CN106834427A - 一种snp分型方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及DNA检测技术领域，提供了一种SNP分型方法及试剂盒。待测SNP位点包括CYP2C9、VKORC1和CYP2C19基因中的SNP位点，所述SNP分型方法利用无荧光标记的寡核苷酸探针替换有荧光标记的寡核苷酸探针，对待测序文库分子进行一次连接测序反应后，再通过连接测序获得待测SNP位点的序列信息。所述SNP分型试剂盒，包括CYP2C9特异性引物对、VKORC1特异性引物对、CYP2C19特异性引物对、无荧光标记的寡核苷酸探针。本发明的SNP分型方法及试剂盒通过封闭待测序文库分子中的非特异性结合位点，降低了连接测序所得结果中的错误信号，从而提高了SNP位点检测的准确性。
Description
技术领域
本发明涉及DNA检测技术领域，更具体地说，涉及一种SNP分型方法及试剂盒。
背景技术
单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）是指基因组内DNA中某一特定核苷酸位置上存在转换、颠换、插入、缺失等变化。目前，国内外常见的SNP分型检测技术包括以下几种，高分辨率融解曲线检测法（high resolution melting，HRM）、基于芯片技术的SNP分型方法、等位基因特异性扩增法（Amplification Refractory
Mutation System Real Time PCR，ARMS-RT PCR）、Taqman荧光探针法、质谱法、高效液相层析法和基因测序法等。
其中，基因测序法又包括以Sanger技术为基础的第一代测序技术，和具有高通量、低成本特点的第二代高通量测序技术。第二代高通量测序技术包括连接测序法和合成测序法。其中，所述连接测序法是基于连接酶在核酸片段之间进行连接反应的过程中的保真性来实现的，以待测序核酸片段为模板，锚定引物（又称测序引物，其与待测序核酸片段所在链互补）和寡核苷酸探针（该探针的特定位置上带有荧光标记）进行连接反应，通过检测连接产物上的荧光标记从而确定寡核苷酸探针上带有荧光标记的特定位置对应的序列的信息。所述合成测序法是基于聚合酶在延伸核酸链过程中的保真性来实现的，以待测序核酸片段为模板，锚定引物互补结合至待测序核酸片段上，通过检测在延伸过程中产生的信号来确定待测序核酸片段上相应位置的序列信息。
在CN201410168995.2中，披露了一种基于连接测序技术的SNP分型方法，本申请发明人在利用该技术对CYP2C9、VKORC1和CYP2C19基因中的SNP位点进行检测时发现，所得测序结果中存在一定比例的错误信号，而这些错误信号将会干扰测序结果的分析，降低SNP位点检测的准确性。
因此需要一种新的SNP分型方法和试剂盒，以提高对CYP2C9、VKORC1和CYP2C19基因中的SNP位点检测的准确性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种对CYP2C9、VKORC1和CYP2C19基因中的SNP位点检测准确率更高的SNP分型方法和试剂盒，旨在解决现有技术中测序结果中存在较高比例的错误信号的技术问题。
为了实现发明目的，一种SNP分型方法，待测SNP位点包括CYP2C9、VKORC1和CYP2C19基因中的SNP位点，所述SNP分型方法包括以下步骤：
A、含待测SNP位点核酸片段的获得：利用CYP2C9特异性引物对、VKORC1特异性引物对和CYP2C19特异性引物对分别对待测样本进行PCR扩增，得CYP2C9扩增产物、VKORC1扩增产物和CYP2C19扩增产物；
B、待测序文库分子的构建：将CYP2C9扩增产物、VKORC1扩增产物和CYP2C19扩增产物分别与接头连接，形成相应的待测序文库分子，并将待测序文库分子通过微球可寻址的固定在固相载体上；
C、封闭非特异性结合位点：利用无荧光标记的寡核苷酸探针替换有荧光标记的寡核苷酸探针，对固定在固相载体上的待测序文库分子进行一次连接测序反应；
D、连接测序获得待测SNP位点的序列信息。
其中，所述步骤C包括以下步骤：
C1、将锚定引物锚定在待测序文库分子上；
C2、加入无荧光标记的寡核苷酸探针、连接酶以及相应的缓冲液，进行连接反应；
C3、变性去除连接产物。
其中，所述CYP2C9特异性引物对、VKORC1特异性引物对和CYP2C19特异性引物对中均至少有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列。
其中，所述CYP2C9特异性引物对、VKORC1特异性引物对和CYP2C19特异性引物对均包括外引物对和内引物对；所述CYP2C9、VKORC1和CYP2C19内引物对中均至少有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列。
其中，所述步骤A包括以下步骤:
A1、利用CYP2C9、VKORC1和CYP2C19外引物对分别对待测样本进行PCR扩增，得CYP2C9第一次扩增产物、VKORC1第一次扩增产物和CYP2C19第一次扩增产物；
A2、分别以CYP2C9第一次扩增产物、VKORC1第一次扩增产物和CYP2C19第一次扩增产物为模板，利用相应的CYP2C9、VKORC1和CYP2C19内引物对分别进行PCR扩增，得CYP2C9第二次扩增产物、VKORC1第二次扩增产物和CYP2C19第二次扩增产物。
其中，所述步骤B包括以下步骤：
B1、将CYP2C9扩增产物、VKORC1扩增产物和CYP2C19扩增产物分别与固定在微球上的接头连接，得固定在微球上的待测序文库分子；
B2、将微球可寻址的固定在固相载体上。
其中，所述步骤B1中的连接反应是在切割-连接反应体系中进行的，所述切割-连接反应体系包括：连接酶、断裂剂、固定在微球上的第一接头和连接缓冲液；
所述断裂剂，用于对核酸片段中的可断裂位点或可切除序列进行特异性切割，形成第一粘性末端；
所述第一接头为核酸分子，含有与第一粘性末端完全互补配对的第二粘性末端。
其中，步骤B1中所述连接缓冲液中含有5-10% PEG。
其中，所述待测SNP位点的rs号分别为：rs1799853、rs1057910、rs9923231、rs4244285和rs4986893。
为了更好的实现本发明的目的，本发明还提供了一种SNP分型试剂盒，包括CYP2C9特异性引物对、VKORC1特异性引物对、CYP2C19特异性引物对、无荧光标记的寡核苷酸探针。
其中，所述CYP2C9特异性引物对、VKORC1特异性引物对和CYP2C19特异性引物对中均至少有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列。
其中，所述CYP2C9特异性引物对、VKORC1特异性引物对和CYP2C19特异性引物对均包括外引物对和内引物对；所述CYP2C9、VKORC1和CYP2C19内引物对中均至少有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列。
其中，还包括建库连接缓冲液，所述建库连接缓冲液中含有5-10% PEG。
由上可知，本发明的SNP分型方法及试剂盒，通过封闭待测序文库分子中的非特异性结合位点，降低了连接测序所得结果中的错误信号，从而提高了CYP2C9、VKORC1和CYP2C19基因中的SNP位点检测的准确性。
附图说明
图1是本发明一个具体实施例中第一接头的结构示意图。
图2是本发明一个具体实施例中第一接头的标签序列与样本来源和SNP位点的对应关系图。
图3是本发明一个具体实施例中各SNP位点与所对应使用的锚定引物关系图。
图4是本发明一个具体实施例中实验组测序流程图。
图5是本发明一个具体实施例中对照组测序流程图。
图6是本发明一个具体实施例中部分初步实验结果对照图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。
本发明提出第一典型实施例，一种SNP分型方法，待测SNP位点包括CYP2C9、VKORC1和CYP2C19基因中的SNP位点，所述SNP分型方法包括以下步骤：
A、含待测SNP位点核酸片段的获得：利用CYP2C9特异性引物对、VKORC1特异性引物对和CYP2C19特异性引物对分别对待测样本进行PCR扩增，得CYP2C9扩增产物、VKORC1扩增产物和CYP2C19扩增产物；
B、待测序文库分子的构建：将CYP2C9扩增产物、VKORC1扩增产物和CYP2C19扩增产物分别与接头连接，形成相应的待测序文库分子，并将待测序文库分子通过微球可寻址的固定在固相载体上；
C、封闭非特异性结合位点：利用无荧光标记的寡核苷酸探针替换有荧光标记的寡核苷酸探针，对固定在固相载体上的待测序文库分子进行一次连接测序反应；
D、连接测序获得待测SNP位点的序列信息。
需要说明的是，所述无荧光标记的寡核苷酸探针与连接测序技术中所使用的有荧光标记的寡核苷酸探针相比，序列完全相同，差别仅在于有无荧光标记；即，所述无荧光标记的寡核苷酸探针序列为（N-N-N……-N）n，所述N为A、G、C或T，n为正整数。
所述可寻址的固定，是指能够确定位置信息的固定。即，固定载体上每一具体位置上所固定的待测序文库分子与其它具体位置上所固定的待测序文库分子是能够明确区分的。
步骤A所得CYP2C9扩增产物、VKORC1扩增产物和CYP2C19扩增产物为相应PCR扩增的产物，它们分别含有相应的待测SNP位点核酸片段，即目标分子。
每一次连接测序反应均包括以下步骤：锚定引物锚定，冲洗（除去多余的未锚定引物），探针连接，冲洗（除去多余探针、连接酶等），采图（获得探针上荧光标记所对应位置的序列信息），变性洗脱连接产物（以便下一次连接测序反应中锚定引物的锚定）。步骤C中的连接测序反应，因为使用的是无荧光标记的寡核苷酸探针，因此可不进行采图步骤，以减少实验步骤，提高实验效率。当然，如果进行采图步骤，可验证该次使用的荧光探针是否是无荧光标记的，起到一个再次确认的效果。
虽然，从理论上来说，步骤C中锚定引物与无荧光标记的寡核苷酸案子会被洗脱去除，无法起到封闭的作用，但是，本申请发明人在具体实验中对比发现，在连接测序前，增加一个使用无荧光标记的寡核苷酸探针替换有荧光标记的探针进行一次连接测序反应的步骤，有效的减少在后续的连接测序中出现的错误信号，从而减少由测序初始结果到最终的序列信息的分析过程中的干扰信号，提高SNP位点检测的准确性。具体原因可能是非锚定引物的目标结合位点和/或非探针的目标结合位点，经过步骤C后被封闭，使得在后续的连接测序实验中，锚定引物和/或探针能够更多更准确的结合在目标结合位点上，从而减少了错误信号的产生。
优选的，所述n在6-10之间；更优选在7-9之间。
更优选的，所述无荧光标记的寡核苷酸探针与步骤D中的有荧光标记的寡核苷酸探针序列完全相同，差别仅在于有无荧光标记。本方案可有效降低无荧光标记的寡核苷酸探针的设计难度。
其中，所述步骤C可包括以下步骤：
C1、将锚定引物锚定在待测序文库分子上；
C2、加入无荧光标记的寡核苷酸探针、连接酶以及相应的缓冲液，进行连接反应；
C3、变性去除连接产物。
对于步骤C3中变性去除连接产物需要说明的是，步骤C3所述连接产物为锚定引物与无荧光标记的寡核苷酸探针的连接产物，为单链核酸分子，可与待测序文库分子互补配对。所述变性既可以通过物理的方法实现，例如提高双链核酸分子（待测序文库分子与连接产物）所处的温度，也可以通过化学的方法实现，例如改变双链核酸分子（待测序文库分子与连接产物）所处的pH值。其中，采用化学方法，只需加入酸性或碱性的试剂即可，无需额外的加热部件，能够更简单有效的实现自动化。优选的，所述步骤C3为：用0.05M-0.15M NaOH冲洗。
其中，所述步骤B可有多种实施方案，以下将通过多个实施例来进行说明。
在本发明的第二实施例中，所述步骤B包括以下步骤：
B1、将CYP2C9扩增产物、VKORC1扩增产物和CYP2C19扩增产物分别与接头连接，然后将CYP2C9连接产物、VKORC1连接产物和CYP2C19连接产物分别固定在微球上，得固定在微球上的待测序文库分子；
B2、将微球可寻址的固定在固相载体上。
在本发明的第三实施例中，所述步骤B包括以下步骤：
B1、将CYP2C9扩增产物、VKORC1扩增产物和CYP2C19扩增产物分别与固定在微球上的接头连接，得固定在微球上的待测序文库分子；
B2、将微球可寻址的固定在固相载体上。
需要说明的是，在第二实施例和第三实施例中，所述接头上含有修饰标记，用于使其固定在微球上。
所述接头可采用多种形式，包括但不限于平末端接头、突出末端接头、分叉接头或含茎环结构的接头。
所述平末端接头是指双链之间完全互补配对的双链核酸接头。优选的，所述平末端接头的两条链的5’末端均不含磷酸基团，其可避免连接过程中接头自连现象的出现，减少对后续测序实验的干扰，提高SNP分型检测的准确率。
所述突出末端接头，是指双链核酸分子中的至少一端带有突出核苷酸序列，而其余核苷酸则完全互补的双链核酸接头。突出末端接头可为单突出末端，也可以是含有两个突出末端的双突出末端，这两个突出末端可在一条核苷酸链上或在不同的核苷酸链上。所述突出末端接头能够避免连接过程中接头自连现象的出现，减少对后续测序实验的干扰，提高SNP分型检测的准确率。在本实施例的具体实施方式中，所述接头优选为单突出末端接头，且该突出末端为其所在链的3’末端，碱基为T；该接头能够与通过Taq酶扩增的含A尾的PCR扩增产物直接连接，提高连接效率。
所述分叉型接头包括互补区和分叉区，互补区双链的核苷酸互补配对，配对的核苷酸对数不限。互补区末端可为平末端或突出末端。所述分叉型接头能够避免连接过程中接头自连现象的出现，减少对后续测序实验的干扰，提高SNP分型检测的准确率。在本实施例的具体实施方式中，所述接头优选为互补区的3’末端为突出末端，且突出末端最后一个碱基为T的T末端分叉接头；该接头能够与通过Taq酶扩增的含A尾的PCR扩增产物直接连接，提高连接效率。
所述带茎环结构的接头，有多种实施方案。在一实施例中，该接头为单链核酸分子，该单链核酸分子依次包括第一互补配对区、茎环区和第二互补配对区，第一互补配对区能够与第二互补配对区完全互补配对。在另一实施例中，带茎环结构的接头还可带有突出末端，该突出末端可位于单链核酸分子的3’端。突出末端4的存在能够防止接头自连现象的发生，减少对后续测序实验的干扰，提高SNP分型检测的准确率。该突出末端优选为T；该接头能够与通过Taq酶扩增的含A尾的PCR扩增产物直接连接，提高连接效率。
所述修饰标记可为生物素、亲和素、链霉亲和素、抗原、抗体、受体、配体、多聚组氨酸、纳米金、碘乙酰、巯基、氨基、醛基、羧基、异硫氰基、硅烷基或丙烯酰胺，它们均能特异性的与相对应的基团或分子结合。
与第二实施例相比，第三实施例中的接头被预先固定在微球上，减少了连接产物与微球连接的步骤，实验效率更高。
因为固定有接头的微球的密度可能会与步骤B反应体系中的其他成分的密度不同，所以，在连接过程中，使整个反应体系周期性震荡，可有效提高固定在微球上的接头与步骤A所得扩增产物的连接效率，避免反应体系中各成分分层而引起的连接效率低现象的出现。
另外，在本发明中，步骤A所得的扩增产物，不经纯化，直接与步骤B中的接头连接，这使得反应体系较大，DNA分子浓度较低，连接效率不高。在本发明的一个优选实施例中，在步骤B的反应体系中加入PEG。
因为PEG既能够提高反应体系中发生反应的分子的有效密度，提高接头与相应的扩增产物之间接触的概率；又能提高反应体系的密度，防止固定有接头的微球沉降；本方案从两个方面有效提高了固定在微球上的接头与相应的扩增产物的连接效率。本方案中，PEG的具体浓度可根据所述步骤B中微球的密度和原反应体系的密度来计算，以使微球的密度与加入PEG后的反应体系的密度基本相同为宜。
在本发明的一个实施例中，所述CYP2C9特异性引物对、VKORC1特异性引物对和CYP2C19特异性引物对中均至少有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列。本方案中，通过CYP2C9特异性引物对、VKORC1特异性引物对和CYP2C19特异性引物对将可断裂位点或可切除序列引入到CYP2C9扩增产物、VKORC1扩增产物和CYP2C19扩增产物中。因此，CYP2C9扩增产物、VKORC1扩增产物和CYP2C19扩增产物能够被断裂剂切割，形成粘性末端。然后在步骤B中的接头上设置与粘性末端互不配对的片段，可有效提高步骤B中的连接效率。
在本发明的另一个实施例中，所述CYP2C9特异性引物对、VKORC1特异性引物对和CYP2C19特异性引物对均包括外引物对和内引物对；所述CYP2C9、VKORC1和CYP2C19内引物对中均至少有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列。
本方案中，通过内外引物对的设置，所述步骤A可进行巢式PCR扩增，有效的提高所得CYP2C9扩增产物、VKORC1扩增产物和CYP2C19扩增产物中目标片段的纯度。而将可断裂位点或可切除序列设置在内引物对上，则保证CYP2C9扩增产物、VKORC1扩增产物和CYP2C19扩增产物中目标片段上携带有可断裂位点或可切除序列。
基于上述实施例，本发明提出另一实施例，所述步骤A包括以下步骤:
A1、利用CYP2C9、VKORC1和CYP2C19外引物对分别对待测样本进行PCR扩增，得CYP2C9第一次扩增产物、VKORC1第一次扩增产物和CYP2C19第一次扩增产物；
A2、分别以CYP2C9第一次扩增产物、VKORC1第一次扩增产物和CYP2C19第一次扩增产物为模板，利用相应的CYP2C9、VKORC1和CYP2C19内引物对分别进行PCR扩增，得CYP2C9第二次扩增产物、VKORC1第二次扩增产物和CYP2C19第二次扩增产物。
需要说明的是，本方案中，CYP2C9第二次扩增产物、VKORC1第二次扩增产物和CYP2C19第二次扩增产物可直接进入到步骤B中进行后续反应。另外，本方案采用两步式巢式PCR，可有效降低内外引物的设计难度，并减少CYP2C9第二次扩增产物、VKORC1第二次扩增产物和CYP2C19第二次扩增产物中非目标产物的比例。
基于第三实施例，本发明又提出第四实施例，所述步骤B1中的连接反应是在切割-连接反应体系中进行的，所述切割-连接反应体系包括：连接酶、断裂剂、固定在微球上的第一接头和连接缓冲液；
所述断裂剂，用于对核酸片段中的可断裂位点或可切除序列进行特异性切割，形成第一粘性末端；
所述第一接头为核酸分子，含有与第一粘性末端完全互补配对的第二粘性末端。
需要说明的是，所述切割-连接反应体系为使连接酶和断裂剂同时具有活性的反应体系。
通过上述对PCR扩增引物和切割-连接反应体系的特殊设计，使得在建库过程中，PCR扩增后的切割和连接反应能在同一反应体系中进行；一旦断裂剂完成对可断裂位点或可切除序列进行特异性切割，形成第一粘性末端，第一接头即可在连接酶的作用下，与被切割后的扩增产物连接，省去了切割反应和连接反应中的纯化步骤，切割、连接反应在同一反应体系中进行；即，减少了建库的步骤，提高了建库效率。
另外，本方案中，当CYP2C9特异性引物对、VKORC1特异性引物对和CYP2C19特异性引物对中均仅有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列时，所述第一接头仅与步骤A所得扩增产物中的目标分子的一端连接。本方案减少了试剂种类，库结构简单，可降低成本。
所述第一接头可为突出末端接头、分叉接头或含茎环结构的接头。
优选的，步骤B1中所述连接缓冲液中含有PEG。PEG既能够提高反应体系中发生反应的分子的有效密度，提高接头与相应的扩增产物之间接触的概率；又能提高反应体系的密度，防止固定有接头的微球沉降；本方案从两个方面有效提高了固定在微球上的接头与相应的扩增产物的连接效率。本方案中，PEG的具体浓度和具体规格可根据所述步骤B1中微球的密度和原切割-连接反应体系的密度来计算，以使微球的密度与加入PEG后的切割-连接反应体系的密度基本相同为宜。
更优选的，步骤B1中所述连接缓冲液中含有2%-15% PEG4000或2%-15% PEG6000或2%-15% PEG8000。
针对步骤B中接头与CYP2C9扩增产物、VKORC1扩增产物或CYP2C19扩增产物的连接，需要说明的是，步骤B中的接头可为一种接头分子，也可由两种接头分子组成。步骤B中的接头既可与步骤A所得扩增产物中的目标分子的一端连接，也可与步骤A所得扩增产物中的目标分子的两端连接，与目标分子两端连接的接头可为同一种接头分子，也可为不同的接头分子。
需要说明的是，当步骤B中的接头由两种接头分子组成时，仅有一种接头上含有修饰标记，用于使其固定在微球上。
优选的，所述步骤B中的接头为一种接头分子，且仅与步骤A所得扩增产物中的目标分子的一端连接。本方案可减少SNP分型方案中的试剂种类，简化待测序文库分子的结构，降低成本。
优选的，步骤B所述接头上含有标签序列，用于识别不同的SNP位点和/或样本来源。本方案中，所述标签序列为由若干个脱氧核糖核苷酸分子顺序连接而成的序列；本方案能够实现多个不同SNP位点的同时检测，更能够实现多样本多SNP位点的同时检测，可大大提高本发明的SNP分型方法的检测通量，提高检测效率。
优选的，所述锚定引物上用于连接寡核苷酸探针的一端距待测SNP位点1至9bp之间，更优选在1至5bp之间。因为最为常见的连接酶——T4连接酶最大限度能保证6个碱基正确互补配对，所以，本方案使得所述步骤D中的测序反应仅需进行一轮连接反应即可实现待测SNP位点的检测，能有效提高检测效率，降低检测成本。
本发明还提供了一种SNP分型试剂盒，包括CYP2C9特异性引物对、VKORC1特异性引物对、CYP2C19特异性引物对、无荧光标记的寡核苷酸探针。
需要说明的是，所述无荧光标记的寡核苷酸探针与连接测序技术中所使用的有荧光标记的寡核苷酸探针相比，序列完全相同，差别仅在于有无荧光标记；即，所述无荧光标记的寡核苷酸探针序列为（N-N-N……-N）n，所述N为A、G、C或T，n为正整数。
本发明的试剂盒能够有效的用于本发明的SNP分型方法中，有效的减少连接测序中出现的错误信号，从而减少由测序初始结果到最终的序列信息的分析过程中的干扰信号，提高SNP位点检测的准确性。
优选的，所述n在6-10之间；更优选在7-9之间。
优选的，所述试剂盒还包括变性缓冲液，所述变性缓冲液为0.05M-0.15M 的NaOH溶液。
优选的，所述试剂盒还包括连接酶和连接酶缓冲液。
更优选的，所述连接酶为T4连接酶。
优选的，所述CYP2C9特异性引物对、VKORC1特异性引物对和CYP2C19特异性引物对中均至少有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列。
优选的，所述CYP2C9特异性引物对、VKORC1特异性引物对和CYP2C19特异性引物对均包括外引物对和内引物对；所述CYP2C9、VKORC1和CYP2C19内引物对中均至少有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列。
优选的，所述试剂盒还包括建库连接缓冲液。
更优选的，所述建库连接缓冲液中含有PEG。本方案的试剂盒可从防止微球沉降和提高连接底物分子的有效浓度两个方面来有效提高固定在微球上的接头与相应的扩增产物的连接效率。
需要说明的是，本方案中PEG的具体浓度和PEG的规格均可根据微球的密度和建库过程中原反应体系的密度来计算，以使微球的密度与加入PEG后的反应体系的密度基本相同为宜。
更优选的，步骤B1中所述连接缓冲液中含有2%-15% PEG4000或2%-15% PEG6000或2%-15% PEG8000。
优选的，所述试剂盒还包括接头。所述接头用于分别与利用CYP2C9特异性引物对、VKORC1特异性引物对和CYP2C19特异性引物对扩增所得扩增产物连接。
更优选的，所述接头上含有修饰标记，用于使其固定在微球上。
所述接头可采用多种形式，包括但不限于平末端接头、突出末端接头、分叉接头或含茎环结构的接头。
更优选的，所述接头可为一种接头分子，也可由两种接头分子组成。
需要说明的是，当接头由两种接头分子组成时，仅有一种接头上含有修饰标记，用于使其固定在微球上。
更优选的，所述接头上含有标签序列，用于识别不同的SNP位点和/或样本来源。
本方案能够实现多个不同SNP位点的同时检测，更能够实现多样本多SNP位点的同时检测，可大大提高本发明的SNP分型试剂盒的检测通量，提高检测效率。
优选的，所述试剂盒还包括锚定引物。
更优选的，所述锚定引物上用于连接寡核苷酸探针的一端距待测SNP位点1至9bp之间，更优选在1至5bp之间。因为最为常见的连接酶——T4连接酶最大限度能保证6个碱基正确互补配对，所以，本方案能有效提高检测效率，降低检测成本。
针对上述各技术方案，为进一步说明本发明所记载技术方案的技术效果及优越性，本发明给出下述具体实施例。
在一具体实施例中，以10个人的血液基因组DNA为模板，同时检测CYP2CP基因的SNP位点rs1799853和rs1057910，VKORC1基因的SNP位点rs9923231，CYP2C19基因的SNP位点rs4244285和rs4986893。
其中，针对上述SNP位点，均分别设计了一对内引物和一对外引物。具体如下所述：所述CYP2C9外引物对为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，以及SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；所述CYP2C9内引物对为为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，以及SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；所述VKORC1外引物对为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；所述VKORC1内引物对为SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12；所述CYP2C19外引物对为SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14，以及SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16；所述CYP2C19内引物对为SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18，以及SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20。
一、含待测SNP位点的核酸片段的获得。
1、第一次PCR扩增
以10个人的血液基因组DNA为模板，利用上述的外引物对，分别对各SNP位点所在序列进行扩增，反应体系为：F引物（10μM），2μL；R引物（10μM），2μL；dNTP（各2.5mM），4μL；血液基因组DNA，50ng；Ex Taq（5U/μL），0.25μL；10×Ex Taq Buffer，5μL；ddH2O加至50μL。
PCR反应条件如下：94℃ 3min；94℃ 15s，57℃ 20s，72℃ 45s；重复20个循环；72℃ 3min。
所得产物即为第一次PCR扩增产物。
2、第二次PCR扩增
以第一次PCR扩增产物为模板，上述的内引物对，分别对各SNP位点所在序列进行扩增，反应体系为：F引物（10μM），2μL；R引物（10μM），2μL；dNTP（各2.5mM），4μL；第一次PCR扩增产物，100ng；Ex Taq（5U/μL），0.25μL；10×Ex Taq Buffer，5μL；ddH2O加至50μL。
PCR反应条件如下：95℃ 3min；94℃ 15s，57℃ 20s，72℃ 30s；重复30个循环；72℃ 3min。
所得产物即为第二次扩增产物。
第二次扩增完成后，经琼脂糖凝胶电泳检测，所有样本的第二次扩增产物中均含有目标分子，且凝胶电泳图显示无杂带，条带单一；说明第二次PCR扩增成功获得了所需的PCR扩增产物。
二、待测序文库分子的构建。
1、将第一接头固定在微球上。
为了在同时检测过程中能够区分不同的样本来源，本具体实施例在第一接头上设计了标签序列，第一接头的基本结构如图1所示（SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22），该接头中的NNNN为标签序列，标签序列与样本来源和SNP位点的对应关系如图2所示。
将上述各第一接头分别与带有链霉亲和素修饰的Myone磁珠（Invitrogen）结合，使得上述各第一接头被分别固定在磁珠表面，反应体系及反应过程为：将200ng第一接头与4μL（约4×107个磁珠）Myone磁珠螺旋振荡混匀，反应30min，以适量TE缓冲液（10mM Tris-HCl，pH8.0；1mM EDTA）清洗两次，离心分离，将得到的磁珠以4μL结合缓冲液（10mM Tris-HCl，pH7.5；1mM EDTA；1M NaCl；0.01% Triton X-100）重悬保存，得固定有第一接头的磁珠。
2、第二次PCR扩增产物与固定在磁珠上的第一接头的连接。
按图2中的对应关系分别配置下述反应体系：步骤一所得扩增产物20μL；USER酶（1U/μL，NEB，Cat#M5505S），10μL；缓冲液，8μL；T4 DNA连接酶，2μL；固定有第一接头的磁珠，0.4μL；加ddH2O至40μL。
其中，所述缓冲液为含400mM Tris、100mM MgCl2、100mM DTT、5mM ATP、25% PEG 6000，pH值7.8的溶液。
25℃反应20分钟，得连接产物，即待测序文库分子。
反应结束后，将50管连接产物合并成1管，2500g 离心3min，磁铁吸附磁珠，去上清，用50μL TE洗涤二次，并最终悬浮于50μL TE中，从而将待测序文库分子固定在磁珠上。
3、固定在磁珠上的待测序文库分子的可寻址固定。
将步骤2所得产物点样至异硫氰基修饰的载样片（玻片），于37℃固定1h，即完成固定在磁珠上的待测序文库分子的可寻址固定。
三、测序。
对步骤二所得的固定在固相载体上的待测序文库分子进行测序。
在本具体实施例中采用深圳华因康基因科技有限公司的高通量基因测序仪Pstar II A测序仪，并采用连接测序法进行测序。测序过程中各SNP位点与所对应使用的锚定引物关系如图3所示。
另外，为了区分不同的样本来源，还需对第一接头上的标签序列进行检测，用于检测标签序列的锚定引物为SEQ ID NO：28。图3中的锚定引物及用于检测标签序列的锚定引物的5’端需磷酸化修饰。
整体的测序顺序如图4所示。其中，待测SNP位点anchor混合物为SEQ ID NO：16-19等5种锚定引物按相同摩尔数混合所得的混合物。其中，Base1用于封闭锚定引物或探针与待测序文库分子上的非特异性结合位点，Base2用于检测待测SNP位点，Base3-6用于检测标签序列。
另外，本实施例同样步骤二所得产物，以图5中的测序顺序作为对比。即，未进行图4中的Base1。
图6示出了上述具体实施例中部分样本待测SNP位点——rs1057910在实验组和对照组中的初步实验结果。其中，N表示A、C、G或T；n表示信号太弱，无法判断是A、C、G和T中的哪一个。
如图6所示，样本1和样本6在实验组和对照组中占比最高的SNP位点序列均相同，但是它们的占比有明显区别。
所有样本的所有SNP位点检测结果中，实验组和对照组中占比最高的SNP位点序列均相同；实验组中占比最高的SNP位点序列检出数均在93%以上，而对照组中占比最高的SNP位点序列检出数基本在70-80%之间。
另外，本发明人还将第二次扩增产物通过Sanger测序进行验证，结果显示，上述实验组和对照组中占比最高的SNP位点序列均与Sanger测序结果完全一致。
以上，本发明的方法能够高效的同时对多个样品的多个SNP位点同时进行检测，并得到准确可信的结果，并且能够有效的降低连接测序所得结果中的错误信号，从而提高了CYP2C9、VKORC1和CYP2C19基因中的SNP位点检测的准确性。
另外，需要说明的是，本申请的发明人，在另一具体实施例中，直接用上述具体实施例中的CYP2C9内引物对、VKORC1内引物对和CYP2C19外引物对，对上述样本1-10进行PCR扩增，然后进行后续的步骤二、三，所得实验结果和上述具体实施例结果基本一致。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州康昕瑞基因健康科技有限公司
<120> 一种SNP分型方法及试剂盒
<130>
<160> 28
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agcttcctct ttcttgcctg
20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgagctaaca accaggactc
a
21
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cccctgaatt gctacaacaa
20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gggacttcga aaacatggag
20
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cgguctcatg acgctgcgga
at
22
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gatatggagt agggtcacc
19
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cgguccagga agagattgaa
cg
22
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
aatgtcacag gtcactgc
18
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ctcagcctcc caagtagttt
g
21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gtgagaaaca gcatctggag
a
21
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
cggutggcca ggcttgtctt aaac
24
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tgggaagtca agcaagagaa
20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
attacaacca gagcttggca
20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
acaaatacgc aagcagtcac
20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
cctgtgatcc cactttcatc
20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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ttttccagat attcacccca
20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cggucaacca gagcttggca tatt
24
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cactttccat aaaagcaagg
20
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<212> DNA
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<400> 19
cggutctgct ccattatttt ccag
24
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<213> 人工序列
<400> 20
aagtggtttc tcaggaagca
20
<210> 21
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(26)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 21
cctccctgca gtctctatgg gcnnnnctgc tagtcgctga agtagtcggt
50
<210> 22
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(23)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 22
ctacttcagc gactagcagn nnngcccata gagactgcag gg
42
<210> 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
gtcctcaatg ctcctct
17
<210> 24
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
gtatctctgg acctcgt
17
<210> 25
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
ggtgcggtgg ctcacgc
17
<210> 26
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
gggaaataat caatgat
17
<210> 27
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
cagggggtgc ttacaat
17
<210> 28
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
gcccatagag actgcag
17
Claims (11)
1.一种SNP分型方法，其特征在于，待测SNP位点包括CYP2C9、VKORC1和CYP2C19基因中的SNP位点，所述SNP分型方法包括以下步骤：
A、含待测SNP位点核酸片段的获得：利用CYP2C9特异性引物对、VKORC1特异性引物对和CYP2C19特异性引物对分别对待测样本进行PCR扩增，得CYP2C9扩增产物、VKORC1扩增产物和CYP2C19扩增产物；
B、待测序文库分子的构建：将CYP2C9扩增产物、VKORC1扩增产物和CYP2C19扩增产物分别与接头连接，形成相应的待测序文库分子，并将待测序文库分子通过微球可寻址的固定在固相载体上；
C、封闭非特异性结合位点：利用无荧光标记的寡核苷酸探针替换有荧光标记的寡核苷酸探针，对固定在固相载体上的待测序文库分子进行一次连接测序反应；
D、连接测序获得待测SNP位点的序列信息。
2.根据权利要求1所述的SNP分型方法，其特征在于，所述步骤C包括以下步骤：
C1、将锚定引物锚定在待测序文库分子上；
C2、加入无荧光标记的寡核苷酸探针、连接酶以及相应的缓冲液，进行连接反应；
C3、变性去除连接产物。
3.根据权利要求1所述的SNP分型方法，其特征在于，所述CYP2C9特异性引物对、VKORC1特异性引物对和CYP2C19特异性引物对中均至少有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列。
4.根据权利要求4所述的SNP分型方法，其特征在于，所述CYP2C9特异性引物对、VKORC1特异性引物对和CYP2C19特异性引物对均包括外引物对和内引物对；所述CYP2C9、VKORC1和CYP2C19内引物对中均至少有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列；所述步骤A包括以下步骤:
A1、利用CYP2C9、VKORC1和CYP2C19外引物对分别对待测样本进行PCR扩增，得CYP2C9第一次扩增产物、VKORC1第一次扩增产物和CYP2C19第一次扩增产物；
A2、分别以CYP2C9第一次扩增产物、VKORC1第一次扩增产物和CYP2C19第一次扩增产物为模板，利用相应的CYP2C9、VKORC1和CYP2C19内引物对分别进行PCR扩增，得CYP2C9第二次扩增产物、VKORC1第二次扩增产物和CYP2C19第二次扩增产物。
5.根据权利要求3所述的SNP分型方法，其特征在于，所述步骤B包括以下步骤：
B1、将CYP2C9扩增产物、VKORC1扩增产物和CYP2C19扩增产物分别与固定在微球上的接头连接，得固定在微球上的待测序文库分子；
B2、将微球可寻址的固定在固相载体上。
6.根据权利要求5所述的SNP分型方法，其特征在于，所述步骤B1中的连接反应是在切割-连接反应体系中进行的，所述切割-连接反应体系包括：连接酶、断裂剂、固定在微球上的第一接头和连接缓冲液；
所述断裂剂，用于对核酸片段中的可断裂位点或可切除序列进行特异性切割，形成第一粘性末端；
所述第一接头为核酸分子，含有与第一粘性末端完全互补配对的第二粘性末端。
7.根据权利要求6所述的SNP分型方法，其特征在于，步骤B1中所述连接缓冲液中含有5-10% PEG。
8.一种SNP分型试剂盒，其特征在于，包括CYP2C9特异性引物对、VKORC1特异性引物对、CYP2C19特异性引物对、无荧光标记的寡核苷酸探针。
9.根据权利要求8所述的SNP分型试剂盒，其特征在于，所述CYP2C9特异性引物对、VKORC1特异性引物对和CYP2C19特异性引物对中均至少有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列。
10.根据权利要求9所述的SNP分型试剂盒，其特征在于，所述CYP2C9特异性引物对、VKORC1特异性引物对和CYP2C19特异性引物对均包括外引物对和内引物对；所述CYP2C9、VKORC1和CYP2C19内引物对中均至少有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列。
11.根据权利要求8所述的SNP分型试剂盒，其特征在于，还包括建库连接缓冲液，所述建库连接缓冲液中含有5-10% PEG。
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Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108004326A (zh) * | 2016-10-27 | 2018-05-08 | 广州康昕瑞基因健康科技有限公司 | 基因检测试剂盒及检测方法 |
| CN108018358A (zh) * | 2016-10-31 | 2018-05-11 | 广州康昕瑞基因健康科技有限公司 | Cyp2c19基因检测试剂盒及检测方法 |
| CN108220409A (zh) * | 2016-12-13 | 2018-06-29 | 深圳华因康基因科技有限公司 | Mthfr基因检测引物组、检测试剂盒及检测方法 |
| CN108624672A (zh) * | 2017-03-16 | 2018-10-09 | 广州康昕瑞基因健康科技有限公司 | 基因检测引物组、试剂盒及检测方法 |
| CN108624698A (zh) * | 2017-03-16 | 2018-10-09 | 广州康昕瑞基因健康科技有限公司 | Cyp2c19基因检测引物组、试剂盒及检测方法 |
| CN109439738A (zh) * | 2018-01-22 | 2019-03-08 | 武汉康昕瑞基因健康科技有限公司 | Abcb1、cyp3a5基因检测引物组、试剂盒及检测方法 |
| CN109457026A (zh) * | 2018-10-22 | 2019-03-12 | 江苏美因康生物科技有限公司 | 一种快速检测抗血栓个体化用药基因多态性的试剂盒及方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103198238A (zh) * | 2012-01-06 | 2013-07-10 | 深圳华大基因科技有限公司 | 药物相关基因型别数据库、基因分型及药物反应检测 |
| CN103710432A (zh) * | 2013-10-31 | 2014-04-09 | 上海百傲科技股份有限公司 | 用于cyp2c9和vkorc1基因芯片检测的特异性引物对和探针 |
| CN104480534A (zh) * | 2014-12-29 | 2015-04-01 | 深圳华因康基因科技有限公司 | 一种快速建库方法 |
-
2015
- 2015-12-07 CN CN201510889618.2A patent/CN106834427A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103198238A (zh) * | 2012-01-06 | 2013-07-10 | 深圳华大基因科技有限公司 | 药物相关基因型别数据库、基因分型及药物反应检测 |
| CN103710432A (zh) * | 2013-10-31 | 2014-04-09 | 上海百傲科技股份有限公司 | 用于cyp2c9和vkorc1基因芯片检测的特异性引物对和探针 |
| CN104480534A (zh) * | 2014-12-29 | 2015-04-01 | 深圳华因康基因科技有限公司 | 一种快速建库方法 |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108004326A (zh) * | 2016-10-27 | 2018-05-08 | 广州康昕瑞基因健康科技有限公司 | 基因检测试剂盒及检测方法 |
| CN108018358A (zh) * | 2016-10-31 | 2018-05-11 | 广州康昕瑞基因健康科技有限公司 | Cyp2c19基因检测试剂盒及检测方法 |
| CN108220409A (zh) * | 2016-12-13 | 2018-06-29 | 深圳华因康基因科技有限公司 | Mthfr基因检测引物组、检测试剂盒及检测方法 |
| CN108624672A (zh) * | 2017-03-16 | 2018-10-09 | 广州康昕瑞基因健康科技有限公司 | 基因检测引物组、试剂盒及检测方法 |
| CN108624698A (zh) * | 2017-03-16 | 2018-10-09 | 广州康昕瑞基因健康科技有限公司 | Cyp2c19基因检测引物组、试剂盒及检测方法 |
| CN109439738A (zh) * | 2018-01-22 | 2019-03-08 | 武汉康昕瑞基因健康科技有限公司 | Abcb1、cyp3a5基因检测引物组、试剂盒及检测方法 |
| CN109457026A (zh) * | 2018-10-22 | 2019-03-12 | 江苏美因康生物科技有限公司 | 一种快速检测抗血栓个体化用药基因多态性的试剂盒及方法 |
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