CN106957910B

CN106957910B - 一种基于cdkn1a基因鉴定奶牛产奶性状的方法及其应用

Info

Publication number: CN106957910B
Application number: CN201710096306.5A
Authority: CN
Inventors: 孙东晓; 韩博; 梁伟俊
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2017-02-22
Filing date: 2017-02-22
Publication date: 2020-11-20
Anticipated expiration: 2037-02-22
Also published as: CN106957910A

Abstract

本发明公开了一种基于CDKN1A基因鉴定奶牛产奶性状的方法及其应用。本发明的鉴定奶牛产奶性状的方法为检测牛基因组23号染色体上第10565335位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质。通过试验证明：本发明的方法简便、快速、灵敏，结果可靠、稳定、准确，并可用于辅助鉴定具有优良产奶性状的牛群体，适合实验室大群体规模检测的需要。不仅可对待选牛进行早期筛选，而且降低了育种花费，能有效提高实际生产中的牛的产奶量，在牛的育种工作中将发挥巨大作用。

Description

一种基于CDKN1A基因鉴定奶牛产奶性状的方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种基于CDKN1A基因鉴定奶牛产奶性状的方法及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子1A(Cyclin-dependent kinase inhibitor1A，CDKN1A)基因编码p21(或称WAF1)蛋白，该蛋白是一种高效而重要的细胞周期调控蛋白，是CKI家族的重要成员。它广泛参与细胞的生长、分化、衰老及死亡过程，同时又与肿瘤发生密切相关。CDKN1A最早是作为一种能被p53转录激活的基因在1993年由Deiry等人发现的，在人类上定位于染色体6p21.2，DNA长度为85kb，包括3个长度分别为68、450、1600bp的外显子，编码一种分子量为21kDa的蛋白，因此命名为p21(Giaccia and Kastan,1998)。该基因上游2.4kb和8kb处各有一个p53蛋白特殊序列结合位点，因此能够被p53转录激活，并参与了p53的肿瘤抑制功能，因此p21的表达也能够抑制人脑、肺、和结肠肿瘤细胞的生长(Giaccia and Kastan,1998；Vogelstein and Kinzler,1992)。此外，CDKN1A基因上游1-2kb处还有肌源性转录因子结合区，在上游50～104bp处有sp1结合区。

CDKN1A基因的表达产物p21蛋白是目前已知的具有最广泛激酶抑制活性的细胞周期抑制蛋白，是CKI(Cyclin-dependent kinase inhibitor，细胞周期依赖性激酶抑制因子)家族的重要成员。p21可通过其氨基末端与几乎任何Cyclin-CDK复合物结合，广泛的抑制各种Cyclin-CDK复合物使之活性丧失，如CyclinD-CDK4/CDK6、CyclinE-CDK2和CyclinA-CDK2，但对CyclinB相关的复合物抑制活性相对较弱。Radhakrishnan等(2004)发现，p21可通过抑制CyclinD1-CDK4与CyclinE-CDK2的活性，使视网膜母细胞瘤蛋白(pRb蛋白)不能发生磷酸化，E2F转录因子因此不能释放，从而使细胞周期停滞在G1期，证明了p21的过表达可使细胞周期阻滞于G1期、G2期或S期。同时也有研究表明，p21可作为CDK聚集因子正性调节CDK功能，使相关功能基因磷酸化，促进细胞G1期转化到S期(张春林，2002)。

PCNA(增殖细胞核抗原)是Miyachi等于1978年在系统性红斑狼疮患者的血清中发现并提纯的一种自身抗原，是DNA多聚酶δ和ε的辅助蛋白(Kelman et al.,1995)，DNA合成所必不可少的因子。由于p21的不同功能域对应不同的靶位，p21可通过C端与PCNA结合，从而覆盖PCNA的某些功能域，使PCNA不能与DNA聚合酶δ形成复合物，从而阻断PCNA活化DNA聚合酶的活性，或使DNA全酶复合物不能在DNA单链上滑动，最终影响DNA复制使细胞周期停滞。

对于CDKN1A的其他生物学功能研究有，p21与细胞凋亡的关系十分密切，但其对细胞凋亡的影响机制目前尚未完全明确，各国研究者的观点主要分成了两派，即p21是阻止还是促进细胞凋亡的发生。一方面，p21可能通过以下途径对抗或阻止细胞凋亡的发生：1)p21通过促使细胞周期阻滞，阻止DNA损伤或促使其修复，从而保护细胞免受凋亡(Raj et al.,2001)；2)在复制抑制因子介导的DNA复制叉损伤的过程中，p21可与细胞周期检查点激酶1共同作用而阻止DNA损伤介导的凋亡(Rodriguez and Meuth,2006)；3)CyclinA-CDK2复合物的活性上调可能促使缺氧诱导的心肌细胞凋亡，而p21则可以通过与CyclinA-CDK2复合物结合使其失活，从而阻止凋亡的发生(Adachi et al.,2001)。另一方面，也有报道指出，p21可能在某些条件下具有促进细胞凋亡的作用，如：1)古曲霉素A通过下调p21水平来诱导破骨细胞凋亡(Yi et al.,2007)；2)p21的表达上调可竞争性抑制凋亡抑制基因Bcl-2的表达，从而诱导足细胞凋亡的发生(Marshall and Shankland,2006)；3)在死亡受体肿瘤坏死因子家族成员诱导的凋亡过程中，p21可能起到正向促进的作用(Hingorani et al.,2000；Lashinger et al.,2005)；4)在细胞凋亡过程中p21的表达还可能与凋亡前体蛋白Bax有密切的关系，p21表达升高的同时往往伴随Bax水平的上升，细胞凋亡数也相应增加(Bai andCederbaum,2006；Daniel et al.,2001)。因此，p21在不同的条件下既有可能抑制细胞凋亡的发生，也有可能促进其发生，具体的机制尚未明确，还有待研究。

牛的CDKN1A基因位于第23号染色体上，全长17.03kb，包含6个外显子和5个内含子。其mRNA长2352bp，共编码161个氨基酸，mRNA序列与人的同源性为78％，氨基酸序列与人的同源性为80％。

聚合酶链式反应(PCR)技术是一种特异性DNA体外扩增技术。以少量的DNA为模板，经过变性-退火-延伸的多次循环，以接近指数扩增的形式产生大量的目标DNA分子，目前，该技术已经成为最常用、也最重要的分子生物学技术之一。PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳后测序即可进行基因多态的鉴定工作，检测方法简单易行。

发明内容

本发明的一个目的是提供检测牛基因组23号染色体上第10565335位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质的新用途。

本发明提供了检测牛基因组23号染色体上第10565335位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质在鉴定或辅助鉴定牛个体产奶性状中的应用。

本发明还提供了检测牛基因组23号染色体上第10565335位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定牛个体产奶性状的产品中的应用。

上述应用中，所述产奶性状为305天产奶量和/或乳脂量和/或乳脂率和/或乳蛋白量。

本发明还提供了检测牛基因组23号染色体上第10565335位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质在牛育种中的应用。

本发明还提供了检测牛基因组23号染色体上第10565335位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质在制备牛育种的产品中的应用。

本发明还提供了检测牛基因组23号染色体上第10565335位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质在选育305天产奶量高和/或乳脂量高和/或乳脂率和/或乳蛋白量高的牛中的应用。

本发明还提供了检测牛基因组23号染色体上第10565335位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质在制备选育305天产奶量高和/或乳脂量高和/或乳脂率高和/或乳蛋白量高的牛的产品中的应用。

上述应用中，所述检测牛基因组23号染色体上第10565335位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质为如下1)或2)：

1)由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成的引物对A；

2)由序列A所示的单链DNA分子和序列B所示的单链DNA分子组成的引物对B；

所述序列A为将序列1删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列1具有相同功能的核苷酸；

所述序列B为将序列2删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列2具有相同功能的核苷酸。

本发明的另一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定牛产奶性状的方法。

本发明提供的鉴定或辅助鉴定牛产奶性状的方法是检测牛个体的基因型是TT基因型还是CC基因型还是CT基因型，根据所述牛个体的基因型确定所述牛个体在第一泌乳期和第二泌乳期的305天产奶量和/或乳脂量和/或乳脂率和/或乳蛋白量：

TT基因型的牛个体在第一泌乳期的305天产奶量高于CC基因型的牛个体，CC基因型的牛个体在第一泌乳期的305天产奶量高于CT基因型的牛个体；CT基因型的牛个体在第一泌乳期的乳脂率高于CC基因型的牛个体，CC基因型的牛个体在第一泌乳期的乳脂率高于TT基因型的牛个体；

TT基因型的牛个体在第二泌乳期的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于CT基因型的牛个体，CT基因型的牛个体在第二泌乳期的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于CC基因型的牛个体；

所述TT基因型为牛基因组23号染色体上第10565335个核苷酸位点的碱基均为T的纯合体；

所述CC基因型为牛基因组23号染色体上第10565335个核苷酸位点的碱基均为C的纯合体；

所述CT基因型为牛基因组23号染色体上第10565335个核苷酸位点的碱基为C和T的杂合体。

上述方法中，所述检测牛个体的基因型是TT基因型还是CC基因型还是CT基因型的方法为如下A)或B)：

A)直接测序；

B)测序含有牛基因组23号染色体上第10565335个核苷酸的PCR扩增产物。

上述方法中，所述PCR扩增产物所用的引物为如下1)或2)：

本发明还有一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定牛产奶性状的产品。

本发明提供的鉴定或辅助鉴定牛产奶性状的产品为检测牛基因组23号染色体上第10565335位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质。

上述产品中，所述检测牛基因组23号染色体上第10565335位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质为如下1)-4)：

所述序列B为将序列2删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列2具有相同功能的核苷酸；

3)含有1)所述引物对A和/或2)所述引物对B的PCR试剂；

4)含有1)所述引物对A和/或2)所述引物对B和/或3)所述PCR试剂的试剂盒。

上述应用或方法或产品中，

所述牛为奶牛；

所述305天产奶量为从产犊到第305个泌乳日的总产奶量；

所述乳脂量为乳中所含脂肪的重量，它等于乳脂率与产奶量的乘积；

所述乳脂率为乳中所含脂肪的百分率；

所述乳蛋白量为乳中所含蛋白的重量，它等于乳蛋白率与产奶量的乘积；

所述第一泌乳期为母牛第一次产犊后产奶的时期，一般泌乳期是305天；

所述第二泌乳期为母牛第二次产犊后产奶的时期，一般泌乳期是305天。

上述应用或方法或产品中，

所述牛基因组序列为牛基因组Bos_taurus_UMD3.1.1/bosTau8版本参考序列。

本发明提供了一种基于CDKN1A基因鉴定奶牛产奶性状的方法及其应用。通过试验证明：c.271C>T分子标记在第一泌乳期与305天产奶量(P＝0.0162)和乳脂率(P＝0.0377)达到显著水平的关联；在第二泌乳期与305天产奶量、乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率达到极显著水平的关联(P＜0.01)。本发明的鉴定奶牛产奶性状方法简便、快速、灵敏，结果可靠、稳定、准确，并可用于辅助鉴定具有优良产奶性状的牛群体，适合实验室大群体规模检测的需要。不仅可对待选牛进行早期筛选，而且降低了育种花费，能有效提高实际生产中的牛的产奶量，在牛的育种工作中将发挥巨大作用。

附图说明

图1为c.271C>T的突变位置。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的中国荷斯坦公牛管制冻精样品和女儿群体的母牛血样分别来源于北京三元绿荷奶牛养殖中心和北京市畜牧兽医总站。

下述实施例中的305天产奶量：从产犊到第305个泌乳日的总产奶量。

下述实施例中的乳脂率：乳中所含的脂肪的百分率。

下述实施例中的乳脂量：乳中所含脂肪的重量，它等于乳脂率与产奶量的乘积。

下述实施例中的乳蛋白率：乳中所含的蛋白的百分率。

下述实施例中的乳蛋白量：乳中所含蛋白的重量，它等于乳蛋白率与产奶量的乘积。

下述实施例中的第一泌乳期：母牛第一次产犊后产奶的时期，一般泌乳期是305天。

下述实施例中的第二泌乳期：母牛第二次产犊后产奶的时期，一般泌乳期是305天。

实施例1、奶牛产奶性状相关的分子标记及鉴定奶牛产奶性状的方法

一、奶牛CDKN1A基因多态位点的确定

1、DNA池的制备

选择北京地区共40头中国荷斯坦公牛作为基因多态性检测的试验群体，将40头中国荷斯坦公牛随机均分为两组，利用核酸分析仪准确测定其冻精基因组DNA的浓度，并将这些DNA均稀释成浓度为50ng/μL，等量混合成两个DNA池，作为PCR扩增的模板。

2、引物的设计

根据牛CDKN1A基因序列(位于GenBank登录号为AC_000180.1的序列中，更新日为2014年12月31日)，设计如表1的13对引物。

表1CDKN1A基因PCR扩增引物序列信息

3、PCR扩增

以步骤1得到的DNA池为模板，分别采用表1中的各组引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

表1中引物8F和8R采用降落PCR方法(touchdown PCR)，其余引物采用了常规PCR的方法。降落PCR的原理大致如下：首先在较高的温度下扩增，此时虽然扩增效率低，但非特异扩增基本没有；随着反应循环数的增加，退火温度的逐步降低，非特异扩增也会逐步增多；但由于此时特异的扩增产物已经达到一定的数量优势，因此会对非特异扩增产生强烈的竞争抑制，从而大幅提高PCR的特异性和效率。表1中部分引物的退火温度表示为“a-btouchdown”(a>b)的形式即为降落PCR中所用的退火温度范围，表示在反应过程中退火温度逐步由a℃降落到b℃。

PCR反应体系如表2所示(表2中的正向引物F和反向引物R分别表示1F和1R、2F和2R等)。常规PCR和降落PCR反应条件如表3所示。

表2、PCR反应体系

表3、PCR反应条件

4、PCR扩增产物的测序及序列分析

将PCR扩增产物进行测序，结果发现公牛群体CDKN1A基因第5外显子处存在1个SNP标记c.271C>T，如表4所示，突变位置如图1所示。

c.271C>T是以牛的基因组DNA为模板，以6F和6R为引物进行PCR扩增得到的产物(产物的核苷酸序列如序列3所示)自5’末端起第56位(也即为牛基因组Bos_taurus_UMD3.1.1/bosTau8版本参考序列23号染色体上第10565335个核苷酸位点的碱基)。将牛基因组23号染色体上第10565335个核苷酸位点的碱基均为C的个体的基因型命名为纯合CC基因型，将牛基因组23号染色体上第10565335个核苷酸位点的碱基均为T的个体的基因型命名为纯合TT基因型，将牛基因组23号染色体上第10565335个核苷酸位点的碱基为C和T的个体的基因型命名为杂合CT基因型。

表4、CDKN1A基因发现的SNPs

基因位置	SNPs	物理位置	突变	突变类型
					外显子5	c.271C>T	chr23:10565335bp	C/T	SNP

二、奶牛CDKN1A基因多态位点与产奶性状的相关性分析

1、基因型检测

根据步骤1中获得的CDKN1A基因的SNP，采用6F和6R引物对40头荷斯坦公牛家系共1093头女儿群体进行群体基因型分型。具体步骤如下：提取女儿群体的母牛血样(为非抗凝血)的基因组DNA，基因组样品交由博淼生物科技(北京)有限公司使用“用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法”，即MALDI-TOF-MS检测技术对步骤一获得的SNP位点的基因型进行检测。基因型检测结果如表5所示。

2、产奶性状检测

分别检测上述1093头试验母牛的305天产奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量和乳蛋白率5个产奶性状。每个个体的测定日的记录依次包括牛只个体号、父号、母号、外祖父号、出生日期、泌乳期、产犊日期、测定日期、测定日产奶量、测定日乳脂率、测定日乳蛋白率、测定日体细胞数、估计的305天产奶量、估计的305天乳脂量和305天乳蛋白量15项信息。

3、单个SNP位点与性状的关联分析模型

采用SAS 9.13软件中的MIXED过程对奶牛305天产奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量和乳蛋白率等5个产奶性状和基因型进行关联分析。关联分析采用动物模型，具体模型如下：Y＝μ+hys+b×M+G+a+e。其中，Y：产奶性状(个体305天产奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量或乳蛋白率)观察值，μ：总体均值，hys：场年季效应，b：协变量M的回归系数，M：产犊月龄效应，G：基因型效应，a：个体随机加性遗传效应，e：随机残差效应。关联分析方法参见文献“东天，基于GWAS后分析策略研究EEF1D基因与奶牛产奶性状遗传效应[D].北京：中国农业大学，2013.”。

5个产奶性状和基因型关联分析结果如表5所示。从表5中可以看出：

在第一泌乳期时，

c.271C>T与305天产奶量(P＝0162)和乳脂率(P＝0.0377)达到显著关联水平，优势等位基因为T。TT基因型的牛个体的305天产奶量高于CC基因型的牛个体，CC基因型的牛个体的305天产奶量高于CT基因型的牛个体；CT基因型的牛个体的乳脂率高于CC基因型的牛个体，CC基因型的牛个体的乳脂率高于TT基因型的牛个体。

在第二泌乳期时，

c.271C>T与305天产奶量、乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率达到极显著关联水平(P＜0.0001)，优势等位基因为T。TT基因型的牛个体的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于CT基因型的牛个体，CT基因型的牛个体的305天产奶量、乳脂量和乳蛋白量高于CC基因型的牛个体。

表5CDKN1A基因与产奶性状关联分析(最小二乘均值±标准误)

注：^*P<0.05，表示差异显著；^**P<0.01，表示差异极显著。^a,b同一列数据有不同上标表示差异显著；^A,B同一列数据有不同上标表示差异极显著。

序列表

<110>中国农业大学

<120>一种基于CDKN1A基因鉴定奶牛产奶性状的方法及其应用

<160>3

<210>1

<211>20bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

ggcctgccca agctctacct 20

<210>2

<211>20bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

tcctcctctg ctcccgtcct 20

<210>3

<211>286bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

ggcctgccca agctctacct tcctcctctg ctcccgtcct ggcctgccca agctctacct 60

gcccgtgggg ccccgagacg acctgggagg gggcaagcgg ccgagcccct catccgccct 120

gctgcagggc acgtctcagg aggaccactt ggacctgtcg ctgtcctgca ccctcgtgac 180

tcgctccccc gagcggcccg aggggacccc cggtgggcct ggcccctccc agggccggaa 240

acggcggcag accagcatga caggtgagga cgggagcaga ggagga 286

Claims

1.检测牛基因组23号染色体上第10565335位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质在鉴定或辅助鉴定牛个体产奶性状中的应用；

所述产奶性状为305天产奶量和/或乳脂量和/或乳脂率和/或乳蛋白量；

所述检测牛基因组23号染色体上第10565335位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质为由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成的引物对A；

所述牛基因组序列为牛基因组Bos_taurus_UMD3.1.1/bosTau8版本参考序列；

所述牛为中国荷斯坦奶牛。

2.检测牛基因组23号染色体上第10565335位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定牛个体产奶性状的产品中的应用；

所述牛为中国荷斯坦奶牛。

3.检测牛基因组23号染色体上第10565335位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质在选育305天产奶量高和/或乳脂量高和/或乳脂率高和/或乳蛋白量高的牛中的应用；

所述牛为中国荷斯坦奶牛。

4.检测牛基因组23号染色体上第10565335位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质在制备选育305天产奶量高和/或乳脂量高和/或乳脂率高和/或乳蛋白量高的牛的产品中的应用；

所述牛为中国荷斯坦奶牛。

5.一种鉴定或辅助鉴定牛产奶性状的方法，是检测牛个体的基因型是TT基因型还是CC基因型还是CT基因型，根据所述牛个体的基因型确定所述牛个体在第一泌乳期和第二泌乳期的305天产奶量和/或乳脂量和/或乳脂率和/或乳蛋白量：

所述CT基因型为牛基因组23号染色体上第10565335个核苷酸位点的碱基为C和T的杂合体；

所述牛为中国荷斯坦奶牛。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述检测牛个体的基因型是TT基因型还是CC基因型还是CT基因型的方法为如下A)或B)：

A)直接测序；

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增产物所用的引物为由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成的引物对A。