CN106701650B

CN106701650B - 一株鸭疫里默氏杆菌基因缺失弱毒株及其构建方法与应用

Info

Publication number: CN106701650B
Application number: CN201710022087.6A
Authority: CN
Inventors: 刘马峰; 税芸; 黄觅; 程安春; 汪铭书; 朱德康; 贾仁勇; 陈舜
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2017-01-12
Filing date: 2017-01-12
Publication date: 2019-11-08
Anticipated expiration: 2037-01-12
Also published as: CN106701650A

Abstract

本发明公开了一株鸭疫里默氏杆菌基因缺失弱毒株及其构建方法与应用，该菌株是Riemerella anatipestifer CH‑1ΔB739_1343，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO:M2016438，缺失了血红素转运系统B739_1343基因的2352bp，所缺失的基因序列如SEQ ID NO.1所示。动物实验结果表明缺失株的LD₅₀值大于10¹⁰CFU，RA‑CH‑1的LD₅₀值约为10⁸CFU；缺失株对雏鸭的致病力下降了至少100倍。该弱毒株对剂量>100×LD₅₀的野生强毒株RA‑CH‑1的攻毒保护率达83.33％，可作为RA基因缺失疫苗的候选菌株。

Description

一株鸭疫里默氏杆菌基因缺失弱毒株及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一株鸭疫里默氏杆菌基因缺失弱毒株及其构建方法与应用。

背景技术

鸭疫里默氏杆菌病是由鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)引起的一种主要侵染雏鸭等多种禽类的急性或慢性的接触性传染病。该病分布范围广，已成为严重危害养鸭业的细菌性传染病之一。目前，我国控制该病的主要措施是疫苗预防和药物治疗。由于鸭疫里默氏杆菌存在多种血清型且各血清学之间无交叉保护作用，所以一种疫苗只能针对一种血清型起作用。而药物的大量使用导致RA的耐药性不断增强，同时也给食品造成了安全隐患。所以研制预防RA病的新型疫苗是未来的发展方向。

铁元素是绝大多数生物体生长所必需的营养元素，包括细菌。然而，宿主通过“营养免疫”机制极大地限制了铁的可利用度。因此病原菌必须拥有铁转运机制才能成功感染宿主。相反，如果病原菌铁离子利用系统遭到损伤，则感染宿主的能力减弱。利用此原理可以产生鸭疫里默氏杆菌弱毒株并用于免疫预防。

发明内容

有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一株鸭疫里默氏杆菌基因缺失弱毒株及其构建方法与应用。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一株鸭疫里默氏杆菌基因缺失弱毒株，该菌株是鸭疫里默氏杆菌CH-1ΔB739_1343，命名为Riemerella anatipestifer CH-1ΔB739_1343，于2016年8月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO:M2016438，该菌株缺失了血红素转运系统B739_1343基因的2352bp，所缺失的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还公开了一种鸭疫里默氏杆菌基因缺失弱毒株的构建方法，包括以下步骤：

1)PCR扩增RA-CH-1B739_1343基因左右同源臂及Spec抗性基因；

2)将扩增好的RA-CH-1B739_1343基因左右同源臂及Spec抗性基因进行酶切并连接过夜，构建B739_1343-LSR片段；

3)构建重组自杀性质粒pEX18GMΔB739_1343-LSR；

4)构建RA-CH-1B739_1343基因缺失株，RA-CH-1B739_1343基因缺失株即为鸭疫里默氏杆菌基因缺失弱毒株。

进一步地，步骤1)中PCR扩增RA-CH-1B739_1343基因左右同源臂及Spec抗性基因具体为：

1.1)根据B739_1343基因左右同源臂设计两对引物B739_1343-L F/R和B739_1343-R F/R，并在引物5’-端添加限制性内切酶酶切位点；利用RA-CH-1基因组作为模板，分别以B739_1343-L F/R和B739_1343-R F/R为引物扩增B739_1343基因左右同源臂片段B739_1343-L和B739_1343-R；PCR条件为：98℃变性30s，经98℃10s，55℃30s，72℃30s循环扩增30次，72℃延伸7min；

其中，B739_1343-L F/R包括B739_1343-L F和B739_1343-L R，B739_1343-L F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，并在引物5’-端添加限制性内切酶酶切位点为BamHI；B739_1343-L R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，并在引物5’-端添加限制性内切酶酶切位点为NheI；

B739_1343-R F/R包括B739_1343-R F和B739_1343-R R，B739_1343-R F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，并在引物5’-端添加限制性内切酶酶切位点为EcoRI；B739_1343-R R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，并在引物5’-端添加限制性内切酶酶切位点为KpnI；

1.2)根据质粒pAM238中的Spec抗性基因片段设计引物Spec F/R，并在引物5’-端加入NheI、EcoRI酶切位点；利用质粒pAM238作为模板，以Spec F/R为引物PCR扩增Spec序列；PCR条件为：98℃变性30s，经98℃10s，55℃30s，72℃50s循环扩增30次，72℃延伸7min；

其中，Spec F/R包括Spec F和Spec R，Spec F的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，并在引物5’-端加入NheI酶切位点；Spec R的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，并在引物5’-端加入EcoRI酶切位点。

进一步地，步骤2)中的构建B739_1343-LSR片段具体为：将扩增的左侧同源臂B739_1343-L用BamHI、NheI进行双酶切，将扩增的右侧同源臂B739_1343-R用EcoRI、KpnI进行双酶切，将扩增的Spec序列用NheI、EcoRI进行双酶切；将回收的三个片段B739_1343-L、Spec、B739_1343-R连接过夜；然后以连接产物为模，用引物B739_1343-L F、B739_1343-R R扩增B739_1343-LSR片段。

进一步地，步骤3)中的构建重组自杀性质粒pEX18GMΔB739_1343-LSR具体为：将扩增的B739_1343-LSR片段和质粒pEX18GM用BamHI和KpnI进行双酶切，将回收的片段和质粒用T4连接酶连接过夜，将连接产物转化到大肠杆菌XL1-Blue感受态中，涂布于含庆大霉素的LB平板进行筛选；将得到的单克隆进行PCR鉴定，筛选出含有质粒pEX18GMΔB739_1343-LSR的阳性克隆；利用质粒小抽试剂盒抽提重组质粒并进行酶切鉴定；将鉴定正确的重组质粒转化到S17-1大肠杆菌中。

进一步地，步骤4)中的构建RA-CH-1B739_1343基因缺失株具体为：将大肠杆菌S17-1pEX18GMΔB739_1343-LSR接种于10mL的LB液体培养基中，RA-CH-1划线于含5％脱脂羊血的LB固体培养基中，37℃培养至对数生长期；刮取RA-CH-1于1mL浓度为10mmol/mL的MgSO₄溶液中，再用MgSO₄溶液洗2次；计算供体菌S17-1pEX18GMΔB739_1343-LSR达2.5×10⁸个菌数，受体菌CH-1达10⁹个菌数所需要的体积；根据计算的体积混匀供体菌、受体菌，然后注入滤器中过滤；取下滤膜平铺于血平板上，30℃5％CO₂培养8h；将滤膜上的细菌用MgSO₄溶液洗脱下来，涂布于浓度为50μg/mL的含卡那霉素和浓度为80μg/mL的壮观霉素的血平板上进行培养；挑取生长的单克隆进行PCR鉴定，构建得到鸭疫里默氏杆菌基因缺失弱毒株。

进一步地，PCR鉴定方法如下：

a)利用RA-CH-1保守序列引物16s rRNA F/R，PCR扩增RA-CH-1的16s rRNA片段，根据电泳结果判定候选突变株是否为RA-CH-1；若电泳得到的条带与以野生株CH-1为模板扩增出的条带大小一致，据此判定该候选突变株为RA-CH-1，其中，16s rRNA F的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；16s rRNA R的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

b)利用Spec抗性基因的引物Spec P1/P2，扩增Spec抗性基因片段，根据电泳结果判断是否发生基因的替换；若电泳得到的条带与阳性对照大小一致，且以野生株RA-CH-1为模板未能扩增出条带，据此判断Spec基因已经替换到候选突变株基因组上；Spec F的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；Spec R的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；

c)利用引物B739_1343F/R，扩增目的基因，根据电泳结果检测B739_1343基因是否被缺失；若以候选突变株RA-CH-1ΔB739_1343为模板未能扩增出条带，以野生株RA-CH-1为模板扩增得到的条带，且与目的条带预期大小一致，据此判定候选突变株的基因B739_1343已被缺失；其中，B739_1343F的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；B739_1343R的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；

d)利用引物SacB F/R，进行扩增，根据电泳结果检测自杀载体是否被甩出基因组；若以质粒pEX18GM为模板扩增得到的条带，与SacB基因预期大小一致，而以RA-CH-1、候选突变株RA-CH-1ΔB739_1343为模板未能扩增出条带，据此判定自杀载体被甩出基因组；其中，SacB F的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；SacB R的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。

本发明还公开了一种鸭疫里默氏杆菌基因缺失弱毒株在制备鸭疫里氏杆菌弱毒疫苗中的应用。

进一步地，该弱毒株RA-CH-1ΔB739_1343对剂量>100×LD₅₀的野生强毒株RA-CH-1的攻毒保护率达83.33％，能够作为RA基因缺失疫苗的候选菌株。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

1)本发明构建的弱毒株Riemerella anatipestifer CH-1ΔB739_1343对野生型强毒株的攻毒保护率达83.33％，可作为RA基因缺失疫苗的候选。

2)本发明从病原菌的营养代谢机制着手，构建了一株基因缺失弱毒株，为后续开发新型的疫苗提供了新研究方法和技术保障。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明PCR扩增B739_1343基因左右同源臂和Spec抗性基因扩增结果；其中，M：mark，1：扩增的左侧同源臂B739_1343-L，2：扩增的右侧同源臂B739_1343-R，3：扩增的Spec抗性基因序列；

图2是本发明重组自杀性质粒pEX18GMΔB739_1343-LSR构建示意图；

图3是本发明RA-CH-1ΔB739_1343缺失株构建鉴定；其中，M：mark；1，2代表扩增的RA-CH-1、RA-CH-1ΔB739_1343的保守序列；3代表扩增的Spec序列，为阳性对照；4，5代表扩增的RA-CH-1、RA-CH-1ΔB739_1343的Spec序列；6，7代表扩增的RA-CH-1、RA-CH-1ΔB739_1343的B739_1343序列；8代表扩增的SacB序列，为阳性对照；9，10代表扩增的RA-CH-1、RA-CH-1ΔB739_1343的SacB序列；

图4是本发明中RA-CH-1ΔB739_1343弱毒株攻毒保护实验中雏鸭存活率统计结果。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

实施例1Riemerella anatipestifer CH-1ΔB739_1343基因缺失弱毒株的构建方法

1)RA-CH-1B739_1343基因左右同源臂及Spec抗性基因的PCR扩增：

B739_1343基因左侧同源臂B739_1343-L的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，B739_1343基因右侧同源臂B739_1343-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，Spec抗性基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

根据B739_1343基因左右同源臂设计两对引物(B739_1343-L F/R，B739_1343-RF/R),并在引物5’-端添加限制性内切酶酶切位点。

B739_1343-L F:CGGGATCCCGGTACCACCTTGGTTAATAATATTC，其核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示，在引物5’-端添加限制性内切酶酶切位点为BamHI；

B739_1343-L R:CTAGCTAGCTAGTCCAATCCAGATTGATTTC，其核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示，在引物5’-端添加限制性内切酶酶切位点为NheI；

B739_1343-R F:CGGAATTCCGCTATTAACATTTTTAATTAAAAC，其核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示，在引物5’-端添加限制性内切酶酶切位点为EcoRI；

B739_1343-R R:GGGGTACCCCTACTTAGAGAGCGTACAGCTCC，其核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示，在引物5’-端添加限制性内切酶酶切位点为KpnI；

利用RA-CH-1基因组作为模板，分别以B739_1343-L F/R和B739_1343-R F/R为引物扩增B739_1343基因左右同源臂片段B739_1343-L和B739_1343-R。PCR条件为：98℃变性30s，经98℃10s，55℃30s，72℃30s循环扩增30次，72℃延伸7min。电泳结果表明扩增得到两条约800bp的条带(见图1)，与预期B739_1343-L和B739_1343-R的大小一致。

根据质粒pAM238中的Spec抗性基因片段设计引物Spec F/R，并在引物5’-端加入NheI、EcoRI酶切位点。

Spec F：CTAGCTAGCTAGCTCGACTTCGCTGCTGCCC，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，并在引物5’-端加入NheI酶切位点；

Spec R：CGGAATTCCGCGAATTGTTAGACATTATTTG，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，并在引物5’-端加入EcoRI酶切位点；

利用质粒pAM238作为模板，以Spec F/R为引物PCR扩增Spec序列。PCR条件为：98℃变性30s，经98℃10s，55℃30s，72℃50s循环扩增30次，72℃延伸7min。电泳结果表明扩增得到一条约1200bp的条带(见图1)，与Spec抗性基因片段预期大小一致。

2)B739_1343-LSR片段的构建

将扩增的左侧同源臂B739_1343-L用BamHI、NheI进行双酶切，将扩增的右侧同源臂B739_1343-R用EcoRI、KpnI进行双酶切，将扩增的Spec序列用NheI、EcoRI进行双酶切。

将回收的三个片段B739_1343-L、Spec、B739_1343-R连接过夜。然后以连接产物为模，用引物B739_1343-L F、B739_1343-R R扩增B739_1343-LSR片段。

3)构建重组自杀性质粒pEX18GMΔB739_1343-LSR

将扩增的B739_1343-LSR片段和质粒pEX18GM用BamHI和KpnI进行双酶切，将回收的片段和质粒用T4连接酶连接过夜，将连接产物转化到大肠杆菌XL1-Blue感受态中，涂布于含庆大霉素的LB平板进行筛选。

将得到的单克隆进行PCR鉴定，筛选出含有质粒pEX18GMΔB739_1343-LSR的阳性克隆。利用质粒小抽试剂盒抽提重组质粒并进行酶切鉴定。将鉴定正确的重组质粒转化到S17-1大肠杆菌中。重组自杀性质粒pEX18GMΔB739_1343-LSR构建示意图见图2。

4)RA-CH-1 B739_1343基因缺失株的构建

本发明采用细菌接合转移方法，以大肠杆菌S17-1 pEX18GMΔB739_1343-LSR为供体菌，RA-CH-1为受体菌进行接合转移，具体步骤如下：

将大肠杆菌S17-1 pEX18GMΔB739_1343-LSR接种于10mL的LB液体培养基中，RA-CH-1划线于含5％脱脂羊血的LB固体培养基(血平板)中，37℃培养至对数生长期；刮取RA-CH-1于1mL浓度为10mmol/mL的MgSO₄溶液中，再用MgSO₄溶液洗2次；计算供体菌S17-1pEX18GMΔB739_1343-LSR达2.5×10⁸个菌数，受体菌RA-CH-1达10⁹个菌数所需要的体积；根据计算的体积混匀供体菌、受体菌，然后注入滤器中过滤；取下滤膜平铺于血平板上，30℃5％CO₂培养8h；将滤膜上的细菌用MgSO₄溶液洗脱下来，涂布于含卡那霉素(50μg/mL)和壮观霉素(80μg/mL)的血平板上进行培养；挑取生长的单克隆进行PCR鉴定。

PCR鉴定的步骤为：

a)利用RA-CH-1保守序列引物16s rRNA F/R，PCR扩增RA-CH-1的16s rRNA片段(960bp)，判定候选突变株是否为RA-CH-1。电泳结果表明以候选突变株(RA-CH-1ΔB739_1343)为模板扩增得到一条约1000bp的条带(见图3)，与以野生株CH-1为模板扩增出的条带大小一致，据此判定该候选突变株为RA-CH-1；

其中，16s rRNA F/R包括16s rRNA F和16s rRNA R，16s rRNA F：CTTCGGATACTTGAGAGCG，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；16s rRNA R：GCAGCACCTTGAAAATTGT，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

b)利用Spec抗性基因的引物Spec P1/P2，扩增Spec抗性基因片段(1140bp)，判断是否发生基因的替换。电泳结果表明以候选突变株(RA-CH-1ΔB739_1343)为模板扩增得到一条约1000bp的条带(见图3)，与阳性对照大小一致，且以野生株RA-CH-1为模板未能扩增出条带，据此判断Spec基因已经替换到候选突变株基因组上；

其中，Spec P1/P2包括Spec P1和Spec P2，Spec P1：CTCGACTTC GCTGCTGCCC，其核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；Spec P2：CGAAT TGTTAGACATTATTTG，其核苷酸序列如SEQID NO.14所示；

c)利用引物B739_1343F/R，扩增目的基因以检测B739_1343基因是否被缺失。电泳结果表明以候选突变株(RA-CH-1ΔB739_1343)为模板未能扩增出条带，以野生株RA-CH-1为模板扩增得到一条约2000bp的条带(见图3)，与目的条带预期大小一致，据此判定候选突变株的基因B739_1343已被缺失。

其中，B739_1343F：CATGCCATGGATGATGCTGTTTTTCAGCACCG，其核苷酸序列如SEQ IDNO.15所示；B739_1343R：CTAGTCTAGATTAA AAATTAAATTGACAAGTG，其核苷酸序列如SEQ IDNO.16所示；

d)利用引物SacB F/R，进行扩增以检测自杀载体是否被甩出基因组；电泳结果表明以质粒pEX18GM为模板扩增得到一条约为1000bp的条带，与SacB基因预期大小一致，而以RA-CH-1、候选突变株(RA-CH-1ΔB739_1343)为模板未能扩增出条带(见图3)，据此判定自杀载体被甩出基因组。

其中，SacB F:CATGCCATGGATGAACATCAAAAAGTTTGC，其核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；SacB R:CTAGTCTAGACTAGTTATTTGTT AACTGTTAATTGTCCTTGTTCAAGG，其核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。

实施例2检测基因缺失株RA-CH-1ΔB739_1343对雏鸭的毒力是否减弱

测定RA-CH-1ΔB739_1343缺失株的LD₅₀值。具体步骤如下：

将RA-CH-1，RA-CH-1ΔB739_1343缺失株分别接种于TSB中，37℃180rpm振荡培养至对数生长期。常温下收集菌体，用PBS洗3遍，测定菌液OD₆₀₀值。然后准备菌液到以下4个浓度梯度：5×10¹⁰CFU/mL、5×10⁹CFU/mL、5×10⁸CFU/mL、5×10⁷CFU/mL。

将3日龄北京鸭分成4组，每组10只，每只经肌肉注射途径接种0.2mL菌液，攻毒剂量分别为10¹⁰CFU、10⁹CFU、10⁸CFU、10⁷CFU。观察记录攻毒后一周内鸭子存活情况。通过Reed-Muench法计算半数致死量。

结果：RA-CH-1ΔB739_1343缺失株的LD₅₀值大于10¹⁰CFU,RA-CH-1的LD₅₀值约为10⁸CFU(见表1)；RA-CH-1ΔB739_1343缺失株对雏鸭的致病力下降了至少100倍。

表1RA-CH-1ΔB739_1343缺失株LD₅₀的测定结果

实施例3提供弱毒株RA-CH-1ΔB739_1343作为基因缺失候选疫苗的应用

1)基因缺失候选疫苗的制备：

弱毒株RA-CH-1ΔB739_1343培养至对数生长期，收集菌体后稀释至含菌量约为5×10⁸CFU/mL。

2)免疫接种途径及剂量：

3日龄雏鸭经腿部肌肉注射免疫，0.2ml/只，免疫剂量约为10⁸CFU。

3)提供该基因缺失弱毒株的安全性检验结果：

以免疫后雏鸭的临床表现以及体重变化作为评估指标，免疫弱毒株RA-CH-1ΔB739_1343组与未免疫对照组基本上无差异。

4)提供该基因缺失弱毒株的免疫保护效果：

该弱毒株对高剂量(>100×LD₅₀)野生强毒株RA-CH-1的攻毒保护率达83.33％，而且免疫RA-CH-1ΔB739_1343组的存活的鸭子与灭活疫苗组均能正常采食、饮水、精神良好，体重增值基本无差异。

实施例4RA-CH-1ΔB739_1343弱毒株作为基因缺失候选疫苗的评价

RA-CH-1ΔB739_1343弱毒株免疫雏鸭后的安全性检验和攻毒保护力测定。

选择北京鸭为动物模型，低剂量经肌肉注射免疫RA-CH-1ΔB739_1343，再用野生株RA-CH-1攻毒，测定免疫弱毒株RA-CH-1ΔB739_1343后的攻毒保护力。具体步骤如下：

1)将弱毒株RA-CH-1ΔB739_1343接种于TSB中，37℃180rpm振荡培养至对数生长期。

2)常温下，6500rmp离心收集菌体，用PBS洗3遍，稀释后测定菌液OD₆₀₀值。

3)根据测定的OD₆₀₀值，稀释RA-CH-1ΔB739_1343到浓度约为5×10⁸CFU/mL。

4)将3日龄北京鸭分成4组，每组20只。第一组I经腿部肌肉注射0.2mL灭菌PBS，作为阴性对照；第二组II经腿部肌肉注射0.2mL浓度约为5×10⁸CFU/mL的RA-CH-1ΔB739_1343，免疫剂量约为10⁸CFU；第三组III经颈部皮下注射0.25mL商品灭活疫苗(成都天邦生物制品有限公司，浆利佳)，作为阳性对照；第四组IV不免疫不攻毒，作为空白对照。监测免疫后鸭子的临床表现，同时称量各组鸭子的体重，评估弱毒株RA-CH-1ΔB739_1343的安全性。

5)首免后12d对第一组I、第二组II、第三组III用RA-CH-1菌液经腿部注射攻毒，参照之前测定的LD₅₀值，每只攻毒剂量约为2.28×10¹⁰(>100×LD₅₀)。监测攻毒后10天内鸭子健康情况及体重变化。

结果：

RA-CH-1ΔB739_1343弱毒株免疫雏鸭后的安全性检验：在攻毒之前，免疫RA-CH-1ΔB739_1343组与其它三组鸭子平均体重无明显差异，而且鸭子采食、饮水、精神状况等临床特征均表现正常(见表2)，表明该弱毒株并不影响鸭子的生长性能，应用上安全可靠。

表2观察期间鸭子体重情况及临床表现

其中，组别I代表免疫PBS组，组别II代表免疫RA-CH-1ΔB739_1343组，组别III代表免疫商品灭活疫苗组，组别IV代表空白对照组。

RA-CH-1ΔB739_1343弱毒株免疫雏鸭后的攻毒保护力测定结果：RA-CH-1攻毒之后，商品灭活苗组和空白对照组鸭子存活率为100％；RA-CH-1ΔB739_1343免疫组存活率为85％；PBS组存活率为25％(见图3)。PBS组存活的鸭子表现消瘦、嗜睡、神经症状等，而免疫RA-CH-1ΔB739_1343组的存活的鸭子与灭活疫苗组、空白对照组均能正常采食、饮水、精神良好，且体重增值基本无差异(见表2)。RA-CH-1ΔB739_1343弱毒株攻毒保护结果表明弱毒株对高剂量(>100×LD₅₀)野生型强毒株RA-CH-1的攻毒保护率达83.33％(见表3)。

表3本发明中RA-CH-1ΔB739_1343弱毒株攻毒保护力测定结果

其中，组别II中RA-CH-1ΔB739_1343的免疫剂量约为10⁸CFU。

以上结果表明该弱毒株在应用上安全可靠，具有较高的攻毒保护效果，可作为研发新型的基因缺失疫苗的候选菌株。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川农业大学

<120> 一株鸭疫里默氏杆菌基因缺失弱毒株及其构建方法与应用

<130> 2016

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2352

<212> DNA

<213> 血红素转运系统B739_1343基因

<400> 1

atgatgctgt ttttcagcac cgttctaaat gcacagcttt accttataga aggtcaggta 60

agagatttgc acgacaatac acctttagct aatgctaaaa taagtattaa cggaaaactc 120

attaccactt ctgatactca aggaaatttt aatttttctt acaaaaaagg cactcatcat 180

cttttgataa cccacttaga ttgtgaacct tttactaaaa agataatact tgatagaaat 240

attaaaatca acattttcct tgagcatcat actaatgaaa tagaaaccgt agtagtacat 300

ggcattcata aaaagtcagg gacggcggtt atcaaaacat tagaacagtc ttttttagag 360

caaaaaacta ccgaaaatct aggcaacata ttgtctgaaa tttctggagt aaatagtatt 420

aaaacaggga ataacatttc taaacctgtt atacaaggac tttacggcag tagagtgttg 480

gtaatgaaca acggcatcaa aatggcagaa caagaatggg gcatagaaca cgctcctagc 540

gtggatccca acgcttttga ccatatagat gttgtaaagg gagcatctgc actaaagtac 600

ggtggagatg ccataggtgg cgttatacta ttagaaagtc ctaaataccc taaaaaagac 660

acccttatgg gtaaagtagc tttatcaggc atcagcaatg gtaaaggctt ggctctgaat 720

acggacatta caaagacttg gcaaaacggt tgggctttgc ggacgcaagg ttctgccaaa 780

aagctaggag atttggaaac acccaattat agtttacaaa atacgggtgc agatgaaaac 840

gcctcccact tttccctaca aaaaagggaa tacgaatacg gaatcacggc taaatattct 900

ttcatcaacc aaaattttgg aatttataaa ggggctcata tcagtaatgc aagaaacttt 960

gccgatgcca tcaataacgg acaatcctac tttacaggta attttggtta taaaatagag 1020

aatcctaaac aagaagttag ccatcacatt gctaaattgg aggcttacaa aagattagga 1080

aggctaggaa aatttacttt agaatatgcc tttcagcaaa atcatagatt tgaatacgat 1140

attcgtagag gagcgtacaa tgataaacct gctaccgacc tactactaac cacccaaagt 1200

ttggctcttt atcatctatt agaaagaccc aactggcagt gggaaacagg tctatcagga 1260

aattatcaag ttaattttcc cgacccaaaa acggagcgtt ctcgtttaat accagattac 1320

cataggtatg atgctggtgc tttttctatt ttcaaatatc aaaaaaatct ttggaaatgg 1380

gaagcagctt tgcggtacga tatgaatttc tacgatgtgt ataaatatta ccttaataaa 1440

gattgggcag cttacagcca agcgtttcat caatttgtaa ttgaaagtaa aggagtgaaa 1500

acattggtgc gtccaaaact ttattaccat aatatatcag catcgttggg tatggaatat 1560

cagcccactc gctttcttac taccaaattt aatttgataa gaaatagccg aagtcctaat 1620

gttgcagaat tattcgctga tgggctacac cacgctgctg ccattattga aaagggagat 1680

atgactatca aaaacgagga aacctaccaa gcccacctaa gcattggtat aaaagcctcc 1740

gttcttaatg gttttaaact taatcttaat ccgtattatt tcacttccga tagttttatt 1800

aaccaaacac ctaacggagt ggaaagtacc attcgtggga atttccctgt atggcaatat 1860

caacagatta aagccaaaat gtatgggata gacatagatt cagaacttaa catcactcca 1920

aaattacaat ggaatggagc gatgagctat gtgtacggac aagacttaac ccataatgaa 1980

cccttgatac ttatgcctcc aatgcagatt aaaaacgccc taagatatga taacaaaggt 2040

aaaaaaccgt ggcatataca aatagaaaac ctagtggtat ttaagcagaa aagatttcct 2100

atgaggcttt tatcctacga tgtatatgag aacaatacaa taaccaaaga gtggctagac 2160

attagtacac cacccgcagg ttatcaaatt tggaacctca atgctggagc aaagctcact 2220

agaaacattc agcttaattt gagtgttaat aatatattca atacaactta tagagaatat 2280

cttaaccgtt tgagattttt ctctgatgct ttgggacgaa atattatttt cacttgtcaa 2340

tttaattttt aa 2352

<210> 2

<211> 796

<212> DNA

<213> B739_1343基因左侧同源臂序列

<400> 2

gtaccacctt ggttaataat attcttaaca gacctaggtc ccattttaat catgttccct 60

tctataagcc cattgtaccc ttctctaatc cccatacatt ctataccata ataatgagct 120

gttcttacca ctgcccttat cgccgcattc atacctggag aatcccctcc agaagtaaga 180

actcctatcc ttttcaactt tgattctgac ataattaaat actttttagc ctagcaaata 240

taagaaattt taactacatt attttaagat ttatatcata ttattactcc tacatctatt 300

cattacatgt tcatttgtat cttagtaaat aaaagttttt ttacctttgc aaaatgtttt 360

cagggaaact tcttttcaga aaagttacaa gtataagcct tgcatgggtt tatgcattag 420

ctttactgat ggctagtgta ttccactcgc atcaagagac ttttaatagt aattataatt 480

cttcccaaaa acagaatcac aaaataatca gtttaaaggg agatgattgt tctatctgtc 540

attttttcat ttcagggcat tctctgcttc ccgaaaaggt aaactttgaa gttttagtat 600

cagtagctac tacacttata ataggctaca agacactgga catccttcag aatcaaattg 660

tttatttctt acttagagga ccgccttcta ttttatagaa ataatatcat tttcactagg 720

tgttctaccg ttttgttagg acacggtttt aaccttttaa ttttcatatc tttaaatgaa 780

atcaatctgg attgga 796

<210> 3

<211> 803

<212> DNA

<213> B739_1343基因右侧同源臂序列

<400> 3

ctattaacat ttttaattaa aacaatttta aaacattatg aaacattcat ttttaaaaac 60

cgcagtatta tccgcagtaa gtattttagc cctcaactct tgtagagata atgatgaagc 120

acctgccgat gtacacaacc acgacgaagt acaatacctt accgttacac ttaccaatac 180

tgctgataac agcacccaaa ccgctacatt cagtgcagaa ggagctgata aagagttagt 240

tttaaaagaa aacaacactt atgatgttca gttatcatta gtagctcctc atgacgacca 300

tacccacgat gttactgatg aaatcataga actaaaagag gaacattttt tcacttataa 360

tttctctaat gtagatgtta aagttactag aaaagatgaa gctgaaagca ctagaaaaga 420

tgggtctaaa ataggtctaa aaacacagtg gcaagtaaca tctgcaccaa aaacaggagc 480

taaagctaac attagacttt accaccttcc tacctctgtg aaaatgagcg gtgctaatgg 540

agacgaagca ggaactgtaa caggtggtga agaggatatt gatgctactt ttaatgttaa 600

ataatgaaat atatctatgt agacacagat attgatactt taatatgatg tttaactcaa 660

aaaatcaaac aaaatgaaaa aagtattttt actaggagca ttagctctgt acagtgctac 720

aaatgcacaa cttaaatttg gtggaaaagc aggatacgcc ttatccgaag tcggagatac 780

aggagctgta cgctctctaa gta 803

<210> 4

<211> 1140

<212> DNA

<213> Spec抗性基因

<400> 4

ctcgacttcg ctgctgccca aggttgccgg gtgacgcaca ccgtggaaac ggatgaaggc 60

acgaacccag tggacataag cctgttcggt tcgtaagctg taatgcaagt agcgtatgcg 120

ctcacgcaac tggtccagaa ccttgaccga acgcagcggt ggtaacggcg cagtggcggt 180

tttcatggct tgttatgact gtttttttgg ggtacagtct atgcctcggg catccaagca 240

gcaagcgcgt tacgccgtgg gtcgatgttt gatgttatgg agcagcaacg atgttacgca 300

gcagggcagt cgccctaaaa caaagttaaa catcatgagg gaagcggtga tcgccgaagt 360

atcgactcaa ctatcagagg tagttggcgt catcgagcgc catctcgaac cgacgttgct 420

ggccgtacat ttgtacggct ccgcagtgga tggcggcctg aagccacaca gtgatattga 480

tttgctggtt acggtgaccg taaggcttga tgaaacaacg cggcgagctt tgatcaacga 540

ccttttggaa acttcggctt cccctggaga gagcgagatt ctccgcgctg tagaagtcac 600

cattgttgtg cacgacgaca tcattccgtg gcgttatcca gctaagcgcg aactgcaatt 660

tggagaatgg cagcgcaatg acattcttgc aggtatcttc gagccagcca cgatcgacat 720

tgatctggct atcttgctga caaaagcaag agaacatagc gttgccttgg taggtccagc 780

ggcggaggaa ctctttgatc cggttcctga acaggatcta tttgaggcgc taaatgaaac 840

cttaacgcta tggaactcgc cgcccgactg ggctggcgat gagcgaaatg tagtgcttac 900

gttgtcccgc atttggtaca gcgcagtaac cggcaaaatc gcgccgaagg aggtcgctgc 960

cgactgggca atggagcgcc tgccggccca gtatcagccc gtcatacgtg aagctagaca 1020

ggcttatctt ggacaagaag aagatcgctt ggcctcgcgc gcagatcagt tggaagaatt 1080

tgtccactac gtgaaaggcg agatcaccaa ggtagtcggc aaataatgtc taacaattcg 1140

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cgggatcccg gtaccacctt ggttaataat attc 34

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctagctagct agtccaatcc agattgattt c 31

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cggaattccg ctattaacat ttttaattaa aac 33

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ggggtacccc tacttagaga gcgtacagct cc 32

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ctagctagct agctcgactt cgctgctgcc c 31

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cggaattccg cgaattgtta gacattattt g 31

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cttcggatac ttgagagcg 19

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gcagcacctt gaaaattgt 19

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ctcgacttcg ctgctgccc 19

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cgaattgtta gacattattt g 21

<210> 15

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

catgccatgg atgatgctgt ttttcagcac cg 32

<210> 16

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ctagtctaga ttaaaaatta aattgacaag tg 32

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

catgccatgg atgaacatca aaaagtttgc 30

<210> 18

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ctagtctaga ctagttattt gttaactgtt aattgtcctt gttcaagg 48

Claims

1.一株鸭疫里默氏杆菌基因缺失弱毒株在制备鸭疫里氏杆菌弱毒疫苗中的应用，其特征在于，该菌株是鸭疫里默氏杆菌CH-1ΔB739_1343，命名为Riemerella anatipestiferCH-1ΔB739_1343，于2016年8月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCCNO:M2016438，该菌株缺失了血红素转运系统B739 1343基因的2352bp，所缺失的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，该弱毒株RA-CH-1ΔB739_1343对剂量>100×LD₅₀的野生强毒株RA-CH-1的攻毒保护率达83.33％，能够作为RA基因缺失疫苗的候选菌株。