CN106928332A - 一种不同溶解性的贻贝蛋白及多肽的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种不同溶解性贻贝蛋白及多肽的制备方法，清洗、去壳、去足丝，匀浆；依次分步进行肌浆蛋白、肌原纤维蛋白、基质蛋白的提取得到相应的提取液，再分别进行超滤，最后进行喷雾干燥得到蛋白粉。另外以上的蛋白提取液酶解、灭酶、离心取上清液、超滤、再进行喷雾干燥得到多肽粉。贻贝中根据溶解性的不同分为肌浆蛋白，肌原纤维蛋白，基质蛋白。利用肌浆蛋白溶于水溶液或稀盐溶液，肌原纤维蛋白溶于一定浓度的盐溶液，基质难溶于水的特性，将贻贝中的混合蛋白进行了适当的分离。并分别用这些蛋白进行酶解，得到不同的三种酶解多肽产物，提高了原料的利用率。

Description

一种不同溶解性的贻贝蛋白及多肽的制备方法

技术领域

本发明涉及一种不同溶解性的贻贝蛋白及多肽的制备方法。

背景技术

贻贝是贝类养殖事业中的重要种类，生产数量也很大。贻贝干品蛋白含量在60%左右，经济价值很高，也有一定的实用价值。为了更充分的开发利用贻贝，本发明采用分步提取的方法使原料的蛋白质溶出，同时也较好的根据蛋白溶解性差异，把原料中的混合蛋白进行了分离，便于后期对不同的蛋白进行研究。

目前的研究中，关于贻贝蛋白的组成、含量等没有确切的报道，贻贝蛋白中各种组分的氨基酸序列更是鲜有报道。这对于贻贝蛋白的深入研究，具有一定的限制。这种限制主要表现在两个方面，简述如下：

第一，由于蛋白质在不同体系中的溶解性存在一定的差异，如果我们能够根据蛋白质的溶解性进行分类，那么在液态食品体系中根据体系特性使用不同溶解性的蛋白质，极有可能提高体系的稳定性，有效保持产品品质。因此，根据溶解性对蛋白进行分类提取制备具有一定的意义。

第二，贻贝中含有不同种类的蛋白质，是通过生物酶解法获得生物活性肽的良好蛋白质来源。然而由于体系的复杂程度较大，对于我们进行定向酶切技术的应用具有一定的限制。因此，通过溶解性的不同将贻贝蛋白进行分类制备，就可以一定程度上减少体系的复杂程度，同时可以为贻贝蛋白的进一步分离制备提供有效的理论和技术基础，该发明具有一定的实用价值。

贻贝，又名淡菜﹑海红﹑海夫人，主要有条纹贻贝﹑紫贻贝和厚壳贻贝，贻贝在分类上属于软体动物门(Mollusca)、瓣鳃纲(Lamellibranchia)、异柱目(Anisomyaria)、贻贝科(Mytilidae)海洋生物。我国已发现的有近50种，分18个属。它们的贝壳都呈三角形，表面有一层黑漆色发亮的外皮。贻贝味道极鲜，营养丰富，它所含蛋白质﹑碘﹑钙和铁都比较多，但所含脂肪很少。产自浙江﹑福建﹑山东﹑辽宁等沿海省份，养殖量极大。在海产食品中，低值的贻贝并未充分利用，因此研究与开发贻贝提高它的利用价值就有十分重要的意义。本专利从蛋白质的角度对贻贝进行初步分析，以便寻求新的思路提高贻贝的利用率。

贻贝中根据溶解性的不同分为肌浆蛋白，肌原纤维蛋白，基质蛋白。利用肌浆蛋白溶于水溶液或稀盐溶液，肌原纤维蛋白溶于一定浓度的盐溶液，基质难溶于水的特性，将贻贝中的混合蛋白进行了适当的分离。

但目前报道的贻贝蛋白的提取技术方法有三个方面的局限性：

（1）对于三种溶解性蛋白的分步提取技术不明确；

（2）各种蛋白的提取率较低；

（3）制备出的蛋白质未能经过后续处理，并开发成可以直接应用的产品。

国内外对贻贝的药用食用价值已经做了大量的研究工作，取得了不少成绩，部分已在医药及食品的生产中得到了应用。但贻贝在我国养殖区域广，产量大，无论从药用的角度，还是从保健食疗的角度均具有广阔的开发前景。在我国，贻贝主要是新鲜或者粗加工后供民间食用，如果能够结合研究成果，加强活性成分的确定，分离，提取，药理和临床等基础研究，发展出相应的保健食品及其药品，不仅对疫病的预防和治疗有贡献，而且会产生较大的社会效益及经济效益。

目前，对贻贝蛋白的分离、提取及理化性质的研究鲜有报道。针对蛋白分级的研究较多集中在小麦、大米、荞麦等农作物蛋白源，而对于贻贝蛋白的分级以及提取工艺的研究鲜有报道。

分别用这些蛋白进行酶解，得到不同的三种酶解多肽产物，具有不同的应用方向和研究价值，提高了原料的利用率。

发明内容

本发明首先对原料进行充分的利用，一批次处理可以获得三类蛋白，且蛋白具有一定特征分子量。分别用这些蛋白进行酶解，得到不同的三种酶解多肽产物，提高了原料的利用率。

本发明的技术方案是这样实现的： 一种不同溶解性贻贝蛋白的制备方法，清洗、去壳、去足丝，匀浆；依次分步进行肌浆蛋白、肌原纤维蛋白、基质蛋白的提取得到相应的提取液，再分别进行超滤，最后进行喷雾干燥得到蛋白粉。

进一步地，肌浆蛋白提取液为0.05mol/L，pH=7的磷酸缓冲溶液，浸提时间30-90min，浸提次数2-3次，温度2-4℃，料液比1:3-1:20，浸提后进行离心，最终蛋白液用10000Da超滤膜过滤。

进一步地，肌浆蛋白提取液为0.05mol/L，pH=7的磷酸缓冲溶液，浸提时间30-90min，浸提次数2-3次，温度2-4℃，料液比1:3-1:20，浸提后进行离心，最终蛋白液用10000Da膜超滤过滤。

进一步地，基质蛋白提取液为2%-5%的柠檬酸溶液，浸提时间60-90min，浸提次数2-4次，温度30-70℃；浸提后进行离心，最终蛋白液用10000Da膜超滤。

进一步地，采用喷雾干燥的进口温度130-170℃，出口温度60-90℃，进行喷雾干燥之前的可对蛋白液进行蒸发浓缩，使其固形物含量是15-50%。

进一步地，采用低温喷雾干燥的方式进行干燥，进风温度68-80℃，出风温度30-45℃，固形物含量要求15-50%，干燥之后的样品控制在5%以内。

另外，用上述贻贝蛋白制备贻贝多肽的方法，对蛋白提取液酶解、灭酶、离心取上清液、超滤、再进行喷雾干燥得到多肽粉。

进一步地，所述酶解的条件是：胰蛋白酶pH8-9、温度40-47℃、时间2-6h；加酶量3000-5000U/g。

进一步地，沸水浴5-15min进行灭酶。

进一步地，待灭酶后的样品冷却至室温后，进行离心，转速8000-10000g/min、时间5-15min。

进一步地，离心后将上清液经过超滤，收集分子量3K以下的酶解液，除去大分子物质。

本发明的有益效果为：本发明旨在以贻贝为原料，采用三步分别提取的技术，获得了贻贝中大部分的蛋白。不仅解决了蛋白提取率低的问题，还使混合蛋白适当进行了分离。同时再酶解等方式，制备新型贻贝多肽。可广泛应用于保健食品，功能性食品等产品中，开阔了广泛的市场前景。采用超滤技术和喷雾干燥技术，最大限度的保证了蛋白及多肽产品的纯度问题，从而保证了其最终的活性发挥到最大（粒度分布、湿含量、生物活性、溶解性、色、味等）。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步解释说明。

实施例1贻贝蛋白的制备方法：

1）前处理：清洗、去壳、去足丝、匀浆5000-8000rpm/min，时间15-30min。

2）肌浆蛋白提取液为0.05mol/L，pH=7的磷酸缓冲溶液，浸提时间30-90min，浸提次数2-3次，温度2-4℃，料液比1:3-1:20.离心条件：8000-13000g，10-20min，4℃。最终蛋白液用10000Da膜超滤2-6次。

3）肌原纤维蛋白提取液为0.1mol/L,pH=7含0.6mol/L氯化钠的磷酸缓冲溶液；浸提时间30-60min；浸提次数2-3次；温度2-4℃；料液比1:3-1:20；离心条件：8000-13000g，10-20min，4℃。最终蛋白液用10000Da膜超滤2-6次。

4）基质蛋白提取液为2%-5%的柠檬酸溶液，浸提时间60-90min，浸提次数2-4次，温度30-70℃；离心条件：8000-10000rpm，20-40min，4℃。最终蛋白液用10000Da膜超滤2-6次。采用超滤技术目的在于除去蛋白溶液中的盐分。在超滤之前对样品进行两次离心，以求快速超滤，防止堵塞，延长膜的使用寿命。

5）采用喷雾干燥技术对贻贝蛋白进行干燥，对采用喷雾干燥的进口温度130-170℃，出口温度60-90℃，进行喷雾干燥之前的可对蛋白液进行蒸发浓缩，使其固形物含量是15-50%。

相关测定方法

蛋白含量的测定：

（1）采用凯氏定氮的方法。

称取充分混合的固体样品0.2-2g，精确至0.001g移入干燥的250ml或500ml定氮瓶中，加入0.2g五水硫酸铜，6g硫酸钾，20ml浓硫酸，摇匀后放入消化炉中进行消化，选择如下程序：220℃处理60min，440℃处理90min。完成后放入自动凯氏定氮仪中进行处理，硼酸吸收游离的氨，用浓度为0.0995-0.1005mol/L的标准盐酸进行滴定。根据酸的消耗量乘以换算系数6.25，即为蛋白质的含量。

（2）采用考马斯亮蓝的方法

配置溶液：标准蛋白液：0.1g牛血清蛋白用超纯水溶解并稀释至1L；考马斯亮蓝G-250（0.01%）染液：称取0.1g考马斯亮蓝G-250溶于50mL95%乙醇中，再加入100mL浓磷酸（85%）加蒸馏水定容至1000mL。

标准曲线制作： 试管编号 0 1 2 3 4 5 6

100ug/ml标准蛋白（mL） 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

超纯水（mL） 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4

考马斯亮蓝试剂 （mL） 5 5 5 5 5 5 5 摇匀，室温静置3min

以1号管为空白对照,在595nm处比色 ，标准曲线的绘制至少三组平行，使R*R>0.9980

样品1mL加入5ml考马斯试剂，混匀，室温静置3min以标准曲线中的1号管为空白对照，在595nm处比色。带入标准曲线中，计算样品蛋白含量。

该方法得到的贻贝蛋白的基本指标为：

① 贻贝蛋白最终呈现粉末状

②蛋白水分含量≤5%

③三种贻贝蛋白的蛋白含量（以N计）≥80%

④肌浆蛋白条带分布较为广泛，范围在90-40KDa，其中以45KDa蛋白为主，肌原纤维蛋白分子量范围70-120KDa，其中以102KDa蛋白为主，基质蛋白分子量大致分布为103、87、72、17KDa。三种蛋白各具有明显的特征条带。总蛋白提取率范围为75-85%。

⑤三种蛋白溶液超滤后制得蛋白粉的蛋白含量在65-90%范围内，明显提高了蛋白纯度。有利于后一步的研究工作。

用实施例1的方法得到的贻贝蛋白进一步进行酶解、灭酶、离心取上清液、超滤、再进行喷雾干燥得到多肽粉，具体的工艺步骤和条件为：

1）酶解条件：胰蛋白酶pH8-9、温度40-47℃、时间2-6h；加酶量3000-5000U/g

2）灭酶：沸水浴5-15min

3）离心：待灭酶后的样品冷却至室温后，进行离心，转速8000-10000g/min、时间5-15min。

4）超滤：将上清液经过超滤，收集分子量3K以下的酶解液，除去大分子物质。

5）喷雾干燥：采用喷雾干燥技术对贻贝蛋白进行干燥，进口温度130-170℃，出口温度60-90℃，进行喷雾干燥之前的可对蛋白液进行浓缩，使其固形物含量是15-50%（根据实际生产需要和设备型号的样品流变学特性确定具合适的固形物含量。也可采用低温喷雾干燥的方式进行干燥，进风温度68-80℃，出风温度30-45℃，固形物含量要求15-50%。干燥之后的样品控制在5%以内。

本发明的制备方法得到多肽的分子量分布为：700-2700Da，其中<1000Da的占的比例为：21.74%；<2000Da的比例为：85.51%。多肽得率为：60%-80%，三种多肽水分含量≤5%。三种多肽蛋白含量（以N计）≥95%。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种不同溶解性贻贝蛋白的制备方法，其特征在于，清洗、去壳、去足丝，匀浆；依次分步进行肌浆蛋白、肌原纤维蛋白、基质蛋白的提取得到相应的提取液，再分别进行超滤，最后进行喷雾干燥得到蛋白粉。

2.根据权利要求1所述的不同溶解性贻贝蛋白的制备方法，其特征在于，肌浆蛋白提取液为0.05mol/L，pH=7的磷酸缓冲溶液，浸提时间30-90min，浸提次数2-3次，温度2-4℃，料液比1:3-1:20，浸提后进行离心，最终蛋白液用10000Da超滤膜过滤。

3.根据权利要求1所述的不同溶解性贻贝蛋白的制备方法，其特征在于，肌浆蛋白提取液为0.05mol/L，pH=7的磷酸缓冲溶液，浸提时间30-90min，浸提次数2-3次，温度2-4℃，料液比1:3-1:20，浸提后进行离心，最终蛋白液用10000Da膜超滤过滤。

4.根据权利要求1所述的不同溶解性贻贝蛋白的制备方法，其特征在于，基质蛋白提取液为2%-5%的柠檬酸溶液，浸提时间60-90min，浸提次数2-4次，温度30-70℃；浸提后进行离心，最终蛋白液用10000Da膜超滤。

5.根据权利要求1所述的不同溶解性贻贝蛋白的制备方法，其特征在于，采用喷雾干燥的进口温度130-170℃，出口温度60-90℃，进行喷雾干燥之前的可对蛋白液进行蒸发浓缩，使其固形物含量是15-50%。

6.根据权利要求5所述的不同溶解性贻贝蛋白的制备方法，其特征在于，采用低温喷雾干燥的方式进行干燥，进风温度68-80℃，出风温度30-45℃，固形物含量要求15-50%，干燥之后的样品控制在5%以内。

7.由权利要求1-6任一项所述的贻贝蛋白制备贻贝多肽的方法，其特征在于，对蛋白提取液酶解、灭酶、离心取上清液、超滤、再进行喷雾干燥得到多肽粉。

8.根据权利要求7所述的制备贻贝多肽的方法，其特征在于，所述酶解的条件是：胰蛋白酶pH8-9、温度40-47℃、时间2-6h；加酶量3000-5000U/g。

9.根据权利要求7所述的制备贻贝多肽的方法，其特征在于，沸水浴5-15min进行灭酶。

10.根据权利要求1所述的制备贻贝多肽的方法，其特征在于，待灭酶后的样品冷却至室温后，进行离心，转速8000-10000g/min、时间5-15min。

11.根据权利要求1所述的不同溶解性贻贝蛋白的制备方法，其特征在于，离心后将上清液经过超滤，收集分子量3K以下的酶解液，除去大分子物质。