CN106916773A - 一株降解对苯二甲酸二乙酯的菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株降解对苯二甲酸二乙酯的菌株，其分类命名为代尔夫特菌(Delftia sp.)，菌株号为WL‑3，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2017136，保藏日期为2017年3月21日。本发明还公开了上述菌株在降解土壤中对苯二甲酸二乙酯的应用。菌株WL‑3为好氧型微生物，最适生长温度为30℃，最适生长pH为7.0。菌株WL‑3在7天内可以完全降解1000mg/L的对苯二甲酸二乙酯，并利用其作为唯一碳源生长，可以完全降解其代谢产物对苯二甲酸。本发明对于对苯二甲酸二乙酯的降解以及对其代谢产物在工业废水的生物治理上具有重要的应用价值。

Description

一株降解对苯二甲酸二乙酯的菌株及其应用

技术领域

本发明属于生物处理技术领域，涉及一株高效降解对苯二甲酸二乙酯的菌株及应用。

背景技术

首先随着聚酯塑料(PET)产业的快速发展和广泛应用，每年都会产生大量的PET废弃物。我国每年约有400kt的聚酯废料产生，虽然这些聚酯废料本身毒性不大，不会直接对环境造成危害，但由于其废弃物数目巨大，而且很难在自然条件下降解，造成了极大地白色污染。由于PET具有疏水性和高结晶度，要直接从PET着手筛选到能高效降解的微生物或酶非常困难。

所以本实验以对苯二甲酸二乙酯(DET)作为结构模拟物来驯化和培养PET的降解菌。首先，对苯二甲酸二乙酯作为化工原料自身是一种环境荷尔蒙，对环境会产生严重污染。其次，对苯二甲酸二乙酯在微生物和水解酶的作用下将释放出对苯二甲酸(TPA)，是一种非常重要的化工原料，广泛应用于合成树脂、涤纶纤维、塑料薄膜和染料等行业，但对水中微生物的再生有抑制作用，对动物有致突性和致癌作用，被公认为是一种有毒害性的污染物。目前对苯二甲酸的生物降解研究较多，但对苯二甲酸二乙酯的处理工艺还很不完善。张建飞等人从对有降解作用的混合菌悬液中分离出5株纯种菌，并从中筛选出对DTP降解作用最好的菌株F₄，降解5000ppm的对苯二甲酸二乙酯，14天后的降解率可超过92％。研究苯二甲酸二乙酯的生物降解规律，不仅可以解决化工原料本身对环境的污染问题，还可以为PET的生物降解研究奠定良好的基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对PET生物降解对苯二甲酸二乙酯和工业废水中对苯二甲酸的生物治理，提供一种高效降解对苯二甲酸二乙酯的微生物。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一株降解对苯二甲酸二乙酯的菌株，其分类命名为代尔夫特菌(Delftia sp.)，菌株号为WL-3，已保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M2017136，保藏日期为2017年3月21日，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。该菌株是发明人于2016年11月筛选出来的。

本发明所述的Delftia WL-3筛选方法：在以对苯二甲酸二乙酯为唯一碳源的无机盐养基(pH 7.0)中，对含苯系物及其衍生物的工业废水中的对苯二甲酸二乙酯(DET)降解菌株进行分离筛选。

具体地，以含苯系物及其衍生物的工业废水作为筛选目标，利用含1000mg/L对苯二甲酸二乙酯的无机盐培养基作为介质，连续富集驯化具有对苯二甲酸二乙酯利用能力的菌株，将无机盐培养基稀释涂布于含有1000mg/L对苯二甲酸二乙酯的无机盐固体培养基，30℃培养2-3d，挑取形态不同的对苯二甲酸二乙酯降解菌株进行划线分离获得纯培养，命名为菌株WL-3，再次验证纯种微生物菌株WL-3对对苯二甲酸二乙酯降解能力，利用高效液相色谱检测对苯二甲酸二乙酯残余含量；

具体地，所述的无机盐培养基是由硝酸铵1.0g，氯化钠1.0g，磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钾1.5g，加水至1.0L配制，调节pH值至7.0，固体培养基加入琼脂20.0g、121℃灭菌15min，使用前添加终浓度1000mg/L的对苯二甲酸二乙酯作为碳源。

WL-3菌株于30℃培养箱培养24h后，菌落乳白色，呈隆起、圆形、不透明状。WL-3菌株淀粉水解反应呈阴性、接触酶反应呈阳性、脲酶反应呈阳性、V-P反应阳性、甲基红反应阳性、氧化酶反应阳性、明胶液化反应阳性。菌株WL-3的生理生化鉴定结果与代尔夫特菌的特征最为接近。

具体地，所述的1/3LB培养基是由蛋白胨3.0g，酵母粉1.5g，氯化钠3.0g，加水至1.0L配制，调节pH值至7.0，固体培养基加入琼脂20.0g、121℃灭菌15min。

本发明所述的菌株WL-3，其16S rDNA的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。

一种含有本发明所述的对苯二甲酸二乙酯及其代谢产物降解菌株Delftia WL-316S rDNA序列的克隆载体。

所述的重组克隆载体，优选出发载体为pMD19T。

含所述的对苯二甲酸二乙酯及其代谢产物降解菌株Deftia WL-3 16S rDNA序列的基因工程菌Escherich coli DH5α(pMD19T-16S)。

所述的基因工程菌Escherich coli DH5α构建方法：利用引物27F：5`-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3`和1492R：5`-TACCTTGTTACGACTT-3`扩增菌株WL-3的16S rDNA，通过T/A克隆的方式连接至克隆载体pMD19T，构建重组克隆载体pMD19T-16S，将其转化到克隆宿主菌Escherich coli DH5α获得重组微生物Escherich coli DH5α(pMD19T-16S)，将所获得的重组微生物外源片段进行测序，NCBI数据库比对该16S rDNA序列，在分子水平上将菌株WL-3鉴定至代尔夫特菌属。

上述菌株WL-3在降解废水中对苯二甲酸二乙酯中的应用也在本发明的保护范围之内。

其中，对苯二甲酸二乙酯在废水中的浓度优选范围是250mg/L～1000mg/L。

一株对苯二甲酸二乙酯降解菌株Delftia WL-3在废水处理过程中的应用，具体步骤如下：

(1)菌株WL-3种子液培养：菌株WL-3种子液采用LB液体培养基，取试管斜面保藏的菌株WL-3，用接种环挑去菌落接入含有100mL LB液体培养基的三角瓶，30℃振荡培养12小时，摇床转速200r·min^-1，获得的菌体经无机盐培养基洗涤两次后，制成OD_600nm＝1.0的菌悬液作为降解试验种子液；

(2)菌株WL-3降解对苯二甲酸二乙酯的动力学：在对苯二甲酸二乙酯终浓度为1000mg/L的无机盐培养基中，按5％接种量接入种子液，于30℃，180r·min^-1震荡培养，每隔1d取样一次，测定OD_600nm和对苯二甲酸二乙酯的残留浓度。

(3)温度和pH对菌株WL-3降解对苯二甲酸二乙酯的影响：在对苯二甲酸二乙酯终浓度为1000mg/L的无机盐培养基中，按5％接种量接入种子液，分别于20℃、25℃、30℃、37℃、42℃，pH 7.0，180r·min^-1震荡培养；分别于初始pH 4.0、6.0、6.5.、7.0、7.5、8、9、10，30℃、180r·min^-1震荡培养，测定温度和pH对菌株WL-3降解对苯二甲酸二乙酯的影响。

(4)底物初始浓度和接种量对菌株WL-3降解对苯二甲酸二乙酯的影响：在对苯二甲酸二乙酯终浓度为1000mg/L的无机盐培养基中，分别按1％、3％、5％、10％的接种量接入种子液于30℃，180r·min^-1震荡培养；分别在对苯二甲酸二乙酯终浓度为250mg/L、500mg/L、1000mg/L、1500mg/L的无机盐培养基中，按5％接种量接入种子液，于30℃，180r·min^-1震荡培养，测定底物初始浓度和接种量对菌株WL-3降解对苯二甲酸二乙酯的影响。

(5)菌株WL-3对对苯二甲酸的降解能力测定：分别在终浓度为2000mg/L的含对苯二甲酸的无机盐培养基中，按5％接种量接入种子液，于30℃，200r·min^-1震荡培养，测定菌株WL-3对对苯二甲酸的降解能力。

有益效果：本发明以化工废水为分离材料，分离纯化到一株可以高效降解对苯二甲酸二乙酯及其代谢产物的微生物，对PET生物降解和工业废水的净化非常具有现实意义。该菌株对对苯二甲酸二乙酯的代谢产物对苯二甲酸具有降解效果，适合应用在工业废水的生物治理上。

附图说明

图1a是未接种菌株WL-3的对苯二甲酸二乙酯HPLC的效果图。

图1b是接种菌株WL-3四天后对苯二甲酸二乙酯HPLC的降解效果图。

图1c是接种菌株WL-3七天后对苯二甲酸二乙酯HPLC的降解效果图。

图2a是温度对菌株WL-3生长的影响示意图。

图2b是pH值对菌株WL-3生长的影响示意图。

图2c是装液量对菌株WL-3生长的影响示意图。

图2d是转速对菌株WL-3生长的影响示意图。

图3是对苯二甲酸二乙酯降解曲线及菌株WL-3生长曲线。

图4a是温度对菌株WL-3降解对苯二甲酸二乙酯的影响示意图。

图4b是pH值对菌株WL-3降解对苯二甲酸二乙酯的影响示意图。

图4c是底物初始浓度对菌株WL-3降解对苯二甲酸二乙酯的影响示意图。

图4d是接种量对菌株WL-3降解对苯二甲酸二乙酯的影响示意图。

图5a是未接种菌株WL-3的对苯二甲酸HPLC的效果图。

图5b是接种菌株WL-3两天后对苯二甲酸HPLC的降解效果图

图6对苯二甲酸降解曲线。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

下述的实施例中所使用的实验方法无特殊说明均为常规方法。下述的实施例中所使用的实验试剂耗材等无特殊说明均可从商业用途购买。

实施例1

对苯二甲酸二乙酯降解菌株Delftia WL-3的分离筛选：

取5mL污水样品置于100mL含500mg/L对苯二甲酸二乙酯的富集培养基中，于30℃、180r·min^-1培养7d。用紫外扫描仪测定富集液对对苯二甲酸二乙酯的降解情况，确定对苯二甲酸二乙酯被降解后，以10％的接种量接入到含750mg/L对苯二甲酸二乙酯富集培养基中，继续富集并测定降解情况，按此方法直至对苯二甲酸二乙酯浓度提高至1500mg/L，并传代3次。

将对苯二甲酸二乙酯富集液经梯度稀释后涂布于1000mg/L对苯二甲酸二乙酯为唯一碳源的无机盐平板上，于30℃培养箱中分别培养3～4d。将菌落形态不同的单菌落分别划线于LB平板纯化，并接种于以500mg/L对苯二甲酸二乙酯为唯一碳源的液体无机盐培养基中，于30℃、180r·min^-1摇床培养7d后，取1mL样品离心收集上清，用高效液相色谱HPLC来检测对苯二甲酸二乙酯的含量。通过高效液相色谱HPLC发现，与对照不加菌的摇瓶对比，编号为WL-3的菌株可以使对苯二甲酸二乙酯的峰值下降。

上述无机盐培养基是由硝酸铵1.0g，氯化钠1.0g，磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钾1.5g，加水至1.0L配制，调节pH值至7.0，固体培养基加入琼脂20.0g、121℃灭菌20min，使用前添加对苯二甲酸二乙酯作为碳源。

上述LB培养基是由蛋白胨10.0g，酵母粉5g，氯化钠5.0g，加水至1.0L配制，调节pH值至7.0，固体培养基加入琼脂20.0g、121℃灭菌15min。

将WL-3降解对苯二甲酸二乙酯前后的培养液离心取上清后用10mL的甲醇稀释，过0.22um有机滤膜，样品用于高效液相色谱检测(HPLC)。未接菌的对照培养液中对苯二甲酸二乙酯的保留时间为3.29min左右，而接种菌株WL-3并培养24h后，培养液中对苯二甲酸二乙酯的含量明显下降，检测到一个4.2min左右的中间代谢产物新峰。具体色谱条件为：色谱柱为C18kromasil 250mm×4.6mm；柱温为室温；泵p680 HPLC pump；检测器UVD170U；检测波长240nm；流动相甲醇80％；流速1ml/min.(图1a和图1b)。

实施例2

对苯二甲酸二乙酯及其代谢产物降解菌株Delftia WL-3的鉴定及其生长特性：

WL-3的鉴定：

对WL-3进行16S rDNA鉴定：利用引物27F：5`-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3`和1492R：5`-TACCTTGTTACGACTT-3`扩增菌株WL-3的16S rDNA，通过T/A克隆的方式连接至克隆载体pMD19T，构建重组克隆载体pMD19T-16S，将其转化到克隆宿主菌Escherich coli DH5α获得重组微生物Escherich coli DH5α(pMD19T-16S)，将所获得的重组微生物外源片段进行测序，NCBI数据库比对该16S rDNA序列，在分子水平上将菌株WL-3鉴定至代尔夫特菌属，其16S rDNA的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。

WL-3的生长特性：

Delftia WL-3在LB平板上生长较慢，30℃，48h可形成直径为2mm的乳白色菌落，菌落边缘整齐，有光泽，突出，粘稠，湿润，光滑，不透明，基于其16S rDNA序列以及生理生化特征，菌株WL-3被鉴定为Delftia属。

菌株WL-3的最适生长温度为30℃，在37℃也可以很好的生长，但在较低温度(20℃和25℃)和较高温度(42℃)时，其生长则受到明显抑制。菌株WL-3在pH为6和7时，生长良好，其最适生长pH为6；当pH为4和10时，其生长就受到明显抑制，菌株WL-3生长时随着摇瓶装液量的增加其生长量下降，表明菌株WL-3也是好氧型微生物，如图2a-2d所示。

实施例3

对苯二甲酸二乙酯及其代谢产物降解菌Delftia WL-3的降解特性：

从LB平板上挑取菌株WL-3单菌落，分别接种于3mL LB液体培养基中于30℃，摇床180r·min^-1培养12h。然后将该菌株的培养液转接到100mL新鲜的液体LB培养基中，继续培养12h。6000r·min^-1离心10min，收集菌体，用灭菌的无机盐培养基洗涤两次后，制成OD_600nm＝1.0的菌悬液，即种子液。在对苯二甲酸二乙酯终浓度为1000mg/L的无机盐培养基中，按5％接种量接入OD_600nm＝1.0菌株WL-3种子液，于30℃、180r·min^-1震荡培养，每隔24h取样一次，测定OD_600nm和对苯二甲酸二乙酯的浓度。

由图4a～图4d可以看出，菌株WL-3接种到培养基中1d，就开始降解对苯二甲酸二乙酯，而没有明显的延滞现象；之后降解速率逐渐增加，到7d就已将1000mg/L的对苯二甲酸二乙酯基本降解完全。另外，从图中还可以看出，随着对苯二甲酸二乙酯的降解，菌株WL-3的生长量开始逐渐增加；当对苯二甲酸二乙酯完全降解以后，菌株WL-3的生长量也达到最大。该结果表明菌株WL-3可以利用对苯二甲酸二乙酯进行生长。

菌株WL-3在30℃和37℃时，对苯二甲酸二乙酯的降解率基本相同；而在25℃时，对苯二甲酸二乙酯的降解率就受到明显抑制；当温度为42℃时，几乎不降解对苯二甲酸二乙酯(图4a)。菌株WL-3在降解对苯二甲酸二乙酯时对pH的适应范围很宽，在pH 5-9之间均具有很好的效果；即使在pH为4时，对苯二甲酸二乙酯(的降解率也可以达到58％。将此结果与菌株WL-3的生长pH相比，发现其降解pH范围比生长pH范围宽的多，说明菌株WL-3产生的降解酶具有较强的pH适应性(图4b)。菌株WL-3对对苯二甲酸二乙酯的降解速率随着底物浓度的增加而降低。当对苯二甲酸二乙酯初始浓度为500mg/L时，其在7d的降解率为97.5％；而当对苯二甲酸二乙酯初始浓度为1000mg/L时，其在7d的降解率仍然可以达到92.3％，说明该菌株对对苯二甲酸二乙酯具有高效的降解效率(图4c)。随着接种量的增大，对苯二甲酸二乙酯的降解速率明显增加。当接种量为1％时，对苯二甲酸二乙酯在7d的降解率为42.3％；而当接种量为5％和10％时，对苯二甲酸二乙酯分别在3d和6d时即基本降解完全(图4d)。

实施例4

对苯二甲酸二乙酯降解菌Delftia WL-3对对苯二甲酸的降解：

48小时后，用HPLC检测对苯二甲酸发现此物质浓度特别低(图5a和图5b)，因此，可以认为菌株WL-3可以完全矿化上述底物。由图6可以看出，菌株WL-3接种到对苯二甲浓度为2000mg/L的无机盐培养基中2h就开始降解对苯二甲酸，之后降解速率逐渐增加，到48h就已将2000mg/L的对苯二甲酸基本降解完全。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京工业大学

<120> 一株降解对苯二甲酸二乙酯的菌株及其应用

<130> SG170314002

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1398

<212> DNA

<213> Delftiamobilis

<400> 1

agcgccctcc ttgcggttag gctacctact tctggcgaga cccgctccca tggtgtgacg 60

ggcggtgtgt acaagacccg ggaacgtatt caccgcggca tgctgatccg cgattactag 120

cgattccgac ttcacgcagt cgagttgcag actgcgatcc ggactacgac tggttttatg 180

ggattagctc cccctcgcgg gttggcaacc ctctgtacca gccattgtat gacgtgtgta 240

gccccaccta taagggccat gaggacttga cgtcatcccc accttcctcc ggtttgtcac 300

cggcagtctc attagagtgc tcaactgaat gtagcaacta atgacaaggg ttgcgctcgt 360

tgcgggactt aacccaacat ctcacgacac gagctgacga cagccatgca gcacctgtgt 420

gcaggttctc tttcgagcac gaatccatct ctggaaactt cctgccatgt caaaggtggg 480

taaggttttt cgcgttgcat cgaattaaac cacatcatcc accgcttgtg cgggtccccg 540

tcaattcctt tgagtttcaa ccttgcggcc gtactcccca ggcggtcaac ttcacgcgtt 600

agcttcgtta ctgagaaaac taattcccaa caaccagttg acatcgttta gggcgtggac 660

taccagggta tctaatcctg tttgctcccc acgctttcgt gcatgagcgt cagtacaggt 720

ccaggggatt gccttcgcca tcggtgttcc tccgcatatc tacgcatttc actgctacac 780

gcggaattcc atccccctct accgtactct agccatgcag tcacaaatgc agttcccagg 840

ttgagcccgg ggatttcaca tctgtcttac ataaccgcct gcgcacgctt tacgcccagt 900

aattccgatt aacgctcgca ccctacgtat taccgcggct gctggcacgt agttagccgg 960

tgcttattct tacggtaccg tcatgggccc cctgtattag aaggagcttt ttcgttccgt 1020

acaaaagcag tttacaaccc gaaggccttc atcctgcacg cggcattgct ggatcaggct 1080

ttcgcccatt gtccaaaatt ccccactgct gcctcccgta ggagtctggg ccgtgtctca 1140

gtcccagtgt ggctggtcgt cctctcagac cagctacaga tcgtcggctt ggtaagcttt 1200

tatcccacca actacctaat ctgccatcgg ccgctccaat cgcgcgaggc ccgaaggtcc 1260

cccgctttca tcctcagatc gtatgcggta ttagctactc tttcgagtag ttatccccca 1320

cgactgggca cgttccgatg tattactcac ccgttcgcca ctcgtcagcg tccgaagacc 1380

tgttaccgtt cgactgca 1398

Claims (3)

1.一株降解对苯二甲酸二乙酯的菌株，其分类命名为代尔夫特菌(Delftia sp.)，菌株号为WL-3，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2017136，保藏日期为2017年3月21日。

2.权利要求1所述的菌株在降解废水中对苯二甲酸二乙酯中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，对苯二甲酸二乙酯的浓度范围是250mg/L～1500mg/L。