CN106867989B - 固定化酶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及固定化酶及其制备方法。本发明的固定化脂肪酶的制备方法，包括：（1）将强碱性离子交换树脂与脂肪酸盐溶液和脂肪酶溶液接触，获得混合液；（2）将上述步骤（1）所得混合液进行干燥。本发明的固定化脂肪酶，其包含强碱性离子交换树脂、脂肪酶、脂肪酸盐和水，其中，以重量比计，强碱性离子交换树脂为50～95%，脂肪酶2～10%，脂肪酸盐0.001～5%，水为2～20%，其中酶的量以酶蛋白计。本发明的固定化脂肪酶的专一性、酯交换活力和酯化活力优异。
Description
技术领域
本发明涉及固定化酶及其制备方法。
背景技术
脂肪酶（lipase，EC3.1.1.3）全称为甘油三酰酯水解酶，不同菌种来源的脂肪酶还可以具有酯化，酯交换，醇解，消旋体拆分等功能。液体脂肪酶不能重复使用，难以分离，限制了其在工业上的应用。通过固定化技术将酶赋形于具有一定物理性质的载体之上，可解决上述问题。
在脂肪酶固定化过程中，较为常见的方法是以高分子吸附或离子交换树脂为载体，通过其巨大的比表面积产生的剩余表面能量将脂肪酶吸附到其孔当中，如US 140542，采用酚醛骨架的离子交换树脂对米黑根毛霉产脂肪酶进行固定，然后用于油脂改性。
在脂肪酶固定化过程中，还可以加入蛋白，表面活性剂，多官能胺等物质提高或改变酶的性质，稳定酶的活力。如CN200680036485.3中，通过将酶，多官能胺和交联剂吸附在粒状多孔载体上来对酶进行固定化。用于环氧化，酰胺化，缩合或水解等多种反应类型。
在脂肪酶固定化过程中，还可对底物油进行精炼，加皂等步骤，提高酶的半衰期。如在US 8697 393B2中，描述了将底物和皂混和均质，然后将混有皂的底物和固定化脂肪酶接触，提高了酶的使用寿命。
现有的离子交换树脂为载体的固定化酶，例如诺维信公司达到RM IM，在使用中存在酶活易降低，稳定性差的问题。在现有文献报道中有以接枝高聚物为载体进行脂肪酶的固定化以提高酶稳定性。如文献biotechnology and bioengineering，V58， No. 5， June5， 1998， a single step purification immobilization and hyperactivation oflipases via interfacial adsorption on strongly hydrophobic supports 中，提到琼脂糖接枝辛基提高表面疏水性，从而提高酶活。在化工进展，2009年第28卷第3期，新型固定化酶载体的合成及其功能一文中，以多烯多胺为接枝，通过多步反应及溶剂处理得到新型接枝树脂，用于酶的固定化。但是接枝方法复杂，接枝越长，成本越高，越不稳定。目前缺少一种有效的载体改性方法，在现有技术中对载体进行改性处理来提高固定化酶的稳定性和活力。
发明内容
本发明包括以下内容：将脂肪酸盐配成一定浓度的溶液，为溶液a，将液体脂肪酶处理成一定浓度或市售脂肪酶溶液不经任何处理，为溶液b，将溶液a和b同时加入含有强碱性离子交换树脂的容器中进行搅拌或震荡，经过一定时间待脂肪酶固定到载体中后，检测上清液中的蛋白和脂肪酸盐含量，抽干液体部分，湿载体部分用缓冲液或蒸馏水冲洗至无脂肪酸盐和蛋白，干燥成具有一定水分含量的固定化酶产品。
本发明的一个目的是提供固定化脂肪酶的制备方法，包括：
（1）将强碱性离子交换树脂与脂肪酸盐溶液和脂肪酶溶液接触，获得混合液；
（2）将上述步骤（1）所得混合液进行干燥。
根据本发明所述的固定化脂肪酶的制备方法，其中所述脂肪酸盐选自碳原子数6～20的脂肪酸的盐中的至少一种。
根据本发明所述的固定化脂肪酶的制备方法，其中所述脂肪酸盐选自碳原子数6～18的脂肪酸的盐中的至少一种。
根据本发明所述的固定化脂肪酶的制备方法，其中所述脂肪酸盐选自己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、油酸、硬脂酸、棕榈酸盐或软脂酸盐的盐中的至少一种。
根据本发明所述的固定化脂肪酶的制备方法，其中所述脂肪酸盐选自辛酸、月桂酸、油酸或硬脂酸的盐中的至少一种。
根据本发明所述的固定化脂肪酶的制备方法，其中所述脂肪酸盐选自碱金属盐中的至少一种。
根据本发明所述的固定化脂肪酶的制备方法，其中所述碱金属盐选自锂盐、钠盐或钾盐中的至少一种。
根据本发明所述的固定化脂肪酶的制备方法，其中所述脂肪酸盐溶液的浓度为0.01～0.1g/ml。
根据本发明所述的固定化脂肪酶的制备方法，其中所述脂肪酸盐溶液的浓度为0.015～0.08g/ml。
根据本发明所述的固定化脂肪酶的制备方法，其中所述脂肪酸盐溶液的浓度为0.02～0.05g/ml。
根据本发明所述的固定化脂肪酶的制备方法，其中，相对于100重量份强碱性离子交换树脂，所述脂肪酸盐的量为0.1～100重量份。
根据本发明所述的固定化脂肪酶的制备方法，其中，相对于100重量份强碱性离子交换树脂，所述脂肪酸盐的量为1～50重量份。
根据本发明所述的固定化脂肪酶的制备方法，其中，相对于100重量份强碱性离子交换树脂，所述脂肪酸盐的量为2～10重量份。
根据本发明所述的固定化脂肪酶的制备方法，其中，相对于100重量份强碱性离子交换树脂，所述脂肪酸盐的量为2.5～5重量份。
根据本发明所述的固定化脂肪酶的制备方法，其中，所述脂肪酶溶液的量与所述强碱性离子交换树脂的量之比以ml/g计，即脂肪酶溶液的体积/强碱性离子交换树脂的重量之比为0.5～2。
根据本发明所述的固定化脂肪酶的制备方法，其中，所述脂肪酶溶液的量与所述强碱性离子交换树脂的量之比以ml/g计，即脂肪酶溶液的体积/强碱性离子交换树脂的重量之比为1～1.5。
根据本发明所述的固定化脂肪酶的制备方法，其中，所述脂肪酶选自由疏棉状嗜热丝孢菌（Thermomyces lanuginose）、米黑根毛霉 （Rhizomucor miehei）、米黑毛霉（Mucor miehei）、假单胞菌 （Pseudomonas sp.）、根霉（Rhizopus sp.）、青霉（Penicillium sp.）、黑曲霉（Aspergillus niguer）或伯克霍尔德氏菌（Burkholderia sp.）所产脂肪酶中的至少一种。
根据本发明所述的固定化脂肪酶的制备方法，其中，所述强碱性离子交换树脂具有氨基交换基团。
根据本发明所述的固定化脂肪酶的制备方法，其中，所述强碱性离子交换树脂是季铵型强碱性阴离子交换树脂。
根据本发明所述的固定化脂肪酶的制备方法，其中，以摩尔比计，所述强碱性离子交换树脂的氨基交换基团与所述脂肪酸盐的量之比为1:0.08～1:1.4。
根据本发明所述的固定化脂肪酶的制备方法，其中，以摩尔比计，所述强碱性离子交换树脂的氨基交换基团与所述脂肪酸盐的量之比为1:0.1～1:0.6。
根据本发明所述的固定化脂肪酶，其中，以摩尔比计，所述强碱性离子交换树脂的氨基交换基团与所述脂肪酸盐的量之比为1:0.11～1:0.3。
根据本发明所述的固定化脂肪酶的制备方法，其中，所述强碱性离子交换树脂的交换容量为0.5～4mmol/g。
根据本发明所述的固定化脂肪酶的制备方法，其中，所述强碱性离子交换树脂的交换容量为1.2～3.6mmol/g。
根据本发明所述的固定化脂肪酶的制备方法，其中，所述强碱性离子交换树脂在使用之前进行预处理。
根据本发明所述的固定化脂肪酶的制备方法，其中，所述预处理通过用酸液和碱液交替处理后，水洗至中性。
根据本发明所述的固定化脂肪酶的制备方法，其中，所述酸液为0.2～1.0mol/L的HCl，所述碱液为0.2～1.0mol/L的NaOH。
根据本发明所述的固定化脂肪酶的制备方法，其中，用酸液和碱液交替处理2～5次。
根据本发明所述的固定化脂肪酶的制备方法，其中，以重量计，所述酸液和碱液的用量分别是所述强碱性离子交换树脂量的2～5倍量。
根据本发明所述的固定化脂肪酶的制备方法，其中，还添加保护剂。
根据本发明所述的固定化脂肪酶的制备方法，其中，所述保护剂选自山梨醇、丙二醇或甘油中的至少一种。
根据本发明所述的固定化脂肪酶的制备方法，其中，以最终产品总重量计，干燥至水分含量5～20%。
根据本发明所述的固定化脂肪酶的制备方法，其中，所述强碱性离子交换树脂选自聚苯乙烯型、丙烯酸型、酚醛型优选聚苯乙烯型、丙烯酸型中的至少一种。
本发明的另一个目的是提供固定化脂肪酶，其包含强碱性离子交换树脂、脂肪酶、脂肪酸盐和水，其中，以重量比计，强碱性离子交换树脂为50～95%，脂肪酶2～10%，脂肪酸盐0.001～5%，水为2～20%，其中酶的量以酶蛋白计。
根据本发明所述的固定化脂肪酶，其中以重量比计，强碱性离子交换树脂为65～85%，脂肪酶3～5%，脂肪酸盐0.002～1%，水为8～12%，其中酶的量以酶蛋白计。
根据本发明所述的固定化脂肪酶，其中所述脂肪酸盐选自碳原子数6～20的脂肪酸的盐中的至少一种。
根据本发明所述的固定化脂肪酶，其中所述脂肪酸盐选自碳原子数6～18的脂肪酸的盐中的至少一种。
根据本发明所述的固定化脂肪酶，其中所述脂肪酸盐选自己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、油酸、硬脂酸、棕榈酸盐或软脂酸盐中的至少一种。
根据本发明所述的固定化脂肪酶，其中所述脂肪酸盐选自辛酸、月桂酸、油酸或硬脂酸的盐中的至少一种。
根据本发明所述的固定化脂肪酶，其中所述脂肪酸盐选自碱金属盐中的至少一种。
根据本发明所述的固定化脂肪酶，其中所述碱金属盐选自锂盐、钠盐或钾盐中的至少一种。
根据本发明所述的固定化脂肪酶，其中，所述脂肪酶选自由疏棉状嗜热丝孢菌（Thermomyces lanuginose）、米黑根毛霉 （Rhizomucor miehei）、米黑毛霉 （Mucor miehei）、假单胞菌 （Pseudomonas sp.）、根霉（Rhizopus sp.）、青霉（Penicillium sp.）、黑曲霉（Aspergillus niguer）或伯克霍尔德氏菌（Burkholderia sp.）所产脂肪酶中的至少一种。
根据本发明所述的固定化脂肪酶，其中，所述强碱性离子交换树脂具有氨基交换基团。
根据本发明所述的固定化脂肪酶，其中，所述强碱性离子交换树脂是季铵型强碱性阴离子交换树脂。
根据本发明所述的固定化脂肪酶，其中，以摩尔比计，所述强碱性离子交换树脂的氨基交换基团与所述脂肪酸盐的量之比为1:0.08～1:1.4。
根据本发明所述的固定化脂肪酶，其中，以摩尔比计，所述强碱性离子交换树脂的氨基交换基团与所述脂肪酸盐的量之比为1:0.1～1:0.6。
根据本发明所述的固定化脂肪酶，其中，以摩尔比计，所述强碱性离子交换树脂的氨基交换基团与所述脂肪酸盐的量之比为1:0.11～1:0.3。
根据本发明所述的固定化脂肪酶，其中，所述强碱性离子交换树脂的交换容量为0.5～4mmol/g。
根据本发明所述的固定化脂肪酶，其中，所述强碱性离子交换树脂的交换容量为1.2～3.6mmol/g。
根据本发明所述的固定化脂肪酶，其中，所述强碱性离子交换树脂是进行了预处理的强碱性离子交换树脂。
根据本发明所述的固定化脂肪酶，其中，所述预处理通过用酸液和碱液交替处理后，水洗至中性。
根据本发明所述的固定化脂肪酶，其中，所述酸液为0.2～1.0mol/L的HCl，所述碱液为0.2～1.0mol/L的NaOH。
根据本发明所述的固定化脂肪酶，其中，用酸液和碱液交替处理2～5次。
根据本发明所述的固定化脂肪酶，其中，以重量计，所述酸液和碱液的用量分别是所述强碱性离子交换树脂量的2～5倍量。
根据本发明所述的固定化脂肪酶，其中，还包含保护剂。
根据本发明所述的固定化脂肪酶，其中，所述保护剂选自山梨醇、丙二醇或甘油中的至少一种。
根据本发明所述的固定化脂肪酶，其中，以所述的固定化脂肪酶总重量计，所述保护剂的含量为0～20％。
根据本发明所述的固定化脂肪酶，其中，以所述的固定化脂肪酶总重量计，所述保护剂的含量为5～10％。
本发明的另外一个目的是提供酯化方法，其特征在于使用通过上述的固定化酶的制备方法制备得到的固定化酶或上述的固定化酶的进行酯化。
发明效果
本发明与现有技术相比，通过离子交换作用形成间隔臂，通过静电吸附，疏水作用等分子间力对脂肪酶的微环境进行调整，从而改变脂肪酶的性质，提高了脂肪酶的专一性和酯交换活力及酯化活力，在工业上具有极高的可操作性。
具体实施方式
固定化脂肪酶的制备方法
本发明的固定化脂肪酶的制备方法，包括：
（1）将强碱性离子交换树脂与脂肪酸盐溶液和脂肪酶溶液接触，获得混合液；
（2）将上述步骤（1）所得混合液进行干燥。
在本发明的优选实施方式中，所述脂肪酸盐选自碳原子数6～20的脂肪酸的盐中的至少一种，优选所述脂肪酸盐选自碳原子数6～18的脂肪酸的盐中的至少一种，进一步优选所述脂肪酸盐选自己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、油酸、硬脂酸、棕榈酸盐或软脂酸盐中的至少一种，更加优选所述脂肪酸盐选自辛酸、月桂酸、油酸或硬脂酸的盐中的至少一种。
在本发明的优选实施方式中，所述脂肪酸盐选自碱金属盐中的至少一种，所述碱金属盐选自锂盐、钠盐或钾盐中的至少一种。
在本发明的优选实施方式中，所述脂肪酸盐溶液的浓度为0.01～0.1g/ml，优选为0.015～0.08g/ml，更优选为0.02～0.05g/ml。在本发明的具体实施方式中，所述脂肪酸盐溶液的浓度为0.02g/ml、0.025g/ml、0.036g/ml或0.038g/ml。
在本发明的优选实施方式中，相对于100重量份强碱性离子交换树脂，所述脂肪酸盐的量为0.1～100重量份，优选为1～50重量份，进一步优选为2～10重量份，更加优选为2.5～5重量份。在本发明的具体实施方式中，相对于100重量份强碱性离子交换树脂，所述脂肪酸盐的量为2.5重量份、3重量份、3.75重量份、4.5重量份或4.75重量份。
在本发明的优选实施方式中，所述脂肪酶溶液的量与所述强碱性离子交换树脂的量之比以ml/g计，即脂肪酶溶液的体积/强碱性离子交换树脂的重量之比为0.5～2，优选为1～1.5。在本发明的具体实施方式中，所述脂肪酶溶液的量与所述强碱性离子交换树脂的量之比以ml/g计，即脂肪酶溶液的体积/强碱性离子交换树脂的重量之比为1.25。
在本发明的优选实施方式中，所述脂肪酶选自由疏棉状嗜热丝孢菌（Thermomyces lanuginose）、米黑根毛霉 （Rhizomucor miehei）、米黑毛霉 （Mucor miehei）、假单胞菌（Pseudomonas sp.）、根霉（Rhizopus sp.）、青霉（Penicillium sp.）、黑曲霉（Aspergillus niguer）或伯克霍尔德氏菌（Burkholderia sp.）所产脂肪酶中的至少一种。本发明的脂肪酶溶液可以是市售脂肪酶溶液不经过任何处理，也可以由脂肪酶粉复溶而得。本发明的脂肪酶溶液可以是商品来源的脂肪酶液，例如诺维信公司的lipozyme TL 100L，palatase20000L，可以是此菌株在合适的培养条件下发酵而得，也可以是通过基因工程，蛋白质工程等现代生物学手段改造而得，包括化学修饰的酶，蛋白质工程的突变体或基因工程菌产生的酶。
在本发明的优选实施方式中，所述强碱性离子交换树脂具有氨基交换基团。优选所述强碱性离子交换树脂是季铵型强碱性阴离子交换树脂。进一步地所述强碱性离子交换树脂选自聚苯乙烯型强碱性阴离子交换树脂、丙烯酸型强碱性阴离子交换树脂或酚醛型强碱性阴离子交换树脂中的至少一种。特别优选聚苯乙烯型强碱性阴离子交换树脂或丙烯酸型强碱性阴离子交换树脂中的至少一种。
在本发明的优选实施方式中，以摩尔比计，所述强碱性离子交换树脂的氨基交换基团与所述脂肪酸盐的量之比为1:0.08～1:1.4，优选为1:0.1～1:0.6，更优选为1:0.11～1:0.3。
在本发明的具体实施方式中，以摩尔比计，所述强碱性离子交换树脂的氨基交换基团与所述脂肪酸盐的量之比为1:0.1、1:0.11、1:0.14、1:0.15。
在本发明的优选实施方式中，所述强碱性离子交换树脂的交换容量为0.5～5mmol/g，优选所述强碱性离子交换树脂的交换容量为2～4mmol/g。
在本发明的优选实施方式中，所述强碱性离子交换树脂在使用之前进行预处理。所述预处理通过用酸液和碱液交替处理后，水洗至中性。所述酸液为0.2～1.0mol/L的HCl，所述碱液为0.2～1.0mol/L的NaOH。所述预处理中用酸液和碱液交替处理2～5次。所述预处理中以重量计，所述酸液和碱液的用量分别是所述强碱性离子交换树脂量的2～5倍量。在本发明的具体实施方式中，处理方法为用3倍树脂体积的碱液浸泡搅拌载体2h，然后滤除碱液将载体洗至中性，加入3倍树脂体积的酸液浸泡搅拌载体2 h，滤除酸液将载体洗至中性，重复2遍以上，最后一遍用3倍树脂体积的碱液处理。
在本发明的优选实施方式中，还添加保护剂。所述保护剂选自山梨醇、丙二醇或甘油中的至少一种。
在本发明中将强碱性离子交换树脂与脂肪酸盐溶液和脂肪酶溶液接触，只要将上述成分充分接触，使得各成分均匀混合即可。
均匀混合后进行固定化。固定化的方法没有特别的限定，例如固定化时间为1～24h，优选2～6 h。温度为10～60℃，优选30～50℃。在本发明的具体实施方式中，所述固定化在100～300rpm（例如150rpm）下20～30℃（例如25℃）下振荡2～8小时（例如4小时）。
在本发明中，可以通过常规手段进行干燥，例如自然干燥、真空干燥等。以最终产品总重量计，干燥至水分含量2～20%，例如干燥至水分含量为10%。
通过本发明固定化脂肪酶的制备方法制备的固定化酶可以合适地应用在油脂改性中，如酯酯交换，酯化，酸解反应中。
固定化脂肪酶
本发明的固定化脂肪酶，其包含强碱性离子交换树脂、脂肪酶、脂肪酸盐和水，其中，以重量比计，强碱性离子交换树脂为50～95%，脂肪酶2～10%，脂肪酸盐0.001～5%，水为2～20%，其中酶的量以酶蛋白计，优选以重量比计，强碱性离子交换树脂为65～85%，脂肪酶3～5%，脂肪酸盐0.002～1%，水为8～12%，其中酶的量以酶蛋白计。
在本发明的优选实施方式中，所述脂肪酸盐选自碳原子数6～20的脂肪酸的盐中的至少一种，优选所述脂肪酸盐选自碳原子数6～18的脂肪酸的盐中的至少一种，进一步优选所述脂肪酸盐选自己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、油酸、硬脂酸、棕榈酸盐或软脂酸盐中的至少一种，更加优选所述脂肪酸盐选自辛酸、月桂酸、油酸或硬脂酸的盐中的至少一种。
在本发明的优选实施方式中，所述脂肪酸盐选自碱金属盐中的至少一种，所述碱金属盐选自锂盐、钠盐或钾盐中的至少一种。
在本发明的优选实施方式中，所述脂肪酶选自由疏棉状嗜热丝孢菌（Thermomyces lanuginose）、米黑根毛霉 （Rhizomucor miehei）、米黑毛霉 （Mucor miehei）、假单胞菌（Pseudomonas sp.）、根霉（Rhizopus sp.）、青霉（Penicillium sp.）、黑曲霉（Aspergillus niguer）或伯克霍尔德氏菌（Burkholderia sp.）所产脂肪酶中的至少一种。
在本发明的优选实施方式中，所述强碱性离子交换树脂具有氨基交换基团，优选所述强碱性离子交换树脂是季铵型强碱性阴离子交换树脂，进一步地所述强碱性离子交换树脂选自聚苯乙烯型强碱性阴离子交换树脂、丙烯酸型强碱性阴离子交换树脂或酚醛型强碱性阴离子交换树脂中的至少一种。特别优选聚苯乙烯型强碱性阴离子交换树脂或丙烯酸型强碱性阴离子交换树脂中的至少一种。
在本发明的优选实施方式中，以摩尔比计，所述强碱性离子交换树脂的氨基交换基团与所述脂肪酸盐的量之比为1:0.08～1:1.4，优选为1:0.1～1:0.6，更优选为1:0.11～1:0.3。
在本发明的具体实施方式中，以摩尔比计，所述强碱性离子交换树脂的氨基交换基团与所述脂肪酸盐的量之比为1:0.1、1:0.11、1:0.14、1:0.15。
在本发明的优选实施方式中，所述强碱性离子交换树脂的交换容量为0.5～5mmol/g，优选所述强碱性离子交换树脂的交换容量为2～4mmol/g。
在本发明的优选实施方式中，所述强碱性离子交换树脂是进行了预处理强碱性离子交换树脂。所述预处理通过用酸液和碱液交替处理后，水洗至中性。所述酸液为0.2～1.0mol/L的HCl，所述碱液为0.2～1.0mol/L的NaOH。所述预处理中用酸液和碱液交替处理2～5次。所述预处理中以重量计，所述酸液和碱液的用量分别是所述强碱性离子交换树脂量的2～5倍量。在本发明的具体实施方式中，处理方法为用3倍树脂体积的碱液浸泡搅拌载体2h，然后滤除碱液将载体洗至中性，加入3倍树脂体积的酸液浸泡搅拌载体2 h，滤除酸液将载体洗至中性，重复2遍以上，最后一遍用3倍树脂体积的碱液处理。
在本发明的优选实施方式中，所述的固定化脂肪酶还包含保护剂。所述保护剂选自山梨醇、丙二醇或甘油中的至少一种。以所述的固定化脂肪酶总重量计，所述保护剂的含量为0～20％，优选以所述的固定化脂肪酶总重量计，所述保护剂的含量为5～10％。
本发明的固定化酶可以通过上述本发明的固定化酶的制备方法进行制备。
酯化方法
本发明的另一个目的是提供酯化方法，其特征在于使用上述的固定化酶或通过上述的固定化酶的制备方法制备得到的固定化酶进行酯化。
本发明中所述酯化方法包括下述的酯化方法，还包括酯交换方法。
本发明的酯化方法使用上述固定化酶按照常规的酯化方法或酯交换方法进行。可以将本发明的固定化酶与待酯化原料或底物进行接触来进行酯化。
待酯化原料或底物可以是油脂。所述油脂可以是植物源油或动物源油。所述植物源油选自稻米油、葵花籽油、菜油、棕榈油、棕榈仁油、花生油、菜籽油、大豆油、棉籽油、红花籽油、紫苏籽油、茶籽油、橄榄油、可可豆油、乌桕籽油、扁桃仁油、杏仁油、油桐籽油、橡胶籽油、玉米油、小麦胚油、芝麻籽油、蓖麻籽油、月见草籽油、榛子油、南瓜籽油、胡桃油、葡萄籽油、玻璃苣籽油、沙棘籽油、番茄籽油、澳洲坚果油、椰子油、可可脂、藻类油等中的至少一种。所述动物源油是深海鱼油，例如三文鱼油、沙丁鱼油等。
固定化酶与待酯化原料或底物的比例，以重量比例计，例如为0.1～10：1～100，优选0.5～8：5～50，更优选1～5：8～20。在本发明的具体实施方式中，固定化酶与待酯化原料或底物的比例，以重量比例计，例如是1：9.33、1：10、1：15。
所述酯化反应可以是脂肪酸与醇及醇的酯化物（如甘油一酯、甘油二酯）的酯化，包括油脂脱酸、生物柴油合成等。所述脂肪酸可以是纯脂肪酸也可以是含有脂肪酸的下述油脂或脂肪酸酯。所述醇可以是纯的醇也可以是含有醇的下述油脂或脂肪酸酯。
所述油脂可以是植物源油或动物源油。所述植物源油选自稻米油、葵花籽油、菜油、棕榈油、棕榈仁油、花生油、菜籽油、大豆油、棉籽油、红花籽油、紫苏籽油、茶籽油、棕榈果油、橄榄油、可可豆油、乌桕籽油、扁桃仁油、杏仁油、油桐籽油、橡胶籽油、玉米油、小麦胚油、芝麻籽油、蓖麻籽油、月见草籽油、榛子油、南瓜籽油、胡桃油、葡萄籽油、玻璃苣籽油、沙棘籽油、番茄籽油、澳洲坚果油、椰子油、可可脂、藻类油等中的至少一种，优选选自大豆油、玉米油、菜油、葵花籽油、稻米油或棕榈油中的至少一种油。所述动物源油是深海鱼油，例如三文鱼油、沙丁鱼油等。
所述油脂可以是毛油，也可以是进行了脱胶和/或脱蜡的油脂。
所述脂肪酸可以是至少一种碳原子数1～30的直链或支链、饱和或不饱和脂肪酸。优选选自碳原子数8～22的饱和或不饱和脂肪酸中的至少一种，可以举出辛酸、壬酸、癸酸、月桂酸、豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、棕榈油酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、十八碳四烯酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸等。
所述醇可以是至少一种碳原子数1～30的直连或支链、饱和或不饱和醇。优选甲醇、乙醇、丙二醇、甘油、赤藓糖醇。所述醇可以是未经过酯化的醇，也可以是其中的1个或以上的羟基被酯化得到的醇酯化物（不包括醇的全部羟基被酯化的酯化物）。例如，丙二醇单酯、甘油一酯、甘油二酯、赤藓糖醇一酯、赤藓糖醇二酯、赤藓糖醇三酯等。
所述醇的酯化物可以是上述本发明的醇的碳原子数1～20的烷基酯、碳原子数2～20的烯基酯、碳原子数6～20的芳基酯、碳原子数7～20的芳烷基酯等。
所述烷基酯可以举出甲酯、乙酯、丙酯、丁酯、戊酯、己酯、庚酯、辛酯、壬酯、癸酯、十一烷基酯、十二烷基酯、十六烷基酯、十八烷基酯等。所述烯基酯可以举出乙烯酯、丙烯酯、丁烯酯、戊烯酯、己烯酯、庚烯酯、辛烯酯、壬烯酯、癸烯酯、十一烯基酯、十二烯基酯、十六烯基酯、十八烯基酯等。所述芳基酯可以举出苯基酯、萘基酯等。所述芳烷基酯可以举出苄基酯等。优选甲酯或乙酯。
本发明所述脂肪酸酯可以为上述脂肪酸和上述醇的酯化物。在本发明的优选实施方式中，所述脂肪酸酯是所述脂肪酸的甲酯或乙酯。
上述底物包括反应体系中的脂肪酸、醇、油脂、脂肪酸酯。
酯化反应温度没有特别限定，只要能够充分酯化、实现本发明的目的即可，例如为20～80℃（例如70℃）。酯化反应时间没有特别限定，只要能够充分酯化、实现本发明的目的即可，例如为10分钟～10小时，优选20分钟～8小时，更优选30分钟～5小时。
上述本发明的固定化酶具有提高的专一性，特别是用于上述酯化反应或酯交换反应中，可以提高专一性。通过2位p（棕榈酸）的插入率来表示专一性的提高率，2位p的插入率是甘油三酯第二位置中的棕榈酸含量占甘油三酯总棕榈酸含量的百分比，反映的是棕榈酸在甘油三酯结构的分布情况，如果按实施例中的反应来看，2位棕榈酸含量越高，证明酶的专一性越强。2位p的插入率计算公式为式（1）。
P% in Sn-2= Sn-2 P/3×（FAC P）×100% （1）
式中，FAC（脂肪酸组成）分析方法参照国标GB/T 17376，GB/T 17377-2008表示分析，Sn-2分析参照国标GB/T 24894-2010。
通过使用本发明的固定化酶与对比固定化酶（例如未加入脂肪酸盐处理）相比，通过式（1）表示的2位p的插入率提高了10％～40％。
通过使用本发明的固定化酶，可以提高酶的酯化能力。酯化能力用下述式（2）所述的酯化率表示。
酯化率%=AV（反应前）-AV（反应后）/AV（反应前）×100% （2）
上式中：AV（反应前）为酯化前酸价；AV（反应后）为酯化反应后酸价。
通过使用本发明的固定化酶相比，酯化能力提高了5％～150％。通过使用本发明的固定化酶与对比固定化酶（例如未加入脂肪酸盐处理）相比，酯化能力提高了5％～150％。
通过使用本发明的固定化酶，可以提高酶的酯化活力。具体地可以提高产物的C32～C46含量比对比例提高至少10%。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。
本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例
实施例1～9为制备实施例，其中强碱性离子交换树脂的交换容量分别为：NKX-8：2.0mmol/g，D290：3.4mmol/g，D296：3.6 mmol/g，D392：2.8mmol/g。
参考例1
载体处理，将下述比较例和实施例中的强碱性离子交换树脂，用0.5 mol/L HCl溶液和0.5 mol/L NaOH溶液以3倍树脂体积量交替处理两遍，然后水洗至中性备用。
对比例1
将商品TL（Thermomyces Linugonious）脂肪酶液(酶蛋白含量为2%，诺维信公司，商品名为palatase 20000L）10 ml，放入含有8 g经过上述参考例1处理好的载体NKX-8（丙烯酸型强碱阴离子交换树脂，天津南开合成科技有限公司）的150 ml三角瓶中，在150 rpm，25℃ 振荡 4h，测上清蛋白浓度，抽滤，将固体部分真空干燥至水分含量10%， 编号为酶1。
对比例2
将甲酸钠（国药试剂）配成0.01 g/ml的溶液，取10 ml加入商品TL（Thermomyces Linugonious）脂肪酶液(酶蛋白含量为2%，诺维信公司，商品名为palatase 20000L）10 ml中，同时放入含有8 g处理好的载体NKX-8（苯乙烯强碱阴离子交换树脂，天津南开合成科技有限公司）的150 ml三角瓶中，在150 rpm，25℃ 振荡 4 h，测上清蛋白浓度，抽滤，将固体部分真空干燥至水分含量10%。编号为酶2。载体功能基（氨基）与甲酸钠摩尔量之比为1:0.18。
对比例3
将乙酸钠（国药试剂）配成0.01 g/ml的溶液，取10 ml加入商品TL（Thermomyces Linugonious）脂肪酶液（酶蛋白含量为2%，诺维信公司，商品名为palatase 20000L）10 ml中，同时放入含有8 g处理好的载体NKX-8（聚苯乙烯强碱阴离子交换树脂，天津南开合成科技有限公司）的150 ml三角瓶中，在150 rpm，25℃ 振荡 4 h，测上清蛋白浓度，抽滤，将固体部分真空干燥至水分含量10%。编号为酶3。载体功能基（氨基）与乙酸钠摩尔量之比为1:0.15。
实施例1
将辛酸钠（国药试剂）配成0.02 g/ml的溶液，取12 ml加入商品TL（ThermomycesLinugonious）脂肪酶液（酶蛋白含量为2%，诺维信公司，商品名为palatase 20000L）10 ml中，同时放入含有8 g经过上述参考例1处理好的载体NKX-8（聚苯乙烯型强碱阴离子交换树脂，天津南开合成科技有限公司）的150 ml三角瓶中，在150 rpm，25℃ 振荡 4 h，测上清蛋白浓度，抽滤，将固体部分真空干燥至水分含量10%。编号为酶4。载体功能基（氨基）与辛酸钠摩尔量之比为1:0.18。
实施例2
将月桂酸钠（国药试剂）配成0.025 g/ml的溶液，取12 ml加入商品TL（Thermomyces Linugonious）脂肪酶液（酶蛋白含量为2%，诺维信公司，商品名为palatase20000L）10 ml中，同时放入含有8 g经过上述参考例1处理好的载体D290（聚苯乙烯型强碱阴离子交换树脂，天津南开合成科技有限公司）的150 ml三角瓶中，在150 rpm，25℃ 振荡4 h，测上清蛋白浓度，抽滤，将固体部分真空干燥至水分含量10%。编号为酶5。载体功能基（氨基）与月桂酸钠摩尔量之比为1:0.1。
实施例3
将油酸钠（国药试剂）配成0.036 g/ml的溶液，取10 ml加入商品TL（ThermomycesLinugonious）脂肪酶液（酶蛋白含量为2%，诺维信公司，商品名为palatase 20000L）10 ml中，同时放入含有8 g经过上述参考例1处理好的载体D296（聚苯乙烯型强碱阴离子交换树脂，天津南开合成科技有限公司）的150 ml三角瓶中，在150rpm，25℃ 振荡 4h，测上清蛋白浓度，抽滤，将固体部分真空干燥至水分含量10%。编号为酶6。载体功能基（氨基）与油酸钠摩尔量之比为1:0.1。
实施例4
将硬脂酸钠（国药试剂）配成0.038 g/ml的溶液，取10 ml加入商品TL（Thermomyces Linugonious）脂肪酶液（酶蛋白含量为2%，诺维信公司，商品名为palatase20000L）10 ml中，同时放入含有8 g经过上述参考例1处理好的载体NKX-8（丙烯酸型强碱阴离子交换树脂，天津南开合成科技有限公司）的150 ml三角瓶中，在150 rpm，25℃ 振荡 4h，测上清蛋白浓度，抽滤，将固体部分真空干燥至水分含量10%。编号为酶7。载体功能基（氨基）与硬脂酸钠摩尔量之比为1:0.15。
实施例5
将辛酸钾（国药试剂）配成0.02 g/ml的溶液，取10 ml加入商品TL（ThermomycesLinugonious）脂肪酶液（酶蛋白含量为2%，诺维信公司，商品名为palatase 20000L）10 ml中，同时放入含有8 g经过上述参考例1处理好的载体NKX-8（丙烯酸型强碱阴离子交换树脂，天津南开合成科技有限公司）的150 ml三角瓶中，在150 rpm，25℃ 振荡 4 h，测上清蛋白浓度，抽滤，将固体部分真空干燥至水分含量10%。编号为酶8。载体功能基（氨基）与辛酸钾摩尔量之比为1:0.14。
实施例6
将辛酸钠（国药试剂）配成0.02 g/ml的溶液，取10 ml加入商品RM（Rhizomucormiehei）脂肪酶液（酶蛋白含量为2%，诺维信公司产，商品名为palatase 20000L）10 ml中，同时放入含有8 g经过上述参考例1处理好的载体NKX-8（丙烯酸型强碱阴离子交换树脂，天津南开合成科技有限公司）的150 ml三角瓶中，在150 rpm，25℃ 振荡 4 h，测上清蛋白浓度，抽滤，将固体部分真空干燥至水分含量10%。编号为酶9。载体功能基（氨基）与辛酸钠摩尔量之比为1:0.15。
实施例7
将辛酸钠（国药试剂）配成0.02 g/ml的溶液，取10 ml加入商品Amano 50（Penicillium sp.）脂肪酶液（酶蛋白含量为2%，天野公司）10 ml中，同时放入含有8 g经过上述参考例1处理好的载体NKX-8（丙烯酸型强碱阴离子交换树脂，天津南开合成科技有限公司）的150 ml三角瓶中，在150 rpm，25℃ 振荡 4 h，测上清蛋白浓度，抽滤，将固体部分真空干燥至水分含量10%。编号为酶10。载体功能基（氨基）与辛酸钠摩尔量之比为1:0.15。
实施例8
将辛酸钠（国药试剂）配成0.02 g/ml的溶液，取10 ml加入商品TL（Thermomyces Linugonious）脂肪酶液（酶蛋白含量为2%，诺维信公司，商品名为palatase 20000L）10 ml中，同时放入含有8 g经过上述参考例1处理好的载体NKX-8（丙烯酸型强碱阴离子交换树脂，天津南开合成科技有限公司）的150 ml三角瓶中，在150 rpm，25℃ 振荡 4 h，测上清蛋白浓度，抽滤，将固体部分真空干燥至水分含量10%。编号为酶11。载体功能基（氨基）与辛酸钠摩尔量之比为1:0.15。
实施例9
将辛酸钠（国药试剂）配成0.02 g/ml的溶液，取10 ml加入商品TL（Thermomyces Linugonious）脂肪酶液（酶蛋白含量为2%，诺维信公司，商品名为palatase 20000L）10 ml中，同时放入含有8 g处理好的载体D392（聚苯乙烯弱碱阴离子交换树脂，沧州宝恩化工有限公司）的150 ml三角瓶中，在150 rpm，25℃ 振荡 4 h，测上清蛋白浓度，抽滤，将固体部分真空干燥至水分含量10%。编号为酶12。载体功能基（氨基）与辛酸钠摩尔量之比为1:0.11。
表1
| 载体量 | 脂肪酶量 | 脂肪酸盐量 | |
| 对比例1 | 4 | 0.2 | -- |
| 对比例2 | 4 | 0.2 | 0.1 |
| 对比例3 | 4 | 0.2 | 0.1 |
| 实施例1 | 4 | 0.24 | 0.24 |
| 实施例2 | 4 | 0.24 | 0.3 |
| 实施例3 | 4 | 0.2 | 0.36 |
| 实施例4 | 4 | 0.2 | 0.38 |
| 实施例5 | 4 | 0.2 | 0.2 |
| 实施例6 | 4 | 0.2 | 0.2 |
| 实施例7 | 4 | 0.2 | 0.2 |
| 实施例8 | 4 | 0.2 | 0.2 |
| 实施例9 | 4 | 0.2 | 0.2 |
上述各个酶的固定化率结果参见表2。
表2固定化率
| 固定化率 | 酶1 | 酶2 | 酶3 | 酶4 | 酶5 | 酶6 | 酶7 | 酶8 | 酶9 | 酶10 | 酶11 | 酶12 |
| % | 97 | 99 | 98 | 99 | 100 | 99 | 100 | 98 | 100 | 99 | 99 | 98 |
固定化率%= （酶液蛋白浓度－固定化后上清蛋白浓度）/酶液蛋白浓度×100%。
专一性考察
实施例10（本实施例为考察脂肪酶专一性方法）
10 g三棕榈酸甘油酯（嘉里特种油脂公司）和20 g油酸（嘉里特种油脂公司）加入250 ml三角瓶中，分别加入2 g 待测固定化酶，于65 ℃，150 rpm反应3.5 h。反应完毕后取出产物重新放入底物进行反应。一共进行5批。
反应完毕后，用气相进行FAC，Sn-2和TAG分析。2位p(棕榈酸)的插入率计算公式为P% in Sn-2= Sn-2 P/3×（FAC P）×100%。结果参见表3。
表3酸解反应中p在Sn-2位的插入率%
P在Sn-2的插入率可反映脂肪酶的专一性。插入率在40%以上可认为该酶在该反应中具有专一性。从上述实验结果可以看出，经过加脂肪酸盐处理的脂肪酶，经过多批次酯化反应之后，P在Sn-2的插入率仍然在40%以上，其专一性相比不加处理的固定化酶有了较大幅度的提高。
酯化能力考察
实施例11（本实施例为考察酶的酯化能力）
分别向100 ml单口圆底烧瓶中加入28 g油酸（国药集团），3 g上述酶，置于磁力搅拌器上50 ℃，250 rpm加热。乙醇4.8 g，反应完毕后取出产物TLC-FID分析其甲酯含量。 反应完毕取出产物重新放入底物进行反应。一共进行6批。酯化活力用下述的酯化率进行评价，结果参见表4。
酯化率%=AV（反应前）-AV（反应后）/AV（反应前）×100%
上式中：AV（反应前）为酯化前酸价；AV（反应后）为酯化反应后酸价。
表4 酯化反应的酯化率
从上述实验结果可以看出，未加脂肪酸盐处理的脂肪酶，酯化能力较差，经过脂肪酸盐处理的载体进行酶的固定化处理后，酯化性能和稳定性能有了较大幅度的提高。
酯交换活力考察
实施例12（本实施例为考察酶的酯交换活力）
称取2 g三油酸甘油酯（嘉里食品工业公司）和2 g MCT（中链甘油三酯，嘉里食品工业公司）于25 mL反应瓶中，加酶量为10%，反应温度60℃，反应时间为6 h，250 rpm。反应完毕取出产物重新放入底物进行反应。一共进行5批。
底物指标
表5 底物甘三酯中总碳数的百分含量%
酯交换实验结果
表6酯交换产物中C32～C48甘三酯气相分析中含量的结果（百分含量%）
该反应是利用中链甘三酯和长链甘三酯进行酯酯交换，产物为碳数在32～46之间的中长链甘三酯混合物。如果酶活较高，则产物中C32～46的含量越高。上述数据可以看出，经处理的固定化酶催化三油酸和MCT进行酯酯交换，产物的C32～C46含量比对比例提高至少10%，证明通过脂肪酸盐处理的固定化酶酯交换活力相比有了较大幅度的提高。
本发明的实施例中的反应物和催化剂均可来自市售。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。
Claims (43)
1.一种固定化脂肪酶的制备方法，包括：
（1）将强碱性离子交换树脂与脂肪酸盐溶液和脂肪酶溶液接触，获得混合液；
（2）将上述步骤（1）所得混合液进行干燥，
相对于100重量份强碱性离子交换树脂，所述脂肪酸盐的量为2.5～5重量份，
所述脂肪酶溶液的量与所述强碱性离子交换树脂的量之比以ml/g计，即脂肪酶溶液的体积/强碱性离子交换树脂的重量之比为0.5～2，
所述脂肪酸盐选自己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、油酸、硬脂酸、棕榈酸盐或软脂酸盐的盐中的至少一种，
所述脂肪酸盐选自钾盐或钠盐中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶的制备方法，其中所述脂肪酸盐选自辛酸、月桂酸、油酸或硬脂酸的盐中的至少一种。
3.根据权利要求1或2所述的固定化脂肪酶的制备方法，其中所述脂肪酸盐溶液的浓度为0.01～0.1g/ml。
4.根据权利要求1或2所述的固定化脂肪酶的制备方法，其中所述脂肪酸盐溶液的浓度为0.015～0.08g/ml。
5.根据权利要求1或2所述的固定化脂肪酶的制备方法，其中所述脂肪酸盐溶液的浓度为0.02～0.05g/ml。
6.根据权利要求1或2所述的固定化脂肪酶的制备方法，其中，所述脂肪酶溶液的量与所述强碱性离子交换树脂的量之比以ml/g计，即脂肪酶溶液的体积/强碱性离子交换树脂的重量之比为1～1.5。
7.根据权利要求1或2所述的固定化脂肪酶的制备方法，其中，所述脂肪酶选自由疏棉状嗜热丝孢菌（Thermomyces lanuginose）、米黑根毛霉 （Rhizomucor miehei）、米黑毛霉（Mucor miehei）、假单胞菌 （Pseudomonas sp.）、根霉（Rhizopus sp.）、青霉（Penicillium sp.）、黑曲霉（Aspergillus niguer）或伯克霍尔德氏菌（Burkholderia sp.）所产脂肪酶中的至少一种。
8.根据权利要求1或2所述的固定化脂肪酶的制备方法，其中，所述强碱性离子交换树脂具有氨基交换基团。
9.根据权利要求1或2所述的固定化脂肪酶的制备方法，其中，所述强碱性离子交换树脂是季铵型强碱性阴离子交换树脂。
10.根据权利要求8所述的固定化脂肪酶的制备方法，其中，以摩尔比计，所述强碱性离子交换树脂的氨基交换基团与所述脂肪酸盐的量之比为1:0.1～1:1.4。
11.根据权利要求8所述的固定化脂肪酶的制备方法，其中，以摩尔比计，所述强碱性离子交换树脂的氨基交换基团与所述脂肪酸盐的量之比为1:0.2～1:0.6。
12.根据权利要求1或2所述的固定化脂肪酶的制备方法，其中，所述强碱性离子交换树脂的交换容量为0.5～4mmol/g。
13.根据权利要求1或2所述的固定化脂肪酶的制备方法，其中，所述强碱性离子交换树脂的交换容量为1.2～3.6mmol/g。
14.根据权利要求1或2所述的固定化脂肪酶的制备方法，其中，所述强碱性离子交换树脂在使用之前进行预处理。
15.根据权利要求14所述的固定化脂肪酶的制备方法，其中，所述预处理通过用酸液和碱液交替处理后，水洗至中性。
16.根据权利要求15所述的固定化脂肪酶的制备方法，其中，所述酸液为0.2～1.0mol/L的HCl，所述碱液为0.2～1.0mol/L的NaOH。
17.根据权利要求15所述的固定化脂肪酶的制备方法，其中，用酸液和碱液交替处理2～5次。
18.根据权利要求15所述的固定化脂肪酶的制备方法，其中，以重量计，所述酸液和碱液的用量分别是所述强碱性离子交换树脂量的2～5倍量。
19.根据权利要求1或2所述的固定化脂肪酶的制备方法，其中，还添加保护剂。
20.根据权利要求19所述的固定化脂肪酶的制备方法，其中，所述保护剂选自山梨醇、丙二醇或甘油中的至少一种。
21.根据权利要求1或2所述的固定化脂肪酶的制备方法，其中，以最终产品总重量计，干燥至水分含量2～20%。
22.根据权利要求1或2所述的固定化脂肪酶的制备方法，其中，所述强碱性离子交换树脂选自聚苯乙烯型、丙烯酸型、酚醛型中的至少一种。
23.根据权利要求1或2所述的固定化脂肪酶的制备方法，其中，所述强碱性离子交换树脂选自聚苯乙烯型、丙烯酸型中的至少一种。
24.一种固定化脂肪酶，其通过权利要求1～23中任意一项所述的固定化脂肪酶的制备方法制备，所述固定化脂肪酶包含强碱性离子交换树脂、脂肪酶、脂肪酸盐和水，其中，以重量比计，强碱性离子交换树脂为50～95%，脂肪酶2～10%，脂肪酸盐0.001～5%，水为2～20%，其中酶的量以酶蛋白计，所述脂肪酸盐选自己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、油酸、硬脂酸、棕榈酸盐或软脂酸盐的盐中的至少一种，所述脂肪酸盐选自钠盐或钾盐中的至少一种。
25.根据权利要求24所述的固定化脂肪酶，其中以重量比计，强碱性离子交换树脂为65～85%，脂肪酶3～5%，脂肪酸盐0.002～1%，水为8～12%，其中酶的量以酶蛋白计。
26.根据权利要求24或25所述的固定化脂肪酶，其中所述脂肪酸盐选自辛酸、月桂酸、油酸或硬脂酸的盐中的至少一种。
27.根据权利要求24或25所述的固定化脂肪酶，其中，所述脂肪酶选自由疏棉状嗜热丝孢菌（Thermomyces lanuginose）、米黑根毛霉 （Rhizomucor miehei）、米黑毛霉 （Mucor miehei）、假单胞菌 （Pseudomonas sp.）、根霉（Rhizopus sp.）、青霉（Penicillium sp.）、黑曲霉（Aspergillus niguer）或伯克霍尔德氏菌（Burkholderia sp.）所产脂肪酶中的至少一种。
28.根据权利要求24或25所述的固定化脂肪酶，其中，所述强碱性离子交换树脂具有氨基交换基团。
29.根据权利要求24或25所述的固定化脂肪酶，其中，所述强碱性离子交换树脂是季铵型强碱性阴离子交换树脂。
30.根据权利要求28所述的固定化脂肪酶，其中，以摩尔比计，所述强碱性离子交换树脂的氨基交换基团与所述脂肪酸盐的量之比为1:0.1～1:1.4。
31.根据权利要求28所述的固定化脂肪酶，其中，以摩尔比计，所述强碱性离子交换树脂的氨基交换基团与所述脂肪酸盐的量之比为1:0.2～1:0.6。
32.根据权利要求24或25所述的固定化脂肪酶，其中，所述强碱性离子交换树脂的交换容量为0.5～2mmol/g。
33.根据权利要求24或25所述的固定化脂肪酶，其中，所述强碱性离子交换树脂的交换容量为0.8～1.2mmol/g。
34.根据权利要求24或25所述的固定化脂肪酶，其中，所述强碱性离子交换树脂是进行了预处理的强碱性离子交换树脂。
35.根据权利要求34所述的固定化脂肪酶，其中，所述预处理通过用酸液和碱液交替处理后，水洗至中性。
36.根据权利要求35所述的固定化脂肪酶，其中，所述酸液为0.2～1.0mol/L的HCl，所述碱液为0.2～1.0mol/L的NaOH。
37.根据权利要求35所述的固定化脂肪酶，其中，用酸液和碱液交替处理2～5次。
38.根据权利要求35所述的固定化脂肪酶，其中，以重量计，所述酸液和碱液的用量分别是所述强碱性离子交换树脂量的2～5倍量。
39.根据权利要求24或25所述的固定化脂肪酶，其中，还包含保护剂。
40.根据权利要求39所述的固定化脂肪酶，其中，所述保护剂选自山梨醇、丙二醇或甘油中的至少一种。
41.根据权利要求39所述的固定化脂肪酶，其中，以所述的固定化脂肪酶总重量计，所述保护剂的含量为0～20％。
42.根据权利要求39所述的固定化脂肪酶，其中，以所述的固定化脂肪酶总重量计，所述保护剂的含量为5～10％。
43.一种酯化方法，其特征在于使用通过权利要求1～23任意一项所述的固定化脂肪酶的制备方法制备得到的固定化脂肪酶或权利要求24～42任意一项所述的固定化脂肪酶的进行酯化。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |