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CN106957808A - 一种用于半滑舌鳎养殖的微生态制剂 - Google Patents

一种用于半滑舌鳎养殖的微生态制剂 Download PDF

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CN106957808A
CN106957808A CN201710335519.9A CN201710335519A CN106957808A CN 106957808 A CN106957808 A CN 106957808A CN 201710335519 A CN201710335519 A CN 201710335519A CN 106957808 A CN106957808 A CN 106957808A
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CN
China
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probiotics
lactobacillus
bacillus
fermentation
preparation
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CN201710335519.9A
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English (en)
Inventor
杨黄浩
陈宪
李智
丛柏林
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Fuzhou University
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Fuzhou University
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

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Abstract

本发明公开了一种用于半滑舌鳎养殖的微生态制剂，其是将生长状况优异的芽孢杆菌和低温乳杆菌分别经培养、发酵、离心后，将分离得到的菌体添加到含低聚木糖、β‑葡聚糖、海藻糖及脱脂乳的保护剂中混匀，再经真空冷冻干燥制得所述微生态制剂。所得微生态制剂不仅可以抑制半滑舌鳎体内有害致病菌的生长，还能去除氨氮以及亚硝酸盐，改善养殖水体环境，有利于促进半滑舌鳎的生长，提高水产幼苗存活率。

Description

一种用于半滑舌鳎养殖的微生态制剂
技术领域
本发明属于微生物制剂领域，具体涉及一种用于半滑舌鳎养殖的微生态制剂。
背景技术
微生态制剂是一种替代抗生素的新型产品，以其无残留、无耐药性、无毒副作用、效果显著等优点广泛应用在水产养殖、动物养殖、种植业以及疾病治疗等领域，具有重大的经济和社会意义。
乳杆菌作为最早应用的、历史最悠久的有益菌，是一类能够分解碳水化合物以产生乳酸为主要代谢产物的革兰氏阳性菌。此类菌属是动物肠道中的正常微生物，自然定植于消化道，可以代谢生成低能脂肪酸降低pH值，从而对肠道中的有害微生物起抑制作用，调整肠道菌群平衡，促进机体对营养物质的消化吸收，提高机体的免疫能力。将乳杆菌应用于水产养殖行业是解决水产存活率低等问题的一个有效途径。
芽孢杆菌在肠道中存在数量极少，但是芽孢杆菌能够形成芽孢，在干燥、高压、高温、低温等恶劣环境中的生存力较强，且能在肠道内进行出芽、生长和繁殖等生理过程，并具有多种高效的酶促效应。芽孢杆菌可以迅速降解养殖水体中的各种有机物，包括残留饵料、水产动物的排泄物、死亡的生物的残体及池底淤泥中的有机物，除此之外，还能降低水体中的氨氮与亚硝态氮的含量、增加溶解氧的含量，进而有效地改良水质，营造良好的养殖生态环境。将芽孢杆菌应用于水产养殖行业是解决抗生素污染问题的一个有效方案。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于半滑舌鳎养殖的微生态制剂。所得微生态制剂既能提高半滑舌鳎幼苗存活率，又能改善养殖水质，在水产养殖方面具有广阔的市场前景。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于半滑舌鳎养殖的微生态制剂，其制备方法包括以下步骤：
1）芽孢杆菌和低温乳杆菌的培养：将芽孢杆菌和乳杆菌菌种从试管斜面培养基中取出，分别接种到装有液体培养基的锥形瓶中，然后置于摇床中，于20℃、150-250r/min条件下培养24h；
2）将步骤1）处于对数期的芽孢杆菌菌液及乳杆菌菌液分别接种到发酵培养基中进行发酵，发酵温度为20℃，发酵时间为48-72h；
3）将步骤2）处于对数期的芽孢杆菌发酵液和乳杆菌发酵液分别于10000r/min离心20min，以分离菌体与上清液；将所得菌体共同加入保护剂中搅拌混匀，再经真空冷冻干燥制得所述微生态制剂。
步骤1）中芽孢杆菌所用的液体培养基配方为：每1000mL蒸馏水中含蛋白胨5-8g、酵母粉1-3g；pH值7.6-7.8，使用前于121℃灭菌15-20min；乳杆菌所用液体培养基为MRS培养基，使用前于121℃灭菌15-20min。
步骤2）中乳杆菌菌液及乳杆菌菌液的接种量均为2vol%，两者所用发酵培养基配方为：每1000mL蒸馏水中含可溶性淀粉3-3.5g、蛋白胨10-12g、酵母膏3-5g、KH2PO4 1.5-4g、KHPO4 2-4g、MgSO4 0.1-1g、ZnCl2 1-3g；pH值7.4-7.6，使用前于121℃灭菌15-20min。
步骤3）中所述保护剂由低聚木糖、β-葡聚糖、海藻糖、脱脂乳及水组成；其中，低聚木糖和β-葡聚糖的浓度均为2.0g/L，海藻糖的浓度为5wt%，脱脂乳的浓度为20wt%。
所述微生态制剂可作为饲料添加剂用于半滑舌鳎的养殖。
低温乳杆菌具有优良的产酶能力，且在低温条件下，产酶能力没有明显下降。添加低温乳杆菌的饲料可以显著增加半滑舌鳎的体重，改善半滑舌鳎的消化能力。
芽孢杆菌具有保湿性强、有机质分解力强、抑菌灭害力强等特点，又能产生丰富的代谢生成物，如多种有机酸、消化酶等，可抑制有害菌、病原菌等有害微生物的生长繁殖，并能够有效地减少水中氨氮和亚硝酸盐的含量，进而改善水质、改善养殖水体微环境。
本发明将芽孢杆菌与低温乳杆菌混合制备的微生态制剂，能起到功能性协同作用，从生态学的角度，利用微生物降低养殖水体氨氮含量，具有天然、无毒、无副作用、无污染、无残留、安全可靠的优越性；且利用有益微生物改善水质，抑制病原菌，减少疾病，能够有效的促进半滑舌鳎的生长，提高其幼苗的存活率。
本发明的有益效果在于：本发明所得微生态制剂可作为水产养殖饲料直接投入养殖水体中，其具有良好改善养殖水体微环境的作用，可以降低养殖水体氨氮含量，氨氮清除率可达65%，亚硝酸盐的去除率可达75%，并能促进水产生物对营养物质的消化吸收，显著提高半滑舌鳎的增重率以及幼苗的存活率。
附图说明
图1为本发明微生态制剂在不同时间下对养殖水体的氨氮清除率变化曲线。
图2为本发明微生态制剂在不同时间下对养殖水体的亚硝酸盐清除率变化曲线。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
实施例1
一种用于半滑舌鳎养殖的微生态制剂，其制备方法包括以下步骤：
1）芽孢杆菌和低温乳杆菌的培养：将芽孢杆菌和乳杆菌菌种从试管斜面培养基中取出，分别接种到装有液体培养基的锥形瓶中，然后置于摇床中，于20℃、150r/min条件下培养24h；
2）将步骤1）处于对数期的芽孢杆菌菌液及乳杆菌菌液分别接种到发酵培养基中进行发酵，发酵温度为20℃，发酵时间为72h；
3）将步骤2）处于对数期的芽孢杆菌发酵液和乳杆菌发酵液分别于10000r/min离心20min，以分离菌体与上清液；将所得菌体共同加入到含低聚木糖和β-葡聚糖的水溶液中混匀，再加入海藻糖，搅拌均匀制得悬浮液，最后加入脱脂乳作为基质，经真空冷冻干燥制得所述微生态制剂。
步骤1）中芽孢杆菌所用的液体培养基配方为：每1000mL蒸馏水中含蛋白胨5g、酵母粉1g；pH值7.6，使用前于121℃灭菌20min；乳杆菌所用液体培养基为MRS培养基，使用前于121℃灭菌20min。
步骤2）中乳杆菌菌液及乳杆菌菌液的接种量均为2vol%，两者所用发酵培养基配方为：每1000mL蒸馏水中含可溶性淀粉3g、蛋白胨10g、酵母膏3g、KH2PO4 1.5g、KHPO4 2g、MgSO4 0.1g、ZnCl2 1g；pH值7.6，使用前于121℃灭菌15min。
步骤3）混合液中低聚木糖和β-葡聚糖的浓度均为2.0g/L，海藻糖的浓度为5wt%，脱脂乳的浓度为20wt%。
实施例2
一种用于半滑舌鳎养殖的微生态制剂，其制备方法包括以下步骤：
1）芽孢杆菌和低温乳杆菌的培养：将芽孢杆菌和乳杆菌菌种从试管斜面培养基中取出，分别接种到装有液体培养基的锥形瓶中，然后置于摇床中，于20℃、200r/min条件下培养24h；
2）将步骤1）处于对数期的芽孢杆菌菌液及乳杆菌菌液分别接种到发酵培养基中进行发酵，发酵温度为20℃，发酵时间为60h；
3）将步骤2）处于对数期的芽孢杆菌发酵液和乳杆菌发酵液分别于10000r/min离心20min，以分离菌体与上清液；将所得菌体共同加入到含低聚木糖和β-葡聚糖的水溶液中混匀，再加入海藻糖，搅拌均匀制得悬浮液，最后加入脱脂乳作为基质，经真空冷冻干燥制得所述微生态制剂。
步骤1）中芽孢杆菌所用的液体培养基配方为：每1000mL蒸馏水中含蛋白胨6g、酵母粉2g；pH值7.4，使用前于121℃灭菌18min；乳杆菌所用液体培养基为MRS培养基，使用前于121℃灭菌18min。
步骤2）中乳杆菌菌液及乳杆菌菌液的接种量均为2vol%，两者所用发酵培养基配方为：每1000mL蒸馏水中含可溶性淀粉3.2g、蛋白胨11g、酵母膏4g、KH2PO4 2.5g、KHPO4 3g、MgSO4 0.6g、ZnCl2 2g；pH值7.5，使用前于121℃灭菌18min。
步骤3）混合液中低聚木糖和β-葡聚糖的浓度均为2.0g/L，海藻糖的浓度为5wt%，脱脂乳的浓度为20wt%。
实施例3
一种用于半滑舌鳎养殖的微生态制剂，其制备方法包括以下步骤：
1）芽孢杆菌和低温乳杆菌的培养：将芽孢杆菌和乳杆菌菌种从试管斜面培养基中取出，分别接种到装有液体培养基的锥形瓶中，然后置于摇床中，于20℃、150-250r/min条件下培养24h；
2）将步骤1）处于对数期的芽孢杆菌菌液及乳杆菌菌液分别接种到发酵培养基中进行发酵，发酵温度为20℃，发酵时间为48h；
3）将步骤2）处于对数期的芽孢杆菌发酵液和乳杆菌发酵液分别于10000r/min离心20min，以分离菌体与上清液；将所得菌体共同加入到含低聚木糖和β-葡聚糖的水溶液中混匀，再加入海藻糖，搅拌均匀制得悬浮液，最后加入脱脂乳作为基质，经真空冷冻干燥制得所述微生态制剂。
步骤1）中芽孢杆菌所用的液体培养基配方为：每1000mL蒸馏水中含蛋白胨8g、酵母粉3g；pH值7.8，使用前于121℃灭菌20min；乳杆菌所用液体培养基为MRS培养基，使用前于121℃灭菌20min。
步骤2）中乳杆菌菌液及乳杆菌菌液的接种量均为2vol%，两者所用发酵培养基配方为：每1000mL蒸馏水中含可溶性淀粉3.5g、蛋白胨12g、酵母膏5g、KH2PO4 4g、KHPO4 4g、MgSO4 1g、ZnCl2 3g；pH值7.6，使用前于121℃灭菌20min。
步骤3）混合液中低聚木糖和β-葡聚糖的浓度均为2.0g/L，海藻糖的浓度为5wt%，脱脂乳的浓度为20wt%。
性能测试
测试1：微生态制剂去除氨氮试验
氨氮的测定：在亚硝基铁氰化钠存在下，铵离子能与水杨酸盐和次氯酸离子反应生成蓝色化合物。颜色越深说明含量越高，于波长697 nm处测量吸光值可以进行定量分析。
图1为本发明微生态制剂在不同时间下对养殖水体的氨氮清除率变化曲线。从图1中可见，所得微生态制剂对养殖水体中氨氮的清除率最高可达65%。
测试2：微生态制剂去除亚硝酸盐试验
亚硝酸盐氮的测定：亚硝酸盐是氮循环的中间产物，不稳定。根据水环境条件，可被氧化成亚硝酸盐，也可被还原成氨。在磷酸介质中，pH值为1.8±0.3时，亚硝酸盐与对-氨基苯磺酰胺反应生成重氮盐，再与N-（1-萘基）-乙二胺偶联生成红色染料。在540nm波长处有最大吸收。
图2为本发明微生态制剂在不同时间下对养殖水体的亚硝酸盐清除率变化曲线。从图2中可见，所得微生态制剂对养殖水体中亚硝酸盐的清除率最高达75%。
测试3：微生态制剂稳定性试验
将实施例1所得微生态制剂在常温下避光条件下保存0个月、1个月、2个月、3个月后，分别取样检测制剂中的芽孢杆菌及低温乳杆菌的含量，结果见表1。
表1 稳定性试验
由表1可见，本发明微生态制剂在常温环境中具有长期的稳定性。
测试4：对半滑舌鳎幼苗存活率的影响
将半滑舌鳎幼苗分为两组，每组100尾，试验组添加本发明实施例1制得的微生态制剂进行喂养，对照组仅采用常规饲料喂养，其结果见表2。
表2 微生态制剂对幼苗存活率的试验
由表2可见，本发明微生态制剂可有效地提高半滑舌鳎幼苗的存活率。
测试5：对半滑舌鳎生长增重的影响
将半滑舌鳎分为两组，每组40尾，试验组A添加本发明实施例1制得的微生态制剂，添加量为饲料量的1wt%，对照组B仅采用常规饲料喂养；每组做3个平行，分别记为1、2、3，共6组，240尾。饲养8周后，空腹24h进行测定，并计算半滑舌鳎的增重率，其计算方法如下：
，
其中W1、W2分别为半滑舌鳎初重和末重。所得结果如表3所示。
表3 微生态制剂对半滑舌鳎增重率的影响试验
由表3可见，试验组A的平均增重率为67.62%，明显高于对照组B的平均增重率（55.19%）。
上述试验结果表明，与常规饲料喂养相比，采用本发明微生态制剂对半滑舌鳎的养殖显示出较好的效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (6)

1.一种用于半滑舌鳎养殖的微生态制剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）芽孢杆菌和低温乳杆菌的培养：将芽孢杆菌和乳杆菌菌种从试管斜面培养基中取出，分别接种到液体培养基中，然后置于摇床中，于20℃、150-250r/min条件下培养24h；
2）将步骤1）处于对数期的芽孢杆菌菌液及乳杆菌菌液分别接种到发酵培养基中进行发酵，发酵温度为20℃，发酵时间为48-72h；
3）将步骤2）处于对数期的芽孢杆菌发酵液和乳杆菌发酵液分别于10000r/min离心20min，以分离菌体与上清液；将所得菌体共同加入保护剂中搅拌混匀，再经真空冷冻干燥制得所述微生态制剂。
2.根据权利要求1所述微生态制剂的制备方法，其特征在于：步骤1）中芽孢杆菌所用的液体培养基配方为：每1000mL蒸馏水中含蛋白胨5-8g、酵母粉1-3g；pH值7.6-7.8；
乳杆菌所用液体培养基为MRS培养基。
3. 根据权利要求1所述微生态制剂的制备方法，其特征在于：步骤2）中乳杆菌菌液及乳杆菌菌液的接种量均为2vol%，两者所用发酵培养基配方为：每1000mL蒸馏水中含可溶性淀粉3-3.5g、蛋白胨10-12g、酵母膏3-5g、KH2PO4 1.5-4g、KHPO4 2-4g、MgSO4 0.1-1g、ZnCl21-3g；pH值7.4-7.6。
4.根据权利要求1所述微生态制剂的制备方法，其特征在于：步骤3）中所述保护剂由低聚木糖、β-葡聚糖、海藻糖、脱脂乳及水组成；
其中，低聚木糖和β-葡聚糖的浓度均为2.0g/L，海藻糖的浓度为5wt%，脱脂乳的浓度为20wt%。
5.一种如权利要求1所述方法制得的微生态制剂。
6.一种如权利要求5所述微生态制剂的应用，其特征在于：作为饲料添加剂用于半滑舌鳎的养殖。
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