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CN106916905B - 隐匿性乙肝病毒检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

隐匿性乙肝病毒检测试剂盒及其检测方法 Download PDF

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CN106916905B CN201710031599.9A CN201710031599A CN106916905B CN 106916905 B CN106916905 B CN 106916905B CN 201710031599 A CN201710031599 A CN 201710031599A CN 106916905 B CN106916905 B CN 106916905B
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Abstract

本发明提供一种隐匿性乙肝病毒检测试剂盒及其检测方法，该试剂盒中引物组包括上游引物CA、下游引物CB、上游引物CC、下游引物CD；所述上游引物CA的序列如SEQ ID NO：1 所示；所述下游引物CB的序列如SEQ ID NO：2 所示；所述上游引物CC的序列如SEQ ID NO：3 所示；所述下游引物CD的序列如SEQ ID NO：4 所示。本发明通过分析现有的隐匿性乙肝病毒感染诊断的巢式PCR引物，重新设计Core/pre‑core区的引物，提高了检测效率，从而为今后在我国人群中检测隐匿性乙肝病毒感染奠定基础。

Description

隐匿性乙肝病毒检测试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种隐匿性乙肝病毒检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染已成为严重的全球性公共卫生问题，全球曾感染乙肝病毒的人群总数高达20亿，且每年约有100万人死于乙肝所致的肝硬化、原发性肝癌及肝衰竭等疾病，其流行存在明显的地域差异。自1992年，我国将乙肝疫苗纳入儿童计划免疫，新生儿乙肝免疫预防工作取得了显著成绩。根据2006年全国人群乙型病毒性肝炎血清流行病学调查显示，人群HBsAg携带率为7.18％，较1992年的9.75％下降了26.35％，其中1～4岁人群乙肝表面抗原携带率最低，为0.96％。
隐匿性乙肝病毒感染(Occult Hepatitis B Virus Infection，OBI)是指肝内持续存在乙肝病毒DNA，且血清中的HBV DNA处于低水平(＜200IU/ml)或阴性，同时不能检出HBsAg。在乙肝的高流行地区人群易患隐匿性乙肝病毒感染，隐匿性乙肝病毒感染也可发生在乙肝疫苗接种后的儿童中。
上世纪70年代以来，隐匿性乙肝病毒感染受到越来越多的重视。Shahmoradi S等人曾报道用巢式PCR方法检测伊朗地区接种乙肝疫苗的儿童中隐匿性乙肝病毒感染，共检测出21名隐匿性乙肝病毒感染儿童。前期实验通过对文献报道的巢式PCR方法进行验证，发现Core/pre-core区段扩增结果不理想，因此，现有的隐匿性乙肝病毒检测方法并不适用于中国人群，灵敏度差，亟待改进。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种隐匿性乙肝病毒检测试剂盒及其检测方法，用于解决现有技术中对隐匿性乙肝病毒的检测方法对中国人群的诊断结果不理想、灵敏度差等问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供用于隐匿性乙肝病毒检测的引物组，包括上游引物CA、下游引物CB、上游引物CC、下游引物CD；
所述上游引物CA的序列如SEQ ID NO：1所示；
所述下游引物CB的序列如SEQ ID NO：2所示；
所述上游引物CC的序列如SEQ ID NO：3所示；
所述下游引物CD的序列如SEQ ID NO：4所示。
本发明第二方面提供一种含有上述引物组的用于检测隐匿性乙肝病毒的试剂盒。
进一步地，所述上游引物CA、下游引物CB为第一轮特异性引物，所述上游引物CC、下游引物CD为第二轮特异性引物。
进一步地，所述试剂盒还包括PCR预混液、HBV DNA、水中的一种或多种组合。
优选地，所述PCR预混液含有Taq DNA聚合酶、dNTPs、标准Taq酶反应缓冲液、酶稳定剂中的一种或多种组合。
更优选地，所述PCR预混液为2×Taq PCR Master Mix。
本发明第三方面提供上述引物组或试剂盒在检测隐匿性乙肝病毒中的应用。
进一步地，至少包括如下步骤：
1)提取待测样品中的HBV DNA；
2)巢式PCR反应：采用所述上游引物CA、下游引物CB对步骤1)获得的HBV DNA进行第一轮PCR扩增，再以第一轮PCR的扩增产物为模板，采用所述上游引物CC、下游引物CD进行第二轮PCR扩增；
3)根据PCR扩增产物的凝胶电泳结果判断是否出现目的条带。
进一步地，步骤1)中所述待测样品选自血清、血浆、全血、纯病毒培养物和携带此类病毒的媒介生物。
进一步地，步骤2)中，第一轮PCR扩增反应条件如下：预变性：温度为94℃，时间是3min；变性：温度为94℃，时间是30s；退火：温度为55℃，时间30s；延伸：温度是72℃，时间是1min；经过34个变性退火延伸的循环后，再延伸，温度72℃，时间5min。
进一步地，步骤2)中，第二轮PCR扩增反应条件如下：预变性：温度为94℃，时间是3min；变性：温度为94℃，时间是30s；退火：温度为55℃，时间30s；延伸：温度是72℃，时间是1min；经过34个变性退火延伸的循环后，再延伸，温度72℃，时间5min。
如上所述，本发明的一种隐匿性乙肝病毒检测试剂盒及其检测方法，具有以下有益效果：本发明通过分析现有的隐匿性乙肝病毒感染诊断的巢式PCR引物，重新设计Core/pre-core区的引物，提高了检测效率，从而为今后在我国人群中检测隐匿性乙肝病毒感染奠定基础。
附图说明
图1显示为本发明实施例Core/pre-core区引物C1、C3、C4检测HBsAg阴性儿童标本的凝胶电泳图。
图2a显示为本发明实施例P4的C1、C3、C4引物检测的凝胶电泳图。
图2b显示为本发明实施例P4的C1、C3、C4引物检测的核苷酸序列比对图。
图3显示为本发明实施例新设计Core/pre-core区上游引物CA、下游引物CB、上游引物CC、下游引物CD检测HBV阳性标本的凝胶电泳图。
图4显示为本发明实施例Core/pre-core区上游引物CA、下游引物CB、上游引物CC、下游引物CD检测HBsAg阴性儿童标本的凝胶电泳图。
图5a和图5b显示为本发明实施例中5例儿童的HBV Core/pre-core区核苷酸序列比对图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
图2b、图5a和图5b所示的比对结果中，短横线“-”表示空白，小圆点“.”表示与HBVC基因相同的碱基。
主要的实验试剂：血清病毒DNA提取试剂盒，购自Qiagen公司；2×Taq PCR MasterMix(货号KT201-02、规格5ml、含有染料)，100bp marker，购自天根生化科技(北京)有限公司；琼脂糖，购自HraGene公司；GoodViewTM核酸染料，购自北京赛百盛生物工程公司。
实验标本：重庆医科大学附属儿童医院住院的HBsAg阴性的儿童的血清标本100份，其纳入条件有：(1)患儿血清标本HBsAg阴性；(2)其母亲或/和父亲HBsAg阳性；(3)完成3次乙肝疫苗接种；(4)无输血史；(5)无其他肝炎病毒如HAV、HCV感染；(6)无HIV感染；(7)年龄在8月以上。收集HBV阳性的儿童的血清标本1例。
血清提取HBV DNA实验：使用血清病毒DNA提取试剂盒，按试剂盒操作说明，提取血清标本中的HBV DNA。
巢式PCR实验：25μL的巢式PCR扩增反应体系如下：2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，正向引物1μL，反向引物1μL，DNA模板(HBV DNA)5μL，ddH2O 5.5μL。
巢式PCR反应参数如下：预变性：温度为94℃，时间是3min；变性：温度为94℃，时间是30s，退火：不同的反应引物温度不同，时间是30s，延伸：温度是72℃，时间是1min，经过34个变性退火延伸的循环后；再延伸，温度是72℃，时间是5min。
不同引物的退火温度不同，P区和S区的退火温度均为62℃，X区的退火温度为55℃，C区和PS区的退火温度为第一轮55℃，第二轮62℃；引物序列见下表1。
表1
新设计的Core/pre-core区引物：选择HBV DNA的Core/pre-core区基因的保守区域来设计引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
上游引物CA位于Core/pre-core区上游的1797-1815碱基区域，序列为：5’–GTCTGTTCACCAGCACCAT-3’(SEQ ID NO：1)；
下游引物CB位于Core/pre-core区的2377-2395碱基区域，序列为：5’–TCTGCGAGGCGAGGGAGTT-3’(SEQ ID NO：2)；
上游引物CC位于Core/pre-core区的1877-1896碱基区域，序列为：5’–CTGTGCCTTGGGTGGCTTTG-3’(SEQ ID NO：3)；
下游引物CD位于Core/pre-core区的2345-2362碱基区域，序列为：5’–CCTGCCTCGTCGTCTAAC-3’(SEQ ID NO：4)。
第一轮PCR扩增反应试剂的配置为：
第一轮PCR扩增反应参数如下：预变性：温度为94℃，时间是3min；变性：温度为94℃，时间是30s，退火：第一轮退火温度55℃，时间是30s，延伸：温度是72℃，时间是1min，经过34个变性退火延伸的循环后；再延伸，温度是72℃，时间是5min。
以第一轮PCR产物为模板，进行第二轮PCR反应。
第二轮PCR扩增反应试剂的配置为：
成分 终浓度 母液浓度 用量(μL)
2×Taq PCR Master Mix 1× 2× 12.5
上游引物CC 0.4μM 10μM 1
下游引物CD 0.4μM 10μM 1
HBV DNA — — 5
ddH2O — — 5.5
总体积 — — 25
第二轮PCR扩增反应参数如下：预变性：温度为94℃，时间是3min；变性：温度为94℃，时间是30s，退火：第二轮退火温度55℃，时间是30s，延伸：温度是72℃，时间是1min，经过34个变性退火延伸的循环后；再延伸，温度是72℃，时间是5min。
两轮巢式PCR产物分别进行琼脂糖凝胶电泳实验，制胶时加入GoodViewTM核酸染料，琼脂糖浓度为1％，电压160V，电泳时间20min，在凝胶成像系统中观察实验结果。预期实验结果：第一轮产物在600bp出现条带，第二轮产物在500bp出现条带。
实验结果如下：
1.原有引物的巢式PCR结果：用表1的引物检测HBV阳性儿童血清中的HBV DNA，电泳结果为：各区均能扩增出目的条带。
2.原有引物检测HBsAg阴性儿童血清中的HBV DNA结果：用表1中的引物检测HBsAg阴性儿童血清中的HBV DNA，电泳结果：Core/pre-core区扩增效果不好，出现除目的条带以外的多条带(见图1，注：1：ddH2O对照；2-11：10个HBsAg阴性标本；12：阴性对照；13：HBsAg阳性儿童标本；14：100bp marker)。100例儿童标本的Core/pre-core区中仅有P4出现较弱的目的条带(见图2a，注：1：P4；2：阴性对照；3：HBV阳性标本；4：100bp marker)，测序的基因序列比对结果显示，P4基因序列见图2b，与HBV C基因型的基因序列比对发现其为HBV基因序列。即100份HBsAg阴性的标本中共有1个标本扩增出HBV C基因。
SEQ ID NO：5所示为用于比对的HBV C基因序列；
SEQ ID NO：6所示为用于比对的P4基因序列，该序列由原有引物经过巢式PCR扩增后测序得到。
4.新设计Core/pre-core区引物的巢式PCR结果：上游引物CA、下游引物CB为第一轮引物，上游引物CC、下游引物CD为第二轮引物，两轮巢式PCR实验，在凝胶成像系统中观察HBV阳性标本的电泳结果：第一轮PCR产物在600bp出现条带，第二轮PCR产物在500bp出现条带，即该引物成功扩增目的条带。电泳图见图3，注：1：ddH2O对照；2：阴性对照；3：HBV阳性标本；4：100bp marker。
5.新设计Core/pre-core区引物检测HBsAg阴性儿童血清中的HBV DNA结果：用新设计Core/pre-core区引物检测HBsAg阴性儿童血清中的HBV DNA，对比引物C1、C3、C4的结果发现，其电泳结果为：仅出现目的条带(见图4，注：1：ddH2O对照；2-11：10个HBsAg阴性标本；12：阴性对照；13：HBsAg阳性儿童标本；14：100bp marker)，100例儿童标本中有5例标本出现目的条带，测序的基因序列比对结果显示见图5a和图5b，与HBV C基因型的基因序列比对发现其均为HBV基因序列，即100份HBsAg阴性的标本中共有5个标本扩增出HBV C基因。
5个标本的测序结果如下：
SEQ ID NO：7所示为用于比对的P4基因序列，该序列由本实施例设计的引物经过巢式PCR扩增后测序得到；
SEQ ID NO：8所示为用于比对的P17基因序列，该序列由本实施例设计的引物经过巢式PCR扩增后测序得到；
SEQ ID NO：9所示为用于比对的P23基因序列，该序列由本实施例设计的引物经过巢式PCR扩增后测序得到；
SEQ ID NO：10所示为用于比对的P29基因序列，该序列由本实施例设计的引物经过巢式PCR扩增后测序得到；
SEQ ID NO：11所示为用于比对的P72基因序列，该序列由本实施例设计的引物经过巢式PCR扩增后测序得到。
对实验结果的分析如下：
隐匿性乙肝病毒感染已被证实与肝硬化、原发性肝癌等疾病的发生发展密切相关，还可能增加输血、透析、肝移植等患者感染HBV的风险，其具有较大的潜在危害性。隐匿性乙肝病毒感染根据乙肝核心抗体(Hepatits B core Antibody,HBcAb)及乙肝表面抗体(Hepatits B surface Antibody,HBsAb)是否为阳性又可划分为血清学阳性OBI和血清学阴性OBI，血清学阳性OBI是乙肝核心抗体阳性，伴或不伴乙肝表面抗体阳性；血清学阴性是两者皆阴性。
目前检测HBV DNA是检测隐匿性乙肝病毒感染的金标准。隐匿性乙肝病毒感染的检测利用针对HBV不同基因高度保守区域的特异性引物进行灵敏度高的巢式PCR或者实时定量PCR。巢式PCR检测中一般检测HBV基因组至少3个保守区域，例如S区、X区、C区。因巢式PCR的灵敏度较高，为了降低实验过程中出现的假阳性现象，每次实验必须同时设置阴性对照及空白对照，在阴性对照及空白对照的结果均阴性时，样本的阳性结果才能采纳。
因此，本实施例收集了100份HBsAg阴性儿童血清标本，通过提取标本的HBV DNA并进行巢式PCR实验，根据电泳结果及测序结果，发现：引物C1、C3、C4扩增HBV C基因时，只有P4出现目的条带，且该目的条带较弱，测序得到其基因序列，通过与HBV C基因型的基因序列比对发现，两段基因序列的相似性较高，即P4的基因序列是HBV基因序列。
在巢式PCR实验过程中引物设计起着重要作用。PCR引物设计不合理，易导致实验结果出现偏差：电泳结果表现为可扩增出目的条带之外的多个条带，目的条带较弱或不出现目的条带等。本实施例通过对Core/pre-core区的引物C1、C3、C4进行验证，发现其电泳结果出现目的条带之外的多条带。分析其引物，发现该引物存在以下问题：(1)引物C1的3’端出现3个以上的连续碱基GGG，可能导致错误引发几率增加；(2)引物C4的3’端末位碱基为A，其在错配位置导致扩增效率明显高于其他碱基；(3)引物C3的GC含量高于60％，且上下游引物的GC含量相差过大，不利于PCR反应的进行。针对以上问题，同时根据我国的HBV基因型分布情况，本实施例重新设计Core/pre-core区的引物，并通过验证发现该引物可用来扩增HBV DNA。
本实施例通过用新设计上游引物CA、CB、CC、CD检测100份HBsAg阴性儿童血清标本，发现5例标本成功扩增出目的条带。测序分别得到5例标本的基因序列，通过与HBV C基因型的基因序列比对，发现这些基因序列与HBV的相似性较高，可见点突变，这5例标本的基因序列均为HBV基因序列。即在引物C1、C3、C4成功扩增出目的基因的P4标本中，新设计的CA、CB、CC、CD引物也成功扩增出目的基因；同时，在引物C1、C3、C4未扩增出目的基因的4例标本中，新设计的CA、CB、CC、CD引物成功扩增出目的基因。新设计的CA、CB、CC、CD引物大大提高了检测效率。
综上所述，本发明根据我国HBV的基因型，通过对HBV基因的保守序列进行分析，从而设计出适用于中国人群中隐匿性乙肝病毒感染诊断的引物。
HBV B基因型和C基因型的Core/pre-core区序列完全一致，因此，本发明的引物主要适用于HBV B基因型和C基因型乙肝病毒感染的诊断。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
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ctcataatgt gccttgggtg gctttggggc atggacattg acccgtataa agaatttgga 60
gcttctgtgg agttactctc ttttttgcct tctgacttct ttccttctat tcgagatctc 120
ctcgacaccg cctctgctct gtatcgggag gccttagagt ctccggaaca ttgttcacct 180
caccatacgg cactcaggca agctatcctg tgttggggtg agttgatgaa tctagccacc 240
tgggtgggaa gtaatttgga agatccagca tccagggaat tagtagtcag ctatgtcaac 300
gttaatatgg gcctaaaaat cagacaacta ttgtggtttc acatttcctg tcttactttt 360
gggagagaaa ctgttcttga atatttggtg tcttttggag tgtggattcg cactcctcct 420
gcatatagac caccaaatgc ccctatctta tcaacacttc 460
<210> 7
<211> 432
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> P4CD
<400> 7
agataggggc atttggtggt ctatatgcag gaggagtgcg aatccacact ccaaaagaca 60
ccaaatattc aagaacagtt tctctcccaa aagtaagaca ggaaatgtga aaccacaata 120
gttgtctgat ttttaggccc atattaacgt tgacatagct gactactaat tccctggatg 180
ctggatcttc caaattactt cccacccagg tggctagatt catcaactca ccccaacaca 240
ggatagcttg cctgagtgcc gtatggtgag gtgaacaatg ttccggagac tctaaggcct 300
cccgatacag agcagaggcg gtgtcgagga gatctcgaat agaaggaaag aagtcagaag 360
gcaaaaaaga gagtaactcc acagaagctc caaattcttt atacgggtca atgtccatgc 420
cccaaagcca ca 432
<210> 8
<211> 437
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> P17CD
<400> 8
gataagatag gggcatttgg tggtctgtaa gcaggaggag tgcgaatcca cactccaaaa 60
gataccaaat actcaaggac agtttctctt ccaaaagtaa gacaggaaat gtgaaaccac 120
agtagttgtc tgatttttag gcccatgtta acattgacat agctgactac taattccctg 180
gatgctgggt cttccaaatt acttcccacc caggtggcca gattcatcaa ctcaccccaa 240
cacagaatag cttgcctgag tgcagtatgg tgaggtgagc aatgttccgg agactctaag 300
gcctcccgat atagagcaga ggcggtgtcg aggagatctc gaatagaagg aaagaagtca 360
gacggcaaaa aagagagtaa ctccacagaa gctccaaatt ctttatacgg gtcaatgtcc 420
atgccccaaa gccacaa 437
<210> 9
<211> 434
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> P23CD
<400> 9
tgatagatag gggcatttgg tggtctgtaa gcaggaggag tgcgaatcca cactccaaaa 60
gataccaaat actcaaggac agtttctctt ccaaaagtaa gacaggaaat gtgaaaccac 120
agtagttgtc tgatttttag gcccatgtta acattgacat agctgactac taattccctg 180
gatgctgggt cttccaaatt acttcccacc caggtggcca gattcatcaa ctcaccccaa 240
cacagaatag cttgcctgag tgcagtatgg tgaggtgagc aatgttccgg agactctaag 300
gcctcccgat atagagcaga ggcggtgtcg aggagatctc gaatagaagg aaagaagtca 360
gacggcaaaa aagagagtaa ctccacagaa gctccaaatt ctttatacgg gtcaatgtcc 420
atgccccaaa gccc 434
<210> 10
<211> 430
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> P29CD
<400> 10
agataggggc atttggtggt ctgtaagcag gaggagtgcg aatccacacc ccaaaagata 60
ccaaatactc aagggcagtt tctcttccaa aagtaagaca ggaaatgtga aaccacagta 120
gttgtctgat ttttaggccc atgttaacat tgacatagct gactactaat tccctggatg 180
ctgggtcttc caaattactt cccacccagg tggccagatt catcaactca ccccaacaca 240
gaatagcttg cctgagtgca gtatggtgag gtgagcaatg ttccggagac tctaaggcct 300
cccgatatag agcagaggcg gtgtcgagga gatctcgaat agaaggaaag aagtcagacg 360
gcaaaaaaga gagtaactcc acagaagctc caaattcttt atacgggtca atgtccatgc 420
cccaaagccc 430
<210> 11
<211> 426
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> P72CD
<400> 11
ggggcatttg gtggtctgta agcaggagga gtgcgaatcc acactccaaa agataccaaa 60
tactcaagga cagtttctct tccaaaagta agacaggaaa tgtgaaacca cagtagttgt 120
ctgattttta ggcccatgtt aacattgaca tagctgacta ctaattccct ggatgctggg 180
tcttccaaat tacttcccac ccaggtggcc agattcatca actcacccca acacagaata 240
gcttgcctga gtgcagtatg gtgaggtgag caatgttccg gagactctaa ggcctcccga 300
tatagagcag aggcggtgtc gaggagatct cgaatagaag gaaagaagtc agacggcaaa 360
aaagagagta actccacaga agctccaaat tctttatacg ggtcaatgtc catgccccaa 420
agcccc 426

Claims (11)

1.一种用于隐匿性乙肝病毒检测的引物组，其特征在于，包括上游引物CA、下游引物CB、上游引物CC、下游引物CD；
所述上游引物CA的序列如SEQ ID NO：1 所示；
所述下游引物CB的序列如SEQ ID NO：2 所示；
所述上游引物CC的序列如SEQ ID NO：3 所示；
所述下游引物CD的序列如SEQ ID NO：4 所示。
2.含有根据权利要求1所述引物组的用于检测隐匿性乙肝病毒的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述上游引物CA、下游引物CB为第一轮特异性引物，所述上游引物CC、下游引物CD为第二轮特异性引物。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括PCR预混液、HBV DNA、水中的一种或多种组合。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述PCR预混液含有Taq DNA聚合酶、dNTPs、标准Taq酶反应缓冲液、酶稳定剂中的一种或多种组合。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述PCR预混液为2×Taq PCR MasterMix。
7.根据权利要求1所述的引物组或权利要求2-5任一项所述的试剂盒在检测隐匿性乙肝病毒中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：至少包括如下步骤：
1）提取待测样品中的HBV DNA；
2）巢式PCR反应：采用所述上游引物CA、下游引物CB对步骤1）获得的HBV DNA进行第一轮PCR扩增，再以第一轮PCR的扩增产物为模板，采用所述上游引物CC、下游引物CD进行第二轮PCR扩增；
3）根据PCR扩增产物的凝胶电泳结果判断是否出现目的条带。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：步骤1）中所述待测样品选自血清、血浆、全血、纯病毒培养物和携带此类病毒的媒介生物。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：步骤2）中，第一轮PCR扩增反应条件如下：预变性：温度94℃，时间3min；变性：温度94℃，时间30s；退火：温度55℃，时间30s；延伸：温度72℃，时间1min；经过34个变性退火延伸的循环后，再延伸，温度72℃，时间5min。
11.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：步骤2）中，第二轮PCR扩增反应条件如下：预变性：温度94℃，时间3min；变性：温度94℃，时间30s；退火：温度55℃，时间30s；延伸：温度72℃，时间1min；经过34个变性退火延伸的循环后，再延伸，温度72℃，时间5min。
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