CN106932329B - 一种皮肤病鉴别诊断检测盒 - Google Patents

Abstract

本申请提供一种皮肤病鉴别诊断检测盒，包含：苏木素染液配制原料、透明胶带、透明胶带取样器和使用说明书，所述说明书上包括如下内容：皮疹区表层脱落细胞取样方法；苏木素染液的配制方法、染色方法；及苏木素染色法在红斑丘疹鳞屑类皮肤病鉴别诊断上的应用。

Description

一种皮肤病鉴别诊断检测盒

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及皮肤病鉴别诊断，更具体地涉及一种皮肤病鉴别诊断用的检测盒。

技术背景

红斑、丘疹、鳞屑类皮肤病及出现类似皮疹形态的皮肤病常见有寻常型银屑病(点滴型、斑块型)、多形红斑、玫瑰糠疹、单纯糠疹、环形红斑、二期梅毒疹、躯干脂溢性皮炎、慢性湿疹、神经性皮炎、发疹性药疹等。从鉴别诊断角度看，典型病例根据各自临床特点可以用肉眼进行鉴别，但在临床实践中肉眼鉴别均有困难和不确定性。例如难以区别躯干部位不典型的点滴状银屑病与躯干玫瑰糠疹、下肢不典型斑块状银屑病与下肢钱币状湿疹、躯干不典型二期梅毒疹与躯干部发疹性药疹等。此时，需要借助相关实验室检查及皮肤组织病理检查进行鉴别。

皮肤病位于体表，病理活检相对容易，因此是皮肤科最常用的实验诊断方法。但是，因组织病理取材需要切取或钻取皮肤全层，部分患者依从性差不能很好配合，而无创伤性实验诊断更容易被患者接受。所以，探索无创伤性的皮疹区表皮脱落细胞诊断方法，来鉴别部分肉眼看来相似的皮肤病有极其重要的意义。

角质形成细胞从基底层逐层演化到角质层时，大约需要28天(即表皮通过时间)。正常皮肤最外层的角质层为死亡的脱落细胞，无细胞核，分不清细胞结构，由角质蛋白性碎屑构成。但在某些皮肤病时，中性细胞、淋巴细胞可以进入表皮，同时因角质形成细胞的表皮通过时间缩短，表皮角质层出现角化不全(即出现有细胞核的鳞状细胞)。

常见红斑丘疹鳞屑皮肤病组织病理学有关表皮层细胞学的研究进展^[1-2]如下：

1.寻常型银屑病(点滴型与斑块型等)组织病理的表皮层特点是表皮增生，在角质层有较多角化不全细胞(即角质形成细胞未角化完全，实质是一种鳞状细胞)及中性粒细胞形成的微脓肿(Muro微脓肿)，两类细胞可以相互层叠，构成“三明治”样结构。以中性粒细胞微脓肿为特征是寻常型银屑病最特征性的组织病理表现。

2.二期梅毒疹表皮增生，角质层有角化不全及中性粒细胞浸润或中性粒细胞微脓肿。

3.脂溢性皮炎表皮增生，表皮角质层的毛囊口的“唇缘”有角化不全细胞及中性粒细胞浸润及其微脓肿。

4.多形红斑组织病理表现为表皮层及其角质层有散在或融合的坏死细胞，无中性粒细胞浸润。

5.玫瑰糠疹表皮有增生、红细胞外渗、角化不全等，角质层无中性粒细胞浸润或其微脓肿。

6.慢性湿疹、慢性苔藓样糠疹、发疹性药疹，在它们组织病理的表皮轻重不等的增生，在角质层都有角化不全，而无中性粒细胞浸润或中性粒细胞微脓肿。

7.原发性皮肤T细胞淋巴瘤(曾用名蕈样肉芽肿)，表皮层有T淋巴细胞浸润，也可由角化不全，无中性细胞浸润及中性细胞微脓肿。

概括起来，上述红斑丘疹鳞屑类皮肤病具有的共同特性是表皮角质层细胞中均有角化不全细胞即皮肤鳞状细胞，而只有寻常型银屑病、二期梅毒疹及脂溢性皮炎的角质层有中性粒细胞及其微脓肿。而只有原发性皮肤T细胞淋巴瘤(曾用名蕈样肉芽肿)，表皮层有淋巴细胞浸润。我们知道，中性粒细胞核为杆状核、分叶核、或核碎裂与核尘是其特点；而角化不全细胞即表皮鳞状细胞为大圆形核或椭圆细胞核；淋巴细胞也是圆形核细胞，但细胞质比例少，细胞也比鳞状细胞偏小。

本发明者根据皮疹表层组织病理特点的不同，提供一种无创伤性表皮脱落细胞鉴别诊断检测盒，采用透明胶带粘贴皮疹区表皮脱落细胞，采取特定的取样器钻取粘附了皮疹区表皮脱落细胞的透明胶带，然后对其进行苏木素染色和镜检，从而完成了本发明。

发明内容

本发明提供一种皮肤病鉴别诊断检测盒，包含：苏木素染液配制原料、透明胶带和使用说明书，所述说明书上包括如下内容：胶带取样方法；苏木素染液的配制方法、染色方法；及苏木素染色法在红斑丘疹鳞屑类皮肤病鉴别诊断上的应用。

进一步说，所述红斑丘疹鳞屑类皮肤病分别以皮肤表层鳞状细胞、中性粒细胞和淋巴细胞为特征。即本发明的检测盒可用于鉴别诊断分别以皮肤表层鳞状细胞、中性粒细胞和淋巴细胞为特征的皮肤病。

本发明检测盒的说明书上写明胶带取样方法包括如下步骤：用剪成小块的透明胶带粘贴皮疹区，保留数秒钟后揭下弃去不用，另取同样大小的透明胶带粘贴皮疹区，保留数秒钟后揭下，固定在载玻片上，粘有细胞的一面朝上，制成固定了皮疹区表层脱落细胞样本的载玻片。

一个优选实施方案中，本发明的检测盒还包含透明胶带取样器，所述透明胶带取样器包括压头和手柄，所述手柄与压头可拆卸地连接，所述压头包括一体成型的头身部和刀刃部，所述头身部呈圆形管状，所述刀刃部呈椭圆形管状，所述刀刃部的侧面设有侧通孔。

在这个优选实施方案中，皮疹区表层脱落细胞的取样方法包括如下步骤：用剪成小块的透明胶带粘贴皮疹区，保留数秒钟后弃去不用，另取同样大小的透明胶带粘贴皮疹区，保留数秒钟后揭下，胶面向上放在硬橡胶板上，用透明胶带取样器将透明胶带钻取一片，然后用牙签从取样器刀刃部的侧通孔推出部分透明胶带标本，再用镊子取出整个透明胶带标本，轻放于载玻片上，制成固定了皮疹区表层脱落细胞样本的载玻片。

本发明的检测盒中，苏木素染液配制原料为：独立包装的苏木素、硫酸铝钾和碘酸钠。

本发明检测盒的说明书上写明苏木素染液的配制方法包括如下步骤：将苏木素6g溶于100ml无水乙醇，将硫酸铝钾150g溶于2000m l蒸馏水，将上述两种溶液与900ml甘油一起混合，最后加入冰醋酸120ml和碘酸钠1.2g。

本发明检测盒的说明书上写明苏木素染液的染色方法包括如下步骤：

(1)将固定了皮疹区表层脱落细胞样本的载玻片用95％酒精固定，用苏木素液染色5分钟；

(2)用流水稍洗去苏木素液1-3秒钟；

(3)蒸馏水过洗1-2秒钟；

(4)无水乙醇过洗5-10秒钟；

(5)用中性树胶封固染色后的样本。

本发明基于不同皮肤病患者皮疹表层组织病理特点的不同，主要根据细胞核形态的不同，用透明胶带取皮疹表层细胞，以苏木素染色来鉴别不同种类的细胞，进而鉴别不同的皮肤病。例如，鉴别点滴状银屑病与玫瑰糠疹；斑块状银屑病与局限性慢性湿疹；不典型斑块状银屑病与钱币状湿疹；点滴状银屑病与多形红斑；湿疹样皮炎与蕈样肉芽肿；花斑癣与二期梅毒疹；以及其它分别以皮疹表层鳞状细胞、中性粒细胞、淋巴细胞为特征的皮肤病。

本发明的有益效果

传统皮肤组织病理活检对于部分依从性差的患者较难实施，其虽然具有可观察到表皮、真皮及皮下组织细胞全层病变的优点，但缺点在于，仅仅在一个非常小的纵切面上观察细胞，如果切片没有切到病灶区域，就会遗漏病理改变。

本发明采用透明胶带无创伤性取样，患者依从性好。又采用特定的带有侧通孔的椭圆形压孔器钻取透明胶带取材标本，钻头的钻刃为椭圆形，使其钻取的透明胶带标本与某些椭圆形皮疹一致，最大限度地保留皮疹区标本，排除了非皮疹区标本，不易遗漏病理改变。钻头带有的侧通孔方便伸入牙签等捅出进入钻头口内的透明胶带标本。

传统透明胶带粘贴皮疹区脱落细胞所用的HE染色法需要20余个步骤，耗时较长。鉴于本发明所观察表皮脱落细胞主要是用细胞核的形态来鉴别细胞种类，改用以细胞核染色为主的苏木素染色法后，与HE染色法相比，不影响检验结果，而所用染色时间小于HE染色法二分之一，并且节约了二分之一的试剂成本，同时也提高了工作效率，缩短了出化验报告的时间。

使用本发明的检测盒，至少可将寻常型银屑病(包括斑块状银屑病、点滴状银屑病)与钱币样湿疹、玫瑰糠疹、湿疹样皮炎、慢性单纯苔藓样糠疹等红斑性疾病区别开来。

附图的简单说明

图1为透明胶带取样器的结构示意图；

图2为透明胶带取样器压头的俯视图；

图3为图2的A-A’向视图；

图4为图2的B-B’向视图。

图中：1、手柄；2、压头；21、头身部；22、刀刃部；221、侧通孔。

具体实施方式

下面结合实施例和检测例，更具体地说明本发明的内容，并对本发明作进一步阐述，但这些实施例和检测例并非对本发明的任何限制。本领域技术人员在本说明书的启示下对本发明实施中所作的任何变动都将属于本发明权利要求书的范围内。

实施例1：皮疹区表层脱落细胞取样方法

用剪成小块的透明胶带粘贴皮疹区，保留数秒钟后弃去不用，另取同样大小的透明胶带粘贴皮疹区，保留数秒钟后揭下，固定在载玻片上，粘有细胞的一面朝上，制成固定了皮疹区表层脱落细胞样本的载玻片。

实施例2：皮疹区表层脱落细胞取样方法

用剪成小块的透明胶带粘贴皮疹区，保留数秒钟后弃去不用，另取同样大小的透明胶带粘贴皮疹区，保留数秒钟后揭下，胶面向上放在硬橡胶板上，用图1所示透明胶带取样器将透明胶带钻取一片，然后用牙签从取样器刀刃部的侧通孔推出部分透明胶带标本，再用镊子取出整个透明胶带标本，轻放于载玻片上，制成固定了皮疹区表层脱落细胞样本的载玻片。

实施例3：苏木素染液的配制

在检测前，将检测盒中的苏木素6g溶于100ml无水乙醇，将硫酸铝钾150g溶于2000ml蒸馏水，将上述两种溶液与900ml甘油一起混合，最后加入冰醋酸120ml和碘酸钠1.2g，配制成苏木素染液。

实施例4：苏木素染液的染色方法

苏木素染液的染色方法包括如下步骤：

(1)将固定了皮疹区表层脱落细胞样本的载玻片用95％酒精固定，用苏木素液染色5分钟；

(2)用流水稍洗去苏木素液1-3秒钟；

(3)蒸馏水过洗1-2秒钟；

(4)无水乙醇过洗5-10秒钟；

(5)用中性树胶封固染色后的样本。

检测例1点滴状银屑病与玫瑰糠疹的皮疹区脱落细胞学比较

寻常型银屑病中的点滴状银屑病与玫瑰糠疹同属红斑鳞屑类皮肤病、都好发于躯干部位，肉眼看来有很多相似之处，部分皮疹不典型的点滴状银屑病与玫瑰糠疹通过专科体格检查不容易鉴别。本发明者根据两种疾病皮疹表层的组织病理特点不同，用透明胶带粘贴皮疹区表层脱落细胞苏木素染色法进行了比较研究。

(1)研究对象2015年9月-2016年6月至本院皮肤科就诊的根据临床表现拟诊及组织病理诊断为点滴状银屑病和玫瑰糠疹志愿受试者各30例，分别称为银屑病组和玫瑰糠疹组，其中银屑病组患者男18例，女12例，年龄39.50±21.55岁；玫瑰糠疹组患者男14例，女16例，年龄32.33±23.75岁。并且一个月内均未局部和全身使用过糖皮质激素类药物、钙调磷酸酶抑制剂及抗生素类等药物。

(2)方法两组志愿患者分别用实施例2的方法进行皮肤取样，将粘有皮肤样本的透明胶带用实施例3的方法进行苏木素染色。

(3)诊断标准：苏木素染色胶带标本出现群集状分布中性粒细胞的为“阳性结果”，诊断为银屑病；未出现中性粒细胞或者出现少量散在中性粒细胞的为“阴性结果”，诊断为玫瑰糠疹。比较本发明方法诊断结果与经典皮肤组织病理诊断结果，以组织病理诊断点滴状银屑病为金标准(即角化不全细胞的上方有中性粒细胞群集，或者角化不全与群集中性粒细胞交替出现呈现三明治样^[1]151-153)，来统计处理透明胶带粘贴法的诊断符合率。

(4)统计学处理：应用SPSS13软件进行统计学分析。比较中性粒细胞在两组疾病中的分布采用X²检验，P<0.05为差异有统计学意义。

(5)结果：根据光学显微镜下细胞核形态来判断细胞类型，将细胞核呈现分叶或杆状判定为中性粒细胞，而圆形或近圆形核为皮肤鳞状细胞即颗粒层或棘层的角质形成细胞，同时观察中性粒细胞分布形态，即分散或聚集分布。结果，银屑病组标本中可见群集成堆的深蓝色分叶核与杆状核，为中性粒细胞群集，还可见淡蓝色大圆形或椭圆形细胞核(为皮肤鳞状细胞即角化不全细胞)；玫瑰糠疹组标本中可见均匀分布的较大淡蓝色圆形或椭圆形细胞核(为皮肤鳞状细胞即角化不全细胞)。银屑病组标本中性粒细胞群集分布占93.33％(28/30)、散在分布占6.67％(2/30)、无分布为0％。而玫瑰糠疹组标本，中性粒细胞群聚分布占0％、散在分布占10％(3/30)，无分布占90％(27/30)。将两组中性粒细胞群聚分布率与非群聚分布率进行卡方检验，X²＝56,p<0.01，差别有显著统计学意义(见表1)。本发明方法对点滴状银屑病和玫瑰糠疹的诊断符合率分别为93.33％和100％，总诊断准确率为96.67％(见表2)。

表1两组患者中性粒细胞分布状况

表2透明胶带-苏木素染色法与组织病理诊断法诊断率比较

银屑病的诊断率(％)＝a/(a+b),玫瑰糠疹诊断率(％)＝d/(c+d),

总诊断准确率(％)＝(a+d)/(a+b+c+d)。

检测例2斑块状银屑病与局限性慢性湿疹的皮疹区脱落细胞学比较

寻常型银屑病中的斑块状银屑病临床表现为红斑、斑块、鳞屑表现为主。慢性湿疹的皮疹具有对称性、剧烈瘙痒性、顽固难治性、反复发作性等特点。下肢斑块状银屑病与下肢慢性湿疹二者都可发于下肢部位，肉眼看来有很多相似之处。治疗后或不典型的斑块状银屑病与不典型的慢性湿疹二者靠肉眼鉴别有一定困难。本发明者根据斑块状银屑病与慢性湿疹二者皮疹表层的细胞学种类不同，研发用透明胶带粘贴皮疹区表层脱落细胞苏木素染色法对这两种疾病进行了比较研究。

(1)研究对象2010年9月‐2015年12月至本院皮肤科就诊的对临床表现不典型的银屑病进行组织病理检查，将组织病理诊断的斑块状银屑病与慢性湿疹患者各60例分别称为银屑病组和慢性湿疹组，其中银屑病组患者男37例，女23例，年龄36.40±21.50岁；慢性湿疹组患者男45例，女15例，年龄32.45±26.20岁，发病以来未使用局部和全身药物。

(2)方法

主要试剂和材料：苏木素染液、一抗为鼠抗人粒细胞浓缩型抗体、二抗为辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG多克隆抗体、二氨基联苯胺(DAB)为底物显色试剂盒，均购自美国BioGenex公司。EAF固定液配置：取冰醋酸5ml，40％甲醛10ml，无水乙醇加至100ml。

方法：两组志愿受试者患者分别用实施例2的方法进行皮肤取样，将粘有皮肤样本的透明胶带进行苏木素染色及免疫组化染色，进行细胞学检查。同时，将两组志愿患者的非透明胶带粘贴皮疹区选择一处做皮肤组织病理检查。

a.苏木素染色：按实施例3的方法进行苏木素染色并封固后于光镜下观察。

b.中性粒细胞免疫组化染色：①取剩余两张粘有脱落细胞标本的胶带，用EAF固定液，4℃固定15min，PBS冲洗，然后按试剂盒说明的操作步骤进行操作。其中一张标本作为空白对照，另外一张标本做DAB显色和苏木素复染，时间均为40s。②染色后脱水，中性树脂封片，备用光镜观察。

(3)诊断标准：胶带标本苏木素染色后显微镜镜下观察，当出现群集状分布的中性粒细胞为“阳性结果”，诊断为银屑病；而未出现中性粒细胞或者出现少量散在中性粒细胞的为“阴性结果”，诊断为慢性湿疹。比较透明胶带法诊断结果与经典组织病理染色法诊断结果。

(4)统计学处理：应用SPSS13软件进行统计学分析。比较中性粒细胞在两组疾病中的分布采用X²检验，P<0.05为差异有统计学意义。

(5)结果

a.苏木素染色结果根据光学显微镜下细胞核形态来判断细胞类型，将细胞核呈现分叶或杆状判定为中性粒细胞，而圆形核或近圆形核为皮肤鳞状细胞，即相当于皮肤组织病理染色法的角质层角化不全细胞或颗粒层细胞。同时观察中性细胞分布状态，即分散或聚集分布。结果，银屑病组标本中可见群集成堆的深蓝色分叶核与杆状核，为中性粒细胞群集，还可见淡蓝色大圆形或椭圆形细胞核(为皮肤鳞状细胞即角化不全细胞)；慢性湿疹组标本中可见均匀分布的较大淡蓝色圆形或椭圆形细胞核(为皮肤鳞状细胞即角化不全细胞)。银屑病组标本中性粒细胞群集分布占96.67％(58/60)，中性粒细胞散在分布占3.33％(2/30)，无中性细胞分布为0。而慢性湿疹组标本，中性粒细胞群聚分布占0，中性细胞散在分布占10％(6/60)，无中性粒细胞占90％(54/60)。将两组中性细胞群聚分布率与中性粒细胞非群聚分布率(中性细胞分散分布+无中性细胞)进行卡方检验，X²＝108.63,p<0.01，表明两组中性细胞群集发生率差别有显著统计意义，见表3。

表3两组患者中性粒细胞分布状况

b.免疫组化结果斑块状银屑病组标本中群集分布的中性粒细胞的胞浆呈粒细胞单抗染色阳性，结合细胞核的形状是分叶状和杆状者，进一步证实此类细胞是中性粒细胞。而阴性对照标本的细胞浆不显色。

(6)透明胶带细胞苏木素染色法诊断率与皮肤组织病理诊断符合率比较：按照胶带标本出现群集状分布的中性粒细胞为“阳性结果”即诊断为银屑病；出现少量散在中性粒细胞或无中性粒细胞为“阴性结果”即诊断为慢性湿疹。计算出透明胶带苏木素染色法对斑块状银屑病和慢性湿疹的诊断符合率分别为96.67％和100％，鉴别诊断准确率为98.33％(表4)。

表4透明胶带-苏木素染色法与组织病理诊断法诊断率比较

透明胶带苏木素染色法诊断斑块状银屑病的诊断率(％)＝a/(a+b),慢性湿疹诊断率(％)＝d/(c+d),

总诊断准确率(％)＝(a+d)/(a+b+c+d)。

检测例3湿疹样皮炎、花斑癣、苔藓样糠疹与神经性皮炎皮疹区脱落细胞的检测

本发明者对发生于躯干部位其他两种红斑鳞屑性皮肤病－湿疹样皮炎及神经性皮炎也进行了透明胶带粘贴皮疹区脱落细胞、苏木素染色法的研究。选择12例湿疹样皮炎患者(非抓伤皮疹)、10例花斑癣患者、3例慢性苔藓样糠疹患者。

显微镜下观察(×400)，慢性湿疹的皮疹区标本可见均匀分布的较大淡蓝色圆形或椭圆形细胞核(为皮肤鳞状细胞即角化不全细胞)；花斑癣的皮疹区标本除了皮肤角质层碎屑外，还可见圆形孢子、菌丝。慢性苔藓样糠疹皮疹区标本可见皮肤鳞状细胞即角化不全细胞与皮损碎屑；神经性皮炎的皮疹区标本可见均匀稀疏分布的较大淡蓝色圆形或椭圆形细胞核(为皮肤鳞状细胞即角化不全细胞)及大量分布的无细胞形状、无核的角质层碎屑。总之，这些皮肤病患者的表皮脱落细胞均无群集性中性粒细胞出现，而只是表皮碎屑、表皮鳞状细胞及少量散发性中性粒细胞。另外，花斑癣皮疹区脱落细胞标本还可以见到圆形孢子或菌丝。然而，无论是斑块状银屑病还是点滴状银屑病，在表皮均有群集中性粒细胞出现。鉴于银屑病与其他红斑鳞屑性皮肤病这一最主要的区别特征，用本发明的检测盒可以进行鉴别诊断。

参考文献

[1]Dirk M Elston,Tammie Ferringer.Dermatopathology[M].1^st ed,SaunderElsevier 2008:151-160.

[2]朱学俊，涂平，陈雪喜，汪旸.皮肤组织病理学诊断[m].3版.北京:北京大学医学出版社，2016：73-93。

Claims (7)

1.一种皮肤病鉴别诊断检测盒，包含：苏木素染液配制原料、透明胶带和使用说明书，所述说明书上包括如下内容：皮疹区表层脱落细胞取样方法；苏木素染液的配制方法、染色方法；及苏木素染色法在红斑丘疹鳞屑类皮肤病鉴别诊断上的应用，

还包含透明胶带取样器，所述透明胶带取样器包括压头和手柄，所述手柄与压头可拆卸地连接，所述压头包括一体成型的头身部和刀刃部，所述头身部呈圆形管状，所述刀刃部呈椭圆形管状，所述刀刃部的侧面设有侧通孔。

2.如权利要求1所述的检测盒，其中所述红斑丘疹鳞屑类皮肤病分别以皮肤表层鳞状细胞、中性粒细胞和淋巴细胞为特征。

3.如权利要求1所述的检测盒，其中所述皮疹区表层脱落细胞取样方法包括如下步骤：用剪成小块的透明胶带粘贴皮疹区，保留数秒钟后揭下弃去不用，另取同样大小的透明胶带粘贴皮疹区，保留数秒钟后揭下，固定在载玻片上，粘有细胞的一面朝上，制成固定了皮疹区表层脱落细胞样本的载玻片。

4.如权利要求1所述的检测盒，其中所述皮疹区表层脱落细胞取样方法包括如下步骤：用剪成小块的透明胶带粘贴皮疹区，保留数秒钟后弃去不用，另取同样大小的透明胶带粘贴皮疹区，保留数秒钟后揭下，胶面向上放在硬橡胶板上，用透明胶带取样器将透明胶带钻取一片，然后用牙签从取样器刀刃部的侧通孔推出部分透明胶带标本，再用镊子取出整个透明胶带标本，轻放于载玻片上，制成固定了皮疹区表层脱落细胞样本的载玻片。

5.如权利要求1所述的检测盒，其中所述苏木素染液配制原料为：独立包装的苏木素、硫酸铝钾和碘酸钠。

6.如权利要求1所述的检测盒，其中所述苏木素染液的配制方法包括如下步骤：将苏木素6g溶于100ml无水乙醇，将硫酸铝钾150g溶于2000ml蒸馏水，将上述两种溶液与900ml甘油一起混合，最后加入冰醋酸120ml和碘酸钠1.2g。

7.如权利要求1所述的检测盒，其中所述苏木素染液的染色方法包括如下步骤：

(1)将固定了皮疹区表层脱落细胞样本的载玻片用95％酒精固定，用苏木素液染色5分钟；

(2)用流水稍洗去苏木素液1-3秒钟；

(3)蒸馏水过洗1-2秒钟；

(4)无水乙醇过洗5-10秒钟；

(5)用中性树胶封固染色后的样本。