CN106868047A - 一种重组腺病毒载体及其构建方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种重组腺病毒载体及其构建方法，其特点是能很好的避免针对Ad5载体本身的预存免疫，即该载体的免疫原性几乎不受人体内广泛存在的Ad5中和抗体干扰。本发明的实现是基于以人体稀有血清型腺病毒Ad35的抗原决定簇基因替换Ad5的相应部分。而用于替换的稀有血清型腺病毒以及替换基因的选择是基于有利于改造后病毒载体的包装和不影响原病毒载体免疫水平考虑的。

Description

一种重组腺病毒载体及其构建方法和用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种用于基因治疗和疫苗载体的重组腺病毒载体及其构建方法。

背景技术

腺病毒 （adenovirus, Ad）作为基因表达载体的研制起始于20世纪60年代初，当时病毒学家观察到腺病毒基因组可与猴类病毒 40（SV40）基因组杂交，说明腺病毒基因组可承载异源性基因。此后腺病毒逐步发展成一种重要的载体系统。

目前，已经鉴别了57种不同的腺病毒血清型，重组腺病毒载体在基因治疗和疫苗载体方面得到了很多的应用，尤其是人血清5型腺病毒，它也是当前肿瘤基因治疗和人类免疫缺陷病毒（HIV）疫苗的研究的主要病毒载体。另外，诸如乙肝病毒、疟疾、结核等病原体的疫苗研制也都十分重视5型腺病毒载体的应用。

然而，由于人体内普遍存在抗Ad5腺病毒本身的免疫反应，这种预存的免疫反应包括抗腺病毒中和抗体和针对腺病毒的杀伤性T细胞，从而抑制其进入机体细胞而其所携带的目的基因就得不到预期水平的表达甚至是完全不表达，此外具有交叉性的针对腺病毒载体的CTL反应会杀死已经感染了腺病毒载体的靶细胞从而阻断外源基因的持续表达。总之，预存免疫反应会大大降低基于腺病毒载体的疫苗免疫或者基因治疗的效果。

为了克服预存免疫反应对腺病毒载体的影响，研究者们尝试了多种方法：（1）利用新方法运载重组Ad5载体；（2）从其它人体腺病毒血清型甚至其他动物种属中开发新的重组腺病毒载体；（3）对Ad5载体进行基因工程改造，这一方法与其他方法相比更安全也更具有应用性。该方法具体是以源于人体安全性较好的人体稀有血清型腺病毒如Ad35、Ad48以及Ad49等的抗原决定簇基因替换Ad5载体的相应基因以期获得既保留Ad5载体的免疫原性，又带有稀有腺病毒亚型血清学性质的嵌合载体。专利CN104419717A公开了一种构建重组腺病毒的方法，所述方法包括以其他人腺病毒血清型的 HVR5、7 替换 RAd5 载体的 HVR5、7，其中所述其他人腺病毒血清型是 Ad43 或 Ad37，但该方法存在如下缺陷：（1）其只是替换HVR，不能完全逃避预存免疫；（2）在制备中使用了至少四个不同公司的载体，价格昂贵，操作不便。

因此，目前在该领域仍然需要通过基因工程技术进一步改造腺病毒载体以获得一种操作简便、易于包装、免疫水平较高且能很好的避免预存的重组腺病毒载体。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种重组腺病毒载体及其构建方法，该重组腺病毒载体能很好的避免针对Ad5载体本身的预存免疫，同时既保留Ad5载体的强免疫原性，又带有稀有血清型腺病毒血清学性质，且操作简便。

本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现：

一种重组腺病毒载体，其是采用分子克隆的方法，将Ad5载体的骨架质粒中的整个六邻体（hexon）用人稀有腺病毒血清型Ad35的六邻体替换，得到重组腺病毒载体RAd5-35-Hexon-Adbone。

本发明还提供一种重组腺病毒载体的构建方法，包括如下步骤：

（一）中间载体改造，在Puc19载体的限制性酶切位点XbaI和BamHI间引入AscI和NruI，获得中间载体Puc19-AscI-NruI；

（二）将原始Ad5骨架质粒用AscI进行单酶切，回收9620bp的片段，同时用AscI单酶切上述Puc19-AscI-NruI，回收2680bp的片段，将上述回收的两部分片段连接，构建质粒9620-Puc19-AscI;

（三）质粒9620-Puc19-AscI用HindIII单酶切，回收7000bp的片段，同时用HindIII单酶切载体Puc19，回收2680bp的片段，将回收的两部分片段连接，构建质粒7000-Puc19-HindIII；

（四）基于质粒：7000-Puc19-HindIII，在Ad5骨架质粒的Hexon 5’端插入酶切位点ClaI，PCR扩增Hexon 5’端A和B两段，在片段A和B连接处插入单酶切位点ClaI，引物设计如下：

片段A

上游：5’-TCTAGACTGGTGACGCAAATAGACGA-3’

下游：5’-TCTATCGATGGGGTAGCCATAAGCTT-3’

片段B

上游：5’-TCTAGACCCATCGATGATGCCGCA-3’

下游：5’-CTTGCTCGTCTACTTCGTCTAAGCTT-3’

（五）将片段A和B分别连接至Puc19载体，用ClaI和HindIII双酶切质粒Puc19-A和Puc19-B，分别回收3100bp和500bp的片段，将回收的两部分片段连接，构建质粒Puc19-A+B；

（六）用XbaI和HindIII双酶切质粒Puc19-A+B，回收1000bp的片段，同时

用DraIII-HF和RsrII双酶切质粒7000-Puc19-HindIII，回收9800bp的片段，将回收的两部分片段用天根的EsayGeno快速重组克隆试剂盒连接，即构建质粒7000-Puc19-ClaI；

（七）PCR扩增Ad35hexon，引物设计如下：

上游：5’-ATGGCCACCCCATCGATGCTGCC-3’

下游：5’-TACGTGGTAGCGTTGCCGGCCGAGA-3’

回收Ad35hexon的2800bp片段；

（八）ClaI和NaeI双酶切质粒7000-Puc19-ClaI，回收7000bp的片段，同时ClaI和NaeI双酶切PCR回收的Ad35hexon，回收2800bp的片段，将回收的两部分片段连接，构建质粒：7000-Puc19-Ad35；

（九）HindIII单酶切7000-Puc19-Ad35，回收7000bp的片段，同时用HindIII单酶切质粒9620-Puc19-AscI，回收5400bp的片段，将回收的两部分片段连接，构建质粒：9620-Puc19-Ad35；

（十）AscI单酶切原始Ad5骨架质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre，回收25000bp的片段，同时用AscI单酶切质粒9620-Puc19-Ad35，回收9620bp的片段，将回收的两部分片段连接，构建质粒：RAd5-35-Hexon-Adbone。

进一步地，步骤（一）中改造Puc19载体的步骤包括：

A.酶切：酶切反应体系为：2μg Puc19载体、1μL XbaI、1μL BamHI、5μL Cusmart buffer以及适量灭菌水，总体积为50μL；反应条件为：37℃，3h，酶切回收2680bp片段。

B.制备上下游的反应片段：混合物为：100mmol/L的上游引物、100mmol/L的下游引物以及8μL灭菌水，总体积为10μL，其中上游引物：5’-CTAGATA GGCGCGCCTACCTCGCGAGGAGGC GCGCCTTG-3’；下游引物：5’-GATCC AAGGCGCGCCTCCTCGCGAGGTAGGCGCGCCTAT-3；反应程序为：从95℃梯度降温至4℃，每5min降5℃。

C.构建质粒Puc19-AscI-NruI：将回收的2680bp片段和上下游的反应片段连接，连接体系为：10×buffer 1μL、T4DNA连接酶1μL、回收的2680bp片段 1μL、上下游的反应片段5μL以及灭菌水2μL，总体积为10μL。

D. 转化、挑取细菌克隆并小提质粒，获得载体Puc19-AscI-NruI。

本发明还提供该重组腺病毒载体用于制备疫苗或基因治疗药物的用途。

本发明具有如下有益效果

（1）Ad5特异的中和抗体主要针对的是腺病毒六邻体，且腺病毒的免疫是血清型特异的，使用人体稀有血清型腺病毒六邻体来替换Ad5，可以逃避Ad5的预存免疫；而HVR只是六邻体中的一些小片段，本发明替换整个六邻体，相比于替换HVR，能逃避体内预存免疫的几率更大。

（2）替换六邻体的难点在于：Ad5载体的骨架质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre约34kb，基本包括了现有的所以酶切位点，无法通过简单的酶切完成整个六邻体的替换；本发明利用Ad5载体骨架质粒上特殊的酶切位点，将含有六邻体的片段连接至Puc19载体上，减小质粒片段，增加了更多的酶切位点，更加方便操作。

（3）本发明仅仅使用分子克隆的方法通过酶切，连接完成整个载体的构建，只使用外源的经典克隆载体Puc19，不需要特殊的试剂和其他克隆载体，也不需要特殊的感受态，方法简单，可行性强，避免了同源重组等其他的方法操作大片段质粒的不确定性。

（4）为了保证能包装出重组的腺病毒，在替换六邻体的过程中，六邻体以外的碱基不发生突变；本发明酶切腺病毒骨架质粒，将包含hexon的一段连接于Puc19载体上，虽在hexon的5’端插入单酶切位点ClaI，改变了碱基，但编码的氨基酸并没有改变，利于病毒的包装。

（5）本发明的载体既保留RAd5载体的强免疫原性，又带有稀有血清型腺病毒血清学性质。

附图说明：

图1为重组腺病毒载体结构示意图；

图2为嵌合RAd5骨架质粒的构建流程图；

图3为病毒载体包装示意图；

图4为构建质粒9620-puc19-AscI的鉴定电泳图，其中泳道1为质粒：未酶切9620-puc19-AscI，泳道2为Adbone，泳道3为9620-puc19-AscI正确克隆，泳道4为puc19-AscI，泳道5为Maker；

图5为构建质粒7000-puc19-HindIII的鉴定电泳图，其中泳道1为Maker，泳道2-5分别为不同的7000-puc19-HindIII克隆，泳道2是正确的7000-puc19-HindIII克隆；

图6为构建质粒7000-puc19-Ad35的鉴定电泳图，其中泳道1-6分别为不同的7000-puc19-Ad35克隆，泳道2，4，5有正确条带，测序均正确，泳道7为Maker；

图7为构建质粒9620-puc19-Ad35的鉴定电泳图，其中泳道1为质粒：9620-puc19-Ad35，泳道2为Maker；

图8为构建质粒RAd5-35-Hexon-Adbone的鉴定电泳图，其中泳道1-10分别为质粒RAd5-35-Hexon-Adbone的不同克隆，仅泳道6有正确条带，泳道M为maker，泳道+为 pBHGlox(delta)E1,3Cre质粒；

图9为穿梭质粒pDC315-GFP转染细胞工作效能图；

图10为重组腺病毒工作效能图，其中A: Ad5-35-hexon-Adbone包装病毒第七天；B:Ad5-35-hexon-Adbone包装病毒第十六天；C：rAd5重组腺病毒包装病毒第八天；

图11为包装重组腺病毒上清感染293A细胞图，其中A．rAd5病毒上清感染293A细胞第三天；B. Ad5-35-hexon-Adbone病毒上清感染293A细胞第十天；

图12为 PCR扩增鉴定rAd5-35-hexon-Adbone包装病毒中的hexon，其中泳道1为PCR扩增的Ad35 hexon，泳道2为 maker。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细的说明，实施例仅是本发明的优选实施方式，不是对本发明的限定。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。Ad35 hexon 序列：GenBank: AB330116.1

实施例1

RAd5载体和表达绿色荧光蛋白（GFP）基因的穿梭质粒的构建方法，包括

1.嵌合Ad5骨架质粒的构建

第一步：中间载体改造：在Puc19载体的限制性酶切位点XbaI和BamHI间引入AscI和NruI，获得中间载体Puc19-AscI-NruI。

A.酶切：酶切反应体系为：2μg Puc19载体、1μL XbaI、1μL BamHI、5μL Cusmartbuffer以及适量灭菌水，总体积为50μL；反应条件为：37℃，3h，酶切回收2680bp片段。

B.制备上下游的反应片段：混合物为：100mmol/L的上游引物、100mmol/L的下游引物以及8μL灭菌水，总体积为10μL，其中上游引物：5’-CTAGATA GGCGCGCCTACCTCGCGAGGAGGC GCGCCTTG-3’（SEQ ID NO：1）；下游引物：5’-GATCCAAGGCGCGCCTCCTCGCGAGGTAGGCGCGCCTAT-3’（SEQ ID NO：2）；反应程序为：从95℃梯度降温至4℃，每5min降5℃。

注：下划线为限制性酶切位点

C.构建质粒Puc19-AscI-NruI：将回收的2680bp片段和上下游的反应片段连接，连接体系为：10×buffer 1μL、T4DNA连接酶1μL、回收的2680bp片段 1μL、上下游的反应片段5μL以及灭菌水2μL，总体积为10μL。

D. 转化、挑取细菌克隆并小提质粒，获得载体Puc19-AscI-NruI。

第二步：病毒载体构建：通过多步克隆构建载体RAd5-35-Hexon-Adbone，其六邻体被35型腺病毒六邻体替换。

A.原始RAd5骨架质粒即AdMax系统的pBHGlox(delta)E1,3Cre质粒，用AscI单酶切，回收9620bp的片段，同时AscI酶切载体Puc19-AscI-NruI，回收2680bp的片段，将两部分片段连接，构建质粒9620-Puc19-AscI；

B.质粒9620-Puc19-AscI用HindIII单酶切，回收7000bp的片段，同时HindIII单酶切载体Puc19，回收2680bp的片段，将回收的两部分片段连接，构建质粒7000-Puc19-HindIII；

C.基于质粒7000-Puc19-HindIII，在RAd5骨架质粒的Hexon 5’端插入酶切位点ClaI，PCR扩增Hexon 5’端A和B两段，在片段A和B连接处插入单酶切位点ClaI，引物设计如下：

片段A

上游：5’-CTGGTGACGCAAATAGACGA-3’ （SEQ ID NO：3）

下游：5’-TCTATCGATGGGGTAGCCAT-3’ （SEQ ID NO：4）

片段B

上游：5’-CCCATCGATGATGCCGCA-3’（SEQ ID NO：5）

下游：5’-CTTGCTCGTCTACTTCGTCT-3’ （SEQ ID NO：6）；

注：下划线为限制性酶切位点

D. 将片段A连接至Puc19载体，用ClaI和HindIII双酶切质粒Puc19-A，回收3100bp的片段；将片段B连接至Puc19载体，用ClaI和HindIII双酶切质粒Puc19-B，回收500bp的片段；将回收的两部分片段连接，构建质粒Puc19-A+B；

E.用XbaI和HindIII酶切质粒Puc19-A+B，回收1000bp的片段，同时用DraIII-HF和RsrII酶切质粒7000-Puc19-HindIII，回收9800bp的片段，将回收的两部分片段用天根的EsayGeno快速重组克隆试剂盒连接，即构建质粒7000-Puc19-ClaI；

F.PCR扩增Ad35 hexon，引入单酶切位点ClaI和NaeI，引物设计如下：

上游：5’-ATGGCCACCCCATCGATGCTGCC-3’ （SEQ ID NO：7）

下游：5’-TACGTGGTAGCGTTGCCGGCCGAGA-3’ （SEQ ID NO：8）

回收Ad35hexon的2800bp片段；

注：下划线为限制性酶切位点

G.ClaI和NaeI酶切质粒7000-Puc19-ClaI，回收7000bp的片段，同时ClaI和NaeI酶切PCR回收的Ad35hexon，回收约2800bp，将回收的两部分片段连接，构建质粒7000-Puc19-Ad35；

H.HindIII酶切7000-Puc19-Ad35，回收7000bp的片段，同时用HindIII酶切质粒9620-Puc19-AscI，回收5400bp的片段，将回收的两部分片段连接，构建质粒9620-Puc19-Ad35；

I. AscI酶切质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre，回收25000bp的片段，同时用AscI酶切质粒9620-Puc19-Ad35，回收9620bp的片段，将回收的两部分片段连接，构建质粒RAd5-35-Hexon-Adbone。

第三步：重组腺病毒载体的验证。由于骨架质粒未经回收纯化，且是单酶切，可能导致骨架质粒自连，或者目的片段连接出现反向结果，需要酶切电泳鉴定片段大小是否正确，同时测序鉴定。

A．电泳实验：以原始Ad5骨架载体为阳性对照进行琼脂糖凝胶电泳。

B. 测序鉴定：将构建的质粒RAd5-35-Hexon-Adbone送样测序，测序引物为：

5’-GAGGAAGTACGGCGCCGCCA-3’ （SEQ ID NO：9）（鉴定以NruI连接的方向是否正确）

5’-GAGGACATGAACGATCATGCCATTC-3’ （SEQ ID NO：10）（鉴定以AscI连接的方向是否正确）

5’-ATCGTTGCGGCCCGTAGCCAGTG-3’ (鉴定Ad35hexon替换是否正确)

2.表达绿色荧光蛋白（GFP）基因的穿梭质粒的构建和荧光显微镜拍照观察细胞变化。

第一步，将PCR获得的GFP基因克隆到真核表达载体pDC315。

A. 以pHAGE-CMV-MCS-GFP（实验室保存的带有GFP基因的质粒，也可以选择其他带有GFP基因的质粒）为模板，上游引物5’-CCGGAATCCGATGTCTAAAGGTGAAGAATTATTCA-3’ （SEQID NO：11）和下游引物5’-CGCGGATCCGCGTTATTTGTACAATTCATCCATACC-3’ （SEQ ID NO：12）进行PCR扩增GFP基因；

PCR的反应体系为：10×buffer 5μL、DNTP 4μL、上游引物1μL、下游引物1μL、高保真酶1μL、模板1μL以及灭菌水适量，总体积为50μL。

PCR反应程序为：98℃预变性2min，98℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸1min，共30个循环；最后68℃再延伸10min。

B. PCR获得目的基因后，以EcoRI和BamHI双酶切PCR产物和pDC315载体，回收目的片段；于16℃下过夜进行连接反应；然后转化、提取质粒pDC315-GFP。

C. EcoRI和BamHI双酶切pDC315-GFP质粒，切出700bp和3900bp两条带，经测序鉴定正确的pDC315-GFP克隆。

第二步，克隆成功后瞬时转染人胚肾（293A）细胞，荧光显微镜观察GFP蛋白的表达。步骤、试剂、条件如下：

A. 将293A细胞以5×10⁵个/孔的密度铺于6孔板内，置于5%CO₂的细胞培养箱中37℃培养，至细胞生长面积为孔板底面积的80%-90%，将3ug pDC315-GFP质粒转染进细胞，转染试剂为X-tremeGENE (购自Roche)，转染操作参见试剂说明书。

B.荧光显微镜拍照观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达：转染72小时后，在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达，并拍照，结果显示在图9中。

实施例2

重组腺病毒的包装和感染力验证

第一步：以实施例1中构建好的重组腺病毒载体rAd5-35-Hexon-Adbone和原始腺病毒载体RAd5分别与实施例1中构建的含有绿色荧光蛋白（GFP）基因的穿梭质粒通过X-tremeGENE（购自Roche）共转染至293A细胞，如图3所示，使共转染到293A细胞中的穿梭质粒和腺病毒载体在重组酶的作用下包装出重组腺病毒，得到的重组病毒是E1/E3缺失的复制缺陷型嵌合腺病毒。结果显示构建的重组腺病毒载体与原始腺病毒载体（即rAd5）均包装成功初步获得了病毒。实验步骤、试剂、条件和操作方法如下：

在六孔板中每孔铺3×10⁵个293A细胞，将携带绿色荧光蛋白的基因的腺病毒穿梭质粒与腺病毒载体骨架质粒各1.5ug，用X-tremeGENE （购自Roche）9μL共转染293A细胞，隔2-3天换液1次，约16天左右出现细胞病变，即细胞变圆变大，脱落并成葡萄串珠状聚集，结果显示在图10A和10B，阳性rAd5包装病毒第八天左右即出现细胞病变，结果显示在图10C。

第二步：收集包装出嵌合病毒，包装病毒至14天，待细胞出现病变后，收集六孔板中包装病毒细胞，经-80℃--37℃水浴反复冻融3次后，4000rpm离心2分钟去除细胞碎片，吸取含有病毒的细胞培养上清感染新的293A细胞。阳性的rAd5腺病毒感染293A细胞约4天左右能看到绿色荧光和细胞病变，结果显示在图11A，但rAd5-35-hexon-Adbone包装的腺病毒感染293A约在10天之后才能看到绿色荧光和细胞病变，结果显示在图11B。

第三步：收集上一步中rAd5-35-hexon-Adbone包装的腺病毒感染的293A细胞，经-80℃--37℃反复冻融3次后，4000rpm离心2分钟吸取上清。以病毒上清为模版，用引物F:5’-Atggccaccccatcgatgct-3’ （SEQ ID NO：13）和R:5’-TTACGTGGTAGCGTTACCG-3’ （SEQ IDNO：14）PCR扩增Ad35hexon，测序鉴定rAd5的hexon被Ad35成功替换，结果显示在图12。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 南方医科大学

<120> 一种重组腺病毒载体及其构建方法

<130> 2016

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ctagataggc gcgcctacct cgcgaggagg cgcgccttg 39

<210> 2

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gatccaaggc gcgcctcctc gcgaggtagg cgcgcctat 39

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctggtgacgc aaatagacga 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tctatcgatg gggtagccat 20

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cccatcgatg atgccgca 18

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cttgctcgtc tacttcgtct 20

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atggccaccc catcgatgct gcc 23

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tacgtggtag cgttgccggc cgaga 25

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gaggaagtac ggcgccgcca 20

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gaggacatga acgatcatgc cattc 25

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ccggaatccg atgtctaaag gtgaagaatt attca 35

<210> 12

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cgcggatccg cgttatttgt acaattcatc catacc 36

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

atggccaccc catcgatgct 20

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ttacgtggta gcgttaccg 19

Claims (3)

1.一种重组腺病毒载体，其特征在于，其是采用分子克隆的方法，将5型腺病毒(rAd5)载体的骨架质粒中的六邻体用人稀有腺病毒血清型Ad35的六邻体替换，得到重组腺病毒载体rAd5-35-Hexon-Adbone。

2.如权利要求1所述的重组腺病毒载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

（一）改造Puc19载体：在Puc19载体的限制性酶切位点XbaI和BamHI间引入AscI和NruI，获得中间载体Puc19-AscI-NruI；

（二）将原始Ad5骨架质粒用AscI进行单酶切，回收9620bp的片段，同时用AscI单酶切上述中间载体Puc19-AscI-NruI，回收2680bp的片段，将上述回收的两部分片段连接，构建质粒9620-Puc19-AscI；

（三）质粒9620-Puc19-AscI用HindIII单酶切，回收7000bp的片段，同时用HindIII单酶切载体Puc19，回收2680bp的片段，将回收的两部分片段连接，构建质粒7000-Puc19-HindIII；

（四）基于质粒7000-Puc19-HindIII，在Ad5骨架质粒的六邻体 5’端插入酶切位点ClaI，PCR扩增该六邻体 5’端A和B两段，在片段A和B连接处插入单酶切位点ClaI，引物设计如下：

片段A

上游：5’-TCTAGACTGGTGACGCAAATAGACGA-3’

下游：5’-TCTATCGATGGGGTAGCCATAAGCTT-3’

片段B

上游：5’-TCTAGACCCATCGATGATGCCGCA-3’

下游：5’-CTTGCTCGTCTACTTCGTCTAAGCTT-3’；

（五）将片段A连接至Puc19载体，用ClaI和HindIII双酶切质粒Puc19-A，回收3100bp的片段；将片段B连接至Puc19载体，用ClaI和HindIII双酶切质粒Puc19-B，回收500bp的片段；将回收的两部分片段连接，构建质粒Puc19-A+B；

（六）用XbaI和HindIII双酶切质粒Puc19-A+B，回收1000bp的片段，同时用DraIII-HF和RsrII双酶切质粒7000-Puc19-HindIII，回收9800bp的片段，将回收的两部分片段用快速重组克隆试剂盒连接，即构建质粒7000-Puc19-ClaI；

（七）PCR扩增Ad35hexon，引物设计如下：

上游：5’-ATGGCCACCCCATCGATGCTGCC-3’

下游：5’-TACGTGGTAGCGTTGCCGGCCGAGA-3’

回收Ad35hexon的2800bp片段；

（八）ClaI和NaeI双酶切质粒7000-Puc19-ClaI，回收7000bp的片段，同时ClaI和NaeI双酶切PCR回收的Ad35hexon，回收2800bp的片段，将回收的两部分片段连接，构建质粒7000-Puc19-Ad35；

（九）HindIII单酶切7000-Puc19-Ad35，回收7000bp的片段，同时用HindIII单酶切质粒9620-Puc19-AscI，回收5400bp的片段，将回收的两部分片段连接，构建质粒9620-Puc19-Ad35；

（十）AscI单酶切原始Ad5骨架质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre，回收25000bp的片段，同时用AscI单酶切质粒9620-Puc19-Ad35，回收9620bp的片段，将回收的两部分片段连接，构建质粒Ad5-35-Hexon-Adbone。

3.如权利要求 1-2任一项所述的重组腺病毒载体用于制备疫苗或基因治疗药物的用途。