CN106868155A - 一种利用核酸外切酶反应产生引物结合树枝状滚环扩增可视化检测miRNA的方法 - Google Patents
一种利用核酸外切酶反应产生引物结合树枝状滚环扩增可视化检测miRNA的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106868155A CN106868155A CN201710154441.0A CN201710154441A CN106868155A CN 106868155 A CN106868155 A CN 106868155A CN 201710154441 A CN201710154441 A CN 201710154441A CN 106868155 A CN106868155 A CN 106868155A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- rolling circle
- circle amplification
- probe
- mirna
- hair fastener
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 230000003321 amplification Effects 0.000 title claims abstract description 61
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 title claims abstract description 61
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 title claims abstract description 54
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 title claims abstract description 23
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 title claims abstract description 22
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 title claims description 4
- 241000555268 Dendroides Species 0.000 title claims 3
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 title claims 2
- 230000001036 exonucleolytic effect Effects 0.000 title claims 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 59
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 54
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims abstract description 36
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 27
- 108010007577 Exodeoxyribonuclease I Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 102100029075 Exonuclease 1 Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 claims abstract description 7
- WSNMPAVSZJSIMT-UHFFFAOYSA-N COc1c(C)c2COC(=O)c2c(O)c1CC(O)C1(C)CCC(=O)O1 Chemical compound COc1c(C)c2COC(=O)c2c(O)c1CC(O)C1(C)CCC(=O)O1 WSNMPAVSZJSIMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 22
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 claims description 7
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 claims description 7
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 claims description 7
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 claims description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 4
- BTIJJDXEELBZFS-QDUVMHSLSA-K hemin Chemical compound CC1=C(CCC(O)=O)C(C=C2C(CCC(O)=O)=C(C)\C(N2[Fe](Cl)N23)=C\4)=N\C1=C/C2=C(C)C(C=C)=C3\C=C/1C(C)=C(C=C)C/4=N\1 BTIJJDXEELBZFS-QDUVMHSLSA-K 0.000 claims description 4
- 229940025294 hemin Drugs 0.000 claims description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 claims description 2
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 claims 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 claims 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 36
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 abstract description 13
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 abstract description 13
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 abstract description 13
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 abstract description 3
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 31
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 15
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 12
- 108091081406 G-quadruplex Proteins 0.000 description 10
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 5
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HQFLTUZKIRYQSP-UHFFFAOYSA-N 3-ethyl-2h-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC=C2N(CC)CSC2=C1 HQFLTUZKIRYQSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 102100023387 Endoribonuclease Dicer Human genes 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 101000907904 Homo sapiens Endoribonuclease Dicer Proteins 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 108020003217 Nuclear RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000043141 Nuclear RNA Human genes 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000052575 Proto-Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700020978 Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 108010057163 Ribonuclease III Proteins 0.000 description 1
- 102000003661 Ribonuclease III Human genes 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000000835 electrochemical detection Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 108091007428 primary miRNA Proteins 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000009711 regulatory function Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种利用核酸外切酶反应产生引物结合树枝状滚环扩增可视化检测miRNA的方法。本发明方法包含三部分，第一部分引物的产生，发卡探针I被靶标miRNA打开后，被核酸外切酶I降解单链部分，而后核糖核酸酶 H降解DNA：RNA杂合链中的RNA，留下一段短链DNA；第二部分是树状滚环扩增，上一步产生的单链DNA连接长单链DNA探针成环作为模板，然后以该单链DNA为引物进行一级滚环扩增，在滚环扩增体系中引入的发卡茎环结构II，被一级滚环扩增产物打开，从而多级树枝状滚环扩增；第三部分是根据滚环扩增产物中含有的G‑四链体进行检测。本发明是一种灵敏、经济、方便、原位的可视化检测miRNA的方法。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学和核酸化学领域，涉及一种利用核酸外切酶反应产生引物结合树枝状滚环扩增可视化检测miRNA的方法。
背景技术
MicroRNA（miRNA）是一类内生的、非编码的、长度约为20-24个核苷酸的小RNA，其在细胞内具有多种重要的调节作用。成熟的miRNA，5′端为磷酸基团，3′端为羟基。miRNA基因通常是由核RNA聚合酶II转录的，最初产物为大的具有帽子结构和多聚腺苷酸尾巴的pri-miRNA，然后在细胞核内由Drosha酶加工成60-70个碱基的发卡状pre-RNA，由转运蛋白Exprotin-5复合物运输到细胞质中，再经由Dicer酶识别并剪切形成成熟的miRNA。据推测，miRNA调节着人类三分之一的基因。近年来，科学家开始认识到miRNA在真核基因表达调控中有着广泛的作用。
miRNA的位置在不同的物种中是高度保守的。miRNA不仅在基因位置上保守，序列上也呈现出高度的同源性，miRNA高度的保守性与其功能的重要性有着密切的关系。人类的miRNA基因经常在癌症相关的基因组区域和易碎位点，可推知，miRNA与肿瘤形成密切相关，可能作为原癌基因或者抑癌基因。miRNA检测在疾病诊断和研究中具有重要的意义，对肿瘤相关miRNA表达水平的研究和序列分析不仅有利于阐明肿瘤的发生发展机制，更为肿瘤的诊断、治疗和预后提供了新的方向和策略。由于其序列较短，高度同源性，以及表达含量低等特点，其检测遇到很多挑战。目前针对miRNA检测的一些方法，如传统的northern blot方法，该方法需要样品量大、检测周期长、对于同源序列的区分能力差限制进一步的应用。新兴的一些基于纳米颗粒和电化学检测手段，这些方法很好的解决了检出限的问题，但是对于纳米颗粒及电化学基底的制作需要熟练的专业人员，不易于该方法的普及应用，RT-PCR的方法成功的解决了上述的问题，灵敏度高，可检测低至1-10ng的RNA，检测范围高达7个数量级，可检测低浓度或者高浓度的miRNA，而且可以很好的区别同源序列。但是复杂的引物设计，昂贵的实时荧光定量PCR仪器等在一定程度上限制了RT-PCR的推广应用。
滚环扩增，是一种等温信号扩增技术，其线性扩增倍数为105，指数化扩增倍数大于109，如此高效的扩增使得该技术被广泛应用于痕量生物分子检测，如DNA、RNA、蛋白及金属离子检测等领域，并且成功应用于生物环境中生物大分子的检测。科学家在此技术基础上进行了一系列的改进和优化，超分子滚环扩增、增加酶切位点引发二级滚环扩增等进一步提高该技术的灵敏度。滚环扩增技术包括环化然后再信号扩增放大，滚环扩增中的聚合酶对碱基错配具有很好的选择性，因此能很好地应用于miRNA的检测。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点与不足，提供一种利用核酸外切酶反应产生引物结合树枝状滚环扩增可视化检测miRNA的方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种利用核酸外切酶反应产生引物结合树枝状滚环扩增可视化检测miRNA的方法，包含三部分，第一部分引物的产生，发卡探针I被靶标miRNA打开后，被核酸外切酶I降解凸出的单链部分，而后核糖核酸酶H降解DNA：RNA杂合链中的RNA，留下一段短链DNA；第二部分是树状滚环扩增，上一步产生的单链DNA连接磷酸化的长单链DNA探针成环作为模板，然后以该单链DNA为引物进行一级滚环扩增，在滚环扩增体系中引入的发卡茎环结构II，被一级滚环扩增产物打开，从而引发多级树枝状滚环扩增；第三部分是根据滚环扩增产物中含有的G-四链体进行定性或定量检测。
优选的，所述的利用核酸外切酶反应产生引物结合树枝状滚环扩增可视化检测miRNA的方法，包括如下步骤：
（1）向体系中加入发卡探针I、核酸外切酶I缓冲液、含靶标miRNA的待检样品和水，预孵育后再加入核酸外切酶I进行反应，反应结束后灭活核酸外切酶I。
（2）向步骤（1）反应的体系中加入T4 DNA连接酶缓冲液、磷酸化的单链DNA探针、核糖核酸酶H、T4 DNA连接酶和水，进行反应。
（3）向步骤（2）反应的体系中加入发卡探针 II、phi29 DNA聚合酶、dNTPs和水进行反应，反应结束后灭活。
（4）向步骤（3）反应的体系中加入G-四链体缓冲液，先加热变性，再加入氯血红素孵育，最后加入ABTS2-和H2O2检测414nm的紫外吸收值及观察体系的颜色变化。在靶标miRNA存在的体系中，颜色由无色变成肉眼可见的绿色，且紫外吸收值随miRNA浓度增加而增强。
上述发卡探针I、磷酸化的长单链DNA探针、发卡探针II的设计原则如下：
将靶标miRNA分成序列长度接近或相等的两部分，N1、N2，即靶标miRNA序列N1-N2。以miRNA21（序列为5'-UAGCUUAUCAG ACUGAUGUUGA-3'）为例，则UAGCUUAUCAG为N1部分、ACUGAUGUUGA为N2部分，U在DNA序列中则为T。
发卡探针I包含A、B、C、D四部分，其结构为A-B-C-D，A、D为茎末端区、B、C为loop环区。茎末端区A、D互补配对，长度为8-10个碱基对，以保证发卡结构稳定。Loop环中的B序列与靶标miRNA互补配对，B序列的组成为N2’-N1’，分别与N2、N1互补配对。C是一小段单链序列，长度为4-7个碱基，以保证发卡结构的稳定。
磷酸化的长单链DNA探针包含E、F、G、H四部分，其结构为E-F-G-H。E为5’末端磷酸化序列，与N2序列相同；H为3’末端序列，与N1相同。F长度为20-25个碱基。G为G-四链体的互补序列，用于扩增G-四链体，长度为17个碱基（CCCAACCCGCCCTACCC）。
发卡探针II包含I、J、K、L四部分，其结构为I-J-K-L，I和L为茎末端区可互补配对，J、K为Loop环区。其中，J与上述磷酸化的长单链DNA探针的F序列相同，K-L与发卡探针I的B序列相同。
本发明检测方法主要由三部分组成：第一部分是利用核酸外切酶反应产生滚环扩增的引物；第二部分树枝状滚环扩增，通过引入发卡探针II，使线性滚环扩增沿着支链方向发展，达到信号进一步放大；第三部分是滚环扩增产物的检测。本发明的检测原理如图1所示。靶标miRNA能与发卡探针I的loop环区中的序列互补配对，从而打开发卡结构，形成DNA:RNA杂合体含一段单链DNA凸起的结构，核酸外切酶I能识别该区域并从3'-5'方向降解单链的DNA，利用核糖核酸酶 H 降解DNA:RNA杂合体中的RNA，剩下一段短单链DNA，然后这段短的单链DNA作为模板，在T4 DNA连接酶的作用下，磷酸化的长单链DNA首尾连接成环，接着以成环后的DNA作为模板，上一步产生的短单链DNA作为引物，在phi29 DNA聚合酶催化下，引发一级滚环扩增。在滚环扩增体系中，引入能与一级滚环扩增产物重复序列互补配对的发卡结构II，其loop区域与一级滚环扩增产物互补配对被打开后，茎区域能与滚环模板互补配对，从而引发滚环扩增向支链方向继续进行，进一步放大信号，降低检出限。设计的DNA环模板含有G-四链体的互补序列，因此得到的滚环扩增产物含有大量重复的G-四链体序列，G-四链体能与氯血红素组装形成过氧化物酶，催化ABTS2-（2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐）氧化形成ABTS.-，在414nm处紫外吸收增强，溶液由无色变成绿色，可定量检测miRNA的含量。针对不同的靶标miRNA，只需要设计相应的发卡探针I、磷酸化的长单链DNA探针和发卡探针II。
本发明基于核酸外切酶反应产生引物，通过树枝状滚环扩增放大信号，利用G-四链体过氧化物酶的活性，提供了一种灵敏、经济、方便、原位的可视化检测miRNA的方法。本发明的优点和有益效果在于：
（1）本发明中用到的DNA都是普通无荧光标记的DNA，避免背景信号的干扰，在检测条件不允许的情况下，可以通过颜色的变化来判断靶标miRNA的含量，实现原位检测。
（2）通过设计不同的探针序列，可以达到检测不同的靶标miRNA。并且该方法先通过酶切反应产生DNA引物然后再进行树枝状滚环扩增，提高了该方法的选择性。DNA较于RNA更为稳定，更适用于当做引物引发较长时间的滚环扩增。
附图说明
图1是利用核酸外切酶反应产生引物结合树枝状滚环扩增检测miRNA的方法示意图。
图2是实施例1检测miRNA21的紫外动力学及可视化结果图。
图3是实施例1中的探针对不同miRNA的检测结果图。
图4 是实施例2检测miRNA155的结果图。
图5是实施例3检测hela细胞中miRNA21结果图。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
本实施例以miRNA21（序列为5'-UAGCUUAUCAG ACUGAUGUUGA-3'）作为检测靶标。
1、发卡探针I、磷酸化长单链DNA、发卡探针II的设计合成
（1）发卡探针I序列为：
5'-CCCAACCCATCAACATCAGTCTGATAAGCTA TTACTAG TGGGTTGGG-3'。
其中，标下划线的序列可互补配对形成“茎”，其余部分形成loop环，标双下划线的序列能与miRNA21互补配对从而使发卡探针I被打开。
发卡探针I与miRNA21互补配对后，用核酸外切酶I、核糖核酸酶 H先后降解后得到短单链DNA，其序列为CCCAACCCA TCAACATCAGT CTGATAAGCTA。
（2）磷酸化长单链DNA探针序列为：
5'-PO4-ACTGATGTTGACAGGAATTAGTAAACAATGAAGACCCAACCCGCCCTACCCTAGCTTATCAG-3'。
其中，首尾部分（标波浪线的序列）能与发卡探针I被降解形成的的短单链DNA（CCCAACCCA TCAACATCAGT CTGATAAGCTA）部分（标波浪线的序列）互补配对；标虚下划线序列（CCCAACCCGCCCTACCC）是G-四链体的互补序列，作为G-四链体合成的模板；剩下的标点下划线部分（CAGGAATTAGTAAACAATGAAGA）通过滚环扩增后得到的序列，可用于打开树枝状滚环扩增引物发卡探针II。
磷酸化长单链DNA以短单链DNA为模板，在T4 DNA连接酶的作用下，首尾连接形成DNA环。以形成的DNA环为模板，短单链DNA作为引物，在phi29 DNA聚合酶催化下，引发一级滚环扩增。
（3）发卡探针II序列为：
5'-TAGCTTATCAGACAGGAATTAGTAAACAATGAAGA TCAACATCAG TCTGATAAGCTA-3'。其中，标下划线的序列可互补配对形成“茎”，其余部分形成loop环。loop环中标点下划线的序列（CAGGAATTAGTAAACAATGAAGA）与上一级滚环扩增得到的产物互补配对，从而发卡探针II被打开，打开后，序列（TCAACATCAGTCTGATAAGCTA）能与滚环序列（TAGCTTATCAGACTGATGTTGA）互补配对，从而引发树枝状滚环扩增。
2、miRNA21的检测
（1）外切酶反应
在10μL外切酶反应体系中，加入10nmol/L 的发卡探针I，一系列不同浓度梯度的miRNA21（0fmol/L，1fmol/L，10fmol/L，100fmol/L，1pmol/L，10pmol/L，100pmol/L，1nmol/L），1μL 10×核酸外切酶缓冲液，0.5μL RNase inhibitor，加无酶水补齐体积至9μL，37℃预孵育30分钟后。加入10U核酸外切酶I（1μL），37℃孵育1小时，80℃ 20分钟灭活核酸外切酶I，然后缓慢冷却至30℃。
（2）连接反应
直接向上一步外切酶反应体系中加入2μL 10×T4 DNA连接酶缓冲液，1U核糖核酸酶H，5U T4 DNA连接酶，30nmol/L磷酸化长单链DNA探针，加无酶水补齐体积至20μL，30℃孵育2小时。
（3）树枝状滚环扩增
直接向上一步连接反应体系中加入3μL 10×Phi 29 DNA聚合酶缓冲液，200μmol/LdNTPs，200nmol/L发卡探针II，1U Phi29 DNA聚合酶，加ddH2O补齐体积至30μL。30℃孵育6小时后，70℃ 10分钟灭活。
（4）结果检测
直接向上述树枝状滚环扩增得到的产物中加入1×G-4缓冲液（25mmol/L HEPES，NH4OH（pH 8.0），20mmol/L KCl，200mmol/L NaCl）至总体积200μL，95℃加热5分钟，然后室温放置0.5小时后，加入氯血红素（125μmol/L）室温孵育0.5 小时，加入ABTS2-（2mmol/L）、H2O2（2mmol/L），检测414nm紫外吸收动力学。结果如图2所示，随着miRNA浓度的增加，紫外吸收逐渐增强；并且，在1nmol/L miRNA21存在下，体系颜色明显变绿。
3、特异性检测
特异性检测所用到的其他miRNA如下：
miRNA 141：5'-UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG-3'，
miRNA155：5'-UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU-3'，
miRNA199a：5'-ACAGUAGUCUGCACAUUGGUUA-3'，
miRNA429：5'-UAAUACUGUCUGGUAAAACCGU-3'。
所用发卡探针I、发卡探针II以及磷酸化长单链DNA探针、方法等均同miRNA21的检测。结果见图3，只有miRNA21对应的紫外动力学明显上升，而其他阴性对照miRNA对应的紫外动力学基本不变，无增强。检测miRNA155的
实施例2
本实施例以miRNA155作为检测靶标，检测方法同实施例1，所用探针序列如下：
发卡探针I：5'-CCCAACCCA ACCCCTATCACGATTAGCATTAA TTACTAG TGGGTTGGG-3'；
磷酸化长单链DNA探针：5'-PO4-GTGATAGGGGT CAGGAATTAGTAAACAATGAAGACCCAACCCGCCCTACCC TTAATGCTAATC-3'；
发卡探针II：TTAATGCTAATC CAGGAATTAGTAAACAATGAAGA ACCCCTATCAC GATTAGCATTAA。
结果如图4，随着miRNA155浓度增加，紫外吸收逐渐增强。表明通过改变探针序列，本发明方法适用于检测其他的miRNA。
实施例3
按照实施例1中的探针、方法，检测从人宫颈癌细胞系hela细胞中提取的总RNA。所用总RNA量分别为0.5μg和5μg。结果见图5，随着加入总RNA量的增加，紫外吸收值增加。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉大学
<120> 一种利用核酸外切酶反应产生引物结合树枝状滚环扩增可视化检测miRNA的
方法
<130> 1
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 检测miRNA21的发卡探针I
<400> 1
cccaacccat caacatcagt ctgataagct attactagtg ggttggg 47
<210> 2
<211> 62
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 检测miRNA21的磷酸化长单链DNA探针
<400> 2
actgatgttg acaggaatta gtaaacaatg aagacccaac ccgccctacc ctagcttatc 60
ag 62
<210> 3
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 检测miRNA21的发卡探针II
<400> 3
tagcttatca gacaggaatt agtaaacaat gaagatcaac atcagtctga taagcta 57
<210> 4
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 检测miRNA155的发卡探针I
<400> 4
cccaacccaa cccctatcac gattagcatt aattactagt gggttggg 48
<210> 5
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 检测miRNA155的磷酸化长单链DNA探针
<400> 5
gtgatagggg tcaggaatta gtaaacaatg aagacccaac ccgccctacc cttaatgcta 60
atc 63
<210> 6
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 检测miRNA155的发卡探针II
<400> 6
ttaatgctaa tccaggaatt agtaaacaat gaagaacccc tatcacgatt agcattaa 58
Claims (5)
1.一种利用核酸外切酶反应产生引物结合树枝状滚环扩增可视化检测miRNA的方法，其特征在于：包含三部分，第一部分引物的产生，发卡探针I被靶标miRNA打开后，被核酸外切酶I降解凸出的单链部分，而后核糖核酸酶H降解DNA：RNA杂合链中的RNA，留下一段短链DNA；第二部分是树状滚环扩增，上一步产生的单链DNA连接磷酸化的长单链DNA探针成环作为模板，然后以该单链DNA为引物进行一级滚环扩增，在滚环扩增体系中引入的发卡茎环结构II，被一级滚环扩增产物打开，从而引发多级树枝状滚环扩增；第三部分是根据滚环扩增产物中含有的G-四链体进行定性或定量检测；
上述发卡探针I、磷酸化的长单链DNA探针、发卡探针II的设计原则如下：
将靶标miRNA分成序列长度接近或相等的两部分，N1、N2，即靶标miRNA序列N1-N2；
发卡探针I包含A、B、C、D四部分，其结构为A-B-C-D，A、D为茎末端区可互补配对、B、C为loop环区；Loop环中的B序列的组成为N2’-N1’，分别与N2、N1互补配对；C是一小段单链序列；
磷酸化的长单链DNA探针包含E、F、G、H四部分，其结构为E-F-G-H；E为5’末端磷酸化序列，与N2序列相同；H为3’末端序列，与N1相同；F长度为20-25个碱基；G为G-四链体的互补序列；
发卡探针II包含I、J、K、L四部分，其结构为I-J-K-L，I和L为茎末端区可互补配对，J、K为Loop环区；其中，J与上述磷酸化的长单链DNA探针的F序列相同，K-L与发卡探针I的B序列相同。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)向体系中加入发卡探针I、核酸外切酶I缓冲液、含靶标miRNA的待检样品和水，预孵育后再加入核酸外切酶I进行反应，反应结束后灭活核酸外切酶I；
(2)向步骤(1)反应的体系中加入T4DNA连接酶缓冲液、磷酸化的单链DNA探针、核糖核酸酶H、T4DNA连接酶和水，进行反应；
(3)向步骤(2)反应的体系中加入发卡探针II、phi29DNA聚合酶、dNTPs和水进行反应，反应结束后灭活；
(4)向步骤(3)反应的体系中加入G-四链体缓冲液，先加热变性，再加入氯血红素孵育，最后加入ABTS2-和H2O2检测414nm的紫外吸收值及观察体系的颜色变化；在靶标miRNA存在的体系中，颜色由无色变成肉眼可见的绿色，且紫外吸收值随miRNA浓度增加而增强。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：发卡探针I茎末端区长度为8-10个碱基对。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：发卡探针I的C部分长度为4-7个碱基。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：磷酸化的长单链DNA探针的F部分长度为20-25个碱基。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710154441.0A CN106868155B (zh) | 2017-03-15 | 2017-03-15 | 一种利用核酸外切酶反应产生引物结合树枝状滚环扩增可视化检测miRNA的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710154441.0A CN106868155B (zh) | 2017-03-15 | 2017-03-15 | 一种利用核酸外切酶反应产生引物结合树枝状滚环扩增可视化检测miRNA的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106868155A true CN106868155A (zh) | 2017-06-20 |
| CN106868155B CN106868155B (zh) | 2020-03-10 |
Family
ID=59171187
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710154441.0A Active CN106868155B (zh) | 2017-03-15 | 2017-03-15 | 一种利用核酸外切酶反应产生引物结合树枝状滚环扩增可视化检测miRNA的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106868155B (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107586827A (zh) * | 2017-10-27 | 2018-01-16 | 湖南工程学院 | 一种基于核酸外切酶iii的汞离子检测探针组、试剂盒及汞离子检测方法 |
| CN108588178A (zh) * | 2018-04-03 | 2018-09-28 | 山东师范大学 | 一种检测碱性磷酸酶的试剂盒及其方法 |
| CN109486911A (zh) * | 2018-11-28 | 2019-03-19 | 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 | 基于滚环扩增和DNA折纸术检测microRNAs的方法 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014006561A3 (en) * | 2012-07-02 | 2014-03-06 | Centre National De La Recherche Scientifique | Method and devices for detecting macroions in a liquid medium |
| US20140120534A1 (en) * | 2011-02-15 | 2014-05-01 | Mats Nilsson Bernitz | Methods for identifying nucleic acid sequences |
| CN104212792A (zh) * | 2014-04-22 | 2014-12-17 | 上海大学 | 基于切刻内切酶的网状滚环扩增体系及其应用 |
| CN105039564A (zh) * | 2015-08-18 | 2015-11-11 | 深圳国际旅行卫生保健中心 | miRNA检测芯片及其制作方法和应用 |
| CN105112411A (zh) * | 2015-08-26 | 2015-12-02 | 武汉顺可达生物科技有限公司 | 一种基于核酸外切酶的microRNA多色检测探针及检测方法 |
| WO2015196120A1 (en) * | 2014-06-19 | 2015-12-23 | Somagenics, Inc. | Methods and compositions for detecting polynucleotides and fragments thereof |
| CN105463110A (zh) * | 2016-01-13 | 2016-04-06 | 武汉顺可达生物科技有限公司 | 一种利用两步扩增法检测MicroRNA的方法 |
-
2017
- 2017-03-15 CN CN201710154441.0A patent/CN106868155B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20140120534A1 (en) * | 2011-02-15 | 2014-05-01 | Mats Nilsson Bernitz | Methods for identifying nucleic acid sequences |
| WO2014006561A3 (en) * | 2012-07-02 | 2014-03-06 | Centre National De La Recherche Scientifique | Method and devices for detecting macroions in a liquid medium |
| CN104212792A (zh) * | 2014-04-22 | 2014-12-17 | 上海大学 | 基于切刻内切酶的网状滚环扩增体系及其应用 |
| WO2015196120A1 (en) * | 2014-06-19 | 2015-12-23 | Somagenics, Inc. | Methods and compositions for detecting polynucleotides and fragments thereof |
| CN105039564A (zh) * | 2015-08-18 | 2015-11-11 | 深圳国际旅行卫生保健中心 | miRNA检测芯片及其制作方法和应用 |
| CN105112411A (zh) * | 2015-08-26 | 2015-12-02 | 武汉顺可达生物科技有限公司 | 一种基于核酸外切酶的microRNA多色检测探针及检测方法 |
| CN105463110A (zh) * | 2016-01-13 | 2016-04-06 | 武汉顺可达生物科技有限公司 | 一种利用两步扩增法检测MicroRNA的方法 |
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| SONG W等: "Sensitive detection of DNA methyltransferase using the dendritic rolling circle amplification-induced fluorescence", 《ANAL CHIM ACTA》 * |
| WANG F等: "Amplified and Multiplexed Detection of DNA Using the Dendritic", 《ANAL CHEM.》 * |
| XIAOE ZHANG等: "convenient and multiplexed detection of microRNAs based on an exonucleation reaction by conformational switch of hairpin probes", 《SENSORS AND ACTUATORS B:CHEMICAL》 * |
| 刘海云: "癌症相关MicroRNA检测及成像研究", 《中国博士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》 * |
| 张荞: "新型DNA分子机器的应用及研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库工程科技Ⅰ辑》 * |
| 葛佳: "基于滚环扩增技术和纳米材料的生物传感新方法的研究", 《中国博士学位论文全文数据库工程科技Ⅰ辑》 * |
| 颜春艳: "基于酶信号放大的新型无标记核酸生物传感方法研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库工程科技Ⅰ辑》 * |
| 魏娟等: "血浆中微小RNA-21与非小细胞肺癌诊断及化疗疗效的关系研究", 《药学与临床研究》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107586827A (zh) * | 2017-10-27 | 2018-01-16 | 湖南工程学院 | 一种基于核酸外切酶iii的汞离子检测探针组、试剂盒及汞离子检测方法 |
| CN108588178A (zh) * | 2018-04-03 | 2018-09-28 | 山东师范大学 | 一种检测碱性磷酸酶的试剂盒及其方法 |
| CN108588178B (zh) * | 2018-04-03 | 2021-10-19 | 山东师范大学 | 一种检测碱性磷酸酶的试剂盒及其方法 |
| CN109486911A (zh) * | 2018-11-28 | 2019-03-19 | 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 | 基于滚环扩增和DNA折纸术检测microRNAs的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN106868155B (zh) | 2020-03-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Chen et al. | Circular RNA: Biosynthesis in vitro | |
| Huang et al. | Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 triggered isothermal amplification for site-specific nucleic acid detection | |
| US10465187B2 (en) | Integrated system for programmable DNA methylation | |
| Zhao et al. | Cleavage-based signal amplification of RNA | |
| CN106834508A (zh) | 一种连接反应引发的超分支滚环扩增检测miRNA的方法 | |
| CN103160611B (zh) | 一种microRNA检测探针和检测microRNA的方法 | |
| CN105018603B (zh) | 一种基于三重放大反应串联的恒温指数放大技术及其在microRNA检测中的应用 | |
| Fajkus et al. | Evolution of plant telomerase RNAs: farther to the past, deeper to the roots | |
| EP4204015A2 (en) | Systems and methods for producing rna constructs with increased translation and stability | |
| CN107130024B (zh) | 一种基于依赖解旋酶DNA恒温扩增技术检测microRNA的方法 | |
| CN102703594A (zh) | 基于石墨烯/核酸染料平台检测miRNA的方法 | |
| Park et al. | Universal, colorimetric microRNA detection strategy based on target-catalyzed toehold-mediated strand displacement reaction | |
| Wang et al. | Genome-wide probing RNA structure with the modified DMS-MaPseq in Arabidopsis | |
| CN104789667B (zh) | 一种基于无偏识别与恒温扩增的小rna检测试剂盒及定量方法 | |
| CN107446919A (zh) | 一种恒温条件下合成核酸的方法及试剂盒 | |
| CN110305939A (zh) | 一种检测miRNA的荧光生物传感器及其制备方法与应用 | |
| Guria et al. | Circular RNA profiling by illumina sequencing via template‐dependent multiple displacement amplification | |
| CN106868155B (zh) | 一种利用核酸外切酶反应产生引物结合树枝状滚环扩增可视化检测miRNA的方法 | |
| Wu et al. | G-triplex based molecular beacon with duplex-specific nuclease amplification for the specific detection of microRNA | |
| Wang et al. | Naked-eye detection of site-specific ssRNA and ssDNA using PAMmer-assisted CRISPR/Cas9 coupling with exponential amplification reaction | |
| Zhou et al. | Sensitive and specific microRNA detection by RNA dependent DNA ligation and rolling circle optical signal amplification | |
| Bagi et al. | CRISPR–Cas based platforms for RNA detection: fundamentals and applications | |
| Zhao et al. | A simple and fast method for profiling microRNA expression from low‐input total RNA by microarray | |
| CN113151265A (zh) | 基于CRISPR-dCase9系统抑制细胞核内lncRNA表达的方法 | |
| CN108823288A (zh) | 一种检测模块及方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |