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CN106859579A - 一种基于亚像素的光纤束共聚焦荧光内窥成像方法及装置 - Google Patents

一种基于亚像素的光纤束共聚焦荧光内窥成像方法及装置 Download PDF

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CN106859579A
CN106859579A CN201710057360.9A CN201710057360A CN106859579A CN 106859579 A CN106859579 A CN 106859579A CN 201710057360 A CN201710057360 A CN 201710057360A CN 106859579 A CN106859579 A CN 106859579A
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endoscopic imaging
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杨青
何悠悠
匡翠方
刘旭
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Zhejiang University ZJU
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Zhejiang University ZJU
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Abstract

本发明公开一种基于亚像素的光纤束共聚焦荧光内窥成像方法，包括：照明光依次耦合至光纤束内不同的单模光纤，由单模光纤出射并聚焦到样品上，收集样品产生的荧光并聚焦到与入射照明光相同的单模光纤内，采集荧光信号得到扫描样品的第一帧图像；然后，控制光纤束的近样品端至少移动一次，在每次移动后的位置处，照明光依次耦合至光纤束内不同的单模光纤，由单模光纤出射并聚焦到样品上，收集样品产生的荧光并聚焦到与入射照明光相同的单模光纤内，采集荧光信号得到扫描样品的第二帧图像；将每次位移后得到的第二帧图像与第一帧图像进行图像重建，得到最终的显微图像。本发明还公开一种基于亚像素的光纤束共聚焦荧光内窥成像装置。

Description

一种基于亚像素的光纤束共聚焦荧光内窥成像方法及装置
技术领域
本发明属于共聚焦显微内镜领域，特别涉及一种基于亚像素的光纤束共聚焦荧光内窥成像方法及装置。
背景技术
十几年前，光纤大部分的应用主要集中在通讯领域。之后光纤作为照明和探测器件逐渐被接受，也逐步被应用到扫描共聚焦系统中。因为光纤器件的灵活性，特种光纤逐渐被发明和生产，在一些场合逐步替代了传统光学器件，也产生了新的和独特的光学系统。这些新的光学器件也给活体内窥成像领域带来了新的进展和优势。
光纤式共聚焦内窥成像方式结合了激光共聚焦显微成像技术和内窥成像技术。既可以发挥光纤灵活性的优势，又保留了共聚焦显微镜高分辨率，高对比度和层析的特点。使用光纤束传递照明光和传输图像可以将扫描机制放置在光学系统的近端，基于光纤束的系统因为远端具有较小的尺寸，可以插入常规内镜的工作通道，在内镜检查过程中，借助荧光染色的手段，在体实时的给出被检查部位的结构信息。这些信息能够为疾病的诊断提供重要帮助，在组织活检和外科手术之前定位病变组织轮廓。
在传统的基于光纤束的共聚焦显微内镜装置(如图1所示)中，包括激光器1，第一滤光片2，二向分色镜3，双轴扫描振镜4，第一透镜5，第二透镜6，物镜7，光纤束8，显微物镜9，第二滤光片11，光电探测器12和计算机13。
采用图1所示的装置所实现的基于光纤束的共聚焦显微内镜，其过程如下：
(1)激光器1发出照明光，经第一滤光片2滤除杂散光后，被二向分色镜3和双轴扫描振镜4反射至扩束系统，扩束系统由第一透镜5和第二透镜6组成，然后被耦合物镜7耦合至光纤束8中的一根光纤中；
(2)从该根照明光纤出射的光经显微物镜9聚焦到荧光样品10上；
(3)激光照明荧光样品10后激发样品产生荧光，经过显微物镜9收集后聚焦到同一根照明光纤中，由该根光纤出射的荧光经过耦合物镜7、第二透镜6和第一透镜5，并由双轴扫描振镜4反射至二向分色镜3，荧光透过二向分色镜3，再经第二滤光片11滤光后滤除样品反射的激光及其他杂散光，仅使荧光出射，被光电探测器12收集；光电探测器12将光信号转变成电信号，并将电信号传送至计算机13，得到一个物点所对应的图像；
(4)计算机13控制双轴扫描振镜4将激发照明光耦合进光纤束8中不同的光纤中，所有的光纤均扫描完毕后，得到图像。
但在光纤式共聚焦内窥成像系统中，光纤束本身蜂窝状的排列会带给图像固有噪声。由于光纤的数量限制了像素点的数目，不足以满足奈奎斯特定律，因此得到的图像分辨率会在混叠效应的影响下降低，这种欠采样是成像系统中最常见的问题。光纤束将连续的图像进行了离散化处理，到成像面上每一个像素点只代表其附近的光强。两个像素点之间存在微小距离，在宏观上可以看作是连在一起的，但在微观上，它们之间还有无限的更小的东西存在，这个更小的东西称之为“亚像素(Sub-Pixel)”，如图2所示。这个问题的关键是在去除光纤束pattern时，改善图像质量，最小程度上模糊图像的细节。
发明内容
本发明提供了一种基于亚像素的光纤束共聚焦荧光内窥成像方法及装置，提出在基于光纤束的共聚焦显微内镜的基础上，利用双轴振镜实现对激光束的扫描，激光束在光纤的远端出射，通过远端微型透镜聚焦到样品上，同时在光纤束远端加入移动平台，增加对光纤束整体的移动，将每次移动后得到的图像做叠加和处理，从而得到高像素图像，提高分辨率，这种方法称为亚像素(Sub-Pixel)，可用于共聚焦显微内镜领域。
本发明利用亚像素(Sub-Pixel)这一概念，可以改善图像质量，得到高清的样品图像。相对于其他共聚焦显微内镜，该装置结构简单，便于操作，为活体内窥成像领域提供了良好的研究手段。
本发明的具体技术方案如下：
一种基于亚像素的光纤束共聚焦荧光内窥成像方法，包括：照明光依次耦合至光纤束内不同的单模光纤，由单模光纤出射并聚焦到样品上，收集样品产生的荧光并聚焦到与入射照明光相同的单模光纤内，采集荧光信号得到扫描样品的第一帧图像；
控制光纤束的近样品端至少移动一次，在每次移动后的位置处，照明光依次耦合至光纤束内不同的单模光纤，由单模光纤出射并聚焦到样品上，收集样品产生的荧光并聚焦到与入射照明光相同的单模光纤内，采集荧光信号得到扫描样品的第二帧图像；
将每次位移后得到的第二帧图像与第一帧图像进行图像重建，得到最终的显微图像。
进一步的，控制光纤束的近样品端在Z轴方向移动，对样品进行三维扫描。
本发明中，光纤束的近样品端移动的次数越多，得到第二帧图像的数量也就越多，更有利于得到高分辨率图像。进一步的，所述光纤束的近样品端移动的次数至少为2次，每次移动的位置各不相同；更进一步的，所述光纤束的近样品端移动的次数为2～36次。
本发明还提供了一种亚像素的光纤束共聚焦荧光内窥成像装置，针对荧光样品包括：
激光器，用于发出激发光，实现对荧光样品的照明激发；
双轴扫描振镜，用于实现对激光束的扫描，也就是将激发依次耦合进光纤束内不同的单模光纤中，完成对样品的二维平面扫描。
第一透镜，用于将激发照明光耦合进单根光纤中；
光纤束，由多根单模光纤组成，断面上的各单模光纤呈蜂窝状排列(如图4所示)，用于出射激发照明光并接收荧光信号；
第二透镜，用于激发照明光会聚到样品面上，收集荧光样品被激发后所发出的荧光；
二向分色镜，用于透射激发光以及激发光照射样品产生的后向散射光，反射样品激发出的荧光；
滤光片，用于滤除经样品面反射回来的激光，而仅使荧光样品发出的荧光通过参与成像；
第二透镜，用于将荧光样品发出的荧光会聚到光电探测器上；
可实现微小位移的移动平台，用于将光纤束整体进行移动，获取不同位置的多帧图像；优选的，所述的移动平台为受控于计算机的用于实现光纤束近样品端移动的压电移动平台或纳米平移台。
光电探测器，将探测针孔处探测到的光信号转换为电信号传送至计算机；
计算机，用于处理探测器的信号，同时控制双轴扫描振镜和微小位移移动平台，完成对样品的三维平面扫描。
本发明中，移动平台用于控制光纤束的近样品端，每次移动的位置各不相同，移动次数可根据需要进行设置。
上述光纤束共聚焦荧光内窥成像装置的具体实施步骤如下：
(1)激光器发出照明光束，经过一个二向色镜到达双轴扫描镜，然后通过一个透镜将其耦合进单根光纤中，激发光从光纤的另一端出射，经过微型透镜聚焦到荧光样品上，对样品进行激发；
(2)所述荧光样品被激发出荧光后，得到的荧光被微型透镜收集并耦合进同一根照明光纤，再通过光纤到达光纤束的近端经耦合物镜收集到达系统的主体部分，经二向色镜实现90度转向，实现和激发光的分离。然后经透镜聚焦并滤除杂散光后，被光电探测器接收；
(3)所述光电探测器将光信号转换为电信号并传给计算机，完成了对第一个扫描点图像信息的读入和处理；
(4)通过计算机控制双轴振镜实现对激光束的扫描，使样品完成二维平面的扫描，即得到第一帧图像；
(5)光纤束远端所在的压电移动平台与计算机相连，通过计算机控制光纤束整体移动一个微小位移后，重复扫描，得到不同位置的几帧图像，计算机将图像进行叠加处理后，得到最终图像；
(6)计算机控制压电移动平台使光纤束在Z轴方向移动，即可完成对样品的三维扫描。
本发明原理如下：
在通用的共聚焦显微内镜装置基础上，将激光发出的通过二向分色镜全部透射而出的照明光束耦合进一根单模光纤中，从该单模光纤出射的激发照明光经物镜聚焦到荧光样品表面发生全反射，激发样品发出荧光。激发出的荧光被收集并耦合进同一根照明光纤中，每根光纤收集到的荧光在光电探测器小孔处成像。双轴振镜控制激光束发生偏转，分别耦合进不同的单根光纤中，完成对样品的二维平面扫描。利用亚像素(Sub-Pixel)概念，通过移动微小距离采集不同位置的图像，得到光纤可以实现高分辨率图像重建。
在采集图像的过程中，由于欠采样，得到的第k帧图像每个像素点记录的信息与理想采样下每个像素点记录的信息存在这样的关系：
其中zr为理想采样下每个像素点记录的光强信息，N＝L1N1×L2N2为高分辨率图像尺寸；m＝1,2,…,M，M＝N1×N2为低分辨率图像尺寸；权重ωk,m,r(θk,hk,vk)表示这r个高分辨率像素点与第m个低分辨率像素点之间的关系；θk,hk,vk分别代表图像旋转角度、水平及垂直方向的移动。
也就是说，低分辨率像素点相对于固定的高分辨率像素点移动或旋转后,一组不同的“虚拟”高分辨率像素点又构成了为另一个低分辨率像素点；如图5所示，图5(a)为“虚拟”高分辨率像素点构成的另一个低分辨率像素点示意图，其中阴影部分为一个低分辨率像素点；图5(b)为图5(a)中低分辨率像素点发生旋转和平移后与高分辨率像素点的对应关系示意图。为了得到高像素点信息，可以通过估算权重ωk,m,r(θk,hk,vk)对低像素点信息进行计算处理。
为了得到权重中各项参数的值，可以定义一个成本函数，则高分辨率图像就是当这个成本函数最小时得到的值。用公式表示即：
其中，C(z)为成本函数：
其中m＝1,2,…,pM，p为图像总帧数；右边部分为正则化项，其值越小时z越平滑，因此定义参数αi,j为：
对C(z)求偏导数，可以找到C(z)的最小值，用公式表示即：
通过迭代的方法，已知初始高分辨率像素点的值，就可以求出所有高分辨率像素点的值，即：
其中εn表示n阶迭代的步长，适当选择εn的值就能计算出高分辨率像素点。如此，便得到了一幅高分辨率图像。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
(1)相对于原有的共聚焦显微内镜，通过移动光纤束整体的方法获取多帧图像，增加像素点。
(2)利用亚像素方法实现高分辨率图像重建，改善图像质量，消除噪声。
(3)装置结构简单，数据处理方便。
附图说明
图1为传统的基于光纤束的共聚焦显微内镜装置示意图；
图2为亚像素(Sub-Pixel)概念原理图；
图3为一种基于亚像素的光纤束共聚焦荧光内窥成像装置示意图；
图4为光纤束截面图；
图5(a)为“虚拟”高分辨率像素点构成的另一个低分辨率像素点示意图，其中阴影部分为一个低分辨率像素点；图5(b)为图5(a)中低分辨率像素点发生旋转和平移后与高分辨率像素点的对应关系示意图；
具体实施方式
下面结合实施例和附图来详细说明本发明，但本发明并不限于此。
实施例1
如图3所示，一种由压电移动平台实现光纤束移动的基于亚像素的光纤束共聚焦荧光内窥成像装置，包括激光器1，二向分色镜3，双轴扫描振镜4，第一透镜5，光纤束8，压电移动平台14，第二透镜15，显微物镜9，样品10，第二滤光片16，第三透镜17，光电探测器12和计算机13。
采用图3所示的装置所实现的基于亚像素的光纤束共聚焦荧光内窥成像方法，其过程如下：
(1)激光器1发出照明光，透过二向分色镜3和双轴扫描振镜4，被第一透镜5耦合进光纤束8中的一根光纤中；
(2)从该根照明光纤出射的光经第二透镜15变为平行光，再经显微物镜9聚焦到荧光样品10上；
(3)激光照明荧光样品10后激发样品产生荧光，经过显微物镜9收集后变成平行光，经第二透镜15聚焦到同一根照明光纤中，由该根光纤出射的荧光经过第一透镜5和双轴扫描振镜4，并由二向分色镜3反射至第二滤光片16，经第二滤光片16滤光后滤除样品反射的激光及其他杂散光，仅使荧光出射，出射的荧光经第三透镜17会聚后，聚焦到光电探测器12上；光电探测器12将光信号转变成电信号，并将电信号传送至计算机13，得到一个物点所对应的图像；
(4)计算机13控制双轴扫描振镜4将激发照明光耦合进光纤束8中不同的光纤中，所有的光纤均扫描完毕后，得到一帧图像；
(5)压电移动平台14与计算机13相连，通过计算机13来控制压电移动平台使光纤束远端(近样品端)移动两次，在每次移动后的位置处，重复1-4步骤，得到2帧图像；
(6)计算机将得到的4帧图像和初始位置的一帧图像进行高分辨率图像重建，得到最终的高分辨率图像。
实施例2
如图3所示，一种由压电移动平台实现光纤束移动的基于亚像素的光纤束共聚焦荧光内窥成像装置，包括激光器1，二向分色镜3，双轴扫描振镜4，第一透镜5，光纤束8，压电移动平台14，第二透镜15，显微物镜9，样品10，第二滤光片16，第三透镜17，光电探测器12和计算机13。
采用图3所示的装置所实现的基于亚像素的光纤束共聚焦荧光内窥成像方法，其过程如下：
(1)激光器1发出照明光，透过二向分色镜3和双轴扫描振镜4，被第一透镜5耦合进光纤束8中的一根光纤中；
(2)从该根照明光纤出射的光经第二透镜15变为平行光，再经显微物镜9聚焦到荧光样品10上；
(3)激光照明荧光样品10后激发样品产生荧光，经过显微物镜9收集后变成平行光，经第二透镜15聚焦到同一根照明光纤中，由该根光纤出射的荧光经过第一透镜5和双轴扫描振镜4，并由二向分色镜3反射至第二滤光片16，经第二滤光片16滤光后滤除样品反射的激光及其他杂散光，仅使荧光出射，出射的荧光经第三透镜17会聚后，聚焦到光电探测器12上；光电探测器12将光信号转变成电信号，并将电信号传送至计算机13，得到一个物点所对应的图像；
(4)计算机13控制双轴扫描振镜4将激发照明光耦合进光纤束8中不同的光纤中，所有的光纤均扫描完毕后，得到一帧图像；
(5)压电移动平台14与计算机13相连，通过计算机13来控制压电移动平台使光纤束远端(近样品端)移动四次，在每次移动后的位置处，重复1-4步骤，得到4帧图像；
(6)计算机将得到的2帧图像和初始位置的一帧图像进行高分辨率图像重建，得到最终的高分辨率图像。
实施例3
如图3所示，一种由纳米平移台实现光纤束移动的基于亚像素的光纤束共聚焦荧光内窥成像装置，包括激光器1，二向分色镜3，双轴扫描振镜4，第一透镜5，光纤束8，纳米平移台14，第二透镜15，显微物镜9，样品10，第二滤光片16，第三透镜17，光电探测器12和计算机13。
采用图3所示的装置所实现的基于亚像素的光纤束共聚焦荧光内窥成像方法，其过程如下：
(1)激光器1发出照明光，透过二向分色镜3和双轴扫描振镜4，被第一透镜5耦合进光纤束8中的一根光纤中；
(2)从该根照明光纤出射的光经第二透镜15变为平行光，再经显微物镜9聚焦到荧光样品10上；
(3)激光照明荧光样品10后激发样品产生荧光，经过显微物镜9收集后变成平行光，经第二透镜15聚焦到同一根照明光纤中，由该根光纤出射的荧光经过第一透镜5和双轴扫描振镜4，并由二向分色镜3反射至第二滤光片16，经第二滤光片16滤光后滤除样品反射的激光及其他杂散光，仅使荧光出射，出射的荧光经第三透镜17会聚后，聚焦到光电探测器12上；光电探测器12将光信号转变成电信号，并将电信号传送至计算机13，得到一个物点所对应的图像；
(4)计算机13控制双轴扫描振镜4将激发照明光耦合进光纤束8中不同的光纤中，所有的光纤均扫描完毕后，得到一帧图像；
(5)纳米平移台14与计算机13相连，通过计算机13来控制压电移动平台使光纤束远端(近样品端)移动三十六次，在每次移动后的位置处，重复1-4步骤，得到36帧图像；
(6)计算机将得到的36帧图像和初始位置的一帧图像进行高分辨率图像重建，得到最终的高分辨率图像。
以上所述仅为本发明的较佳实施举例，并不用于限制本发明，凡在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种基于亚像素的光纤束共聚焦荧光内窥成像方法，包括：照明光依次耦合至光纤束内不同的单模光纤，由单模光纤出射并聚焦到样品上，收集样品产生的荧光并聚焦到与入射照明光相同的单模光纤内，采集荧光信号得到扫描样品的第一帧图像；其特征在于：
控制光纤束的近样品端至少移动一次，在每次移动后的位置处，照明光依次耦合至光纤束内不同的单模光纤，由单模光纤出射并聚焦到样品上，收集样品产生的荧光并聚焦到与入射照明光相同的单模光纤内，采集荧光信号得到扫描样品的第二帧图像；
将每次位移后得到的第二帧图像与第一帧图像进行图像重建，得到最终的显微图像。
2.如权利要求1所述的光纤束共聚焦荧光内窥成像方法，其特征在于：控制光纤束的近样品端在Z轴方向移动，对样品进行三维扫描。
3.如权利要求1所述的光纤束共聚焦荧光内窥成像方法，其特征在于：所述光纤束的近样品端移动的次数至少为2次，每次移动的位置各不相同。
4.如权利要求3所述的光纤束共聚焦荧光内窥成像方法，其特征在于：所述光纤束的近样品端移动的次数为2～36次。
5.一种基于亚像素的光纤束共聚焦荧光内窥成像装置，包括：用于发出照明光的激光器，用于出射激发照明光并接收荧光信号的光纤束，用于将照明光依次耦合进光纤束中各单模光纤内的扫描振镜，用于收集荧光信号的光电探测器，和对光电探测器输出信号进行处理的计算机；其特征在于：
设置控制光纤束的近样品端至少移动一次的移动平台；
在各个位置处，照明光依次耦合进光纤束中各单模光纤内对样品进行扫描照明，通过光电探测器收集光纤束的近样品端在初始位置的第一帧图像和每次移动位置后的第二帧图像；
所述的计算机将每次位移后得到的第二帧图像与第一帧图像进行图像重建，得到最终的显微图像。
6.如权利要求5所述的光纤束共聚焦荧光内窥成像装置，其特征在于：所述的移动平台为受控于计算机的用于实现光纤束近样品端移动的压电移动平台或纳米平移台。
7.如权利要求6所述的光纤束共聚焦荧光内窥成像装置，其特征在于：所述的移动平台控制光纤束的近样品端移动的次数为至少2次，每次移动的位置各不相同。
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