CN106706929B - 一种利用唾液检测人体疲劳的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用唾液检测人体疲劳的方法，包括提取收集唾液、向收集的唾液中加入吸附剂和蛋白酶抑制剂、检测唾液中特定蛋白的含量等步骤，是通过检测唾液中特定蛋白的含量来确定健康状况。本发明属于人体蛋白的检测领域，是一种非侵入式的标志物检测方法，不会破坏人体组织，其具有无创、无痛、快速的优点，具有重要社会意义和应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用唾液检测人体疲劳的方法，属于蛋白质检测技术领域。
背景技术
蛋白质约占人体全部质量的18％左右，其与生命活动现象紧密联系在一起的物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由20多种氨基酸(Amino acid)按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新。
在现有技术中，蛋白质的提取、检验更多的是采用例如：抽血等人体侵入式的提取方式。2008年，美国南加州大学的丹尼(Denny)等在《蛋白组学研究杂志》发表文章指出，人的唾液中有1166种蛋白质。其中大部分蛋白质能同时在血浆和泪液中找到。当时研究者就提出，从这些蛋白质中可以找到与疾病相关的生物标志物，从而为今后的临床诊断提示一种新方式。随后也有研究陆续发现，人唾液中的C反应蛋白、α-1B糖蛋白、肌酐等水平与心血管疾病、癌症、肾脏病等相关。但是，迄今尚未建立一种无创、便捷的唾液中蛋白质提取和检测技术。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是如何提供一种非侵入式的用生物分子进行蛋白质检测的方法。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
A、提取收集疑似疲劳人体的唾液；
B、向收集的唾液中加入吸附剂和蛋白酶抑制剂；
C、检测唾液中特定蛋白的含量。
本发明技术方案的进一步改进在于：步骤A中提取唾液的具体方法是：先 用生理盐水漱口不少于两次，再用清水漱口不少于两次，然后收集唾液。
本发明技术方案的进一步改进在于：每次漱口所用生理盐水或清水的体积为20～30ml，每次的漱口时间为20～30s，漱口所用生理盐水或清水的温度为20～35℃。
本发明技术方案的进一步改进在于：唾液收集量不小于0.1毫升。
本发明技术方案的进一步改进在于：唾液收集后需要储存在-80～-70℃下。
本发明技术方案的进一步改进在于：步骤B中吸附剂为PEG、聚乙烯吡咯酮、蔗糖或凝胶的一种，蛋白酶抑制剂为亮肽素、抗痛素、糜蛋白酶抑素、抑弹性蛋白酶醛、抑胃蛋白酶素、磷酰胺素的混合物，步骤C中的特定蛋白为核连蛋白-2、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、胃蛋白酶或金属蛋白酶中的一种或者它们的组合。
本发明技术方案的进一步改进在于：检测唾液中蛋白的方法是：
将唾液进行离心处理得到上清液Ⅰ，向上清液Ⅰ中滴入蛋白质提取剂后冷冻一段时间，得到冷冻液；
将冷冻液进行离心处理，取出下层液并再次冷冻，得到蛋白干粉；
将蛋白干粉溶于水化液中，并离心处理，得上清液Ⅱ并与NH4HCO3溶液混合，再次离心处理后向得到的上清液中加入胰酶并控温消化酶解，然后进行分子标记并测得蛋白的含量。
由于采用了上述技术方案，本发明取得的技术进步是：
本发明是通过特定方法提取人体唾液进行蛋白质检测，是一种非侵入式的生物分子检测方法，不会破坏人体组织，其具有无创、无痛、快速的优点。唾液作为体液之一，随时都可以方便地收集到，无创、无痛。其适用于人体，也可以延伸到动物体等。
实施本发明的方法可以将唾液作为人体健康状况的一面镜子，以唾液作为诊断用介质，本发明的方法可以在多种环境下进行并提供有价值的诊断信息， 甚至可以用于HIV、HBV病毒以及各种药物如可卡因、酒精的检测。本发明的方法刚刚起步，有关检测的灵敏性、特异性、重复性以及与现有诊断标准的相关性还有待进一步完善。尽管如此，唾液仍是具有极大科研和临床潜力的生物液。发明人相信随着唾液检测的研究工作的不断深入，其应用将会实现由疾病诊断到健康监控的转变。将唾液中的蛋白作为临床标志物进行检测，可以用来协助疾病的诊断。
唾液中的某些蛋白发生疾病特异的改变，使得这些唾液中的蛋白有成为疾病特异生物标志物的潜力。未来，通过检测人体中特定蛋白质的即时含量，以建立疾病的快速识别方法。对有效预防和减少因疲劳导致的生命和安全隐患，造福人民意义重大。
本发明利用了人体的唾液等体液成分，在飞行时间质谱检测时的2000～15000Da范围内可以获得良好的肽谱识别，并且多肽的检出与疲劳间呈现一定规律性；同时，利用唾液中蛋白质具有易得性和易检测性，便于对人体的健康状态进行测定。
本发明的方法可以利用非侵入的方式大量获得基本可溶的肽段和蛋白质，唾液收集时要先用生理盐水漱口三次，再用清水漱口三次，然后才可收集唾液，这样可以大幅度减少唾液中其他杂质的对检测结果的干扰，此收集方法优于刷牙等其它收集方式。收集唾液后利用质谱或其它物理化学方法对唾液样品中的蛋白进行鉴定，可以测定特定蛋白的含量，可以作为检测人体健康状况的判定依据，而高通量的液相-质谱联用方法测得的结果更加精确。检测过程中体液收集量小，方便取得、储存和保藏。在-80～-70℃下储藏不会使唾液中的蛋白质的含量发生变化。
本发明在提取唾液后向唾液中加入了吸附剂，提高了唾液中蛋白质的浓度，减少了样品的体积，更加便于进一步的纯化；同时，蛋白酶抑制剂的加入破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持 蛋白质不被降解，防止了蛋白水解。
本发明将唾液特定蛋白作为健康标志物，可以做到非侵入的方式获取，经过胰酶酶解后的肽段和蛋白质基本可溶并且可以利用TMT试剂对蛋白进行标记，易保存，具有广泛的应用前景。
具体实施方式
下面对本发明做进一步详细说明：
一种利用唾液检测人体疲劳的方法，包括以下步骤，
A、提取收集疑似疲劳人体的唾液；唾液来自于人体，其提取唾液的具体方法是：先用生理盐水漱口不少于两次，再用清水漱口不少于两次，每次漱口所用生理盐水或清水的体积为20～30ml，每次的漱口时间为20～30s，漱口所用生理盐水或清水的温度为20～35℃，然后收集唾液，收集量不小于0.1毫升，唾液收集后需要储存在-80～-70℃下。
B、向收集的唾液中加入吸附剂和蛋白酶抑制剂，其中吸附剂为PEG、聚乙烯吡咯酮、蔗糖或凝胶的一种或者它们的组合，蛋白酶抑制剂为亮肽素、抗痛素、糜蛋白酶抑素、抑弹性蛋白酶醛、抑胃蛋白酶素、磷酰胺素的混合物。
C、检测唾液中特定蛋白的含量，具体方法为：将唾液进行离心处理得到上清液Ⅰ，向上清液Ⅰ中滴入蛋白质提取剂后冷冻一段时间，得到冷冻液；将冷冻液进行离心处理，取出下层液并再次冷冻，得到蛋白干粉；将蛋白干粉溶于水化液中，并离心处理，得上清液Ⅱ并与NH4HCO3溶液混合，再次离心处理后向得到的上清液中加入胰酶并控温消化酶解，然后进行分子标记并测得蛋白的含量。特定蛋白核连蛋白-2、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、胃蛋白酶或金属蛋白酶中的一种或者它们的组合。本发明通过检测唾液中特定蛋白的含量确定是否处于健康状态。
实施例：
疲劳是诱发多种疾病的根源，下面以测定唾液中的核连蛋白-2含量与人体 疲劳状况为例对本发明做进一步做详细说明，具体方法如下：
A、提取收集疑似疲劳人体的唾液
首先，在收集唾液前一般用生理盐水漱口三次，再用清水漱口三次，用生理盐水和清水漱口每种不应少于两次，每次漱口所用生理盐水或清水的体积可以在20～30ml之间的任一数值，以口腔能够灵活运动为好，每次的漱口时间大概在25s左右，可以取20～30s的任一数值，漱口所用的生理盐水或清水温度可以是口感舒适的20～35℃，如30℃左右。然后将舌上翘或者做咀嚼运动，使唾液在下颌部积聚，通过下唇收缩，使得唾液顺着下唇形成的通道自然流入唾液收集管中。收集的唾液在0.1～3毫升之间，唾液的收集量可以根据收集到检测的时间间隔确定，只要能够满足每次检测需要即可，如果唾液收集后需要储存时，储藏在-80～-70℃温度范围的任一温度的冰箱中。
B、向收集的唾液中加入吸附剂和蛋白酶抑制剂
将吸附剂、蛋白酶抑制剂均按照与唾液的体积之比在1:20～1:30范围内的任一种比例加入到唾液收集管中，吸附剂为PEG、聚乙烯吡咯酮、蔗糖或凝胶中的一种，蛋白酶抑制剂是亮肽素、抗痛素、糜蛋白酶抑素、抑弹性蛋白酶醛、抑胃蛋白酶素、磷酰胺素的混合物。
C、检测唾液中核连蛋白-2的含量
C1、将唾液进行离心处理得到上清液Ⅰ，离心处理的转速调节成5000～7000rpm之间的任一转速，离心处理在10～15分钟之间完成，向上清液Ⅰ中滴入质量分数是0.2～0.4％的DTT和质量分数在15～25％之间的TCA丙酮溶液后，将其放入至温度在-18～-25℃范围之内的冰箱中，冷冻10～12小时即可，冷冻得到冷冻液；
C2、将冷冻液进行离心处理，离心处理的转速调节在12000～14000rpm之间的任一转速，离心处理在10～15分钟完成，取下后，将下层液再次放入冷冻冰箱冷冻，得到蛋白干粉，冷冻的温度在-75～-85℃之间，冷冻时间在1.0～1.5 小时之间；
C3、将蛋白干粉溶于水化液中并离心处理，离心处理的转速调节在5000～7000rpmm之间的任一转速，得上清液Ⅱ，离心处理在10～15秒完成；将上清液Ⅱ与NH4HCO3溶液混合，并转移至3K的超滤管中进行离心处理，离心处理的转速调节在5000～7000rpm之间的任一速度，离心处理在2～4分钟内完成，重复上述步骤两次；将离心处理后向得到的上清液中加入胰酶，控制温度在36～40℃之间，消化酶解控制在8～10小时之内；
C4、利用体外标记法进行TMT试剂标记酶解后的溶液，并将标记后的溶液采用高通量的液相-质谱联用分析，可以得到样品的液相-质谱图。并计算出核连蛋白-2的含量。
为了验证唾液中检测核连蛋白-2与疲劳的对应关系，并为了方便研究，发明人邀请了几十位志愿者参与研究，选取的志愿者身体健康，无器质性疾病和慢性疲劳症状；并排除持续或反复发作的疲劳持续6个月以上、咽喉疼痛、颈部或腋下淋巴结肿痛、肌肉疼痛、多发性非关节炎性疼痛、头疼、睡眠障碍、劳累后不适持续24小时以上的睡眠不足人群队列。
在采集志愿者常规状态下和持续工作后的两种唾液标本，将常规状态下采集的样本标记为“前”，将持续工作后采集的唾液样本标记为“后”。在采集常规状态下和持续工作后的唾液样本时，都通过脑电图(目前国际公认的疲劳金标准)方式检测该志愿者是否出现疲劳，并将此脑电图编号与采集的唾液样品对应保存。在对采集的唾液样品中的核连蛋白-2含量进行检测后，再与该志愿者当时的脑电图进行对比。经分析发现，唾液样品中是否含有核连蛋白-2及核连蛋白-2含量多少与脑电图的θ波是否出现及出现的密度保存高度一致。下表是核连蛋白-2检测结果和脑电图结果对比。脑电图结果中无θ波表示不疲劳，θ波较少表示轻度疲劳，θ波较多表示重度疲劳。
从上表可以反应出核连蛋白-2含量为0时(唾液中不含核连蛋白-2)，脑电图的结果是没有θ波出现，即人体不疲劳；当唾液中检测到核连蛋白-2，并且其值小于300ng/ml时，脑电图出现θ波，但其密度不大，为轻度疲劳范围；当唾液中的核连蛋白-2大于300ng/ml时，脑电图θ波明显增加，密度较大，为重度疲劳。由此可见，利用本发明的非侵入方式收集唾液并通过检测唾液中的核连蛋白-2的含量可以作为检测人体疲劳状况的指标。
用本发明的方法检测唾液中其他的蛋白如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、胃蛋白酶或金属蛋白酶的检测方法相同，在此不再一一赘述。
Claims (7)
1.一种利用唾液检测人体疲劳的方法，其特征在于：包括以下步骤，
A、提取收集疑似疲劳人体的唾液；
B、向收集的唾液中加入吸附剂和蛋白酶抑制剂；
C、检测唾液中特定蛋白的含量；
步骤C中的特定蛋白为核连蛋白-2。
2.根据权利要求1所述的一种利用唾液检测人体疲劳的方法，其特征在于：步骤A中提取唾液的具体方法是：先用生理盐水漱口不少于两次，再用清水漱口不少于两次，然后收集唾液。
3.根据权利要求2所述的一种利用唾液检测人体疲劳的方法，其特征在于：每次漱口所用生理盐水或清水的体积为20～30ml，每次的漱口时间为20～30s，漱口所用生理盐水或清水的温度为20～35℃。
4.根据权利要求2所述的一种利用唾液检测人体疲劳的方法，其特征在于：唾液收集量不小于0.1毫升。
5.根据权利要求4所述的一种利用唾液检测人体疲劳的方法，其特征在于：唾液收集后需要储存在-80～-70℃下。
6.根据权利要求1所述的一种利用唾液检测人体疲劳的方法，其特征在于：步骤B中吸附剂为PEG、聚乙烯吡咯酮、蔗糖或凝胶的一种，蛋白酶抑制剂为亮肽素、抗痛素、糜蛋白酶抑素、抑弹性蛋白酶醛、抑胃蛋白酶素、磷酰胺素的混合物。
7.根据权利要求1所述的一种利用唾液检测人体疲劳的方法，其特征在于：检测唾液中蛋白的方法是：
将唾液进行离心处理得到上清液Ⅰ，向上清液Ⅰ中滴入蛋白质提取剂后冷冻一段时间，得到冷冻液；
将冷冻液进行离心处理，取出下层液并再次冷冻，得到蛋白干粉；
将蛋白干粉溶于水化液中，并离心处理，得上清液Ⅱ并与NH4HCO3溶液混合，再次离心处理后向得到的上清液中加入胰酶并控温消化酶解，然后进行分子标记并测得蛋白的含量。
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