CN106924817B - 一种超薄载体细胞片及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种超薄载体细胞片及其制备方法。包含如下步骤：1)将凝胶材料溶液铺展到基底上凝固成固态；2)得到的铺有凝胶材料的基底上生成与凝胶材料所带电性相反的离子聚合物层，再在上层离子聚合物层上生成与上层离子聚合物层电性相反的离子聚合物层，依此循环，形成层层自组装膜；3)把目的细胞种植于步骤2)得到的基底之上，常规培养；4)培养过程中，负载有细胞的层层自组装膜脱离基底，形成细胞片。相较于传统细胞片的制备方法，本发明省去了支撑体材料的性状控制或消解步骤，显著提升了细胞片的机械强度，还可以负载蛋白、多肽、抗体、核酸等大分子药物。

Description

一种超薄载体细胞片及其制备方法

技术领域

本发明属于组织工程领域，特别涉及一种超薄载体细胞片及其制备方法。

背景技术

细胞移植被广泛的用于组织工程领域中进行角膜、心肌重建，组织修复。但传统的注射细胞悬液的方法无法确保细胞在损伤区域的有效驻留，也无法调控修复区域的形状和大小。并且，由于细胞悬液在收集的过程中需要经过胰蛋白酶或化学药品处理才能从培养容器表面剥离、回收，这样会造成细胞损伤导致原有功能受到损害。因此，人们将细胞接种到胶原凝胶、纤维蛋白凝胶等生物可降解支架材料上，再连同支架材料一起移植。这种含细胞支架具有可调节的机械性能，便于负载药物和进行人工修饰。但这些支架材料通常很厚，不利于小空间移植，而且随着大量材料在体内降解容易诱发免疫、炎症反应，病理性纤维化，眼部的移植还会引起透光减弱的问题。为了解决上述困难，人们又开发出了一种无载体的细胞片(cell sheet)产品。细胞片的构建思路是预制一层性状可控或可消解的支撑体，再将细胞接种到支撑体上，通过细胞自身的增殖、迁移连接成片，之后通过改变支撑体性状或消解支撑体，使细胞成片脱附，形成细胞片。目前的支撑体材料主要包括细胞、温敏材料、粗糙颗粒、可被酶解的水凝胶、具有磁性的阳离子脂质体、具有压电响应性质的聚合物电解质薄膜，不同的材料对应着不同的构建方法。但通过这些方法构建的细胞片是通过细胞与细胞之间的结构和细胞分泌的细胞外基质(extracelluarmix，ECM)使细胞相互连接成片的，因此这种细胞片的机械性能较差，容易破损。并且，因为没有附加的材料结构，此类细胞片无法进行药物负载或进行进一步的人工修饰。

因此，需要开发出一种同时兼具含细胞支架和细胞膜片的优点，而有效避免其各自缺陷的细胞移植产品。

静电层层自组装技术(layer‐by‐layer electrostatic self‐assembly,LBL)是依靠不同物质间的静电作用，把不同种类及功能的物质按照一定顺序组装成超薄膜的新技术。它利用正负电荷间的静电吸引力将有相反电荷的聚电解质交替吸附在基底表面以构建纳米至微米级超薄多层膜，由于是一层层进行组装，使得膜结构易于调控，尤其是薄膜厚度可以实现在纳米级别精细调控。这种技术工艺简单、操作方便、对基材和设备要求低,而且可以保持生物大分子的生物活性,因而已经被广泛应用于医用生物材料表面改性、药物组装和缓释,光电薄膜以及生物传感器制备等领域。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种超薄载体细胞片的制备方法。

本发明的另一目的在于提供由上述制备方法得到的超薄载体细胞片。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种超薄载体细胞片的制备方法包含如下步骤：

1)将凝胶材料溶液铺展到基底上使其凝固成固态，或将凝胶材料溶液铺展到基底上，待溶剂挥发后凝胶材料凝固成固态；

2)在步骤1)得到的铺有凝胶材料的基底上生成与凝胶材料所带电性相反的离子聚合物层，再在上层离子聚合物层上生成与上层离子聚合物层电性相反的离子聚合物层，依此循环10～100次，形成层层自组装膜；

3)把目的细胞种植于步骤2)得到的载有层层自组装膜的基底之上，常规培养；

4)培养过程中，凝胶材料溶于细胞培养基转化为液态，负载有细胞的层层自组装膜脱离基底，形成细胞片。

优选的，所述的凝胶材料为无细胞毒性的凝胶材料，所述的凝胶材料溶液的质量百分比浓度为1％～15％，溶剂为水、乙醇或异丙醇。

所述的步骤1)优选地在压力低于0.01MPa下进行，加速溶剂挥发。

所述的步骤2)中所述的离子聚合物溶液根据电性分为阴离子聚合物溶液和阳离子聚合物溶液，优选的，所述的阳离子聚合物为聚(二烯丙基二甲基氯化铵)、聚丙烯胺盐酸盐、壳聚糖、聚赖氨酸中的一种或多种，所述的阴离子聚合物优选为聚苯乙烯磺酸盐、透明质酸、明胶中的一种或多种，所述的步骤2)中离子聚合物溶液的浓度为1～5g/L。

所述的步骤2)优选为以下步骤A-步骤C中的一种：

步骤A：将步骤1)得到的铺有凝胶材料的基底浸在与凝胶材料所带电性相反的离子聚合物溶液中5～20分钟，再浸入清水中3～10分钟，再浸入与上次离子聚合物溶液电性相反的离子聚合物溶液中5～20分钟，再浸入清水中3～10分钟，依此循环10～100次，形成层层自组装膜；

步骤B:将步骤1)得到的铺有凝胶材料的基底放在匀胶机上，滴加与凝胶材料所带电性相反的离子聚合物溶液，400-5000rpm/min旋涂30-90秒，再滴加清水，400-5000rpm/min旋涂30-90秒，再滴加与上次离子聚合物溶液电性相反的离子聚合物溶液，400-5000rpm/min旋涂30-90秒，再滴加清水，400-5000rpm/min旋涂30-90秒，依此循环10～100次，形成层层自组装膜；

步骤C:使用喷涂设备将与凝胶材料所带电性相反的离子聚合物溶液均匀喷涂到步骤1)得到的铺有凝胶材料的基底上，再均匀喷涂与上次离子聚合物溶液电性相反的离子聚合物溶液，依此循环10～100次，形成层层自组装膜。

所述的步骤3)的目的细胞为全能干细胞、多能干细胞、成体干细胞、体细胞中的任何一种或多种。

步骤3)中所述的目的细胞优选为胚胎干细胞、诱导性多潜能分化细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞、羊膜干细胞、角膜缘干细胞、心脏干细胞、皮肤干细胞、血管内皮祖细胞、心肌细胞、角膜上皮细胞、皮肤细胞、神经元细胞、成纤维细胞中任何一种或多种。

优选的，为了进行药物负载，在所述制备方法的步骤2)的一个或多个循环过程中，用具有电性的大分子药物溶液替换相同电性的离子聚合物溶液作为自组装材料进行层层组装；得到负载有药物的层层自组装薄膜，所述的大分子药物溶液为蛋白、多肽、抗体或核酸中的一种或多种。

本发明一种超薄载体细胞片由权利要求1所述方法制备得到，所述层层自组装膜的总厚度为100～20000nm。

本发明还提供了一种多层细胞片，其为采用上述方法制备得到载有层层自组装膜的基底后采用以下步骤制备：

3)把目的细胞种植于步骤2)得到的载有层层自组装膜的基底之上，常规培养；

4)待第一层细胞贴附后，将第二层细胞直接种植于第一层细胞上，使其贴附于第一层细胞，以此类推将下一层细胞种植于在上一层细胞上，直到达到所需层数；

5)培养过程中，凝胶材料溶于细胞培养基转化为液态，负载有细胞的层层自组装膜脱离基底，形成多层细胞片。

多层细胞片还可以通过将多片制备好的细胞片进行堆叠得到。

相对于现有技术，本发明具有如下有益效果:

1.相较于传统细胞片的制备方法，本发明省去了支撑体材料的性状控制或消解步骤，显著提升了细胞片的机械强度，还可以负载蛋白、多肽、抗体、核酸等大分子药物；

2.相较于含细胞支架，本发明可实现细胞移植产品的厚度、大小、形状的精确控制；

3.相较于含细胞支架，本发明可以形成100‐10000nm的超薄细胞载体，移植入体内的材料量显著减少；

4.可以用于接种形成细胞片的细胞种类多，通过本发明所述的方法，可获得具有较好生物学特性的超薄载体细胞片。具有灵活方便的可加工性，通过细胞片的堆叠和重建成更厚更复杂的组织结构。不但是组织工程领域的新突破，也为临床疾病治疗开拓了新途径。本发明原理科学可靠，工艺简单灵活，产品质量稳定，且重现性好，可实现产业化。

附图说明

附图1显示了依靠本发明的方法制得的脱离原来基底的未接种细胞的层层自组装膜；

附图2显示了来源于大鼠的间充质干细胞贴附生长于聚苯乙烯磺酸盐、聚丙烯胺盐酸盐层层自组装形成的膜上；

附图3显示了来源于大鼠的眼角膜上皮细胞附生长于聚苯乙烯磺酸盐、聚丙烯胺盐酸盐层层自组装形成的膜上；

附图4显示了依靠本发明的方法制得的超薄细胞片，细胞为来源于大鼠的间充质干细胞，载体膜为聚苯乙烯磺酸盐、聚丙烯胺盐酸盐层层自组装形成的高分子膜。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

配制质量分数为1％的明胶水溶液，55℃下待其溶解，均匀涂抹到盖玻片表面，放入真空干燥箱内，常温抽真空6h，脱去溶剂。

取出载玻片，浸入聚苯乙烯磺酸盐水溶液5分钟，再浸入水中3分钟，再浸入聚丙烯胺盐酸盐溶液5分钟，再浸入水中3分钟。依此次序进行15个循环，自然晾干，环氧乙烷气体灭菌。其中聚苯乙烯磺酸盐、聚丙烯胺盐酸盐水溶液，浓度2g/L，加入0.15M氯化钠，调PH值为3。

将上步骤得到的载玻片置于培养皿中，滴加大鼠来源的骨髓间充质干细胞细胞悬液(10⁴～10⁶个/ml)没过其表面，置于常规细胞培养箱中培养24h。细胞片脱附载玻片，悬浮在培养液中。超薄载体细胞片的构建得以实现。附图1显示了依靠本发明的方法制得的脱离原来基底的未接种细胞的层层自组装膜；附图2显示了来源于大鼠的间充质干细胞贴附生长于聚苯乙烯磺酸盐、聚丙烯胺盐酸盐层层自组装形成的膜上。附图4显示了依靠本发明的方法制得的超薄细胞片，细胞为来源于大鼠的间充质干细胞，载体膜为聚苯乙烯磺酸盐、聚丙烯胺盐酸盐层层自组装形成的高分子膜。

实施例2

配制质量分数为15％的明胶水溶液，55℃下待其溶解，用匀胶机旋涂到载玻片表面，放入真空干燥箱内，常温抽真空6h，脱去溶剂。

取出载玻片，浸入透明质酸水溶液10分钟，再浸入水中3分钟，再浸入赖氨酸水溶液10分钟，再浸入水中3分钟。依此次序进行40个循环，自然晾干，环氧乙烷气体灭菌。其中透明质酸、聚赖氨酸水溶液，浓度1g/L，加入0.15M氯化钠，调PH值为3。

将上步骤得到的载玻片置于培养皿中，滴加大鼠来源的角膜上皮细胞细胞悬液(10⁴～10⁶个/ml)没过其表面，置于常规细胞培养箱中培养24h。细胞片脱附载玻片，悬浮在培养液中。超薄载体细胞片的构建得以实现。

实施例3

配制质量分数为5％的明胶乙醇溶液，55℃下待其溶解，均匀涂抹到载玻片表面，放入真空干燥箱内，常温抽真空6h，脱去溶剂。

取出载玻片，浸入聚苯乙烯磺酸盐水溶液20分钟，再浸入水中5分钟，再浸入聚丙烯胺盐酸盐水溶液20分钟，再浸入水中5分钟。依此次序进行40个循环，自然晾干，环氧乙烷气体灭菌。其中聚苯乙烯磺酸盐、聚丙烯胺盐酸盐水溶液，浓度2g/L，加入0.15M氯化钠，调PH值为3。

将上步骤得到的载玻片置于培养皿中，滴加滴加大鼠来源的角膜上皮细胞细胞悬液(10⁴～10⁶个/ml)没过其表面，置于常规细胞培养箱中培养24h。细胞片脱附载玻片，悬浮在培养液中。超薄载体细胞片的构建得以实现。附图3显示了来源于大鼠的眼角膜上皮细胞附生长于聚苯乙烯磺酸盐、聚丙烯胺盐酸盐层层自组装形成的膜上。

实施例4

配制质量分数为5％的明胶异丙醇溶液，55℃下待其溶解，均匀涂抹到载玻片表面，放入真空干燥箱内，常温抽真空6h，脱去溶剂。

取出载玻片，均匀喷涂透明质酸水溶液，再均匀喷涂壳聚糖水溶液。依此次序进行20个循环，自然晾干，环氧乙烷气体灭菌。其中透明质酸、壳聚糖水溶液，浓度4g/L，加入0.15M氯化钠，调PH值为3。

将上步骤得到的载玻片置于培养皿中，滴加神经元细胞悬液(10⁴～10⁶个/ml)没过其表面，置于常规细胞培养箱中培养24h。细胞片脱附载玻片，悬浮在培养液中。超薄载体细胞片的构建得以实现。

实施例5

配制质量分数为5％的胶原水溶液，55℃下待其溶解，均匀涂抹到载玻片表面，放入真空干燥箱内，常温抽真空6h，脱去溶剂。

取出载玻片置于匀胶机上，滴加聚苯乙烯磺酸盐水溶液，400‐5000rpm/min旋涂60秒，再滴加清水，400‐5000rpm/min旋涂30秒，再浸滴加聚丙烯胺盐酸盐水溶液，400‐5000rpm/min旋涂60秒，再滴加清水，400‐5000rpm/min旋涂30秒。依此次序进行20个循环，自然晾干，环氧乙烷气体灭菌。其中聚苯乙烯磺酸盐、聚丙烯胺盐酸盐水溶液，浓度2g/L，加入0.15M氯化钠，调PH值为3。

将上步骤得到的载玻片置于培养皿中，滴加心肌细胞悬液(10⁴～10⁶个/ml)没过其表面，置于常规细胞培养箱中培养24h。细胞片脱附载玻片，悬浮在培养液中。超薄载体细胞片的构建得以实现。

实施例6

配制质量分数为15％的胶原水溶液，55℃下待其溶解，匀胶机旋涂到载玻片表面，放入真空干燥箱内，常温抽真空6h，脱去溶剂。

取出载玻片，浸入聚苯乙烯磺酸盐水溶液15分钟，再浸入水中5分钟，再浸入聚(二烯丙基二甲基氯化铵)水溶液15分钟，再浸入水中5分钟。依此次序进行20个循环，自然晾干，环氧乙烷气体灭菌。其中聚苯乙烯磺酸盐、聚(二烯丙基二甲基氯化铵)水溶液，浓度5g/L，加入0.15M氯化钠，调PH值为3。

将上步骤得到的载玻片置于培养皿中，滴加成纤维母细胞悬液(10⁴～10⁶个/ml)没过其表面，置于常规细胞培养箱中培养24h。细胞片脱附载玻片，悬浮在培养液中。超薄载体细胞片的构建得以实现。

实施例7

配制质量分数为5％的明胶乙醇溶液，55℃下待其溶解，均匀涂抹到载玻片表面，放入真空干燥箱内，常温抽真空6h，脱去溶剂。

取出载玻片，浸入透明质酸水溶液20分钟，再浸入水中5分钟，再浸入壳聚糖水溶液20分钟，再浸入水中5分钟。依此次序进行10个循环。再浸入TGFβ抗体溶液30分钟，再浸入水中3分钟，再浸入聚赖氨酸水溶液30分钟，再浸入水中3分钟，依此次序进行10个循环。自然晾干，环氧乙烷气体灭菌。其中聚透明质酸、聚赖氨酸溶液浓度为2g/L，直接用商品化PBS溶液配制；TGFβ抗体溶液浓度50μg/ml，直接用商品化PBS溶液配制；壳聚糖水溶液，浓度2g/L，加入0.15M氯化钠，调PH值为3。

将上步骤得到的载玻片置于培养皿中，滴加滴加大鼠来源的角膜上皮细胞细胞悬液(10⁴～10⁶个/ml)没过其表面，置于常规细胞培养箱中培养24h。细胞片脱附载玻片，悬浮在培养液中，得到负载有TGFβ抗体的超薄载体细胞片。

实施例8

配制质量分数为5％的明胶水溶液，55℃下待其溶解，用匀胶机旋涂到载玻片表面，放入真空干燥箱内，常温抽真空6h，脱去溶剂。

取出载玻片，浸入透明质酸水溶液10分钟，再浸入水中3分钟，再浸入赖氨酸水溶液10分钟，再浸入水中3分钟。依此次序进行40个循环，自然晾干，环氧乙烷气体灭菌。其中透明质酸、聚赖氨酸水溶液，浓度2g/L，加入0.15M氯化钠，调PH值为3。

将上步骤得到的载玻片置于培养皿中，滴加真皮微血管内皮细胞悬液(10⁴～10⁶个/ml)没过其表面，置于常规细胞培养箱中培养2h，待细胞贴附到层层自组装膜上后，移去培养基，滴加真皮成纤维细胞悬液(10⁴～10⁶个/ml)没过其表面，置于常规细胞培养箱中培养2h，待细胞贴附到真皮微血管内皮细胞表面后，移去培养基，滴加表皮细胞悬液(10⁴～10⁶个/ml)没过其表面，置于常规细胞培养箱中培20h。表皮细胞贴附到真皮成纤维细胞表面，之后细胞片脱附载玻片，悬浮在培养液中。多层细胞片的构建得以实现。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种超薄载体细胞片的制备方法，其特征在于包含如下步骤：

1)将凝胶材料溶液铺展到基底上使其凝固成固态；

2)在步骤1)得到的铺有凝胶材料的基底上生成与凝胶材料所带电性相反的离子聚合物层，再在上层离子聚合物层上生成与上层离子聚合物层电性相反的离子聚合物层，依此循环10～100次，形成层层自组装膜；

3)把目的细胞种植于步骤2)得到的载有层层自组装膜的基底之上，常规培养；

4)培养过程中，凝胶材料溶于细胞培养基转化为液态，负载有细胞的层层自组装膜脱离基底，形成细胞片。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的凝胶材料为无细胞毒性的凝胶材料，所述的凝胶材料溶液的质量百分比浓度为1％～15％，溶剂为水、乙醇或异丙醇。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的步骤1)在压力低于0.01MPa的压力下进行，加速溶剂挥发。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的步骤2)为以下步骤A-步骤C中的一种：

步骤A：将步骤1)得到的铺有凝胶材料的基底浸在与凝胶材料所带电性相反的离子聚合物溶液中5～20分钟，再浸入清水中3～10分钟，再浸入与上次离子聚合物溶液电性相反的离子聚合物溶液中5～20分钟，再浸入清水中3～10分钟，依此循环10～100次，形成层层自组装膜；

步骤B:将步骤1)得到的铺有凝胶材料的基底放在匀胶机上，滴加与凝胶材料所带电性相反的离子聚合物溶液，400-5000rpm/min旋涂30-90秒，再滴加清水，400-5000rpm/min旋涂30-90秒，再滴加与上次离子聚合物溶液电性相反的离子聚合物溶液，400-5000rpm/min旋涂30-90秒，再滴加清水，400-5000rpm/min旋涂30-90秒，依此循环10～100次，形成层层自组装膜；

步骤C:使用喷涂设备将与凝胶材料所带电性相反的离子聚合物溶液均匀喷涂到步骤1)得到的铺有凝胶材料的基底上，再均匀喷涂与上次离子聚合物溶液电性相反的离子聚合物溶液，依此循环10～100次，形成层层自组装膜。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述的步骤2)中所述的离子聚合物溶液根据电性分为阴离子聚合物溶液和阳离子聚合物溶液，所述的阳离子聚合物为聚(二烯丙基二甲基氯化铵)、聚丙烯胺盐酸盐、壳聚糖、聚赖氨酸中的一种或多种，所述的阴离子聚合物为聚苯乙烯磺酸盐、透明质酸、明胶中的一种或多种，所述的步骤2)中离子聚合物溶液的浓度为1～5g/L。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤3)中所述的目的细胞为全能干细胞、多能干细胞、成体干细胞、体细胞中的任何一种或多种。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于步骤3)中所述的目的细胞为胚胎干细胞、诱导性多潜能分化细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞、羊膜干细胞、角膜缘干细胞、心脏干细胞、皮肤干细胞、血管内皮祖细胞、心肌细胞、角膜上皮细胞、皮肤细胞、神经元细胞、成纤维细胞中任何一种或多种。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤2)的一个或多个循环过程中，用具有电性的大分子药物溶液替换相同电性的离子聚合物溶液作为自组装材料进行层层组装；得到负载有药物的层层自组装薄膜，所述的大分子药物为蛋白、多肽、抗体或核酸中的一种或多种。

9.一种超薄载体细胞片，其特征在于由权利要求1所述方法制备得到，所述层层自组装膜的总厚度为100～20000nm。

10.一种多层细胞片，其特征在于由权利要求9所述的超薄载体细胞片堆叠而成，或在权利要求1步骤2)制备得到载有层层自组装膜的基底后采用以下步骤制备：

3)把目的细胞种植于步骤2)得到的载有层层自组装膜的基底之上，常规培养；

4)待第一层细胞贴附后，将第二层细胞直接种植于第一层细胞上，使其贴附于第一层细胞，以此类推将下一层细胞种植于在上一层细胞上，直到达到所需层数；

5)培养过程中，凝胶材料溶于细胞培养基转化为液态，负载有细胞的层层自组装膜脱离基底，形成多层细胞片。