CN106701966B

CN106701966B - 基于分析pcr副产物焦磷酸的病原微生物快速检测方法

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Publication number: CN106701966B
Application number: CN201710042607.XA
Authority: CN
Inventors: 肖鹏峰; 周东蕊; 陈玲
Original assignee: Southeast University
Current assignee: Southeast University
Priority date: 2017-01-20
Filing date: 2017-01-20
Publication date: 2020-12-11
Anticipated expiration: 2037-01-20
Also published as: CN106701966A

Abstract

本发明公开了一种基于分析PCR副产物焦磷酸的病原微生物快速检测方法，包括如下步骤：(1)检索病原微生物特征核酸序列片段；(2)针对该特征核酸序列片段，设计一对特异的PCR引物；(3)提取待检测样本微生物基因组，并用特异的PCR引物进行PCR扩增；(4)分析PCR扩增中焦磷酸；(5)根据分析结果判定PCR反应是否发生与发生的多少，确定样本中是否含有该病原微生物及其DNA浓度。本发明的方法可以准确的检测出样本中是否含有该病原微生物及其含量；该检测分析方法灵敏度高，检测快，操作流程简单，容易实施，能对大样本实施快速分析。

Description

基于分析PCR副产物焦磷酸的病原微生物快速检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种一种基于分析PCR副产物焦磷酸的病原微生物快速检测方法，适用于食品安全、饮用水安全监测、临床样本诊断等特定致病微生物的快速鉴定。

背景技术

引起人类疾病和食物中毒的致病性微生物(如:沙门氏菌、葡萄球菌、链球菌、副溶血性弧菌、变形杆菌、志贺氏菌、禽流感病毒、黄曲霉菌及病毒、口蹄疫病毒等)的检测在食品、卫生和医疗领域具有重要的意义。传统的培养法检测操作步骤繁琐、耗时长，不能满足快速检测于诊断的需求。

分子生物学为致病性微生物的快速检测提供了可能。原理上，针对某个微生物的定性分析而言，现有非常多得到了广泛的应用的成熟分子生物学方法和技术，大致分为两类。一类是实时跟踪PCR(聚合酶链式反应)：如实时定量PCR技术，实时熔解曲线分析等；另一类是PCR完成后、对PCR产物进行分析：如核酸序列分析的金标准Sanger DNA测序技术，DNA芯片技术。上述两类均涉及PCR、且各有优劣，前者快速、但需要昂贵的仪器和试剂；后者繁琐、耗时。发展特定核酸序列片段的快速、低成本检测在诸如卫生、食品等行业越来越受到重视和必需。

PCR技术是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，能将微量的DNA大幅增加。然而，在现有的分子生物学检测微生物技术中，所有分析的对象均为PCR反应中产生的DNA序列，其理论量为样本中核酸拷贝数的2^N-1(N为PCR循环数)，如果采用电泳等简单、快速的方法分析，则样本中核酸拷贝数目需要达到数百个才能通过电泳条带清晰判断PCR反应是否发生，对低丰度样本无法实施有效检测。

实际上，在PCR过程中，每合成一个核苷酸、PCR引物便会延伸一个碱基长度，同时也会伴随产生一个副产物焦磷酸分子。如果每条一条引物在PCR过程中延伸100个碱基，在一对DNA模板在一个PCR过程要产生200个焦磷酸分子；也就是说PCR过程中，产生的焦磷酸分子数目一般为DNA的几百倍。因此，如果检测DNA与焦磷酸的灵敏度相当，则检测焦磷酸分子的灵敏度应当比检测DNA分子提高几百倍。因此，选择分析PCR副产物焦磷酸，而非PCR产物DNA片段其灵敏度更大，更适合低丰度核酸序列的分析。

现有非常多的分析方法用于焦磷酸的定量分析技术，应用焦磷酸分析的一个典型例子为焦测序。该技术是将PCR扩增后的DNA片段进行检测，即通过获取PCR产物的单链DNA，然后杂交测序引物，测序引物延伸核苷酸进行测序，而测序信号的获取是通过核苷酸延伸反应释放出的焦磷酸分子实现的：通过分析单个测序反应中是否有焦磷酸产生、及其产生的量可以判断测序反应是否有核苷酸合成、以及合成的数目。其原理是反应底物为5'-磷酰硫酸、荧光素，在腺嘌呤核苷三磷酸硫酸化酶的作用下，焦磷酸可以和5'-磷酰硫酸结合形成腺嘌呤核苷三磷酸，在荧光素酶的催化下，生成的腺嘌呤核苷三磷酸又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过检测装置可获得一个检测峰，峰值的高低和焦磷酸的量成正比。但是现有技术中通常是将PCR扩增后的DNA片段进行检测，即通过获取PCR产物的单链DNA，然后杂交测序引物，测序引物延伸核苷酸进行测序，而测序信号的获取是通过核苷酸延伸反应释放出的焦磷酸分子实现的，这种检测依然存在操作流程复杂、耗时长、以及检测限等问题。

发明内容

发明目的：针对现有技术在微生物检测中存在操作流程复杂、耗时长、以及检测限等问题，本发明提供一种基于分析PCR副产物焦磷酸的病原微生物快速检测方法，该方法根据检测的病原微生物，从公用数据库中检索一段代表该微生物特征的核酸序列片段、并设计一对特异的PCR引物，通过对样本基因组特异PCR扩增、并分析PCR扩增中产生的总焦磷酸判定PCR反应是否发生与发生的多少，从而推导出是否含有该特定的微生物及其DNA浓度。该检测分析方法灵敏度高，检测快，操作流程简单，容易实施，能对大样本实施快速分析。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述的一种基于分析PCR副产物焦磷酸的病原微生物快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)根据检测的病原微生物，从数据库中检索出一段代表该微生物的特征核酸序列片段；

(2)针对该特征核酸序列片段，设计一对特异的PCR引物；

(3)提取样本微生物基因组，并用特异的PCR引物进行PCR扩增；

(4)分析PCR扩增中焦磷酸；

(5)根据分析结果判定PCR反应是否发生与发生的多少，确定样本中是否含有该微生物及其含量。

其中，步骤(1)中所述的特征核酸序列片段为需要检测的微生物唯一具有、其它生物中不具有、并且通过公用数据库可以获得的核酸序列信息。

步骤(3)中所述PCR扩增是特异的，只扩增步骤(1)中特征核酸序列片段，不扩增其它序列片段。

步骤(4)中所述分析PCR扩增中焦磷酸是通过焦磷酸化学发光分析法，直接分析PCR产物中的总焦磷酸来实现的。

所述焦磷酸化学发光分析法通过采用焦磷酸检测试剂盒来实施或通过配制的化学发光试剂来实施。

所述焦磷酸检测试剂盒为SIGMA-ALDRICH公司的焦磷酸检测试剂盒。

进一步地，所述配制的化学发光试剂主要成份为：0.01～0.5M Tris-acetate(pH7.7),10～50mM EDTA,1～5mM Mg(Ac)₂，0.02％～0.1％牛血清白蛋白(BSA)，1～5mM二硫苏糖醇(DTT)，10～50mM 5'-磷酰硫酸(APS)，0.2～1.0mg/mL聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，2～10mM荧光素(D-luciferin)，50～800mM荧光素酶。通常为0.01M Tris-acetate(pH 7.7),20mMEDTA,1mM Mg(Ac)₂，0.02％牛血清白蛋白(BSA)，1mM二硫苏糖醇(DTT)，10mM 5'-磷酰硫酸(APS)，0.4mg/mL聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，4mM荧光素(D-luciferin)，800mM荧光素酶。

进一步地，所述焦磷酸化学发光分析法中光信号的检测抗原用光电二极管或者电荷耦合元件(CCD)；可以单个检测，也可以并行检测。

其中，步骤(5)中所述确定样本中是否含有该微生物是通过设定的焦磷酸CV值来判断的：焦磷酸分析信号强度大于CV值判定为有、与之对应为样本中是含有该微生物，小于CV值判定为无、与之对应为样本中是不含该微生物；

步骤(5)中所述确定样本中该微生物含量的定量分析是指先通过一系列该微生物已知浓度经过步骤(1)—(5)，建立浓度与信号强度的关系曲线后，再分析样本得到的信号强度，从关系曲线上求得该微生物具体浓度。

本发明基于PCR过程中产生数百倍于DNA量的焦磷酸用于判断最终PCR反应是否发生、以及反应程度，同时倒推出参与PCR反应的样本中是否含有某种微生物及其含量。由于焦磷酸检测是成熟的技术，市场上有相应的试剂盒出售(SIGMA-ALDRICH公司等)。因此，只需构建一个简单的光信号检测装置就可以实现对焦磷酸的定量分析。

有益效果：现有技术相比，本发明是直接检测PCR过程中产生的大量焦磷酸，来判断PCR反应是否发生；而现在技术公开的是焦磷酸测序技术，是将PCR扩增后的DNA片段进行检测，即通过获取PCR产物的单链DNA，然后杂交测序引物，测序引物延伸核苷酸进行测序，而测序信号的获取是通过核苷酸延伸反应释放出的焦磷酸分子实现的。因此，虽然都是检测焦磷酸分子，区别在于：1、现有技术中公开的焦磷酸测序技术是实时检测单个测序反应的焦磷酸分子；而本发明检测的是PCR反应产生的总焦磷酸分子。2、检测的对象不同，现有技术公开的焦磷酸测序技术检测的对象是PCR产物的DNA序列；而本发明检测的对象是PCR产物的焦磷酸。

本发明具有下列优点：

1、本发明选择微生物的该特征核酸序列片段设计特定的引物，通过检测PCR副产物中的焦磷酸，可以准确的检测出样本中是否含有该微生物及其DNA浓度。

2、本发明采用检测数百倍DNA分子的焦磷酸来跟踪PCR反应，其灵敏度比传统检测DNA分子方法的灵敏度高。

3、本发明采用直接检测PCR产物中焦磷酸含量，PCR完成，3分钟内可以完成样本的分析，其检测速度比传统的检测DNA分子方法快。

4、本发明的方法能对大样本实施快速分析，可以用于初筛、也可以用于检测。

5、本发明可以采用简易的光学检测装置实现焦磷酸的定量分析，操作流程简单，容易实施。

附图说明

图1为本发明实施例1中志贺菌DNA模板浓度C(ng/μL)与荧光信号强度(Y)的标准曲线；

图2为本发明实施例1中不同含量志贺菌的PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测结果。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：鸡肉中志贺菌的检测

1、基因组DNA样本制备：采用PBS(PH＝7.2)将鸡肉表面的细菌冲洗下来，然后采用细菌DNA提取试剂盒将冲洗下来的细菌DNA提取出，低温保存备用。

2、PCR引物设计与PCR反应

针对志贺菌特征核酸序列片段，志贺菌的ipaH基因是编码分泌毒力蛋白的基因，与该菌致病性密切相关，是志贺菌属特有的，根据GenBank accession no.M76445.1设计正向引物和反向引物：

SEQ ID NO 1为正向引物F:5’ACTATTGGCTCTGGATGTT 3’，

SEQ ID NO 2为反向引物R:5’GGGCGATGGAGTGTATT 3’；

(在GeneBank数据库中检索扩增基因的序列，提交到引物设计软件Primer5.0中进行引物设计，其特异性可以通过NCBI BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行同源序列比对)，要求引物特异性强，无或较少引物二聚体、误引等。

将设计的引物合成并做如下PCR反应：

(1)标准曲线的测定：25μL的PCR扩增体系包含：基因组DNA分别为126、1.26、1.26×10^-2、1.26×10^-4、1.26×10^-6、0ng/μL，0.2mM dNTP，0.8μM正向引物和0.8μM反向引物，2UTaq DNA聚合酶，1×扩增缓冲液，1.5mM MgCl₂。扩增条件：94℃预变性5分钟，35个热循环(94℃变性30秒～54℃退火30秒～72℃延伸30秒)，最后72℃延伸5分钟。

(2)实际样本的检测：25μL的PCR扩增体系包含：200ng基因组DNA，0.2mM dNTP，0.8μM正向引物和0.8μM反向引物，2U Taq DNA聚合酶，1×扩增缓冲液，1.5mM MgCl₂。扩增条件：94℃预变性5分钟，35个热循环(94℃变性30秒～54℃退火30秒～72℃延伸30秒)，最后72℃延伸5分钟。

3、PCR产物检测

(1)化学发光体系准备

采用下列自制的配方反应体系(S-mix)：0.01M Tris-acetate(pH 7.7),20mMEDTA,1mM Mg(Ac)₂，0.02％牛血清白蛋白(BSA)，1mM二硫苏糖醇(DTT)，10mM 5'-磷酰硫酸(APS)，0.4mg/mL聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，4mM荧光素(D-luciferin)，800mM荧光素酶。

(2)PCR产物检测

A.开启微弱发光测量仪，设置温度和高压值。

B.准备1.5mL离心管，加入400μL化学发光体系(S-mix)溶液。

C.检查微弱发光测量仪的快门是否关闭，快门关闭下打开样品室的盖子，将离心管放入样品室，盖上上盖，打开快门，测量化学发光体系溶液的本底信号。

D.关闭快门后打开上盖，取出离心管。在加入化学发光体系溶液中加入1μL的PCR扩增产物，振荡混合均匀。然后放入样品室，打开快门，测量得到PCR扩增产物的荧光信号值。记录测量得到的数据。

E.测量完毕后，关闭快门、测量仪。

F.根据志贺菌DNA标准浓度下测量所得的CV值，将所测样品的荧光信号值与CV值进化比较，信号强度大于CV值判定为有、与之对应为样本中是含有该微生物，小于CV值判定为无、与之对应为样本中是不含微生物。

(3)结果判断

A.测定结果：绘制标准曲线和实际样本的测定结果见表1。根据不同浓度下的荧光信号值，测量样品的信号强度大于45000的为阳性样品，表示该样品中含有该微生物。信号强度位于45000与56000之间的为轻度污染；信号强度位于56000与88000之间的为中度污染，信号强度大于88000的为重度污染。

表1.不同DNA模板浓度下PCR产物的荧光信号强度。

B.标准曲线的绘制：根据表1中已知DNA模板浓度(C)测得的荧光信号强度(Y)绘制测量曲线图1，拟合得到的曲线方程式为Y＝11750X+86300，X为DNA浓度的对数(lgC)，Y为测得的荧光信号强度减去空白对照的荧光信号强度(24000)。

C.实际样本检测结果：本实施例2测得样品1的信号强度为45000，根据标准曲线(图1)，可知其检出的志贺菌DNA浓度为3.98×10^-6ng/μL，为轻度污染；样品2的信号强度为22000，与空白对照24000相当，未检出志贺菌，没有污染。

对比例1：志贺菌对比检测方法

(1)已知志贺菌基因组DNA的PCR产物电泳检测

1、基因组DNA样本制备：采用PBS(PH＝7.2)将鸡肉表面的细菌冲洗下来，然后采用细菌DNA提取试剂盒将冲洗下来的细菌DNA提取出、并确定基因组DNA的的浓度。

2、PCR引物设计与PCR反应

SEQ ID NO 1为正向引物F:5’ACTATTGGCTCTGGATGTT 3’，

SEQ ID NO 2为正向引物R:5’GGGCGATGGAGTGTATT 3’；

将设计的引物合成并做如下PCR反应(不加DNA模板为空白对照)：

25μL的PCR扩增体系包含：基因组DNA模板浓度分别为126、1.26、1.26×10^-2、1.26×10^-4、1.26×10^-6、0ng/μL，0.2mM dNTP，0.8μM正向引物和0.8μM反向引物，2U Taq DNA聚合酶，1×扩增缓冲液，1.5mM MgCl₂。扩增条件：94℃预变性5分钟，35个热循环(94℃变性30秒～54℃退火30秒～72℃延伸30秒)，最后72℃延伸5分钟。

3、PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测

将5微升PCR产物上样于浓度为1％的琼脂糖凝胶，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(电泳条件：120V，20分钟)，观察条带是否清晰，检测结果如图2。图2中，不同含量志贺菌的PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测结果。图中M、1、2、3、4、5、6分别为已知长度的DNA片段(Marker)、PCR模板浓度分别为126、1.26、1.26×10^-2、1.26×10^-4、1.26×10^-6、0ng/μL。

(2)志贺菌培养检测方法

1、配制BPW培养基：称取BPW培养基20.1g，加入蒸馏水1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，以90mL/瓶分装到各锥形瓶，并于121℃灭菌15min，冷至常温。

2、培养基冷却至室温后，对培养基和整个房间进行紫外灭菌15分钟,关灯60min后使用。

3、预增菌：称量鸡肉样品10g至含BPW培养基的锥形瓶，并及时盖上盖子，150rpm下振荡10min，于36℃±1℃培养18h左右。

4、配制TTB增菌液：取TTB增菌液基础93.6g，加入蒸馏水1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装于锥形瓶中，每瓶100mL。将锥形瓶放入灭菌锅中，121℃灭菌20min；冷至30℃，每100mL基础培养基中加入TTB配套试剂碘液和煌绿各一支(开启前用75％酒精棉消毒西林瓶表面)，混合均匀。

5、增菌

6、接种和培养：轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1mL，转种于9mL TTB增菌液内，于42℃±1℃培养18h～24h。

7、观察培养现象。

8、配制志贺菌显色培养基平板。

9、取瓶内干粉4.75g，用100mL蒸馏水溶解，可按比例扩大或者缩小。

10、混合加热至100℃，搅拌加热至完全溶解，冷却至50℃倒平板。

11、样品用画线或者涂布法接种，37℃培养24小时。

12、观察菌落颜色。

通过与已知志贺菌DNA浓度样本的电泳检测对比分析，本发明的基于分析PCR副产物焦磷酸的病原微生物快速检测方法可以检测到的基因组DNA模板最低浓度为1.26×10^- ⁶ng/μL，而传统的PCR产物电泳检测法无法对基因组DNA模板浓度为1.26×10^-2ng/μL的样本进行检测，因而更灵敏。

通过实际样本培养检测法的对比分析，本发明的基于分析PCR副产物焦磷酸的病原微生物快速检测方法与培养检测法结果一致。

培养检测法是一种严格、准确的微生物检测方法，但这一方法操作流程复杂、耗时长，不适合微生物的快速检测；微生物PCR产物的电泳检测法是目前快速检测的一种定性分析方法，相对于微生物PCR产物的电泳检测法，实施例1的方法不仅耗时更短，且能对检测出微生物进行定量分析。因此，本发明基于分析PCR副产物焦磷酸的病原微生物快速检测方法检测快，操作流程简单，容易实施，能对大样本实施快速分析，非常适合食品、卫生等行业的微生物快速检测。

实施例2

实施例2采用和实施例1相同的方法，不同之处在于焦磷酸化学发光分析法采用SIGMA-ALDRICH公司购买的焦磷酸检测试剂盒，检测结果与实施例1类似。

SEQUENCE LISTING

<110> 东南大学

<120> 基于分析PCR副产物焦磷酸的病原微生物快速检测方法

<130> 2017.01.20

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

actattggct ctggatgtt 19

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gggcgatgga gtgtatt 17

Claims

1.一种基于分析PCR副产物焦磷酸的病原微生物快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：基因组DNA样本制备：采用PBS pH=7.2将鸡肉表面的细菌冲洗下来，然后采用细菌DNA提取试剂盒将冲洗下来的细菌DNA提取出，低温保存备用；

步骤2：PCR引物设计与PCR反应

针对志贺菌特征核酸序列片段，志贺菌的ipaH基因是编码分泌毒力蛋白的基因，与该菌致病性密切相关，是志贺菌属特有的，根据GenBank accession no. M76445.1设计正向引物和反向引物：

SEQ ID NO 1为正向引物F: 5’ ACTATTGGCTCTGGATGTT 3’，

SEQ ID NO 2为反向引物R: 5’ GGGCGATGGAGTGTATT 3’；

将设计的引物合成并做如下PCR反应：

（1）标准曲线的测定：25μL的PCR扩增体系包含：基因组DNA分别为126、1.26、1.26×10^-2、1.26× 10^-4、1.26×10^-6、0 ng/μL，0.2mM dNTP，0.8 μM正向引物和0.8 μM反向引物，2 UTaq DNA聚合酶，1×扩增缓冲液，1.5 mM MgCl₂；扩增条件：94℃预变性5分钟，35个热循环94℃变性30秒～54℃退火30秒～72℃延伸30秒，最后72℃延伸5分钟；

（2）实际样本的检测：25μL的PCR扩增体系包含：200 ng基因组DNA，0.2mM dNTP，0.8 μM正向引物和0.8 μM反向引物，2 U Taq DNA聚合酶，1×扩增缓冲液，1.5 mM MgCl₂；扩增条件：94℃预变性5分钟，35个热循环94℃变性30秒～54℃退火30秒～72℃延伸30秒，最后72℃延伸5分钟；

步骤3：PCR产物检测

（1）化学发光体系准备

采用下列自制的配方反应体系：0.01 M Tris-acetate pH 7.7，20 mM EDTA，1 mM Mg(Ac)₂，0.02%牛血清白蛋白BSA， 1 mM二硫苏糖醇， 10 mM 5'-磷酰硫酸，0.4 mg/mL聚乙烯吡咯烷酮，4 mM 荧光素，800 mM荧光素酶；

（2）PCR产物检测

A.开启微弱发光测量仪，设置温度和高压值；

B.准备1.5mL离心管，加入400μL 化学发光体系S-mix溶液；

C. 检查微弱发光测量仪的快门是否关闭，快门关闭下打开样品室的盖子，将离心管放入样品室，盖上上盖，打开快门，测量化学发光体系溶液的本底信号；

D.关闭快门后打开上盖，取出离心管，在加入化学发光体系溶液中加入1μL的PCR扩增产物，振荡混合均匀，然后放入样品室，打开快门，测量得到PCR扩增产物的荧光信号值，记录测量得到的数据；

E. 测量完毕后，关闭快门、测量仪；

F．根据志贺菌DNA标准浓度下测量所得的CV值，将所测样品的荧光信号值与CV值进化比较，信号强度大于CV值判定为有、与之对应为样本中是含有该微生物，小于CV值判定为无、与之对应为样本中是不含微生物；同时建立浓度与信号强度的关系曲线后，再分析样本得到的信号强度，从关系曲线上求得该微生物DNA具体浓度。