属(Helianthus)，烟草属(Nicotiana)，斑鸠菊属(Vernonia)，小麦属(Triticum)，大麦属(Hordeum)，稻属(Oryza)，燕麦属(Avena)，高粱属(Sorghum)，黑麦属(Secale)，以及禾本科(Gramineae)的其它成员。

16.一种含油种子植物，其包含权利要求1的核酸序列。

17.一种含油种子植物，其包含权利要求5或6所述的构建体。

18.一种植物种子，其表达选自下组的质体外去饱和酶：SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ IDNO:26,SEQ ID NO:27,或SEQ ID NO:28。

19.转基因欧洲油菜系的种子，该种子相对于该转基因欧洲油菜系的等基因型版本具有降低的饱和脂肪酸水平。

20.一种用于创建与野生型植物相比具有减少的植物中饱和脂肪酸的量的遗传工程植物的方法，所述方法包括：

用权利要求1的核酸分子转化植物材料；和

培养经转化的植物材料以获得植物。

21.一种用于创建与野生型植物相比具有减少的植物中饱和脂肪酸的量的遗传工程植物的方法，所述方法包括：

用权利要求4的构建体转化植物材料；和

培养经转化的植物材料以获得植物。

22.权利要求21所述的方法，其中所述植物选自下组：拟南芥属，琉璃苣属，卡诺拉，蓖麻属，可可属，玉米属，棉属，两节荠属，萼距花属，亚麻属，小滨菊属，鲸油草属，Linola，旱金莲属，月见草属，木樨榄属，油棕属，花生属，油菜籽，红花属，大豆属，野生大豆属，向日葵属，烟草属，斑鸠菊属，小麦属，大麦属，稻属，燕麦属，高粱属，黑麦属，以及禾本科的其它成员。

23.一种通过权利要求21所述的方法获得的植物。

24.一种从权利要求23的植物获得的植物材料。

25.权利要求23的植物材料，其中所述植物材料是种子。

26.来自权利要求23的植物的油。

27.来自权利要求23的植物的油，其中所述油含有小于3.5％的饱和脂肪酸。

28.来自权利要求23的植物的油，其中所述油含有少于3.0％的饱和脂肪酸。