CN106636206A

CN106636206A - 一种merrf患者的外周血单个核细胞的非整合性重编程方法

Info

Publication number: CN106636206A
Application number: CN201610961696.3A
Authority: CN
Inventors: 梁栋; 许争峰; 胡平
Original assignee: Nanjing Maternity and Child Healthcare Hospital
Current assignee: Nanjing Maternity and Child Healthcare Hospital
Priority date: 2016-10-28
Filing date: 2016-10-28
Publication date: 2017-05-10

Abstract

本发明公开了一种MERRF患者的外周血单个核细胞的非整合性重编程方法，其步骤是：先将冻存的外周血单个核细胞（PBMC）复苏，接种至24孔细胞培养板，在37℃，5% CO₂的饱和湿度条件下连续培养4天，每日换液；用台盼蓝进行活细胞染色计数，并调整细胞密度，弃去含病毒的培养液，更换为PBMC完全培养液继续培养3 天，将感染后的细胞转移至Matrigel基底膜基质包被的6孔细胞培养板中；用不含细胞因子的StemPro‑34半数换液，3天后更换为PSC培养液，出现大小合适的克隆后，进行传代、扩大培养和冻存；本发明通过检测试验证明所获得的细胞系具有全能性、核型正常、完全不含外源基因，并且可以模拟MERRF患者的线粒体遗传物质存在的突变，适合MERRF疾病研究的各种需求。

Description

一种MERRF患者的外周血单个核细胞的非整合性重编程方法

技术领域

本发明涉及的是细胞生物学和生物医学技术领域，具体的说是一种MERRF患者的外周血单个核细胞的非整合性重编程方法。

背景技术

阵挛性癫痫伴破碎红纤维综合症（myoclonic epilepsy with ragged-redfibers, MERRF）是一种遗传性多种系统疾病，是线粒体肌脑病常见类型之一。其主要临床症状表现为肌阵挛发作、强直-阵挛发作、肢体无力、小脑性共济失调、智能减退或痴呆以及精神异常。MERRF综合症主要是由于线粒体DNA（mtDNA）第8344位A到G突变（mtDNA 8344A→G）（80%~90%）引起呼吸链受损，进而出现相应的临床症状[1]。该疾病可通过mtDNA一代或二代测序技术，检查相应线粒体DNA位点的突变情况从而进行明确诊断，但现阶段除了通过鸡尾酒疗法延缓疾病发展，并没有积极有效的治疗方法。对于该疾病而言，由于动物模型不能完全模拟人类疾病情况，因此缺乏一种良好的疾病模型，不能对其发病机制和根治方法进行深入研究。

2006年，日本科学家Shinya Yamanaka首次通过4个重要的转录因子OCT3/4、SOX2、KLF4和c-MYC实现对已分化体细胞的重编程，从而得到与胚胎干细胞类似的诱导多能干细胞 (iPSC)。这种多能干细胞具有多向分化能力和自我更新能力，直接将患者来源的体细胞重编程为hiPSCs，能够为研究遗传病的发病机制，药物筛选等提供了良好的体外模型。在人类线粒体遗传病患者细胞中，线粒体DNA突变往往存在着同一细胞中突变型和野生型共存的现象，被称为异质性（heteroplasmy）。由于这种特殊性，对线粒体遗传病进行重编程存在着一定的技术难点，也就是得到的诱导多能干细胞的异质度（heteroplasmic level）不均一的问题。这一问题在线粒体遗传病中普遍存在，而在不同的疾病，在不同MERRF综合症的临床和科研上，目前没有良好的人源性疾病模型用于对该疾病的机制研究并提供药物筛选平台。这种疾病模型需要能够完美的模拟该疾病在线粒体DNA上的遗传学缺陷，同时具有多向分化能力，便于后续的应用。

国外有实验室对另一种常见线粒体遗传病线粒体脑病伴乳酸酸中毒及卒中样发作综合征（MELAS）患者的细胞进行了重编程，而由于致病位点不同，MELAS的诱导多能干细胞并不能完全用于MERRF的研究。同时，由于使用了基于慢病毒或逆转录病毒载体的整合性诱导技术，使得这些细胞存在潜在的基因组改变，不能完全模拟患者的情况。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的缺陷和不足，提供了一种MERRF患者的外周血单个核细胞的非整合性重编程方法，通过采用仙台病毒的非整合重编程方法，并在重编程得到的hPBMC-iPSC细胞株中检测了不同代数中仙台病毒基因组RNA的存在情况，说明我们获得的是完全不含外源基因的安全可靠的iPSC株，适合MERRF疾病研究的各种需求。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种MERRF患者的外周血单个核细胞的非整合性重编程方法：包括以下步骤：1、先将冻存的外周血单个核细胞（PBMC）复苏，用外周血单个核细胞（PBMC）完全培养液（含SCF（100ng/μL），Flt-3(100 ng/μL)，IL-3（20 ng/μL），IL-6（20 ng/μL）的StemPro-34培养液）将细胞密度调整至1×10⁶/mL，接种至24孔细胞培养板，在37℃，5% CO₂的饱和湿度条件下连续培养4天，每日换液。

2、用台盼蓝进行活细胞染色计数，并调整细胞密度至1×10⁵个，按照KOS MOI=5,hc-Myc MOI=5, hKlf4 MOI=3，病毒滴度=1.5×10⁸计算病毒使用量，在1mL培养液内分别加入含KOS、c-Myc和Klf4的仙台病毒3.3 μL，3.3 μL和2 μL（仙台病毒重编程试剂盒提供），在37 ℃，5% CO₂的饱和湿度条件下培养24 小时后，弃去含病毒的培养液，更换为PBMC完全培养液继续培养3 天，将感染后的细胞按0.5×10⁴，3×10⁴，8×10⁴的密度转移至Matrigel基底膜基质包被的6孔细胞培养板中。

3、用不含细胞因子的StemPro-34半数换液，3天后更换为PSC培养液。培养条件为在37 ℃，5% CO₂的饱和湿度条件不变。2～3周后，出现大小合适的克隆，挑选合适的形态上类似胚胎干细胞的克隆，用无菌注射器针头切割并转移至Matrigel基底膜基质包被的细胞培养板中，按照胚胎干细胞的培养方法进行传代、扩大培养和冻存。

本发明的有益效果为：采用了仙台病毒的非整合重编程方法，并在重编程得到的hPBMC-iPSC细胞株中检测了不同代数中仙台病毒基因组RNA的存在情况，在第12代细胞之后外源性病毒基因组可被完全清除。这一结果说明我们获得的是完全不含外源基因的安全可靠的iPSC株，MERRF患者多能干细胞系包含了从0%到68%之间的6个细胞系，适合MERRF疾病研究的各种需求。

附图说明

图1是本发明的一个实施例的细胞形态结构示意图；

图2是本发明的一个实施例的第10代iPS细胞的代表核型图；

图3是本发明的一个实施例的多能干细胞标志基因免疫荧光染色结果图；

图4是本发明的一个实施例的拟胚体随机分化实验图；

图5是本发明的一个实施例的RT-PCR鉴定iPSC中干细胞标志基因的表达情况对比图；

图6是本发明的一个实施例的畸胎瘤试验图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本具体实施方式采用以下技术方案：

实施例：

在获得知情同意的前提下，在南京市妇幼保健院采集1例11岁MERRF患者新鲜的外周血5 mL，该患者已通过一代测序技术确诊为mt DNA 8344A→G突变。用Ficoll淋巴细胞分离液分离PBMC，用含有10%二甲亚砜（DMSO）的细胞冻存液重悬后放置液氮保存。通过仙台病毒方法对得到的PBMC进行非整合性重编程。

具体步骤为：将冻存的PBMC复苏，用PBMC完全培养液（含SCF（100 ng/μL），Flt-3(100 ng/μL)，IL-3（20 ng/μL），IL-6（20 ng/μL）的StemPro-34培养液）将细胞密度调整至1×10⁶/mL，接种至24孔细胞培养板，37℃，5% CO₂，饱和湿度条件下连续培养4 d，每日换液。用台盼蓝进行活细胞染色计数，并调整细胞密度至1×10⁵个，按照KOS MOI=5, hc-Myc MOI=5, hKlf4 MOI=3，病毒滴度=1.5×10⁸计算病毒使用量，公式为：病毒使用量（μL）=（MOI（CIU/cell）×细胞数量）/（病毒滴度（CIU/mL）×10^-3（μL/mL））计算所需病毒数量，在1mL培养液分别加入含KOS、c-Myc和Klf4的仙台病毒3.3 μL，3.3 μL和2 μL（仙台病毒重编程试剂盒提供），37 ℃，5% CO₂，饱和湿度条件下培养24 h后，弃去含病毒的培养液，更换为PBMC完全培养液继续培养3 d，将感染后的细胞按0.5×10⁴，3×10⁴，8×10⁴的密度转移至Matrigel基底膜基质包被的6孔细胞培养板中，用不含细胞因子的StemPro-34半数换液，3 d后更换为PSC培养液。培养条件为37 ℃，5% CO₂，饱和湿度条件不变。2～3周后，出现大小合适的克隆，挑选合适的形态上类似胚胎干细胞的克隆，用无菌注射器针头切割并转移至Matrigel基底膜基质包被的细胞培养板中，按照胚胎干细胞的培养方法进行传代、扩大培养和冻存。(参看图1)

对得到的诱导多能干细胞进行核型分析：取成功建立细胞系的iPSC进行培养，融合度至80%时，加入0.25 μg/mL秋水仙素处理3 h，后用2.5 g/L胰蛋白酶和10 g/L柠檬酸三钠37℃消化细胞1 min，1000 r/min离心10 min，弃上清液，收集细胞。用4 g/L枸橼酸钠与4 g/L氯化钠（体积比为3：1）溶液固定3次，用滴管将细胞悬液滴在经冰水（0 ℃）浸泡的洁净载玻片上并吹散，置75～80 ℃烤箱中烤片2 h。用预温的1 g/L胰蛋白酶消化25～30 s，Giemsa染色液染色10 min，高倍显微镜下观察20个分裂中期细胞染色体，并用GSL-120扫描仪获取核型图，用cytovision软件对染色体核型进行结果分析。（参看图2）

对得到的诱导多能干细胞进行多能性分析：首先，通过免疫荧光染色，从蛋白水平鉴定多能性标志基因的表达情况。将成功建系的第10代iPSC传代至12孔细胞培养板，待克隆长到合适大小，将培养液吸出，PBS洗涤2次，加入4%的聚甲醛（PFA），室温固定1 h，PBS洗涤3次，用含0.1% TritonX-100通透30 min，用含1% 小牛血清（BSA）的PBST封闭1 h。加入含有抗小鼠单克隆抗体SSEA4，抗小鼠单克隆抗体TRA1-60，抗小鼠单克隆抗体TRA1-81的抗体（1：100稀释），4 ℃过夜。PBST洗涤3次，每次30 min。加入相应山羊抗小鼠荧光二抗和山羊抗兔荧光二抗（1：1 000稀释），避光室温放置2 h。避光条件下使用PBS洗涤3次后，加入3 μmol/L DAPI染色液，避光室温放置10 min。吸出DAPI，PBST清洗1次后，加入适量PBS，并在荧光倒置显微镜下观察并拍照（参看图3）。

其次，通过RT-PCR，从转录水平鉴定多能性标志基因的表达情况。取10代左右的iPSC约1×10⁶个，用0.5 mmol/L EDTA（无胰酶）消化。用Trizol提取细胞的总RNA，将1 μLRNA反转录为cDNA，RT-PCR检测诱导多能干细胞中干细胞标志性基因Oct4，Sox2，Nanog的表达情况,并使用GAPDH作为阳性对照。PCR体系为20 μL。包括cDNA模板2 μL，400 nmol/L上下游引物各1.6 μL，320 nmol/L dNTP 3.2 μL，1 U LA-Taq酶0.1 μL，ddH₂O 7.5 μL，10×Buffer 2 μL，Mg²⁺ 2μL。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环扩增30次，最后72 ℃延伸5 min。PCR产物进行0.1 g/L琼脂糖凝胶电泳（参看图5）。进一步，通过体外拟胚体（EB）形成和分化试验验证所得细胞系的多能性: 将第10代iPSC按1×10⁵的密度传代至6孔板，培养细胞至融合度为80%时，使用0.5 mmol/LEDTA将iPSC消化，并用含有4 mg/mL 聚乙烯醇（PVA），10 μmol/L ROCK抑制剂的PSC培养液将克隆吹打成单细胞悬液，接种至超低吸附6孔细胞培养板中。37 ℃，5% CO₂，饱和湿度条件下培养24 h。使用EB培养液（Knockout DMEM 83 ml、血清替代物（KSR） 15 ml、非必需氨基酸（NEAA） 1 ml、谷氨酰胺（Glutamax） 1 ml）隔日半数换液。7 d后，将EB转移至1% 明胶包被的24孔细胞培养板中，每个孔约3～5个。加入含有10% FBS的EB培养液，37 ℃，5% CO₂，饱和湿度条件下培养2周。待EB贴壁后，使用小鼠抗甲胎蛋白（AFP）抗体（1：100稀释）、兔抗心肌肌钙蛋白（cTNI）抗体（1：500稀释）和兔抗β微管蛋白（Tuj1）抗体（1：100稀释）对迁出细胞进行免疫荧光染色，检测外胚层标志基因Tuj1、中胚层标志基因cTNI和内胚层标志基因AFP。相对应的免疫荧光染色阳性，表明贴壁的拟胚体已定向分化为相应胚层的细胞，以此鉴定拟胚体向三个胚层分化的能力（参看图4）。最后，通过体内畸胎瘤形成实验，证明所得细胞的体内多能性: 培养第10代iPSC至细胞数约1×10⁷个，0.5 mmol/L EDTA消化细胞，1000 rpm离心5 min，收集细胞沉淀于1.5 mL EP管中，用PBS重悬。注射细胞于4周龄的NOD-SCID雄鼠皮下，2个月后小鼠皮下成瘤。引颈处死小鼠，将瘤完整剥下，至4%多聚甲醛（PFA）中4 ℃固定2 d。取出后将固定的样品进行石蜡包埋和切片，并对所得切片进行伊红苏木精(HE)染色。用倒置显微镜观察到外、中、内三胚层的结构并拍照。（参看图6）

由于仙台病毒是一种经改造的非整合RNA病毒，我们对病毒感染第4天（第0代），重编程后第6代，第12代的hPBMC-iPSC进行仙台病毒基因组RNA检测。结果显示，在第6代的hPBMC-iPSC中仍有部分仙台病毒基因组残留，第12代时残留的仙台病毒基因组已被基本清除。这表明构建的诱导多能干细胞系不含外源基因成分。

对得到的细胞系进行遗传学分析：按照DNA提取试剂盒说明书步骤提取10代左右iPSCs的DNA，并测浓度。将DNA用m.8344引物进行PCR扩增，得到含有m.8344位点的产物并进行一代测序分析，判断是否存在相应的点突变。PCR体系为50 μL，包括cDNA模板2 μL，400nmol/L上下游引物各4 μL，320 nmol/L dNTP 8 μL，1 U LA-Taq酶0.5 μL，ddH₂O 30.5 μL，10×Buffer GC 5 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环扩增40次，最后72 ℃延伸7 min。在确认所得细胞系线粒体DNA携带有m.8344 A-G 突变后，由PyroMark Assay Design 2.0设计探针和焦磷酸测序引物，通过焦磷酸测序检测原代细胞和所得多能干细胞系线粒体DNA中突变型和野生型的异质度。

本发明通过采用了仙台病毒的非整合重编程方法，并在重编程得到的hPBMC-iPSC细胞株中检测了不同代数中仙台病毒基因组RNA的存在情况，在第12代细胞之后外源性病毒基因组可被完全清除。这一结果说明我们获得的是完全不含外源基因的安全可靠的iPSC株，MERRF患者多能干细胞系包含了从0%到68%之间的6个细胞系，适合MERRF疾病研究的各种需求。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims

1.一种MERRF患者的外周血单个核细胞的非整合性重编程方法，其特征在于：它的步骤是：

1、先将冻存的外周血单个核细胞（PBMC）复苏，用外周血单个核细胞（PBMC）完全培养液（含SCF（100 ng/μL），Flt-3(100 ng/μL)，IL-3（20 ng/μL），IL-6（20 ng/μL）的StemPro-34培养液）将细胞密度调整至1×10⁶/mL，接种至24孔细胞培养板，在37℃，5% CO₂的饱和湿度条件下连续培养4天，每日换液；

2、用台盼蓝进行活细胞染色计数，并调整细胞密度至1×10⁵个，按照KOS MOI=5, hc-Myc MOI=5, hKlf4 MOI=3，病毒滴度=1.5×10⁸计算病毒使用量，在1mL培养液内分别加入含KOS、c-Myc和Klf4的仙台病毒3.3 μL，3.3 μL和2 μL（仙台病毒重编程试剂盒提供），在37℃，5% CO₂的饱和湿度条件下培养24 小时后，弃去含病毒的培养液，更换为PBMC完全培养液继续培养3 天，将感染后的细胞按0.5×10⁴，3×10⁴，8×10⁴的密度转移至Matrigel基底膜基质包被的6孔细胞培养板中；

3、用不含细胞因子的StemPro-34半数换液，3天后更换为PSC培养液，培养条件为在37℃，5% CO₂的饱和湿度条件不变；2～3周后，出现大小合适的克隆，挑选合适的形态上类似胚胎干细胞的克隆，用无菌注射器针头切割并转移至Matrigel基底膜基质包被的细胞培养板中，按照胚胎干细胞的培养方法进行传代、扩大培养和冻存。