CN106868045A - 乙型肝炎e抗原阴性小鼠模型的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乙型肝炎e抗原阴性小鼠模型的构建方法，包括步骤：1)提取被诊断为HBeAg阴性感染的病人血清DNA，使用引物对HBV‑F/HBV‑R进行PCR扩增；2)PCR产物测序，重新设计针对该序列的特异性PCR扩增引物对重新进行PCR扩增；3)将PCR产物克隆到pEASY‑Blunt Zero载体中；4)提取质粒，酶切，回收片段并纯化，环化并纯化，得到HBV e阴性的cccDNA；5)将cccDNA注射入小鼠中，即构建了乙型肝炎e抗原阴性小鼠模型。本发明首次成功的构建了乙型肝炎e抗原阴性小鼠模型，对HBeAg阴性乙肝感染的机理研究和药物处理疗效研究具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种乙型肝炎e抗原阴性小鼠模型的构建方法。
背景技术
乙型病毒性肝炎是一个由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)引起的重大的全球健康问题。HBV感染引起的慢性乙肝可能发展成肝硬化和肝细胞癌。最近有报道称全球大约有2.48亿人患有慢性乙肝(Chronic hepatitis B，CHB)。慢性乙肝的血清学分类非常复杂，按照血清e抗原水平可将其分为e抗原阳性和e抗原阴性慢性乙肝感染。近年来全球HBV的感染人数有所下降，但其中HBeAg阴性感染数量越来越多。但目前对e抗原阴性病人对抗病毒疗法响应率低，导致处理时间增加，此外，e阴性慢性乙肝患者发展为肝细胞癌的几率更高。因此，对e阴性HBV的发展史和致病机理需要更深层次的研究。而目前对慢性HBV感染和治疗的研究主要是基于e阳性动物模型展开的，到目前为止，世界范围内仍无一例对e阴性HBV感染动物模型的研究和报道，目前对e阴性HBV感染的研究仅限于致病机理、药物处理和药物筛选。因此，目前急需一个能够用于e阴性HBV持续感染研究的动物模型。
发明内容
本发明的目的针对上述问题提供一种乙型肝炎e抗原阴性小鼠模型的构建方法，包括如下步骤：
1)提取被诊断为HBeAg阴性感染的病人血清DNA，使用引物对HBV-F/HBV-R进行PCR扩增，引物序列为：
HBV-F：5′-CCGGAAAGCTTATGCTCTTCTTTTTCACCTCTGCCTARTCATC-3′，
HBV-R：5′-CCGGAGAGCTCATGCTCTTCAAAAAGTTGCATGGTGCTGGTG-3′；
2)将PCR产物进行测序，根据测序结果重新设计针对该序列的特异性PCR扩增引物对，利用该引物对HBeAg阴性感染的病人血清DNA重新进行PCR扩增；
3)将步骤2)获得的PCR产物克隆到pEASY-Blunt Zero载体中，挑选阳性克隆；
4)提取步骤3)中阳性克隆的质粒，将提取到的质粒用BspQI内切酶酶切，进行琼脂糖凝胶电泳，回收大小约3.2kb的的片段并纯化，用T4连接酶将其环化并纯化，得到HBV e阴性的cccDNA；
5)将步骤4)得到的cccDNA注射入小鼠中，即构建了乙型肝炎e抗原阴性小鼠模型。
在上述技术方案中，步骤2)中所述的引物对为HBV-VF/HBV-VR，序列为：
HBV-VF：CCGGATGCTCTTCTTTTTCACCTCTGCCTAATCATC，
HBV-VR：CCGGATGCTCTTCAAAAAGTTGCATGGTGCTGGTG。
步骤5)中采用水动力法将cccDNA注射入小鼠中。
在步骤5)中，每只小鼠注射2μg cccDNA，cccDNA的浓度为1μg/mL，注射时间为5～8s。
本发明的有益效果是：首次成功的构建了乙型肝炎e抗原阴性小鼠模型，解决了目前只有乙肝e阳性动物模型而没有e抗原阴性动物模型的问题。本发明构建的乙型肝炎e抗原阴性小鼠模型可以用于e阴性HBV持续感染研究，对e抗原阴性乙肝感染的机理研究和药物处理疗效研究具有重要意义。
附图说明
图1是HBV病毒特异标志物在小鼠血清中的表达图，其中，A为高压水动力注射后血清HBsAg的表达水平，B为注射后不同时间点血清中HBsAg阳性结果的百分比，C为血清中HBVDNA的水平，D为注射后血清HBeAg的表达水平。
图2是肝组织中HBVDNA表达的qPCR检测结果图。
图3是滚环扩增-PCR法检测cccDNA的结果，其中，1：100bp ladder，2：pEASY-HBV/HBeAg-阴性质粒作为模板，3：线性HBV作为模板，4：注射后21天的实验组提取的DNA作为模板，5：注射后21天的实验组提取的DNA作为模板，6：cccDNA作为模板。
图4是注射后21天和70天小鼠肝组织HBcAg的IHC检测结果，其中，a、b、c分别是注射后21天的肝组织IHC结果，a为生理盐水，b为pAAV/HBV1.2，c为环化的HBV DNA；d、e、f分别是注射后70天的肝组织IHC结果，d为生理盐水，e为pAAV/HBV1.2，f为环化的HBV DNA。
图5是注射后21天和70天小鼠肝组织HBsAg的IHC检测结果图(×400)，其中，a、b、c分别是注射后21天的肝组织IHC结果，a为生理盐水，b为pAAV/HBV1.2，c为环化的HBV DNA；d、e、f分别是注射后70天的肝组织IHC结果，d为生理盐水，e为pAAV/HBV1.2，f为环化的HBVDNA。
图6是HE染色检测注射后21天和70天的肝组织组织病理学变化图(×400)，其中，a、b、c分别是注射后21天的小鼠肝组织病理学HE分析结果，a为生理盐水，b为pAAV/HBV1.2，c为环化的HBVDNA；d、e、f分别是注射后70天的小鼠肝组织病理学HE分析结果，d为生理盐水，e为pAAV/HBV1.2，f为环化的HBV DNA。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
主要试剂及生产者：
pEASY-BluntZero载体(全式金公司，中国)
PrimeSTAR GXLDNAPolymerase(Takara公司，日本)
质粒提取试剂盒(QIAGEN公司，德国)
BspQI内切酶(NEB公司，美国)
胶回收试剂盒(Takara公司，日本)
T4连接酶(Takara公司，日本)
放射免疫鉴定试剂盒(北京北方生物技术研究所，中国)
小鼠ELISA试剂盒(武汉基因美生物科技有限公司，中国)
plasmid-safeATP-dependentDNase PSAD(Epicentre公司，美国)
Phi29DNA聚合酶(NEB公司，美国)
FastStartUniversal SYBR-Green Master mix(Roche公司，德国)
测序服务(Invitrogen公司，上海)
实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例一、构建乙型肝炎e抗原阴性的小鼠模型
按照如下步骤操作：
一、HBV e阴性病毒株全长DNA的克隆
1、扩增HBV DNA全长：提取被诊断为HBeAg阴性感染的11061008号病人血清(由重庆医科大学第二附属医院感染科提供)DNA，使用引物对HBV-F/HBV-R进行PCR扩增，引物序列为：
上游引物HBV-F：
5′-CCGGAAAGCTTATGCTCTTCTTTTTCACCTCTGCCTARTCATC-3′，
下游引物HBV-R：
5′-CCGGAGAGCTCATGCTCTTCAAAAAGTTGCATGGTGCTGGTG-3′。
2、将步骤1得到的PCR产物进行测序，得到其序列，根据测序结果重新设计引物，新设计的上下游引物各删除了7个碱基，并且将上游引物的简并碱基根据测序结果改为了特异碱基，提高了PCR的特异性和扩增效率以及后续纯化效率。新的引物为：
HBV-VF：CCGGATGCTCTTCTTTTTCACCTCTGCCTAATCATC，HBV-VR：CCGGATGCTCTTCAAAAAGTTGCATGGTGCTGGTG。利用引物对HBV-VF/HBV-VR，以前面提取的11061008号病人血清DNA为模板，进行PCR扩增：
PCR反应条件为：95℃3min；(95℃50S；58℃20S；72℃3min30S)30个循环；72℃5min。
3、将步骤2获得的PCR产物克隆到pEASY-Blunt Zero载体中：在1.5mL离心管中加入3μL PCR产物和1μL pEASY-Blunt Zero室温连接30min。加入100μLDH5α于连接产物中，置于冰上冰浴20min，42℃水浴热激30S，转至冰上2min，加入800μL SOC培养基于热激产物中，置于摇床200rpm/min、37℃恢复生长30min，10000rpm离心1min弃大部分上清，吹打重悬沉淀，将重悬的细胞涂布于预先涂有IPTG和X-Gal的LBA平板上；置于37℃培养箱倒置培养过夜。挑取10个白斑单克隆进行LBA液体培养，12h后提取质粒，进行BspQI酶切验证，电泳结果显示已成功得到了3个阳性克隆，将其送公司进行测序，测序结果显示均为阳性pEASY-HBV质粒。
二、e阴性HBV cccDNA的制备
cccDNA是通过质粒酶切环化的方法制备得到，过程如下：首先将前述阳性克隆的菌株进行扩大培养，用质粒提取试剂盒提取前述得到的阳性pEASY-HBV质粒，将提取到的质粒用BspQI内切酶酶切，酶切产物用1％的琼脂糖凝胶电泳，然后将大小约3.2kb的的片段用胶回收试剂盒回收并纯化，最后用T4连接酶将其环化并纯化，即得到HBeAg阴性的cccDNA。
三、动物模型的建立
取36只6-8周龄的C57BL/6J雄性小鼠随机分成3组，实验组15只水动力法注射HBeAg阴性cccDNA(2μg/2mL/只,5–8s)；对照组15只注射pAAV/HBV1.2(5μg/2mL/只)；空白组6只注射生理盐水(2mL)。分别在注射后1天、3天、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周和10周采集尾静脉血。每组分别在3周和10周时采集肝组织进行检测。
实施例二、小鼠模型的检测
对实施例一构建的实验组、对照组、空白组小鼠模型进行检测：
一、小鼠血清HBV特定标志物的检测
实验小鼠血清对HBV特定标志物如HBsAg、HBeAg、病毒DNA和谷丙转氨酶(alanineaminotransferase，ALT)等在不同的时间点进行检测，HBsAg和HBeAg的检测使用放射免疫鉴定试剂盒；ALT检测使用小鼠ELISA试剂盒。
HBVDNA的检测用实时荧光定量PCR方法，取50μL血清进行病毒DNA、RNA的提取，用2μL总DNA进行qPCR，并分析HBV拷贝数。在HBV基因的保守区进行引物设计并扩增，正向引物：HBV-Q-F：5′-CCTCTTCATCCTGCTGCT-3′；反向引物HBV-Q-R：5′-AACTGAAAGCCAAACAGTG-3′，标准曲线使用pEASY-HBV/HBeAg-阴性HBVDNA按5×103,5×104,5×105,5×106,5×107,and 5×108拷贝/μL梯度进行绘制，PCR反应程序为：95℃3min；94℃20s，50℃30s，40个循环；72℃32s。
检测结果如图1所示，图1A为高压水动力注射后血清HBsAg的表达水平，检测下限为15ng/mL，从图中可以看出实验组和阳性对照组的HBsAg表达水平在注射后一周内迅速增加并达到峰值，随后显著下降，空白对照组为持续阴性结果。图1B为注射后不同时间点血清中HBsAg阳性结果的百分比(对照组和实验组n＝15,空白组n＝6)其中实验组在注射70天后仍然具有60％的阳性率。图1C为血清中HBV DNA的水平，实验组和阳性对照组分别约为2.70×108拷贝/mL和2.69×108拷贝/mL。图1D为注射后血清HBeAg的表达水平，检测下限为1ng/mL，与预期结果一致实验组中无HBeAg的表达。
综上所述，从常规检测指标可以看出我们已成功建立了一个e抗原阴性感染的小鼠模型。
二、小鼠肝组织中病毒效价和cccDNA的检测
肝组织中HBV DNA的定量用前述的qPCR方法进行，结果如图2所示，cccDNA的持续存在是HBV长期感染的标志，因此我们分别在注射后21天和70天进行了cccDNA的检测，实验结果表明该小鼠模型的cccDNA持续存在，且水平均大于108拷贝/mL。
cccDNA的检测用滚环扩增加PCR的方法进行，步骤如下：首先提取注射后3周和10周的小鼠肝组织的病毒DNA，用依赖ATP的质粒安全DNA酶(plasmid-safeATP-dependentDNase PSAD)37℃处理12h；随后进行滚环扩增，用1μL DNA和2μL的八条引物混合再加入10×phi29缓冲液至终体积为10μL，对以上DNA混合液进行95℃3min，逐渐冷却至50℃15s,30℃15s,20℃10min，然后置于冰上；接下来进行扩增反应，将上述10μLDNA混合物中加入3μLdNTPs、10×Phi29缓冲液和10U的Phi29DNA聚合酶，进行30℃16h的反应，反应结束后置于65℃10min，最后滚环扩增的产物通过跨cccDNA缺口的PCR反应进行检测。所述的八条引物序列为：
RCA1:AATCCTCACAATACC，
RCA2:GATGGGATGGGAATA，
RAC3:CCTATGGGAGTGGGC，
RAC4:GCAACGGGGTAAAGG，
RAC5:ATGCAACTTTTTCAC，
RAC6:TCCAAATTCTTTATA，
RAC7:TAGAAGAAGAACTCC，
RAC8:AGAATATGGTGACCC。
检测结果如图3所示，1:100bp ladder；2:pEASY-HBV/HBeAg-阴性质粒作为模板；3:线性HBV作为模板；4:注射后21天的实验组提取的DNA作为模板；5:注射后21天的实验组提取的DNA作为模板；6:cccDNA作为模板。可见本模型中确实存在HBV感染的标志物cccDNA。
三、肝组织病理学和免疫组化分析
用苏木素伊红(hematoxylin and eosin，HE)染色的方法进行肝组织病理学观察。病毒抗原的定位和表达用免疫组织化学法(immunohistochemistry，IHC)进行检测。多聚甲苯固定的4.5μm厚的石蜡包埋的组织切片分别用HE和IHC进行染色，使用马anti-HBsAg(1:1000)和兔anti-HBcAg(1:1000)二抗进行观察肝组织切片中HBsAg and HBV core antigen(HBcAg)的表达，在阴性对照中，用生理盐水代替二抗。
注射后21天和70天小鼠肝组织HBcAg和HBsAg的IHC检测结果分别如图4和5所示，从图中可以看出实验组小鼠肝细胞中有HBcAg和HBsAg的表达，其中HBVsAg结果进一步确证了前述的放射免疫检测结果，可见该模型构建是成功的。
HE染色检测注射后21天和70天的肝组织组织病理学变化如图6所示，可见HBV的长期感染并不引起急性肝损伤。
序列表
<110> 重庆市科学技术研究院
<120> 乙型肝炎e抗原阴性小鼠模型的构建方法
<160> 14
<210> 1
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HBV-F
<400> 1
ccggaaagcttatgctcttctttttcacctctgcctartcatc 43
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> HBV-R
<400> 2
ccggagagctcatgctcttcaaaaagttgcatggtgctggtg 42
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> HBV-VF
<400> 3
ccggatgctcttctttttcacctctgcctaatcatc 36
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> HBV-VR
<400> 4
ccggatgctcttcaaaaagttgcatggtgctggtg 35
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> HBV-Q-F
<400> 5
cctcttcatcctgctgct 18
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> HBV-Q-R
<400> 6
aactgaaagccaaacagtg 19
<210> 7
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> RCA1
<400> 7
aatcctcacaatacc 15
<210> 8
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> RCA2
<400> 8
gatgggatgggaata 15
<210> 9
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> RCA3
<400> 9
cctatgggagtgggc 15
<210> 10
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> RCA4
<400> 10
gcaacggggtaaagg 15
<210> 11
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> RCA5
<400> 11
atgcaactttttcac 15
<210> 12
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> RCA6
<400> 12
tccaaattctttata 15
<210> 13
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> RCA7
<400> 13
tagaagaagaactcc 15
<210> 14
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> RCA8
<400> 14
agaatatggtgaccc 15
Claims (4)
1.一种乙型肝炎e抗原阴性小鼠模型的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)提取被诊断为HBeAg阴性感染的病人血清DNA，使用引物对HBV-F/HBV-R进行PCR扩增，引物序列为：
HBV-F：5′-CCGGAAAGCTTATGCTCTTCTTTTTCACCTCTGCCTARTCATC-3′，HBV-R：
5′-CCGGAGAGCTCATGCTCTTCAAAAAGTTGCATGGTGCTGGTG-3′；
2)将PCR产物进行测序，根据测序结果重新设计针对该序列的特异性PCR扩增引物对，利用该引物对HBeAg阴性感染的病人血清DNA重新进行PCR扩增；
3)将步骤2)获得的PCR产物克隆到pEASY-HBV载体中，挑选阳性克隆；
4)提取步骤3)中阳性克隆的质粒，将提取到的质粒用BspQI内切酶酶切，回收大小约3.2kb的的片段并纯化，用T4连接酶将其环化并纯化，得到HBeAg阴性的cccDNA；
5)将步骤4)得到的cccDNA注射入小鼠中，即构建了乙型肝炎e抗原阴性小鼠模型。
2.如权利要求1所述的乙型肝炎e抗原阴性小鼠模型的构建方法，其特征在于：步骤2)中所述的引物对为HBV-VF/HBV-VR，序列为：
HBV-VF：CCGGATGCTCTTCTTTTTCACCTCTGCCTAATCATC，
HBV-VR：CCGGATGCTCTTCAAAAAGTTGCATGGTGCTGGTG。
3.如权利要求1所述的乙型肝炎e抗原阴性小鼠模型的构建方法，其特征在于：步骤5)中采用水动力法将cccDNA注射入小鼠中。
4.如权利要求3所述的乙型肝炎e抗原阴性小鼠模型的构建方法，其特征在于：在步骤5)中，每只小鼠注射2μg cccDNA，cccDNA的浓度为1μg/mL，注射时间为5～8s。
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|---|---|---|---|---|
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1701124A (zh) * | 2002-09-27 | 2005-11-23 | 国家健康医学研究所 | 检测hbv复制和测试药物敏感性的方法 |
| WO2016120186A1 (en) * | 2015-01-27 | 2016-08-04 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Recombinant hbv cccdna, the method to generate thereof and the use thereof |
-
2017
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1701124A (zh) * | 2002-09-27 | 2005-11-23 | 国家健康医学研究所 | 检测hbv复制和测试药物敏感性的方法 |
| WO2016120186A1 (en) * | 2015-01-27 | 2016-08-04 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Recombinant hbv cccdna, the method to generate thereof and the use thereof |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| STEPHAN GUNTHER等: "Amplification of Full-Length Hepatitis B Virus Genomes from Samples from Patients with Low Levels of Viremia: Frequency and Functional Consequences of PCR-Introduced Mutations", 《JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY》 * |
| 严磊等: "利用乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA构建慢性乙型肝炎病毒感染的小鼠模型", 《四川动物》 * |
| 杜茜等: "低拷贝HBV病毒全长DNA的制备和体外复制水平的鉴定", 《重庆医科大学学报》 * |
| 马其欢等: "HBV DNA环化结构在体外的复制表达水平优于HBV线性结构的表达质粒", 《中国生物化学与分子生物学报》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109652452A (zh) * | 2018-12-13 | 2019-04-19 | 重庆市科学技术研究院 | 长期携带乙型肝炎病毒的实验动物模型构建方法 |
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