CN106916871A - 一种仿生酶解制备蚌肉小肽的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从蚌肉蛋白中仿生酶解制取蚌肉小肽的工业生产方法。其特征是以蚌肉蛋白为起始物料，经过仿生酶解、高速离心、超滤、电渗析、浓缩、干燥得到蚌肉小肽。该蚌肉小肽总蛋白含量在90%以上，三氯乙酸可溶解的小分子肽含量在80%以上，具有符合人体吸收选择机制、无毒副作用、成本低等优点，可应用于食品、保健食品及药品中。
Description
技术领域
本发明涉及一种蚌肉小肽的制备方法，具体涉及一种从蚌肉蛋白中仿生酶解制取蚌肉小肽的工业生产方法。
背景技术
河蚌的营养价值很高,含有蛋白质,脂肪,糖类,钙,磷,铁,维生素A、B1、B2等。文献报道，河蚌每100克可食部分含蛋白质10.9克、钙248毫克、铁26.6毫克、锌6.23毫克、磷305毫克、维生素A 243微克、硒20.24微克、胡罗卜素2.3微克,还含有较多的核黄素和其他营养物质,总能量可达到20.71兆焦/公斤。河蚌肉对人体有良好的的保健功效,有滋阴平肝、明目防眼疾等作用。
河蚌蛋白的含量较高，但因蛋白的分子量较大，人体不易吸收。蛋白进入人体要经过胃蛋白酶、胰蛋白酶的双重酶解后，才会更好的吸收。但体内的酶解过程缓慢，蛋白质酶解的程度较低。仿生酶解为模拟口服蛋白类的胃肠道消化过程(胃为消化部位、吸收很少，肠道为消化、吸收部位)，创造性的将蛋白类酶解成小分子肽类的方法，即在适当的条件下以胃蛋白酶、胰蛋白酶进行连续酶解，再经高速离心、超滤、电渗析或纳滤得到以相对分子质量小于3KD为主的小分子肽类。与传统技术相比，吸收入血的有效物质群与直接口服蛋白相同，仿生酶解有效成分提取更充分，生物利用度高，不仅增强了疗效，而且消除了服用异蛋白等引起的免疫原反应，减小了不良反应发生率，安全性高；与其他酶解方法相比，仿生酶解更符合人体的选择机制，更安全。
以仿生酶解方法从蚌肉蛋白中制取蚌肉小肽是发明人的独创方法，经放大化的工业生产验证，稳定、可行，有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种从蚌肉蛋白中仿生酶解制取蚌肉小肽的工业生产方法；第二目的在于提供通过所述的工业化生产方法得到的蚌肉小肽；第三目的在于提取所述的蚌肉小肽在食品、保健食品及药品领域中的应用。
本发明的目的是这样实现的：
一种从蚌肉蛋白中仿生酶解制取蚌肉小肽的工业生产方法，采用以下步骤：
(1)向仿生酶解罐中加纯化水20-40升，启动搅拌浆，设置转速30-60转/分钟，取蚌肉蛋白粉2kg，缓慢加入，加入完毕后继续搅拌润胀30分钟，夹层通蒸汽加热至80-85℃灭菌15-30分钟，夹层通冷却水冷却至罐内温度约50-55℃，启动夹层水与加热器循环，加热器加热至50-55℃保温；
(2)启动pH检测端子，向仿生酶解罐中以蠕动泵加入稀盐酸调节pH值1.8-2.2，加入蚌肉蛋白量的1-3％胃蛋白酶，保温酶解1-3小时，随时监测pH值，补充稀盐酸保持pH值在1.8-2.2范围内；
(3)向仿生酶解罐中以蠕动泵加入40％氢氧化钠调节pH值7.8-8.2，加入1-3％胰蛋白酶，保温酶解3-6小时，随时监测pH值，补充40％氢氧化钠保持pH值在7.8-8.2范围内；
(4)向仿生酶解罐中以蠕动泵加入稀盐酸调节pH值6.8-7.2，放掉夹层水，夹层通蒸汽煮沸加热至80-85℃灭酶15-30分钟，放液；
(5)至管式高速离心机中离心，转速8000～12000转/分钟，上清液通过1812型超滤装置超滤，超滤膜相对分子质量为3KD，透过液经电渗析除盐，电压30～90伏，除盐液经减压浓缩至60℃相对密度为1.10～1.15的清膏，喷雾干燥，进风温度为180-200℃，出风温度为90-100℃，得到蚌肉小肽，复合膜袋包装。
步骤(1)中所述的蚌肉蛋白中蛋白含量在90％以上，水分小于10％；
步骤(2)中所述的胃蛋白酶酶活力为3000U/g；
步骤(3)中所述的胰蛋白酶酶活力为100000U/g；
步骤(5)中所述的蚌肉小肽中总蛋白含量在90％以上，三氯乙酸可溶解的小分子肽含量在80％以上，游离氨基酸含量小于8％，水分小于6％。
对本发明中蚌肉小肽进行质谱测定，对小肽肽链结构进行确证，小肽质谱(ESI-MS)测定方法及结果如下:
ESI-MS参数雾化气为氮气，碰撞气体为氩气；源温80℃，锥孔电压50V；TOF加速电压9.1kV；MCP检测器电压为2150V；毛细管电压800V。
首先进行分析，质量扫描范围为100～1000D。根据本品的测定结果显示，大部分肽段二重质子化(即带两个单位正电荷)，通过选择信号强的母离子进入MS/MS分析，得到5种肽的MS/MS图谱，对得到的MS/MS碎片信息进行分析，获得的它们的氨基酸序列组成结果见表1。
表1蚌肉小肽相对分子质量及氨基酸序列组成表
注：表中序列字母代表不同氨基酸的简写，丙氨酸A，精氨酸R，天冬氨酸D，半胱氨酸C，谷氨酰胺Q，谷氨酸E，组氨酸H，异亮氨酸I，甘氨酸G，天冬酰胺N，亮氨酸L，赖氨酸K，甲硫氨酸M，苯丙氨酸F，脯氨酸P，丝氨酸S，苏氨酸T，色氨酸W，酪氨酸Y，缬氨酸V。
应用仿生酶解法制备蚌肉小肽，不仅增强了疗效，而且消除了服用动物原粉及其他常规提取方法引入异蛋白引起的免疫原反应，减小了不良反应发生率，安全性高。
由于不同的酶水解的部位不一样，得到的酶解产物也大不相同，如胃蛋白酶主要酶解的部位为苯丙氨酸、酪氨酸和亮氨酸组成的肽键，胰蛋白酶主要酶解的部位为精氨酸、赖氨酸等碱性氨基酸组成的肽键。
本研究以同一批次的蚌肉药材，以总肽量为指标，考察了蚌肉采用不同蛋白酶酶解工艺的提取液的活性，即考察了蚌肉胃蛋白酶酶解、胰蛋白酶酶解、木瓜蛋白酶酶解及仿生酶解法所得的酶解液的含量。
取蚌肉蛋白粉，称取四份，每份20g，加10倍量水煮沸15分钟，待冷至40℃，一份以稀盐酸溶液调节pH值1.5～2.0，加入2％量的胃蛋白酶，40℃保温酶解2小时；一份以20％氢氧化钠溶液调节pH值8.0～8.5，加入2％量的胰蛋白酶，40℃保温酶解4小时；一份以20％氢氧化钠溶液调节pH值6.0～7.0加入2％量的木瓜蛋白酶，40℃保温酶解4小时；最后一份以稀盐酸溶液调节pH值1.5～2.0，加入1％量的胃蛋白酶，40℃保温酶解2小时，20％氢氧化钠溶液调节pH值8.0～8.5，加入1％量的胰蛋白酶，40℃保温酶解4小时；以上酶解液均加热煮沸使酶灭活，离心(5000r/min)，上清液减压浓缩(70～80℃，-0.07～-0.08MPa)并调整总量至100mL，即得蚌肉不同酶提取液。分别测定各提取液的总肽量，测定结果见表2。
表2蚌肉不同蛋白酶酶解提取方法各部分的成分含量
实验结果表明，用单一的胃蛋白酶、胰蛋白酶来酶解，均不能使蚌肉中的蛋白被有效的利用，酶解产物的活性和总肽含量不高，显示药材未充分利用，造成了一定的药材浪费；双酶连续酶解与木瓜蛋白酶酶解产物活性和总肽含量均较高，且双酶连续酶解高于木瓜蛋白酶，但由于木瓜蛋白酶酶解在体外强制酶解，与人体自身酶解所得的活性物质不尽相同，必会引起人体的排异反应。
一种蚌肉小肽，是通过上述工业化生产方法得到的。利用本方法得到的蚌肉小肽，其主要相对分子质量为3KD以下，具有极强的水溶性，其总蛋白含量在90％以上，三氯乙酸可溶解的小分子肽含量在80％以上，游离氨基酸含量小于8％，水分小于6％。
上述仿生酶解罐及酶解系统指的是CN205874433U、CN205590709U中涉及的设备，随着设备容积的增大，本发明方法中各物料的用量可随之增大。在其他具有同类功能的设备上，本方法同样适应。
本发明中的原料蚌肉蛋白粉，可以是购自市场上的成品原料，也可以是先从蚌肉中水解得到蚌肉蛋白粉或含蚌肉蛋白的液体产品。总之，无论以何种原料投料生产(蚌肉、蚌肉蛋白粉、蚌肉蛋白液等)，只要生产工艺中涉及到了本发明保护的内容，即视为采用了本发明的技术内容。
按上述工业生产方法得到的蚌肉小肽在食品、保健食品及药品中的应用，包括但不限于下述应用：根据所生产的蚌肉小肽的营养特性、功能特性和加工特性，以蚌肉小肽作为基本素材，可以开发出许多优质、营养、健康的食品。利用其促进蛋白质合成和抗疲劳的特性，可以开发增强肌肉和消除疲劳的运动营养食品和保健食品；利用其促进脂肪代谢的特性，可以开发促进脂肪代谢的减肥功能食品；利用其促进细胞生长的特性，可以开发用作促进微生物生长、代谢的发酵促进剂等。
本发明的有益效果是：本发明从蚌肉蛋白中仿生酶解制取蚌肉小肽的工业生产方法，符合人体选择机制，制备工艺简便、可行，成本低，生产过程绿色环保；所得的蚌肉小肽总蛋白含量在90％以上，小分子肽类含量在80％以上，相对分子质量主要在3KD以下，无毒副作用，达到绿色食品纯天然的要求，能获得良好的经济效益。
具体实施方式
下面列举实施例，进一步说明本发明，各实施例仅用于说明本发明，并不限制本发明：
实施例1本实施例包括如下步骤：
(1)向仿生酶解罐中加纯化水20升，启动搅拌浆，设置转速60转/分钟，取蚌肉蛋白粉(蚌肉分离蛋白，蛋白含量在90％以上，水分小于10％)2kg，缓慢加入，加入完毕后继续搅拌润胀30分钟，夹层通蒸汽加热至80-85℃灭菌15分钟，夹层通冷却水冷却至罐内温度约55℃，启动夹层水与加热器循环，加热器加热至55℃保温；
(2)启动pH检测端子，向仿生酶解罐中以蠕动泵加入稀盐酸调节pH值2.0，加入蚌肉蛋白量的1％胃蛋白酶(酶活力为3000U/g)，保温酶解1小时，随时监测pH值，补充稀盐酸保持pH值在1.8-2.2范围内；
(3)向仿生酶解罐中以蠕动泵加入40％氢氧化钠调节pH值8.0，加入1％胰蛋白酶(酶活力为100000U/g)，保温酶解3小时，随时监测pH值，补充40％氢氧化钠保持pH值在7.8-8.2范围内；
(4)向仿生酶解罐中以蠕动泵加入稀盐酸调节pH值6.8，放掉夹层水，夹层通蒸汽煮沸加热至80-85℃灭酶30分钟，放液；
(5)至管式高速离心机中离心，转速8000～12000转/分钟，上清液通过1812型超滤装置超滤，超滤膜相对分子质量为3KD，透过液经电渗析除盐，电压30伏，除盐液经减压浓缩至60℃相对密度为1.10～1.15的清膏，喷雾干燥，进风温度为180-200℃，出风温度为90-100℃，得到蚌肉小肽，复合膜袋包装。
实施例2本实施例包括如下步骤：
(1)向仿生酶解罐中加纯化水40升，启动搅拌浆，设置转速30转/分钟，取蚌肉蛋白粉2kg，缓慢加入，加入完毕后继续搅拌润胀30分钟，夹层通蒸汽加热至80-85℃灭菌15分钟，夹层通冷却水冷却至罐内温度约50℃，启动夹层水与加热器循环，加热器加热至50℃保温；
(2)启动pH检测端子，向仿生酶解罐中以蠕动泵加入稀盐酸调节pH值1.8，加入蚌肉蛋白量的3％胃蛋白酶，保温酶解3小时，随时监测pH值，补充稀盐酸保持pH值在1.8-2.2范围内；
(3)向仿生酶解罐中以蠕动泵加入40％氢氧化钠调节pH值8.2，加入3％胰蛋白酶，保温酶解6小时，随时监测pH值，补充40％氢氧化钠保持pH值在7.8-8.2范围内；
(4)向仿生酶解罐中以蠕动泵加入稀盐酸调节pH值7.2，放掉夹层水，夹层通蒸汽煮沸加热至80-85℃灭酶15分钟，放液；
(5)至管式高速离心机中离心，转速8000～12000转/分钟，上清液通过1812型超滤装置超滤，超滤膜相对分子质量为3KD，透过液经电渗析除盐，电压90伏，除盐液经减压浓缩至60℃相对密度为1.10～1.15的清膏，喷雾干燥，进风温度为180-200℃，出风温度为90-100℃，得到蚌肉小肽，复合膜袋包装。
实施例3蚌肉小肽：
取实施例1所述的工业化生产方法得到的蚌肉小肽，经检测：其总蛋白含量为94％，三氯乙酸可溶解的小分子肽含量为91％，游离氨基酸含量为3.2％，水分含量为5.0％，相对分子量分布为：
| 相对分子量范围 | 峰面积百分比 |
| ＞3000D | 5.6％ |
| 3000-2000D | 27.2％ |
| 2000-1000D | 29.4％ |
| 1000-300D | 31.6％ |
| ＜300D | 6.2％ |
实施例4蚌肉小肽制备的产品：
取实施例1方法所得的蚌肉小肽200g，按蚌肉小肽:玉米油:蜂蜡:卵磷脂比例为10:36:3:1混合物料，经胶体磨研磨30分钟，以明胶、甘油、纯化水、可可壳色素按100：40：100：1比例制作软胶囊囊皮胶液，控制胶盒温度55±5℃，保温罐40±5℃，喷体温度36±5℃，以压丸机压制软胶囊，每粒内容物重0.4g，18℃～26℃冷风干燥4h(相对湿度为30％～40％)定型，洗丸、干燥、选丸、包装，制备成软胶囊成品。
实施例5蚌肉小肽制备的产品：
取实施例1方法所得的蚌肉小肽40g，加入葛根提取物30g，枳椇子提取物30g，白茅根提取物15g，大豆肽粉10g，加三氯蔗糖适量，混合物料，分装，10g/袋，制成固体饮料。
Claims (5)
1.一种仿生酶解制取蚌肉小肽的方法，其特征在于采用以下步骤：
（1）向仿生酶解罐中加纯化水20-40升，启动搅拌浆，设置转速30-60转/分钟，取蚌肉蛋白粉2kg，缓慢加入，加入完毕后继续搅拌润胀30分钟，夹层通蒸汽加热至80-85℃灭菌15-30分钟，夹层通冷却水冷却至罐内温度约50-55℃，启动夹层水与加热器循环，加热器加热至50-55℃保温；
（2）启动pH检测端子，向仿生酶解罐中以蠕动泵加入稀盐酸调节pH值1.8-2.2，加入蚌肉蛋白量的1-3%胃蛋白酶，保温酶解1-3小时，随时监测pH值，补充稀盐酸保持pH值在1.8-2.2范围内；
（3）向仿生酶解罐中以蠕动泵加入40%氢氧化钠调节pH值7.8-8.2，加入1-3%胰蛋白酶，保温酶解3-6小时，随时监测pH值，补充40%氢氧化钠保持pH值在7.8-8.2范围内；
（4）向仿生酶解罐中以蠕动泵加入稀盐酸调节pH值6.8-7.2，放掉夹层水，夹层通蒸汽煮沸加热至80-85℃灭酶15-30分钟，放液；
（5）至管式高速离心机中离心，转速8000-12000转/分钟，上清液通过1812型超滤装置超滤，超滤膜相对分子质量为3KD，透过液经电渗析除盐，电压30-90伏，除盐液经减压浓缩至60℃相对密度为1.10-1.15的清膏，喷雾干燥，进风温度为180-200℃，出风温度为90-100℃，得到蚌肉小肽，复合膜袋包装。
2.根据权利要求1所述的仿生酶解制取蚌肉小肽的方法，其特征在于所述的胃蛋白酶酶活力为3000U/g；胰蛋白酶酶活力为100000U/g；蚌肉蛋白中蛋白含量在90%以上，水分小于10%。
3.根据权利要求1所述的仿生酶解制取蚌肉小肽的方法，其特征在于所得到的蚌肉小肽中总蛋白含量在90%以上，三氯乙酸可溶解的小分子肽含量在80%以上，游离氨基酸含量小于8%，水分小于6%。
4.一种蚌肉小肽，通过权利要求1-3所述的工业化生产方法得到。
5.权利要求4所述的蚌肉小肽在食品、保健食品及药品领域中的应用。
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