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CN106939320B - 一种伪狂犬病毒js-2012株感染性克隆质粒、构建方法与应用 - Google Patents

一种伪狂犬病毒js-2012株感染性克隆质粒、构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种伪狂犬病毒JS‑2012株感染性克隆质粒、构建方法与应用，以我国新出现的PRV变异株JS‑2012株为基础，利用loxp‑Cre酶系统，在JS‑2012株gG基因终止密码子下游插入pBeloBAC11载体序列，建立了JS‑2012株感染性克隆质粒，并利用galk正反筛选系统对其进行遗传序列操作，建立了变异株JS‑2012株反向遗传操作系统，为深入研究PRV变异株的遗传变异机制、毒力增强、病毒潜伏感染机制及疫苗开发等提供技术平台。

Description

一种伪狂犬病毒JS-2012株感染性克隆质粒、构建方法与应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种伪狂犬病毒感染性克隆质粒及其制备方法和应用。
背景技术
伪狂犬病是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的以发热、奇痒、脑脊髓炎为主要特征的一种重要动物传染病。PRV能感染多种宿主，但猪是该病毒主要的天然宿主、贮存者和传播者。不同年龄段的猪都可感染，主要引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎，哺乳仔猪高死亡率，及种猪不育。PRV属于疱疹病毒科甲型疱疹病毒亚科，其基因组为线状双链DNA，长约150kb，由长独特区(UL)、短独特区(US)及US两侧的重复序列所组成，编码70多种蛋白。一些重要的病毒基因，如gE、gI、gG和tk，对病毒毒力存在显著影响，其缺失能使病毒致弱。
伪狂犬最早发生于美国，我国于20世纪60年代初在猪群中也出现了该病毒流行，至今PRV仍在我国广泛流行，严重威胁着我国猪群的健康，并造成了严重经济损失。PRV感染猪，除哺乳仔猪呈现高死亡外，其它猪都能耐过。但在耐过猪的外周神经细胞中，存在PRV的潜伏感染。潜伏感染的PRV在一定条件下能被激活，从而成为传染源，这增加了PRV防治的难度。为了控制PRV，我国猪场自上世纪末开始广泛使用PRV弱毒活疫苗，如PRV Bartha株活疫苗，猪伪狂犬发病率明显下降。但自2011年以来，许多使用PRV活疫苗免疫的规模化猪场出现了母猪产弱仔、死胎、流产，仔猪出现神经症状及死亡等伪狂犬的临床症状。国内多个研究组已证实，我国此次猪伪狂犬病的爆发是由于我国出现了伪狂犬病毒变异株导致的。与经典PRV毒株SC相比，伪狂犬病毒变异株毒力出现增强，Bartha疫苗对变异株不能完全保护。为了有效防控PRV变异株，需要深入研究病毒的遗传变异与毒力增强机制。
发明内容
本发明以我国新出现的PRV变异株JS-2012株为基础，利用loxp-Cre酶系统，在JS-2012株gG基因终止密码子下游插入pBeloBAC11载体序列，建立了JS-2012株感染性克隆质粒，并利用galk正反筛选系统对其进行遗传序列操作，建立了变异株JS-2012株反向遗传操作系统，为深入研究PRV变异株的遗传变异机制、毒力增强、病毒潜伏感染机制及疫苗开发等提供技术平台。
1、通过同源重组方法，在伪狂犬病毒JS-2012株gG基因ORF终止密码子下游插入两翼含有loxp的EGFP表达框，获得重组病毒rJS2012-gG/EGFP；利用Cre酶及loxp位点，删除EGFP表达框，获得gG基因ORF终止密码子下游插入loxp的重组病毒rJS2012-gG/loxp
2、利用Cre-loxp，将在BamHI-HindIII酶切位点间插入EGFP表达框的pBeloBAC11载体重组入rJS2012-gG/loxp中，获得重组病毒rJS2012-BAC，该重组病毒中，pBeloBAC11载体序列位于gG基因下游。
3、将rJS2012-BAC感染细胞过程中的基因组DNA电转化DH10B细菌，环状病毒基因含有pBeloBAC11，可在细菌中增殖，通过筛选，获得病毒基因组克隆化的质粒pBAC-JS2012。pBAC-JS2012转染细胞，可产生感染性病毒resJS-BAC，表明JS-2012株基因组克隆质粒pBAC-JS2012具有感染性。利用Cre酶，可删除resJS-BAC中的pBeloBAC11序列，获得resJS-ΔBAC。resJS-ΔBAC具有与亲本病毒JS-2012株相似的体外生长特性和小鼠毒力。
4、通过galk筛选基因，在pBAC-JS2012感染性克隆中删除了gE/gI基因，并拯救出gE/gI基因缺失病毒resJS-ΔgE/gI。
本发明同时提供了一种伪狂犬病毒感染性克隆，所述的伪狂犬病毒感染性克隆是通过以下方法制备得到的：
1)通过同源重组方法，在伪狂犬病毒gG基因ORF终止密码子下游插入两翼含有loxp的EGFP表达框，获得重组病毒rJS2012-gG/EGFP；利用Cre酶及loxp位点，删除EGFP表达框，获得gG基因ORF终止密码子下游插入loxp的重组病毒rJS2012-gG/loxp；
2)利用Cre-loxp，将在BamHI-HindIII酶切位点间插入EGFP表达框的pBeloBAC11载体重组入rPRV-gG/loxp中，获得重组病毒rJS2012-BAC，该重组病毒中，pBeloBAC11载体序列位于gG基因下游；
3)将rJS2012-BAC感染细胞过程中的基因组DNA电转化DH10B细菌，环状病毒基因含有pBeloBAC11，可在细菌中增殖，通过筛选，获得病毒基因组克隆化的质粒pBAC-JS2012；
优选的，其中所述的伪狂犬病毒选自PRV变异株JS-2012株。
同时，本发明还提供一种利用伪狂犬病毒感染性克隆在制备检测伪狂犬病毒的试剂或药物中的用途；
同时，本发明还提供一种伪狂犬病毒感染性克隆在制备预防或治疗伪狂犬病毒病生物制品中的用途；
同时，本发明还提供一种制备gE/gI缺失的伪狂犬病毒感染性克隆的构建方法，所述方法包括如下步骤：
1)、获得病毒基因组克隆化的质粒pBAC-JS2012；
2)、利用galk正反筛选系统，在PRV感染性克隆pBAC-JS2012上缺失gE/gI基因，获得gE/gI缺失的伪狂犬病毒感染性克隆pBACJS-ΔgE/gI；
优选的，其中所述的伪狂犬病毒选自PRV变异株JS-2012株；
同时，本发明还提供多种利用伪狂犬病毒感染性克隆拯救出的病毒，包括但不限于：resJS-BAC、resJS-ΔBAC、resJS-ΔgE/gI。
同时，本发明还提供一种区分gE/gI缺失的伪狂犬病毒感染性克隆与自然感染毒株的检测方法，包括以下步骤：使用LgEgIF/RgEgIR为引物进行PCR鉴定，gE/gI缺失的伪狂犬病毒感染性克隆扩增出1000bp的条带，为阳性菌落，而gE/gI非缺失的自然感染毒株扩出2000多bp条带。
需要说明的是，这种方法不仅仅针对于JS-2012株的操作，可以应用于多株PRV病毒株，本领域技术人员可以通过常规的实验操作和分子生物学操作，在本发明技术方案的启示下，实现其他毒株的相应的操作。
附图说明
本发明将通过例子并参照附图的方式说明，其中：
图1是以PRV JS-2012基因组为模板，使用引物PgGF/PgGR和PDgGF/PDgGR分别扩增左右侧同源臂，PCR扩增结果电泳图，其中，1：DNA Marker DL2000，2：左重组臂，3：右重组臂；
图2是使用FuGENE 6转染试剂将2ug pTEGGF转染BHK-21细胞绿色荧光图；
图3是使用FuGENE 6转染试剂将2ug PRV JS-2012基因组与1ug pTEGGF质粒共转染BHK-21细胞绿色荧光图；
图4是重组病毒rJS2012-gG/loxp PCR扩增鉴定结果电泳图；
图5是重组病毒rJS2012-gG/loxp PCR扩增鉴定结果序列分析图；
图6以pEGFP-C3D为模板，使用引物PEGFPF/PEGFPR扩增EGFP表达盒的PCR扩增鉴定结果电泳图，其中，1：DNA Marker DL2000，2：PCR扩增片段；
图7是使用FuGENE 6转染试剂将2ug pBeloBAC11-EGFP转染BHK-21细胞绿色荧光图；
图8是使用FuGENE 6转染试剂将1ug pBeloBAC11-EGFP、1ug pcDNA3.1-cre、2ugrJS2012-gG/loxp基因组共转染BHK-21细胞绿色荧光图；
图9是使用BamHI对3个克隆质粒进行限制性酶切图谱分析图，其中，1：DNA MarkerDL15000；2：基因组克隆质粒1；3：基因组克隆质粒2；4：基因组克隆质粒3；
图10是使用FuGENE 6转染试剂将2μg pBAC-JS2012转染Vero细胞绿色荧光图；
图11是PRV JS-2012、resJS-BAC、resJS-ΔBAC的病毒一步生长曲线图；
图12是PRV JS-2012、resJS-BAC、resJS-ΔBAC的病毒空斑实验图；
图13是小鼠接种JS-2012和resJS-ΔBAC后存活率。其中，(A)104TCID50接种；(B)105TCID50接种；
图14是以质粒pGalk为模板，使用引物galkup/galkdown扩增galk表达盒PCR扩增结果电泳图，其中，1：DNA Marker DL2000，2：PCR产物；
图15是使用菌液为模板、PgBDF/PgBDR与LgalkDF/LgalkDR为引物进行PCR筛选PCR扩增结果电泳图，其中，1：DNA Marker DL2000，2-7：PgBDF/PgBD鉴定结果，8-13：LgalkDF/LgalkDR鉴定结果；
图16是以pBAC-JS2012为模板，使用引物LgEgIF/LgEgIR和RgEgIF/RgEgIR扩增左同源臂PCR扩增结果电泳图，其中，1：DNA Marker DL2000，2：左同源臂；
图17是以pBAC-JS2012为模板，使用引物LgEgIF/LgEgIR和RgEgIF/RgEgIR扩增右同源臂PCR扩增结果电泳图，其中，1：DNA Marker DL2000，2：右同源臂；
图18是以XhoI和BamHI双酶切鉴定负筛选转移载体电泳图，其中，1：DNA MarkerDL5000，2：pSKDEI-1、3：pSKDEI-2；
图19是使用LgEgIF/RgEgIR为引物进行PCR鉴定电泳图，其中，M1：DNA MarkerDL5000，1-21：检测样品，c：pJS2012-BAC作对照，M2：DNA Marker DL2000；
图20是以resBACJS-ΔgE/gI感染Vero细胞绿色荧光图；
图21是提取resJS-ΔgE/gI基因组，以LgEgIF/RgEgIRPCR鉴定，测序结果图；
图22是以IFA检测在resJS-ΔgE/gI感染细胞中gE蛋白的表达，其中，A：PRV JS-2012，B：resJS-ΔgE/gI，C：negative control；
图23是resJS-ΔgE/gI与亲本株JS-2012的一步生长曲线图；
图24是resJS-ΔgE/gI与亲本株JS-2012的空斑形态图；
具体实施方式
下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯，R.E.金斯顿，J.G.塞德曼等主编，马学军，舒跃龙的译.北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行。
本发明在伪狂犬病毒变异株JS-2012基础上，通过同源重组，在病毒基因组gG终止密码子下游引入EGFP标记基因和loxp位点，并利用Cre酶/loxp的重组系统删除重组病毒中的EGFP基因，获得rJS2012-gG/loxp。在利用Cre酶/loxp的重组系统，将携带EGFP基因的BAC载体重组入rJS2012-gG/loxp，获得重组病毒rJS2012-BAC。将rJS2012-BAC感染细胞过程中的基因组DNA电转化DH10B细菌，筛选获得病毒基因组克隆化的质粒pBAC-JS2012。
pBAC-JS2012转染细胞，获得感染性的病毒resJS-BAC，证实pBAC-JS2012具有感染性。利用Cre酶/loxp系统删除resJS-BAC中BAC载体序列的病毒resJS-ΔBAC具有与亲本株JS-2012相近的生长特性和对小鼠强毒力特征。利用galk正反筛选系统，在pBAC-JS2012中成功构建了gE/gI缺失的克隆pBACJS-ΔgE/gI，从克隆来源的病毒resJS-ΔgE/gI不表达gE蛋白，证实了pBAC-JS2012的可操作性。本发明成功构建出的PRV变异株JS-2012的感染性克隆pBAC-JS2012，并建立了其操作方法，为利用反向遗传学研究病毒复制、潜伏感染与变异株毒力增强机制、开发新型弱毒疫苗和构建病毒载体等都具有重要意义。
下面通过实施例，具体阐述本发明。
在本发明的下述实施例中，使用的主要实验材料如下：
病毒和细胞：BHK-21细胞(美国细胞保藏中心ATCC，保藏号为：CCL-10)，Vero细胞(美国细胞保藏中心ATCC，保藏号为：CCL-81)，伪狂犬病毒变异株JS-2012(本实验室保存；发表文章见：童武，张青占，郑浩等.免疫后发病仔猪中伪狂犬病毒的分离和鉴定.中国动物传染病学报，2013，21(3)：1-7)。
质粒与菌株：pBeloBAC11载体与大肠杆菌DH10B由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所王云峰研究员惠赠，pgalk质粒与大肠杆菌SW102由河南大学曹更生教授惠赠，pcDNA3.1-cre购自和元生物技术(上海)股份有限公司，pEGFP-N1、pEGFP-C3购自Clontech公司，pMD18-T、大肠杆菌DH5α购自Takara公司。
其他试剂：限制性内切酶和T4DNA连接酶购自NEB公司，FuGENE 6转染试剂购自Promega公司，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、MEM、DMEM购自Gibco公司，质粒小提试剂盒购自QIAGEN公司，质粒中提试剂盒购自Macherey-Nagel公司，凝胶回收试剂盒购自广州东盛生物科技有限公司，PCR试剂购自Takara公司。正反筛选所需试剂购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
本发明的实施例中，BHK-21细胞和Vero细胞的培养方法如下：
BHK-21细胞在含有10％FBS的MEM培养基的T25细胞培养瓶中贴壁长满单层后，弃去细胞培养瓶中培养基，并以PBS洗一次，以0.25％的胰酶将细胞消化下，加入新的含有10％FBS的MEM培养基，以1∶8的比例分种于细胞瓶或细胞培养板中。
Vero细胞在含有10％FBS的DMEM培养基的T25细胞培养瓶中贴壁长满单层后，弃去细胞培养瓶中培养基，并以PBS洗一次，以0.25％的胰酶将细胞消化下，加入新的含有10％FBS的DMEM培养基，以1∶5的比例分种于细胞瓶或细胞培养板中。
实施例1重组病毒rJS2012-gG/loxp的构建
为了构建伪狂犬病毒JS-2012株感染性克隆，本实施例通过同源重组的方法，将loxp序列及标记基因EGFP插入JS-2012基因组中，获得重组病毒rJS2012-gG/EGFP。再通过Cre酶作用，删除rJS2012-gG/EGFP中的EGFP标记基因，获得携带loxp的重组病毒rJS2012-gG/loxp。
具体实施过程如下：
1.1转移载体pTEGGF的构建
首先使用XhoI和BamHI酶切pEGFP-C3，并用T4DNA polymerase补平，胶回收大片段并以T4DNA Ligase连接，获得了删除XhoI至BamHI间多克隆位点序列的质粒pPEGFP-C3D。以PRV JS-2012基因组为模板，使用引物PgGF/PgGR(表1)和PDgGF/PDgGR(表1)分别扩增左右侧同源臂，PCR扩增结果如图1(图1中，1：DNA Marker DL2000，2：左重组臂，3：右重组臂)，并将扩增产物连接入pMD18-T，获得重组质粒pGL-ARM和pGR-ARM。利用SalI和AseI酶切pGL-ARM、AseI和XbaI酶切pEGFP-C3D，回收小片段，以T4DNA Ligase连接入经SalI和XbaI酶切的pBlueScript SK(+)，获得重组质粒pLARM-EGFP。以AflII和EcoRI分别酶切pGR-ARM和pEGFP-N1，将从pEGFP-N1切下的polyA片段连接入pGR-ARM，获得重组质粒pRARM-PA。以XhoI和XbaI酶切pRARM-PA，回收小片段，以T4DNA Ligase连入经相同酶酶切的pLARM-EGFP，获得了转移载体pTEGGF。使用FuGENE 6转染试剂将2ug pTEGGF转染BHK-21细胞，转染后30h，转染细胞出现绿色荧光表达(图2)。本说明所有转染方法均按照FuGENE 6转染试剂说明书进行操作。
表1本说明中PCR扩增引物汇总表
Figure BSA0000141146440000071
Figure BSA0000141146440000081
1.2重组病毒rJS2012-gG/EGFP
以PRV JS-2012感染BHK-21细胞，感染后20h，收获细胞毒，以酚-氯仿法提取JS-2012基因组DNA。以FuGENE 6转染试剂将2ug PRV JS-2012基因组与1ug pTEGGF质粒共转染BHK-21细胞。转染后36h，转染细胞出现有绿色荧光表达的细胞病变(图3)。待60％细胞出现病变，收上清进行空斑纯化。经过连续3轮挑取有绿色荧光的单个病毒空斑进行纯化，获得含有EGFP及其两翼各有一个loxp位点插入的重组病毒，称之为rJS2012-gG/EGFP。
1.3重组病毒rJS2012-gG/loxp
利用FuGENE 6转染试剂将2ug pcDNA3.1-cre转染BHK-21细胞。转染后10h，以0.01MOI重组病毒rJS2012-gG/EGFP进行感染。待出现70％细胞病变，收上清进行空斑纯化。挑取没有绿色荧光的单个病毒空斑，获得不表达EGFP的重组病毒，称之为rJS2012-gG/loxp。并利用引物gLoxF/gLoxR(表1)检测重组病毒是否删除EGFP并含有单一loxp位点。PCR反应体系：94℃ 5min，94℃30s，68℃1min，68℃ 2min30s，共进行30个循环；72℃ 10min。PCR产物电泳结果如图4(1：DNA Marker DL2000，2：PCR扩增片段)，扩增出1条约550bp的条带，与预期大小一致。将目的条带进行测序，序列见说明书核苷酸和氨基酸序列表中SEQ IDNO.21，序列分析(图5)显示，在PRV gG Orf下游成功插入34bp的loxp序列。
实施例2重组病毒rJS2012-BAC的构建
本实施例通过loxp-Cre酶系统，借助于rJS2012-gG/loxp中的loxp位点，将携带标记基因EGFP的人工细菌染色体载体重组入rJS2012-gG/loxp，获得重组病毒rJS2012-BAC。具体实施过程如下：
2.1转移载体pBeloBAC11-EGFP的构建
以pEGFP-C3D为模板，使用引物PEGFPF/PEGFPR(表1)扩增EGFP表达盒，PCR反应体系：94℃ 5min，94℃ 30s，57℃ 45s，72℃ 2min，共进行30个循环；72℃ 10min。PCR产物电泳结果如图6(图6中，1：DNA Marker DL2000，2：PCR扩增片段)，扩增出1600bp左右目的条带。以BamHI和HindIII分别酶切目的DNA条带和pBeloBAC11，经胶回收，以T4DNA连接酶将EGFP表达盒与pBeloBAC11连接。连接产物转化DH5α，以BamHI和HindIII酶切筛选阳性克隆，获得转移载体pBeloBAC11-EGFP。使用FuGENE 6转染试剂将2ug pBeloBAC11-EGFP转染BHK-21细胞，转染后36h，转染细胞出现绿色荧光表达(图7)。
2.2重组病毒rJS2012-BAC
按照实施实例1.2方法，提取rJS2012-gG/loxp基因组DNA。以FuGENE 6转染试剂将1ug pBeloBAC11-EGFP、1ug pcDNA3.1-cre、2ug rJS2012-gG/loxp基因组共转染BHK-21细胞。共转染36h后，可见病变及绿色荧光的表达(图8)。待70％细胞病变，收上清进行空斑纯化。挑取有绿色荧光的单个病毒空斑，进行纯化获得BAC载体插入的重组病毒，命名rJS2012-BAC。
实施例3PRV感染性细菌人工染色体的构建
本实施例通过将rJS2012-BAC基因组电转化入大肠杆菌DH10B，筛选获得具有感染性的质粒pBAC-JS2012。具体实施过程如下：
以rJS2012-BAC感染vero细胞，感染后16-21h，使用Hirt法提取细胞中rJS2012-BAC复制过程中的环状基因组，电转化大肠杆菌DH10B，电转化条件如下：1mm电转化杯，1750V，25μF，200Ω，电击一次。电击后立即加入0.8mL S.O.C培养液，并将电转化菌移入2.0mL离心管，37℃培养1h，5000rmp离心2min，将沉淀菌涂布于含氯霉素(25μg/mL)的LB平板，37℃培养24h。挑取平板上的细菌菌落，置含氯霉素(25μg/mL)的LB液体培养基中，在37℃培养15h，提取重组BAC质粒。分别以PgBDF/PgBDR和PgCDF/gCDR为引物对，PCR检测重组BAC质粒，鉴定是否含有gB和gC基因。筛选获得3个含gB、gC基因的克隆质粒。使用BamHI对3个克隆质粒进行限制性酶切图谱分析，酶切条带电泳结果如图9(1：DNA Marker DL15000；2：基因组克隆质粒1；3：基因组克隆质粒2；4：基因组克隆质粒3)，三个克隆质粒BamHI酶切图谱相近，15kb以上条带2条，7.5kb-10kb间3条，5kb-7.5kb间4条，2.5kb-5kb间4条，2.5kb以下1条。克隆质粒1与克隆质粒2、3间的存在一个条带的差异，即2.5kb-5kb间的1个条带，克隆质粒1比克隆质粒2、3间大。对JS-2012基因组序列中Bam HI酶切位点进行分析，预测的大酶切条带与电泳图谱相符。将克隆质粒3称之为pBAC-JS2012(SEQ ID NO.24)，选择进行后续试验。
使用FuGENE 6转染试剂将2μg pBAC-JS2012转染Vero细胞，转染后24h，细胞出现表达绿色荧光的细胞病变(图10)，待细胞病变达70％，收获上清，获得拯救病毒resJS-BAC。上述实验结果表明，pBAC-JS2012转染细胞能产生感染性病毒颗粒，具有感染性。JS-2012株感染性克隆pBAC-JS2012构建成功。
参照实施实例1.3，以FuGENE 6转染试剂将2ug pcDNA3.1-cre转染Vero细胞，转染后10h，以0.01MOI重组病毒resJS-BAC进行感染。待出现70％细胞病变，收上清进行空斑纯化。经过三轮挑选无绿色荧光蛋白表达的单个空斑进行纯化，获得了不含BAC载体序列的PRV拯救株，称之为resJS-ΔBAC。参照实施例1.3方法，以resJS-ΔBAC基因组为模板、gLoxF/gLoxR为引物，扩增出的片段测序显示，序列与rJS2012-gG/loxp的序列一致。这表明，拯救病毒resJS-BAC中BAC载体序列可删除，获得的病毒resJS-ΔBAC与重组病毒rJS2012-gG/loxp具有相同的遗传特征。
实施例4拯救病毒生长特性分析
通过本实施实例，发现拯救病毒resJS-ΔBAC的生长动力学特征、空斑形态与JS-2012株相似，小鼠攻毒实验表明resJS-ΔBAC与JS-2012株的毒力相同，这显示从感染性克隆中拯救出的病毒resJS-ΔBAC具有与亲本株相同的生物学特性。
4.1一步生长曲线
将PRV JS-2012、resJS-BAC、resJS-ΔBAC以1MOI分别接种长满单层Vero细胞的T25中，孵育1h后，以DMEM洗一遍，每个培养瓶中加5ml 2％FBS的DMEM接种后分别以接种后分别于4、8、12、16、20、24、28、32、36、40h取培养上清500ul，并补加500ul含2％FBS的DMEM。将不同时间点的病毒以1∶10稀释成10-1至10-9的稀释度，并接种到生长于96孔细胞培养板中的单层Vero细胞，每个稀释度接8孔。接种细胞培养4d后，观察每孔的细胞病变，按照Reed-Muench法计算病毒TCID50，利用GraphPad软件绘制病毒一步生长曲线。病毒生长曲线如图11，三株病毒具有相似的生长动力学特性，但拯救病毒resJS-BAC、resJS-ΔBAC的最高滴度比亲本毒株JS-2012稍低。
4.2空斑实验
将拯救病毒resJS-BAC、resJS-ΔBAC与亲本毒PRV JS-2012分别使用DMEM培养基稀释后，接种Vero细胞，孵育1小时后，弃去病毒液，PBS洗两次，每孔加入3ml含有1％低熔点琼脂糖和2％FBS的覆盖培养基。室温凝固后，于37℃、5％CO2中倒置培养3d，以5％的结晶紫染色，结果如图12。在图12中，删除BAC载体后拯救病毒resJS-ΔBAC与亲本毒PRV JS-2012空斑形态一致，大小相近，而含BAC序列的resJS-BAC比JS-2012偏小。
4.3小鼠致病性实验
分别以104TCID50/只与105TCID50/只的PRV JS-2012和resJS-ΔBAC腹部皮下接种7周龄SPF级昆明雌性小鼠，每组10只，共5组，含一组以DMEM为接种物对照。每天观察小鼠死亡情况，绘制小鼠生存曲线。结果如图13，104TCID50接种(13A)，resJS-ΔBAC的存活率和死亡时间与PRV JS-2012完全一致；105TCID50接种(13B)，resJS-ΔBAC与PRV JS-2012接种组均完全死亡，死亡时间集中于接种后第4d和5d，但resJS-ΔBAC在第4d死亡率略高。这表明，拯救病毒删除BAC序列后，保持了亲本株JS-2012强毒特征。
实施例5利用galk正反筛选系统操作pJS2012-BAC构建gE/gI缺失病毒
本实施例利用galk正反筛选系统，在PRV感染性克隆pBAC-JS2012上缺失gE/gI基因，构建了gE/gI缺失病毒resJS2012-ΔgE/gI，从而建立了JS-2012感染性克隆pBAC-JS2012的操作方法。具体实施过程如下：
5.1正筛选
参照实施实例3中电转化方法，将pBAC-JS2012质粒电转进入SW102菌株，获得含pBAC-JS2012菌株SW102-BAC。
以质粒pGalk为模板，使用引物galkup/galkdown(表1)扩增galk表达盒，PCR反应体系：94℃ 4min，94℃ 1Ss，60℃ 30s，72℃ 1min，共进行30个循环；72℃ 10min。PCR产物电泳结果如图14(1：DNA Marker DL2000，2：PCR产物)，扩增获得1300bp左右的目的条带，胶回收该条带。
制备SW102-BAC菌株电转化感受态，按照实施实例3中电转化方法，将galk条带转入SW102-BAC。将转化菌涂M63平板(15g Agar溶于800ml去离子水中高压灭菌，再添加200ml5xM63、1ml 1M MgSO4、10ml 20％半乳糖、5ml 0.2mg/ml生物素、4.5ml 10mg/ml L-亮氨酸、500ul氯霉素(25mg/ml)后，倒无菌平皿，获得M63平板)进行正筛选。32℃培养3d后，挑取菌落于含氯霉素(25μg/ml)的LB液体中培养16h，直接使用菌液为模板、PgBDF/PgBDR与LgalkDF/LgalkDR(表1)为引物进行PCR筛选gB与galk阳性克隆，PCR扩增结果如图15(1：DNAMarker DL2000，2-7：PgBDF/PgBD鉴定结果，8-13：LgalkDF/LgalkDR鉴定结果)，所检测的6个克隆，均能扩增出gB基因片段，但其中只有3个克隆检测出galk基因，且大小与预期相符。由于LgalkDF位于JS-2012基因组中galk重组位点上游，LgalkDR位于galk基因中，LgalkDF/LgalkDR扩增出片段，则显示galk基因重组如病毒基因组中。因此，三个扩增出片段的克隆为阳性克隆，命名SW102-BAC-galk+。经测序后确认galk的序列如SEQ ID NO.23所示。
5.2反筛
以pBAC-JS2012为模板，使用引物LgEgIF/LgEgIR和RgEgIF/RgEgIR扩增左、右同源臂，左同源臂片段如图16(1：DNA Marker DL2000，2：左同源臂)，右同源臂片段如图17(1：DNA Marker DL2000，2：右同源臂)，两同源臂长为500bp左右。胶回收左同源臂、右同源臂和Eco RV酶切pBluescriptSK载体，使用体外重组试剂盒Gibson Assembly Master Mix将左、右重组臂与载体连接，获得负筛选转移载体pSKDEI。以XhoI和BamHI双酶切鉴定负筛选转移载体，如图18(1：DNA Marker DL5000，2：pSKDEI-1、3：pSKDEI-2)，可将pSKDEI酶切成1000bp和3000bp左右的两条带，与序列分析图谱结果一致。
以pSKDEI为模板，以LgEgIF/RgEgIR(表1)为引物，PCR扩增获得DNA片段DgE/gI。参照实施实例3方法，将DgE/gI片段电转入SW102-BAC-galk+中，将转化菌涂M63负筛选平板(15g Agar溶于800ml去离子水中高压灭菌，再添加200ml 5xM63，1ml 1M MgSO4，10ml 20％DOG，10ml 20％甘油，5ml 0.2mg/ml生物素，4.5ml 10mg/ml L-亮氨酸，500ul氯霉素(25mg/ml)后，倒无菌平皿，获得M63负筛选平板)。32℃培养3d后，挑取菌落于含氯霉素(25μg/ml)的LB液体32℃培养16h，使用LgEgIF/RgEgIR为引物进行PCR鉴定。PCR产物电泳结果如图19(M1：DNA Marker DL5000，1-21：检测样品，c：pBAC-JS2012作对照，M2：DNA MarkerDL2000)，15个菌落培养物扩增出1000bp的条带，为阳性菌落，而gE/gI非缺失的pBAC-JS2012扩出2000多bp条带。将阳性克隆称之为pBACJS-ΔgE/gI(SEQ ID NO.25)。
5.3resJS-ΔgE/gI病毒拯救
使用NucleoBond Xtra Midi试剂盒从阳性克隆菌液中提取pBACJS-ΔgE/gI，以转染试剂FuGENE 6将2ug pBACJS-ΔgE/gI转染Vero细胞，获得病毒resBACJS-ΔgE/gI。以resBACJS-ΔgE/gI感染Vero细胞，感染20h后细胞中可出现绿色荧光表达(图20)。参照实施实例1.3方法，使用FuGENE 6转染试剂将2ug pcDNA3.1-cre转染Vero细胞，再以resBACJS-ΔgE/gI感染细胞。待细胞出现60％病变，收获上清，进行空斑纯化。经过三轮挑选没有绿色荧光蛋白表达的空斑，获得病毒称之为resJS-ΔgE/gI。
5.4resJS-ΔgE/gI鉴定
提取resJS-ΔgE/gI基因组，以LgEgIF/RgEgIR(表1)PCR鉴定，测序结果如SEQIDNO.22所示。与JS-2012基因组相比，resJS-ΔgE/gI基因组中含有一段gI基因编码区第571位核苷酸至gE基因编码区1211位核苷酸的缺失(图21)。
以resJS-ΔgE/gI感染6孔板中的Vero细胞，同时以JS-2012感染为阳性对照，DMEM感染为阴性对照，使用本实验室gE单克隆抗体作为一抗，羊抗鼠IgG为二抗，以IFA检测在resJS-ΔgE/gI感染细胞中gE蛋白的表达。如图22(A：PRV JS-2012，B：resJS2012-ΔgE/gI，C：negative control。)，仅有野毒株JS-2012感染细胞中呈现绿色荧光，而resJS-ΔgE/gI与DMEM接种的阴性对照细胞相同，未见荧光，这表明resJS-ΔgE/gI不表达gE蛋白。
5.5resJS-ΔgE/gI生物学特性分析
参照实施例4.1和4.2方法，比较resJS-ΔgE/gI与亲本株JS-2012的一步生长曲线及空斑形态。一步生长曲线(图23)结果显示，resJS-ΔgE/gI增殖速度与JS-2012相比，稍有下降。空斑实验(图24)显示，resJS-ΔgE/gI空斑比JS-2012的偏小。这表明gE/gI基因的删除，能影响病毒的增殖与细胞间扩散。
本发明并不局限于前述的具体实施方式。本发明扩展到任何在本说明书中披露的新特征或任何新的组合，以及披露的任一新的方法或过程的步骤或任何新的组合。
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Claims (5)

1.一种伪狂犬病毒感染性克隆pBAC-JS2012，其特征在于，该质粒由载体pBeloBAC11、伪狂犬病毒JS-2012株基因组序列、标记基因EGFP和loxp序列组成，其中：
(1)标记基因EGFP位于载体pBeloBAC11的BamHI-HindIII两酶切位点间；
(2)伪狂犬病毒JS-2012株基因组序列插入载体pBeloBAC11的loxp位点，通过JS-2012基因组序列插入时形成两个loxp位点在gG基因终止密码子下游将环状JS-2012基因组分开并实现载体pBeloBAC11与JS-2012基因组序列的连接；
所述的pBAC-JS2012全长序列如SEQ ID NO.24所示。
2.如权利要求1所述的伪狂犬病毒感染性克隆，其特征在于，所述的伪狂犬病毒选自PRV变异株JS-2012株。
3.权利要求1或2所述的伪狂犬病毒感染性克隆在制备检测伪狂犬病毒的试剂或药物中的用途。
4.权利要求1或2所述的伪狂犬病毒感染性克隆在制备预防或治疗伪狂犬病毒病生物制品中的用途。
5.一种区分权利要求1所述的伪狂犬病毒感染性克隆pBAC-JS2012与自然感染毒株的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：使用LgEgIF/RgEgIR为引物进行PCR鉴定，权利要求1所述的伪狂犬病毒感染性克隆pBAC-JS2012扩增出1000bp的条带，为阳性菌落，而gE/gI非缺失的自然感染毒株扩出2000多bp条带；
所述LgEgIF/RgEgIR的序列为：
LgEgIF：ACGGTATCGATAAGCTTGATAGCGTGCACGTCGCCGGCAG
LgEgIR：TCGTGACGCCGTCCACGTAG GTCGTGCCACGATCCGACGACGGG。
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