CN106701963B - 一种基于实时定量pcr的贝类性别鉴定的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学领域，尤其是一种基于实时定量PCR的贝类性别鉴定的方法。鉴定方法如下：受检个体性腺取材；总RNA提取；反转录合成cDNA；实时定量PCR检测FOXL2和DMRT的表达量；用
方法处理数据，计算LOG10(DMRT/FOXL2)，确定性别。本发明无需使用特殊仪器，只需掌握一般实验操作技能，具有简便、准确、灵敏的特点。对通过表型观察和组织切片无法鉴定的雌雄个体具有普适性，在贝类养殖与育种研究中具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术中的贝类性别鉴定技术，具体地说，是一种简便高效地运用实时定量PCR技术实现贝类性别鉴定的方法。
背景技术
贝类养殖是我国海水养殖的主导产业之一，其产量占海水养殖总产量的70％以上。性别鉴定是贝类养殖和育种工作中不可缺少的环节。但除少数贝类第二性征比较明显外，绝大多数难以根据外部性征判定其性别。目前，对其性别鉴定的方法主要有两种，表型观察法和组织切片法。表型观察法虽然简单，但只适用于一些在生长期或成熟期雌雄性腺颜色有明显区别的物种；组织切片法适用于对增殖期、生长期和成熟期性腺的性别鉴定，对于休止期性腺则较困难，且该方法操作繁琐。
迄今为止，在贝类中未见有关于性染色体的报道，尚难以从DNA水平实现性别鉴定。但已有对虾夷扇贝，太平洋牡蛎等的性腺转录组分析显示，成熟的卵巢和精巢存在大量的差异表达基因，其中包括一些已知的脊椎动物性别决定基因，这些基因可能在贝类性别的维持中起着重要作用，有望用于贝类性别鉴定。FOXL2为叉头框转录因子家族成员，是脊椎动物卵巢发育、分化及功能维持的关键基因。DMRT则是很多无脊椎动物和脊椎动物所共有的性别分化的关键基因，对精巢的形成和维持起着重要作用。虽然贝类的性别决定的分子机制至今尚不清晰，我们发现，根据FOXL2和DMRT在卵巢和精巢中差异表达这一特征，可对贝类各发育时期的性腺进行性别鉴定。
实时荧光定量PCR是对特定核酸序列进行准确定量的方法，被认为是基因表达定量的“金标准”。其原理是对PCR扩增反应中每一个循环产物的荧光信号进行实时检测，从而实现对起始模板的定量分析。它不仅操作简便、快速高效，还具有极高的灵敏性、重复性和特异性。该技术已被广泛应用于分子生物学研究的各个领域。
本发明旨在选取合适的贝类雌雄性别表征基因组合，建立一种准确的定量与计算方法，稳定地对处于各发育时期(包括休止期)的性腺进行性别鉴定。
发明内容
本发明的目的是克服现有表型观察法和组织切片法存在的缺陷，提供一种基于实时定量PCR的贝类性别鉴定的方法，简便高效地实现贝类的性别鉴定。
本发明提供一种鉴定贝类性别的方法，即通过实时定量PCR检测贝类性腺组织中雌性表征基因FOXL2和雄性表征基因DMRT的表达量，从而确定性别。具体标准为：实时定量PCR检测FOXL2和DMRT表达量，用2-△Ct方法计算DMRT和FOXL2的相对表达量，根据LOG10转换后的值确定性别；如果获得的数值大于2，则该个体为雄性；如果获得的数值小于0，则该个体为雌性。在上述方案的基础上，需针对不同的贝类设计两对雌雄性别表征基因FOXL2和DMRT的特异性引物进行实时定量PCR检测。
具体步骤如下：
(1)受检个体性腺取材
受检贝类材料低温取回后在循环池中暂养，待新陈代谢稳定再进行解剖，性腺取材需规避其它组织的污染。
(2)总RNA提取
Trizol法提取总RNA，所得RNA用琼脂糖凝胶电泳检测完整性，并通过分光光度计测定浓度。
(3)反转录合成cDNA
以mRNA为模板，dNTP为底物，Oligo d(T)为引物，用反转录酶合成cDNA。
(4)实时定量PCR检测FOXL2和DMRT的表达量
利用两对雌雄性别表征基因FOXL2和DMRT的特异性引物，实时定量PCR检测FOXL2和DMRT表达量。
每个实验个体设三个技术重复。反应体系如下：
反应条件如下：50℃2min；94℃10min；94℃15s，60℃1min，40个循环；94℃15s，每10s降温0.5℃直至55℃，55℃1min。为排除引物二聚体及非特异性扩增产物对基因表达定量的影响，反应过程中温度由94℃至55℃缓慢降低，连续采集荧光信号并获取熔解曲线。
(5)用2-△Ct方法处理数据，计算LOG10(DMRT/FOXL2)，确定性别
如果获得的数值大于2，则该个体为雄性；如果获得的数值小于0，则该个体为雌性。
本发明操作方法具有原创性，步骤清晰，优点如下：
(1)解决了贝类第二性征不明显，通过性腺表型观察或组织切片无法判定部分个体性别的难题，从分子水平进行性别鉴定。
(2)不受性腺发育时期、个体大小等因素限制，只用少量性腺组织即可鉴定性别。
(3)本方法基于实时定量PCR技术，无需使用特殊仪器，只需掌握一般实验操作技能，具有简便、准确、灵敏的特点。
附图说明
图1为对组织切片确定性别与性腺发育时期的虾夷扇贝的性别鉴定结果。
图2为对组织切片无法确定性别的虾夷扇贝的性别鉴定结果。
图3为对组织切片无法确定性别的栉孔扇贝的性别鉴定结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明：
以下部分是具体实施方式对本发明做的进一步说明，但以下实施方式仅仅是对本发明的进一步解释，不代表其保护范围仅限于此，凡是以本发明思路所做的等效替换，均在本发明的保护范围。
实施例1
(1)受检个体性腺取材
二龄虾夷扇贝取自辽宁省大连市獐子岛综合试验站，于2015年7月至2016年3月每月低温取回些许成体材料，放于实验室充气循环水池中暂养。待新陈代谢稳定再进行解剖，性腺取材需规避其它组织的污染，将其剪切成直径为5mm左右小块。一部分用波恩氏液固定24h，然后保存于4℃的70％酒精中，用于石蜡切片；一部分在液氮中速冻后，存放于-80℃超低温冰箱，用于RNA提取。
(2)石蜡切片确定时期
流程为：脱水，透明，渗蜡、包埋，切片、贴片、展片，染色、封片，镜检拍照。然后显微镜观察细胞类型及形态，挑选出处于休止期、增殖期、生长期和成熟期的雌雄性腺各三个。
(3)总RNA提取
选取上一步骤中所得时期确定的24个个体，Trizol法提取总RNA。所得RNA用1％琼脂糖凝胶电泳检测完整性，并通过分光光度计Nanovue Plus spectrophotometer测定浓度。
(4)反转录合成cDNA
在200μl PCR(RNase&DNase-free)管中配制如下混合液：
总RNA 2μg
Oligo d(T)18(20μM) 1μl
H2O(RNase&DNase-free) 补至12.5μl
65℃温育5min后迅速在冰上冷却2min以上，然后在上述混合液中再加入如下反应物：
混匀离心后置于PCR仪中，42℃90min，70℃10min。得到的cDNA溶液-20℃保存。
(5)实时定量PCR检测FOXL2和DMRT的表达量
设计虾夷扇贝FOXL2和DMRT基因的特异性引物，引物序列为：
FOXL2 F:AACTTCTGGACATTGGACCCTGCTT
R:CCGCAGTGGTTGTCAGCAAATAAGG
DMRT F:ACAGATTCCCTACAGATGCT
R:TTATTCATGGCGGCGTCTAT
每个实验个体设三个技术重复。反应体系如下：
根据
480(Roche)实时荧光定量PCR仪说明书的要求，反应条件如下：50℃2min；94℃10min；94℃15s，60℃1min，40个循环；94℃15s，每10s降温0.5℃直至55℃，55℃1min。为排除引物二聚体及非特异性扩增产物对基因表达定量的影响，反应过程中温度由94℃至55℃缓慢降低，连续采集荧光信号并获取熔解曲线。
(6)用2-△Ct方法处理数据，计算LOG10(DMRT/FOXL2)，确定性别
根据所得结果，处于各时期的二龄虾夷扇贝均可根据本方法确定性别：LOG10(DMRT/FOXL2)大于2为雄性个体，LOG10(DMRT/FOXL2)小于0为雌性个体。如图1所示，三个个体为一组，依次为休止期、增殖期、生长期、成熟期卵巢和休止期、增殖期、生长期和成熟期精巢。
该方法鉴定的结果，与性腺石蜡切片鉴定结果完全一致。说明本发明适用于各性腺发育时期成体虾夷扇贝的性别鉴定。
实施例2
(1)受检个体性腺取材
二龄虾夷扇贝取自辽宁省大连市獐子岛综合试验站，于2015年7月至2015年12月每月低温取回些许成体材料，放于实验室充气循环水池中暂养。待新陈代谢稳定再进行解剖，性腺取材需规避其它组织的污染，将其剪切成直径为5mm左右小块。一部分用波恩氏液固定24h，然后保存于4℃的70％酒精中，用于石蜡切片；一部分在液氮中速冻后，存放于-80℃超低温冰箱，用于RNA提取。
(2)石蜡切片确定时期
流程为：脱水，透明，渗蜡、包埋，切片、贴片、展片，染色、封片，镜检拍照。
(3)总RNA提取
选取性腺透明且无法通过组织切片确定性别的12个虾夷扇贝，Trizol法提取总RNA。所得RNA用1％琼脂糖凝胶电泳检测完整性，并通过分光光度计Nanovue Plusspectrophotometer测定浓度。
(4)反转录合成cDNA
在200μl PCR(RNase&DNase-free)管中配制如下混合液：
总RNA 2μg
Oligo d(T)18(20μM) 1μl
H2O(RNase&DNase-free) 补至12.5μl
65℃温育5min后迅速在冰上冷却2min以上，然后在上述混合液中再加入如下反应物：
混匀离心后置于PCR仪中，42℃90min，70℃10min。得到的cDNA溶液-20℃保存。
(5)实时定量PCR检测FOXL2和DMRT的表达量
设计虾夷扇贝FOXL2和DMRT基因的特异性引物，引物序列为：
FOXL2 F:AACTTCTGGACATTGGACCCTGCTT
R:CCGCAGTGGTTGTCAGCAAATAAGG
DMRT F:ACAGATTCCCTACAGATGCT
R:TTATTCATGGCGGCGTCTAT
每个实验个体设三个技术重复。反应体系如下：
根据
480(Roche)实时荧光定量PCR仪说明书的要求，反应条件如下：50℃2min；94℃10min；94℃15s，60℃1min，40个循环；94℃15s，每10s降温0.5℃直至55℃，55℃1min。为排除引物二聚体及非特异性扩增产物对基因表达定量的影响，反应过程中温度由94℃至55℃缓慢降低，连续采集荧光信号并获取熔解曲线。
(6)用2-△Ct方法处理数据，计算LOG10(DMRT/FOXL2)，确定性别
根据所得结果，性腺透明且组织切片无法确定性别的二龄虾夷扇贝均可根据本方法确定性别：LOG10(DMRT/FOXL2)大于2为雄性个体，LOG10(DMRT/FOXL2)小于0为雌性个体，如图2所示。
经过该方法鉴定的虾夷扇贝，性别识别率高达100％。说明本发明适用于性腺透明且组织切片无法确定性别的成体虾夷扇贝的性别鉴定。
实施例3
(1)受检个体性腺取材
二龄栉孔扇贝取自山东省青岛市八仙墩养殖有限公司，于2015年12月至2016年4月每月低温取回些许成体材料，放于实验室充气循环水池中暂养。待新陈代谢稳定再进行解剖，性腺取材需规避其它组织的污染，将其剪切成直径为5mm左右小块。一部分用波恩氏液固定24h，然后保存于4℃的70％酒精中，用于石蜡切片；一部分在液氮中速冻后，存放于-80℃超低温冰箱，用于RNA提取。
(2)石蜡切片确定时期
流程为：脱水，透明，渗蜡、包埋，切片、贴片、展片，染色、封片，镜检拍照。
(3)总RNA提取
选取性腺透明且无法通过组织切片确定性别的12个栉孔扇贝，Trizol法提取总RNA。所得RNA用1％琼脂糖凝胶电泳检测完整性，并通过分光光度计Nanovue Plusspectrophotometer测定浓度。
(4)反转录合成cDNA
在200μl PCR(RNase&DNase-free)管中配制如下混合液：
总RNA 2μg
Oligo d(T)18(20μM) 1μl
H2O(RNase&DNase-free) 补至12.5μl
65℃温育5min后迅速在冰上冷却2min以上，然后在上述混合液中再加入如下反应物：
混匀离心后置于PCR仪中，42℃90min，70℃10min。得到的cDNA溶液-20℃保存。
(5)实时定量PCR检测FOXL2和DMRT的表达量
设计栉孔扇贝FOXL2和DMRT基因的特异性引物，引物序列为：
FOXL2 F:CCTAAGGTGGAGATGTGTGGACGAG
R:AATACAGTCCAAGGCAAGTGGTCGT
DMRT F:CTCCCCTTCGCTCCCCTAA
R:GCAGAATCGCTTGTGCCCCT
每个实验个体设三个技术重复。反应体系如下：
根据
480(Roche)实时荧光定量PCR仪说明书的要求，反应条件如下：50℃2min；94℃10min；94℃15s，60℃1min，40个循环；94℃15s，每10s降温0.5℃直至55℃，55℃1min。为排除引物二聚体及非特异性扩增产物对基因表达定量的影响，反应过程中温度由94℃至55℃缓慢降低，连续采集荧光信号并获取熔解曲线。
(6)用2-△Ct方法处理数据，计算LOG10(DMRT/FOXL2)，确定性别
根据所得结果，性腺透明且组织切片无法确定性别的二龄栉孔扇贝均可根据本方法确定性别：LOG10(DMRT/FOXL2)大于2为雄性个体，LOG10(DMRT/FOXL2)小于0为雌性个体，如图3所示。
经过该方法鉴定的栉孔扇贝，性别识别率高达100％。说明本发明适用于成体栉孔扇贝的性别鉴定。
上面以举例方式对本发明进行了说明，但本发明不限于上述具体实施例，凡基于本发明所做的任何改动或变型均属于本发明要求保护的范围。
Claims (1)
1.一种基于实时定量PCR的栉孔扇贝性别鉴定的方法，其特征是：首先提取所需性别鉴定贝类个体的性腺总RNA，反转录合成cDNA，然后设计两对贝类雌雄性别表征基因的特异性引物，实时定量PCR检测其表达量，用2-△Ct方法计算雄性与雌性表征基因的相对表达量，进行LOG10转换，确定性别；
所述的两对贝类雌雄性别表征基因是FOXL2和DMRT；
所述的用2-△Ct方法计算雄性与雌性表征基因的相对表达量，进行LOG10转换，确定性别；如果获得的LOG10(DMRT/FOXL2)数值大于2，则该个体为雄性；如果获得的LOG10(DMRT/FOXL2)数值小于0，则该个体为雌性；
其中栉孔扇贝FOXL2和DMRT基因的特异性引物的序列如下：
FOXL2 F:CCTAAGGTGGAGATGTGTGGACGAG、
R:AATACAGTCCAAGGCAAGTGGTCGT、
DMRT F:CTCCCCTTCGCTCCCCTAA、
R:GCAGAATCGCTTGTGCCCCT。
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