CN106608907A - 抗ERPV-ATIp重组截短蛋白单克隆抗体的制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了抗ERPV-ATIp重组截短蛋白的单克隆抗体及其制备和应用。具体地，利用果蝇S2细胞表达系统，导入特定的ERPV-ATIp截短蛋白编码基因，获取高纯度的重组ERPV-ATI截短蛋白，并以此为抗原获得了抗ERPV-ATIp截短蛋白单克隆抗体。所述单克隆抗体能够特异性的识别ERPV-ATIp截短蛋白，对ERPV-ATIp全长蛋白有高亲和力。

Description

抗ERPV-ATIp重组截短蛋白单克隆抗体的制备和应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，更具体地涉及抗ERPV-ATIp重组截短蛋白单克隆抗体的制备和应用。

背景技术

红斑性肢痛症相关痘病毒(erythromelalgia-related poxvirus，ERPV)，是正痘病毒属鼠痘病毒的一员，该病毒曾经被命名为Zheng-Zhang Virus，由流行性红斑性肢痛症患者咽拭子中分离。流行性红肿性肢痛症多发于15岁至17岁的女中学生；该病发病急，多在夜间突然发作；起初患者脚趾疼痛，继而脚前掌疼痛；患者常不能安然入眠，冷敷可以缓解疼痛；部分患者脚和腿出现水肿充血，同时伴有麻木感；严重者行走困难；某些患者脚出现病症时，手指也会出现类似病症。

EPPV病毒在生长周期中会出现A型包涵体(ATI)，该包涵体由A25L表达的ATIp经组装形成；该包涵体为无病毒型(ATI V-)；在某些流行性红肿性肢痛症病人血清中会出现特异性抗ERPV A型包涵体的IgG。目前，还没有上市的抗ERPV A型包涵体的抗体。

因此，本领域迫切需要开发具有良好临床应用前景的抗ERPV病毒的药物和检测抗体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗ERPV-ATIp重组截短蛋白单克隆抗体的制备和应用。

在本发明的第一方面，提供了一种抗原多肽，所述的抗原多肽的序列如SEQ ID NO.:2中第497-919位所示。

在另一优选例中，所述的抗原多肽是在真核宿主细胞中重组表达的。

在另一优选例中，所述的真核宿主细胞包括果蝇S2细胞。

在本发明的第二方面，提供了一种特异性抗本发明第一方面所述的抗原多肽的抗体。

在另一优选例中，所述的抗体为多克隆抗体或抗血清。

在另一优选例中，所述的抗体为单克隆抗体。

在本发明的第三方面，提供了一种检测试剂盒，所述的试剂盒含有本发明第一方 面所述的抗原多肽和/或本发明第二方面所述的抗体。

在本发明的第四方面，提供了一种本发明第一方面所述的抗原多肽和/或本发明第二方面所述的抗体的用途，用于制备检测红斑性肢痛症相关痘病毒(erythromelalgia-related poxvirus，ERPV)的检测试剂或试剂盒。

在另一优选例中，所述的检测试剂包括侧流片。

在本发明的第五方面，提供了一种用于检测红斑性肢痛症相关痘病毒的检测试剂，所述的检测试剂含有本发明第一方面所述的抗原多肽和/或本发明第二方面所述的抗体。

在另一优选例中，所述的检测试剂包括测试条。

在另一优选例中，所述检测条包括：

样品垫、结合垫、反应膜、吸收垫、和背衬，其中所述反应膜上设置有检测区和质控区；以及

其中，所述的检测区固定有如本发明第一方面所述的多肽，且所述结合垫固定有如本发明第二方面所述的抗体。

在本发明的第六方面，提供了一种抗体的重链可变区，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

SEQ ID NO:XH1所示的CDR1，

SEQ ID NO:XH2所示的CDR2，和

SEQ ID NO:XH3所示的CDR3；

优选地，所述重链可变区具有SEQ ID NO:XHV所示的氨基酸序列。

在本发明的第七方面，提供了一种抗体的重链，所述的重链具有本发明第六方面所述的重链可变区和重链恒定区。

在另一优选例中，所述抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO.:XH所示。

在本发明的第八方面，提供了一种抗体的轻链可变区，所述轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：

SEQ ID NO:XL1所示的CDR1’，

SEQ ID NO:XL2所示的CDR2’，和

SEQ ID NO:XL3所示的CDR3’；

优选地，所述的轻链可变区具有SEQ ID NO:XLV所示的氨基酸序列。

在本发明的第九方面，提供了一种抗体的轻链，所述的轻链具有本发明第八方面所述的轻链可变区和轻链恒定区。

在另一优选例中，所述抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.:XL所示。

在本发明的第十方面，提供了一种抗体，所述抗体具有：

(1)如本发明第六方面所述的重链可变区；和/或

(2)如本发明第八方面所述的轻链可变区；

或者，所述抗体具有：

如本发明第七方面所述的重链；和/或本发明第九方面所述的轻链。

在另一优选例中，所述的抗体的亚型为IgG1。

在另一优选例中，所述单克隆抗体由选自下组的杂交瘤细胞株产生：5E9、6G12、和/或11B2。

在本发明的第十一方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：

(i)如本发明第六方面所述的重链可变区、如本发明第七方面所述的重链、如本发明第八方面所述的轻链可变区、如本发明第九方面所述的轻链、或如本发明第十方面所述的抗体；以及

(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

在本发明的第十二方面，提供了一种多核苷酸，它编码选自下组的多肽：

(1)如本发明第六方面所述的重链可变区、如本发明第七方面所述的重链、如本发明第八方面所述的轻链可变区、如本发明第九方面所述的轻链、或如本发明第十方面所述的抗体；或

(2)如本发明第十一方面所述的重组蛋白。

在另一优选例中，所述多核苷酸的序列具有如SEQ ID NO.:XHDNA和/或SEQ ID NO.:XLDNA所示的多核苷酸序列。

在本发明的第十三方面，提供了一种载体，它含有本发明本发明第十二方面所述的多核苷酸。

在本发明的第十四方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，它含有本发明第十三方面所述的载体或基因组中整合有本发明第十二方面所述的多核苷酸。

在本发明的第十五方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括：

本发明第十方面所述的抗体。

在另一优选例中，所述试剂盒为酶联免疫检测试剂盒。

在本发明的第十六方面，提供了一种免疫偶联物，该免疫偶联物含有：

(a)本发明第十方面所述的抗体或本发明第十一方面所述的重组蛋白；和

(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。

在本发明的第十七方面，提供了一种药物组合物，所述组合物包含本发明第十方面所述的抗体、本发明第十一方面所述的重组蛋白、或本发明第十六方面所述的免疫偶联物；以及

药学上可以接受的载体。

在本发明的第十八方面，提供了一种重组多肽的制备方法，该方法包含：

(a)在适合表达的条件下，培养本发明第十四方面所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是本发明第十方面所述的抗体或本发明第十一方面所述的重组蛋白。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了采用PCR扩增ERPV-ATIp编码序列片段的电泳结果。

图2显示了使用亲和层析方法纯化ERPV-ATIp重组截短蛋白的SDS-PAGE图。

图3显示了使用亲和层析方法纯化ERPV-ATIp重组截短蛋白免疫印迹(WB)。

图4显示了Balb/c小鼠第三次免疫后血清抗体效价图。

图5显示了使用ProteinG亲和层析柱纯化腹水中抗体的SDS-PAGE分析图。

图6显示了本发明单克隆抗体和Abmart公司的His-Tag(2A8)Mouse mAb进行免疫印迹分析的结果。

图7显示了本发明单克隆抗体和Abmart公司的His-Tag(2A8)Mouse mAb进行免疫沉淀分析的结果。

图8显示了本发明单克隆抗体与Abbkine公司的Anti-Flag Tag Mouse Monoclonal Antibody(1B10)(对照)进行免疫荧光实验的结果。

图9显示了本发明提供的间接酶联免疫法检测血清中抗ERPV-ATIp抗体的情况。

图10显示了重组杆状病毒P1virus感染Sf9细胞4天后细胞裂解液重组蛋白的检测结果。

图11显示了果蝇S2细胞表达的ERPV-ATIp全长蛋白的WB检测图。

图12显示了不同长度截短蛋白表达WB检测图。

图13显示了不同长度的重组ERPV-ATIp蛋白表达纯化效果的检测。其中图13-A为SDS-PAGE检测；图13-B为WB检测。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，获得了一种抗ERPV-ATIp截短蛋白单克隆抗体。实验表明，利用果蝇S2细胞表达系统，导入特定的ERPV-ATIp截短蛋白编码基因，可以获取高纯度的重组ERPV-ATI截短蛋白，进而获得抗ERPV-ATIp截短蛋白单克隆抗体。所述单克隆抗体能够特异性的识别ERPV-ATIp截短蛋白，对ERPV-ATIp全长蛋白有高亲和力。在此基础上，完成了本发明。

术语

ERPV病毒

ERPV病毒，即红斑性肢痛症相关痘病毒(erythromelalgia-related poxvirus，)，由流行性红斑性肢痛症患者咽拭子中分离。经血清学鉴定表明，ERPV为正痘病毒属内成员，但与正痘病毒属内成员痘苗病毒和鼠痘病毒具有中和抗原表位差异。流行性红斑性肢痛症患者血清中含有抗ERPV的中和抗体和抗ERPV型包涵体IgG抗体，其检出率明显高于当地未发病者和美国居民。

EPPV-ATI是病毒在生长周期中出现的A型包涵体，该包涵体由A25L表达的ATIp经组装形成。编码ATIp全长蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示，ATIp全长蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

本发明人经过多次筛选，获得了一段特定的ERPV-ATIp截短蛋白，所述截短蛋白可以利用果蝇S2细胞表达系统稳定表达，并且能够分离纯化。以所述截短蛋白为抗原，可以获得特异性的识别ERPV-ATIp重组截短蛋白与ERPV-ATIp全长蛋白的高亲和力单克隆抗体。在本发明的一个优选的实施方式中，所述ERPV-ATIp截短蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2中第497-919位所示。

抗体

如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。

如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些 情况下可形成部分β-折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。

脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。

如本文所用，术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。

本发明还包括具有所述的抗ERPV-ATIp截短蛋白单克隆抗体的相应氨基酸序列的单克隆抗体、具有所述的抗ERPV-ATIp截短蛋白单克隆抗体可变区链的单克隆抗体，以及具有这些链的其他蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物。具体地，本发明包括具有含超变区(互补决定区，CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。

如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与所述的抗ERPV-ATIp截短蛋白单克隆抗体或其片段结合的而形成的偶联物。本发明还包括与所述的抗ERPV-ATIp截短蛋白单克隆抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。

本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或(Fab’)2片段；抗体重链；抗体轻链。

如本文所用，术语“重链可变区”与“VH”可互换使用。

如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(complementarity determining region,CDR)”可互换使用。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

CDR1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:XH1所示，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO.:XH1DNA；

CDR2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.:XH2所示，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO.:XH2DNA；

CDR3，其氨基酸序列如SEQ ID NO.:XH3所示，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO.:XH3DNA。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区，所述重链恒定区可以为鼠源或人源。

如本文所用，术语“轻链可变区”与“VL”可互换使用。

在本发明的一个优选的实施方式中，根据本发明的抗体的轻链可变区，具有选自下组的互补决定区CDR：

CDR1’，其氨基酸序列如SEQ ID NO:XL1所示，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO.:XL1DNA；

CDR2’，其氨基酸序列如SEQ ID NO.:XL2所示，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO.:XL2DNA；

CDR3’，其氨基酸序列如SEQ ID NO.:XL3所示，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO.:XL3DNA。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的轻链包括上述轻链可变区和轻链恒定区，所述轻链恒定区可以为鼠源或人源。

在本发明中，术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用，都指特异性结合抗ERPV病毒的抗体，例如具有重链和/或轻链的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。

在另一优选例中，所述的抗体为抗ERPV病毒的鼠或人鼠嵌合单克隆抗体，它的重链恒定区和/或轻链恒定区可以是人源化的重链恒定区或轻链恒定区。更优选地，所述的人源化的重链恒定区或轻链恒定区为人IgG1、IgG2等的重链恒定区或轻链恒定区。

本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含可变区的重链和轻链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该可变区与本发明抗体的重链和轻链的可变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。

一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。

本发明抗体的重链和/或轻链的可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的单克隆抗体轻链和重链可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。

本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。

如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

本发明抗体指具有抗ERPV病毒A型包涵体结合活性的、与所述ERPV-ATIp截短蛋白特异结合的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、与所述ERPV-ATIp截短蛋白特异结合的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。

本发明还提供了其他多肽，如包含人抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

在本发明中，“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。

表A

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO.:XVHDNA、或XVLDNA所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有与本发明的多肽相同的氨基酸序列，但与SEQ ID NO.:XVH、XVL所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％， 更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。

本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔，脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。

用于诊断目的的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。

组合物

本发明还提供了一种组合物。较佳地，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。

本发明的药物组合物可直接用于结合ERPV病毒，因而可用于预防和治疗ERPV病毒是导致流行性红斑性肢痛症。此外，还可同时使用其他科学研究和临床诊断。

本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％，较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的单克隆抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

杂交瘤细胞株

本发明还提供了可生产本发明针对抗ERPV-ATIp截短蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株；优选的，本发明提供了高效价的针对抗ERPV-ATIp截短蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

在获得生产本发明的抗ERPV-ATIp截短蛋白单克隆抗体的杂交瘤之后，本领域技术人员可以方便地利用该杂交瘤细胞株制备抗体。此外，本领域技术人员还可很方便地获知本发明的抗体的结构(比如抗体的重链可变区和轻链可变区)，然后可通过重组方法来制备本发明的单克隆抗体。

单克隆抗体的制备

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，本发明抗原，可被施用于动物以诱导单克隆抗体的产生。对于单克隆抗体，可利用杂交瘤技术来制备或重组DNA法制备。

代表性的骨髓瘤细胞是有效融合、通过选择的抗体产生细胞支持抗体的稳定高水平产生、且对培养基(HAT培养基基质)敏感的那些骨髓瘤细胞，包括骨髓瘤细胞株，例如鼠类的骨髓瘤细胞株，包括衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的骨髓瘤细胞株(可购自Salk Institute Cell Distribution Center，圣地亚哥，加利福尼亚，美国)以及SP-2、NZ0或X63-Ag8-653细胞(可购自American Type Culture Collection，洛克维尔，马里兰，美国)。人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞株也已被描述用于产生人单克隆抗体。

对杂交瘤细胞生长于其中的培养基进行分析以检测具有所需特异性的单克隆抗体的产生，如，通过体外结合分析例如，酶联免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫分析(RIA)。表达抗体的细胞的位置可用FACS进行检测。然后，可将杂交瘤克隆通过有限稀释步骤形成亚克隆(subcloned)，并通过标准方法生长。为了达到这一目的而使用的适合的培养基包括，例如，DMEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可在动物体内作为腹水瘤生长。

由亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基、腹水或血清中通过常规的免疫球蛋白纯化工艺适当地得到分离，这些纯化工艺为例如，蛋白A-琼脂糖法(protein A-Sepharose)、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析。

本发明提供了一种针对ERPV病毒的单克隆抗体。在本发明的一个优选的方案中，单克隆抗体采用培养杂交瘤细胞方法制备。取杂交瘤细胞培养的上清液，经饱和硫酸铵沉淀法粗提出IgG，再将粗提的抗体经亲和层析柱(Protein G-Sephrose)纯化。

本发明的一个优选的方案中，单克隆抗体采用Balb/C小鼠腹水生产单克隆抗体的方法制备。将约杂交瘤细胞接种到致敏的小鼠腹腔内，10天左右可见腹部明显胀大。抽取腹水，离心取上清，用上样缓冲液稀释，再将稀释液经亲和层析柱(HiTrap PtoteinG HP column(1mL))纯化。

标记的免疫球蛋白(抗体)

在本发明的一个优选例中，所述免疫球蛋白带有可检测标记物。更佳地，所述的标记物选自下组：胶体金标记物、辣根过氧化物酶标记、有色标记物或荧光标记物。

胶体金标记可采用本领域技术人员已知的方法进行。在本发明的一个优选的方案中，抗ERPV-ATIp截短蛋白的单克隆抗体用胶体金标记，得到胶体金标记的单克隆抗体。

本发明的抗ERPV-ATIp截短蛋白单克隆抗体具有很好的特异性，很高的效价。

检测板及其材料

本发明的检测板可采用本领域常用的检测板材料，采用常规的检测板制备方法制成。

本发明检测ERPV病毒的免疫检测板，包括测试条和支撑测试条的支撑板，如可采用PVC聚脂胶板等；所述的测试条由滤样纸、层析材料、硝酸纤维素膜和吸水纸依次搭接组成，搭接部位可以采用常规的方法，如胶带等固定连接；其中：层析材料预包被胶体金标记或有色标记的抗ERPV-ATIp截短蛋白单克隆抗体，优选被胶体金标记的抗ERPV-ATIp截短蛋白单克隆抗体，硝酸纤维素膜上吸附检测线和质控线；

在一个优选的方案中：层析材料上预包被胶体金标记的抗ERPV-ATIp截短蛋白单克隆抗体是采用浓度为0.5-1.5mg/mL胶体金标记的抗ERPV-ATIp截短蛋白单克隆抗体溶液进行预包被的，包被量为50μL/cm²；优选的浓度为0.5或1.5mg/mL，50μL/cm²。

检测方法与结果判定

平放检测板，将试样滴在滤样纸上，3～5min内观察层析结果。根据出现的条纹位置来判断结果。

阴性：质控区、检测区均出现明显的色带，示为阴性；

阳性：只在质控区出现明显色带，而在检测区无色带，示为阳性；

无效：质控区、检测区无任何色带或在质控区未出现色带而在检测区出现色带，表明检测方法错误或检测板变质或失效，应重新换取检测板检测。

方法和样本

本发明涉及用于在以细胞和/或组织溶解的样本检测ERPV病毒的方法。该方法步骤大致如下：获得细胞和/或组织样本；将样本溶解在介质中；检测在所述溶解的样本中ERPV病毒的水平。本发明方法所使用的样本可以是存在于细胞保存液中的包括细胞的任何样本，正如在液基细胞检测法中所使用的。

试剂盒

本发明还提供了一种指含有本发明的抗体(或其片段)或本发明的检测板的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。

本发明进一步设计用于检测ERPV病毒水平的检测试剂盒，该试剂盒包括识别抗ERPV-ATIp截短蛋白的抗体，用于溶解样本的裂解介质，检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。

本发明进一步设计开发用于对来自溶液样本的ERPV病毒感染相关情况诊断评估的试剂盒，该试剂盒可以检测存在于样本溶液中的ERPV病毒，其中保存样本的细胞保存液可以是诸如液基细胞检测法中的细胞保存液。

本发明的抗ERPV-ATIp截短蛋白单克隆抗体具有高亲和力、高特异性等优点，可广泛应用在制备ERPV病毒的检测领域，如检测试剂或检测设备的制备领域等，在特异性、灵敏度和检测率等方面较之传统的检测方法或检测试剂具有显著的优势。

本发明的主要优点包括：

(a)可以方便快速获得单克隆抗体，不仅仅能用于检测ATIp，还为人源化重组抗体的开发提供了序列依据。

(b)可以用于ERPV的诊断试剂盒的研发，可用于制备酶联免疫试剂盒和胶体金快速诊断试剂盒。

(c)由于使用的是果蝇S2细胞表达的重组蛋白，所以获得的重组蛋白接近天然构象，免疫原性好，获得单克隆抗体的亲和力和特异性好。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1

ERPV-ATI截短蛋白编码基因的获取

根据Virus Pathogen Resource数据库中ERPV-ATIp基因的基本信息，以实验室已有pFLAG-CMV5.1-ATI(pFLAG-CMV5.1载体由上海巴斯德研究所肿瘤病毒研究组惠赠，插入的ATI全长序列由上海伯尚生物公司合成)为模板，使用In-Fusion试剂盒，利用Vector NTI Advance 11软件设计特异性引物，PCR扩增得到一段ERPV-ATIp截短蛋白的编码序列，同时在PCR产物的两端分别引入了酶切位点：Kpn I和ApaL I。其中，PCR扩增使用引物序列如下：

引物1(SEQ ID NO.:3)：

5’-TCTCCATGGCCCGGGGTACCTAGAGAATCTCTTGATAGGGAACGGGA-3’

引物2(SEQ ID NO.:4)：

5’-GGCTTACCTTCGAAGGGCCCAGAATAGTCTTTCTGAAGACGATCGAATTCTA-3’

图1为PCR扩增的ERPV-ATIp编码序列片段的琼脂糖凝胶电泳图，分子量标记为购自GeneDirex公司的1Kb DNA Ladder RTU(DM010)，其中各泳道样品依次为：1:1Kb DNA Ladder RTU(Genedirex),2:ERPV-ATIp蛋白编码序列片段,3:pMT-BIP-V5/His-A,4:双酶切后pMT-BIP-V5/His-A,5:连有ERPV-ATIp蛋白编码序列片段的重组pMT-BIP-V5/His。

结果如图1所示，PCR扩增得到1.2kb的片段(截短)。质粒在天然情况下是以超螺旋状态存在。超螺旋的质粒pMT-BIP-V5/His-A约为2kb，双酶切后的大小则变为5kb左右。构建好的超螺旋重组质粒约为2.7kb。

实施例2

重组蛋白表达载体的构建

将实施例1中的PCR产物经KpnI和ApaL I双酶切后切胶回收，与同样使用KpnI和ApaL I双酶切的pMT/BIP/V5-His-A载体连接，随后转入DH5a中。涂布平板，过夜，挑取单斑送博尚生物技术有限公司测序验证。其中，载体pMT/BIP/V5-His-A位果蝇S2表达系统(Drosophial Expression System)所用的表达载体。

测序结果显示，载体中插入片段的核苷酸序列与目的片段核苷酸序列完全一致，重组蛋白表达载体构建正确。

实施例3

稳定表达重组蛋白的果蝇S2稳转细胞株构建

将实施例2构建的重组蛋白表达载体和pCoBlast质粒分别转化DH5a感受态细胞，挑选单个克隆扩大培养后提取质粒，并使用NanoDrop测定质粒浓度。参照果蝇S2表达系统提供的方法制备转染试剂。

转染前一天，将准备状态良好的果蝇S2细胞传代至六孔板中，每孔1.5×10⁶细胞，28℃培养12-18h后细胞密度达到4×10⁶个细胞即可以用于转染。

转染当天，按照以下配方准备转染混合液：

溶液A：150μL

细胞操作台上缓慢将溶液A滴加到溶液B中，同时用Vortex连续混匀。整个过程约1min左右。然后将混合液置细胞操作台静置30min直到形成大小较均一的沉淀物。均匀的将混合液滴加到铺有果蝇S2细胞的6孔板中，每孔150μL混合液。细胞置28℃培养18h。

转染后18h给细胞换液，离心去除磷酸钙溶液，用完全培养液洗细胞两次后用2mL完全培养液重悬转染的细胞并将细胞传代至原来的6孔板中。

转染后3天向细胞培养液中加入筛选抗生素Blasticidin HCl至终浓度为25μg/mL，间隔4-5天更换含有选择抗生素的培养液，经过2周左右的筛选即可获取稳定转染的细胞。

通过有限稀释法，取获得的稳定转染的细胞100个，稀释到预先准备好的10mL细胞密度为105的正常细胞中，混匀后铺96孔板，每空加样量为100μL。24h后向96孔板中加入100μL筛选抗生素Blasticidin浓度为50μg/mL的培养液，每隔4-5天向96孔板中补 充50μL含25μg/mL筛选抗生素Blasticidin HCl的培养液，10天后挑选单个细胞克隆孔传代至48孔板，并逐级扩大培养。细胞传代至24孔板48h换成无血清培养液并加入终浓度为5μM的诱导剂CdCl₂，72h后收集细胞培养液和细胞进行WB分析。WB分析使用抗体：一抗：His-Tag(2A8)Mouse mAb(购自Abmart公司，M20001S)；二抗：Anti-Mouse IgG(H+L),AP Conjugate(购自Promega公司，S3721)。

实施例4

ERPV-ATIp截短重组蛋白大量诱导表达及纯化

取实施例3中得到的稳定转染细胞株扩大培养后接种至3L Spinner Flask中，每瓶加入1L无血清培养液，接种细胞密度0.5-1×10⁶cell/mL。28℃培养24-48h后向培养液中加入诱导剂CdCl₂使终浓度为5μM，加入诱导剂后4天收集细胞培养液。操作如下：

取细胞培养液4℃，6000rpm/min离心10min收集细胞培养上清液，0.45μm滤膜过滤后向培养上清液中加入蛋白酶抑制剂PMSF，使终浓度为1mM。将上述培养液使用GE公司QuixStand^TMbenchtop systems进行10倍浓缩和缓冲液交换。浓缩后样品可放-20℃储存。

使用GE公司His GraviTrap Column通过亲和层析的方法对人重组ERPV-ATI截短蛋白进行纯化。纯化结果进行SDS-PAGE和WB分析。WB分析所用的一抗为His-Tag(2A8)Mouse mAb(Abmart)，二抗使用抗体为Goat Anti-Mouse Ig capture antibody(SBA)。

图2显示了使用亲和层析方法纯化ERPV-ATIp重组截短蛋白的SDS-PAGE图。其中，各泳道样品依次为:Marker:PageRuler Prestained Protein Ladder(10-170kDa)；Lane1-6:His亲和层析柱纯化处理的洗脱液(每管收集1ml样品)

图3显示了使用亲和层析方法纯化ERPV-ATIp重组截短蛋白免疫印迹(WB)分析结果。各泳道样品上样顺序与图2相同。

结果如图2和图3所示。通过对比图2和图3可知，我们获得了纯度较高的截短蛋白，获得的单体蛋白(实施案例9中证明该截短蛋白是以二聚体的形式存在)的大小约为60kDa，其中洗脱液4的纯度较好，表达量也较高。

实施例5

动物免疫

取实施例4中纯化的ERPV-ATIp重组截短蛋白作为免疫原，免疫Balb/c小鼠(8周，雌鼠)2只，免疫4次，每次间隔1周。具体方如下：

初次免疫：抗原50μg，加福氏完全佐剂皮下多点注射；

↓1周后

第二次免疫：剂量减至20μg，加福氏不完全佐剂皮下多点注射；

↓1周后

第三次免疫：剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下多点注射，7天后采集血清测抗体效价；

↓1周后

第四次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下多点注射；

↓1周后

加强免疫，抗原10μg，不加佐剂，皮下多点注射；

↓3天后

取脾细胞融合。

结果如图4所示，第三次免疫后2只小鼠血清抗体效价都超过1:1000000。

实施例6

杂交瘤制备和筛选

骨髓瘤细胞采用单克隆抗体制备的常用细胞株SP2/0。融合前细胞用含有8-氮鸟嘌呤的培养液处理，杀死对HAT不敏感的返祖细胞。融合时选择对数期生长且细胞形态和活性好的细胞，融合前一天用新鲜培养液调整细胞密度约为2×10⁵cells/mL，第二天的细胞用于融合实验。

加强免疫后第三天，取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞在50％的PEG介导下进行细胞融合，随后用培养液终止融合作用。融合时脾细胞与骨髓瘤细胞的比例为10:1。融合完成后将细胞加入到提前一天铺有饲养层细胞的96孔板中。

使用间接ELISA方法筛选阳性克隆。筛选用抗原为实施例4中纯化的ERPV-ATIp重组截短蛋白，二抗使用HRP-labeled Goat Anti-Mouse IgG1(SBA)。经确认的阳性克隆使用有限稀释法进行亚克隆，经三次克隆化后均为阳性的细胞克隆即为单克隆株，可扩大培养和冻存。

实施例7

腹水制备和抗体纯化

选择8周Balb/c小鼠用于腹水的制备。每只小鼠腹腔注射0.5mL液体石蜡，7天后注射已经定株的杂交瘤细胞，每只小鼠注射细胞量为1-3×10⁶cells。1-2周后可见小鼠腹部明显膨大，用注射器抽取腹水，从腹水中即可纯化获得大量的抗体。

取腹水离心(4℃，2000rpm离心5min)，吸去最上层的脂肪组织，除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清，用冷的结合缓冲液进行20倍稀释，12000rpm离心15min，取上清用0.45μm滤膜过滤后静置至无气泡。按照Bio-Rad仪器的使用手册，使用甲醇和ddH₂O对仪器管道进行清洗。连接好HiTrap ProteinG HP column(1mL)，设置好流速和紫外吸收值。然后按照以下步骤进行纯化：

20mL ddH₂O清洗→20mL结合缓冲液平衡→上样→10mL结合缓冲液清洗→20mL洗脱缓冲液洗脱(在吸光值到达高值之前，用单独的收集管收集，一旦出现吸光值，立即分多管收集，每管收集1mL，每1mL洗脱液中加入100μL中和缓冲液)→20mL纯水清洗→20mL 20％乙醇清洗，拆下柱子置4℃储存。各流程取样品，加入上样缓冲液，沸水浴10min，样品用SDS-PAGE分析抗体纯度。余下洗脱液收集至预处理好的透析袋中，在PBS溶液中4℃透析24h，期间更换4次透析液。收集透析后样品加入甘油至终浓度为50％，用Bio-Rad Bradford试剂测定抗体浓度，纯化好的抗体分装后置-80℃冰箱保存。

图5显示了腹水中抗体的SDS-PAGE分析图。其中，各泳道样品依次为：Lane1：经Binding Buffer稀释处理后的腹水；Lane 2：HiTrap ProteinG HP亲和层析柱处理后的穿透液；Lane3-7：经Elution buffer处理后的洗脱液。

结果如图5所示，在洗脱液(Lane3-7)中可以检测到两条带，55kDa和20kDa，分别为抗体的重链和轻链，且无杂带，纯化的效果较好。。

实施例8

单克隆抗体免疫印迹(Western Blot)应用

取实施例3中筛选得到的果蝇S2细胞稳转株，正常传代至T75Flask后48h将完全培养基换为无血清培养基，24h后加入终浓度为5μM的诱导剂CdCl₂，诱导ERPV-ATIp重组截短蛋白表达。加入诱导剂后72h收集细胞培养上清液，分别取1600μL上清液液加至1.5mL EP管中，加入240μL 100％TCA，冰浴20min。13000rpm 4℃离心30min，弃上清。加入4800μL丙酮冰浴20min，13000rpm 4℃离心30min，弃上清，开盖使丙酮挥发干。加入50μL 2×SDS-PAGE上样缓冲液，100℃处理10min，上样(15孔PAGE胶每孔上样量为30μL，ERPV-ATIp重组截短蛋白含量1μg)，10％的SDS-PAGE电泳，(电泳条件90V，30min，接着120V，40min)转膜(恒压条件下90V，60min)。转印完成后的PVDF膜室温下置5％脱脂牛奶中封闭60min。将膜按照泳道位置剪成小条，每一条分别置1mL终浓度为1μg/mL的单克隆抗体中(单克隆抗体来自于实施例5中纯化的抗体和Abmart公司的His-Tag(2A8)Mouse mAb)，4℃孵育过夜后用TBST溶液洗4次，将所有膜小片置1:1000稀释的HRP标记的Goat Anti-Mouse Ig capture antibody(SBA)抗体溶液中孵育1h，TBST洗4次后使用Las2000扫描。

结果如图6所示，三株单克隆抗体分别可以和60kDa的单体蛋白结合；对照组His抗体结合的单体蛋白也为60kDa，这表明，三株单克隆抗体正确识别截短蛋白。

实施例9

单克隆抗体免疫沉淀(IP)应用

取实施例3中筛选得到的果蝇S2细胞稳转株，正常传代至T75 Flask后72h，加入终浓度为5μM的诱导剂CdCl₂，诱导ERPV-ATIp重组截短蛋白表达。加入诱导剂后72h收 集细胞培养上清液，取1mL上清液液加至1.5mLEP管中，向上清液中加入20μL Recombinant Protein G(rProtein G)Agarose(购自Invitrogen公司：15920-010)，EP管置旋转摇床上4℃孵育1h，10000rpm离心5min，收集离心上清液，分别向每个EP管中加入50μL Recombinant Protein G(rProtein G)Agarose和实施例7中纯化的抗体5E9、6G7和11B2各1μg，EP管置旋转摇床上4℃孵育过夜，10000rpm离心5min，收集离心后的沉淀物，用预冷的PBS洗3次后向每个EP管中加入100μL 2×SDS-PAGE上样缓冲液，100℃煮10min后，4000rpm离心5min收集上清液，取30μL样品跑8％SDS-PAGE胶，经转印，封闭，一抗Goat mAb to 6xHis-tag(abcam)孵育，清洗，二抗Polyclonal Rabbit Anti-Goat Immunoglobulins/HRP(abcam)孵育，清洗后用Las 2000mini成像。

结果如图7所示，上述抗体均可以结合培养液中游离的ERPV-ATIp重组截短蛋白；该截短蛋白以二聚体形式存在，添加高浓度的DTT才会使二聚体解离。

实施例10

单克隆抗体免疫荧光(IF)实验

按照lipofectamine 2000说明书中的方法，将2ug的质粒pFLAG-CMV5.1-ATI转入24孔板内盖玻片上生长的293T内，6h后换液，48h收样。吸干培养基，用PBS洗两遍，500μL 2％多聚甲醛PBS溶液固定20min。再用PBS洗两遍，加入500μL 0.1％Triton X-100PBS室温浸泡15min使细胞膜穿孔。随后将盖玻片移植新的24孔板，PBS洗两遍。加入500μL Blocking Buffer(含5％FBS的PBS)封闭，室温20min。吸干Blocking Buffer，加入40μL一抗(实施例7纯化的3株抗体和Abbkine公司的Anti-Flag Tag Mouse Monoclonal Antibody(1B10)，1：100)过夜。PBS清洗3次，500μL封闭缓冲液封闭5min。加入50μL 1:1000稀释的山羊Anti-小鼠IgG H&L(Alexa555)(abcam)孵育60min。PBS清洗1次，加入300μL 1：5000倍稀释的DAPI封闭10min，PBS清洗2次。在ddH₂O中浸泡一次，吸干水分。在载玻片上滴一滴指甲油，把盖玻片倒扣在指甲油上，赶走汽包，再用指甲油封闭盖玻片。使用免疫电镜Lecia DM2500检测。

结果如图8所示，三株单克隆抗体都可以和全长的ERPV-ATIp结合，而且单克隆株5E9分泌的单克隆抗体的结合能力很强。图中，蓝色部分为DAPI染色后细胞核，红色部分为在细胞质中分布的ERPV-ATIp全长蛋白。

实施例9

间接ELISA检测抗ERPV-ATIp抗体

取纯化的ERPV-ATIp重组截短蛋白用包被缓冲液(Na2CO3：1.59g，NaHCO3：2.93g溶解在800mL水中，调节pH至7.4，定容至1000mL)稀释至2μg/mL，包被空白ELISA板(Nunc：468667)，100μL/well，4℃过夜，洗涤后加入封闭液(1％BSA，PBST，pH7.4)37℃封闭2h。充分洗涤后加入待检测液。小鼠阳性血清(serum-mouse-pos)是购自中科院上海巴斯德研究所肿瘤病毒研究组。该血清是使用全长ERPV-ATIp免疫后获 得的。小鼠血清从1：1000开始10倍稀释。37℃孵育40min后，用PBST洗涤4次后，加入1：10000倍稀释Goat Anti-Mouse Ig capture antibody(SBA)。37℃孵育30min后用PBST洗涤4次，加入TMB使用液(10mg/5mL无水乙醇)0.5mL，底物缓冲液(0.2M Na2HPO4(25.7mL×0.1M柠檬酸24.3mL加蒸馏水50mL)10mL，0.75％H₂O₂32μL)37℃孵育20min，加入50μL终止液(2M H₂SO₄)，用Molecular Device SpectraMax 190酶标仪记录450nm波长下每孔的吸光度，利用Prizm6对测定结果进行分析。

结果如图9所示，阳性小鼠血清稀释10⁶倍依然可以检测到，而小鼠阴性血清则基本无读数。结果表明，本发明的抗ERPV-ATIp抗体的特异性较好。

对比实施例1

利用杆状病毒表达系统表达ERPV-ATIp全长蛋白

以pFlag-CMV5.1-ERPV-ATIp为模板，参照In-Fusion Kit使用说明书，设计重组引物，PCR扩增得到ERPV-ATIp基因，将PCR产物与杆状病毒表达载体pFast-bactobac-HTB连接，转化DH5αE.coli感受态细胞，获得重组质粒pFast-bactobac-HTB-ATIp。其中，PCR扩增所用引物如下：

引物3(SEQ ID NO.:5)：

5’-TTTCAGGGCGCCATGGTTGAGGTCACGAACCTTATTGAAAAATGTAC-3’

引物4(SEQ ID NO.:6)：

5’-TTCTCGACAAGCTTGGTACCAGTAGATATTGGTAGAAGATATGCACTAACA-3’

将上述重组质粒转化DH10Bac E.coli感受态细胞。利用50μg/ml Kan、7μg/ml Tet和10μg/ml Gen三重抗性固体琼脂糖平板进行筛选，筛选得到的菌落接种至三抗液体培养基内，PCR检验并抽提质粒。即为构建的穿梭载体(Bacmid)。

27℃预热的不完全培养基调整Spinner Flask中悬浮培养的Sf9细胞的密度至4×10⁵cell/ml。转染前1h向24孔板每孔加入0.5ml(2×10⁵cells)上述不完全培养基Sf-9细胞稀释液，27℃昆虫细胞培养箱培养。

转染当天按照说明书提供的配方准备转染混合液：

在生物安全柜内逐滴把溶液B缓慢地加入溶液A中。用Vortex旋转混匀混合液后，将AB混合液静置15min。随后缓慢滴入160μL不完全培养基进行稀释。移走24孔板内不完全培养基后，将AB混合液的稀释液加入，确保稀释液覆盖整个孔底。随后将24孔板放入湿盒，27℃昆虫细胞培养箱内培养8h后，移除孔板内的AB混合液的稀释液，加入200μL完全培养基。27℃昆虫细胞培养箱内培养8天后，收取含有第一代病毒(P1 virus)的培养基，期间保持观察CPE的出现与否和形态。随后用不同量的P1 virus感染Sf9细胞，4天后收取细胞，期间保持观察CPE的出现与否和形态。

根据实施例3的方法，免疫印迹(WB)检验蛋白的表达情况。

图10显示了重组杆状病毒P1 virus感染Sf9细胞4天后细胞裂解液重组蛋白的WB检测结果，其中，Lane1:未转染细胞；Lane2-6:不同量的P1 virus感染Sf9细胞后4天细胞裂解液的WB检测图，Lane2-6：P1 virus的量分别为：50μL含P1 virus的培养基，100μL含P1 virus的培养基，200μL含P1 virus的培养基，400μL含P1 virus的培养基和800μL含P1 virus的培养基。红色箭头所指条带为Sf9细胞表达的蛋白WB检测条带。

结果如图10所示，重组杆状病毒表达出的重组蛋白的大小明显低于130kDa，这与ERPV-ATIp蛋白分子量的估计值130kDa相差很大。由于昆虫杆状病毒表达系统表达出的蛋白会经历翻译后修饰，这暗示着ERPV-ATIp有可能被剪切。

结果表明，杆状病毒表达系统表达的全长蛋白不适合作为ERPV-ATIp抗体的免疫原。

对比实施例2

利用果蝇S2细胞表达ERPV-ATIp全长蛋白

根据实施例1-4中的方法，获取ERPV-ATI全长蛋白，构建重组蛋白表达载体，构建稳定表达重组蛋白的果蝇S2稳转细胞株并对ERPV-ATIp全长蛋白大量诱导表达和纯化，SDS-PAGE和WB检验蛋白的表达情况。

其中，PCR扩增所用引物如下：

引物5(SEQ ID NO.:7)：

5’-TCTCCATGGCCCGGGGTACCTATGGAGGTCACGAACCTTATTGAAAA-3’

引物6(SEQ ID NO.:8)：

5’-GGCTTACCTTCGAAGGGCCCAGTAGATATTGGTAGAAGATATGCACTAACATCATATG-3’

结果如图11所示，WB显示出大小约为130kDa目的条带，但SDS-PAGE则无相应条带，表明表达量较低。因此，利用果蝇S2细胞表达的ERPV-ATIp全长蛋白也不适合作为抗原免疫小鼠。

实施例10

截短蛋白truncated-γ的筛选

在实施例1中的截短蛋白为truncated-γ，该截短蛋白在本实施例中筛选获得的表达量出乎意料地高于其他同类ATIp蛋白(全长或片段)，且可有效纯化的多肽。

方法同实施例1-4中的方法，即分别通过PCR获取多个不同的ERPV-ATI截短蛋白基因，利用果蝇S2表达系统表达，WB检验蛋白的表达情况。

本实施例中的截短蛋白在ERPV-ATI全长蛋白编码基因中的位置和所用引物如下 表所示：

截短蛋白	起止位置	正向引物	反向引物
				truncated-1	1-1404	f-1	r-1404
truncated-2	1-1554	f-1	r-1554
				truncated-3	1-1667	f-1	r-1667
truncated-4	1-1797	f-1	r-1797
				truncated-5	1-1929	f-1	r-1929
truncated-6	1-2064	f-1	r-2064
				truncated-7	1-2193	f-1	r-2193
truncated-8	1-2325	f-1	r-2325
				truncated-α	1-1269	f-1	R-α
truncated-β	445-1659	F-β	R-β
				truncated-γ	1489-2757	F-γ	R-γ
truncated-δ	1801-3339	F-δ	R-δ

所用的部分引物序列如下表所示：

图12显示了不同长度截短蛋白表达WB检测图。分别对不同诱导时间，3天和4天取样检测。图中数字上的横线包含的泳道数实际为2个，分别为第3天和第4天的WB检测。泳道：1-12:编码truncated-δ、truncated-α、truncated-β、truncated-γ、truncated-1、truncated-8、truncated-4、truncated-5、truncated-3、truncated-2、truncated-7和truncated-6片段蛋白质粒的果蝇S2细胞诱导培养基上清。

结果如图12所示，12个截短蛋白并不都表达，且各蛋白片段的表达量随诱导时间 的增加也呈不同变化。为了获取截短蛋白表达量高的细胞株，我们选择了较高的三株细胞(truncated-γ，truncated-1和truncated-8)大量培养和纯化。

对表达量较高的三株稳转细胞株(truncated-γ，truncated-1和truncated-8)进行扩大培养，根据实施例4中的方法，诱导表达并纯化这三种截短蛋白。SDS-PAGE和WB检验蛋白表达情况。

图13显示了不同长度的重组ERPV-ATIp蛋白表达纯化效果的检测。其中图13-A为SDS-PAGE检测；图13-B为WB检测。SDS-PAGE的顺序与WB的顺序一致，分别为truncated-1，truncated-8，truncated-γ的洗脱液。

结果如图13所示，截短蛋白truncated-γ的纯化效果要比其余两个蛋白的效果好的多。截短蛋白truncated-γ的分子量的推算值大约47kDa，SDS-PAGE和WB的显示的蛋白分子量要大于47kDa，这表示truncated-γ存在翻译后修饰。截短蛋白truncated-γ的洗脱液E3的蛋白纯度很高。

此外，对比SDS-PAGE和WB的结果，发现truncated-1(推算值52kDa)和truncated-8(推算值85kDa)的表达量很低，SDS-PAGE检测不到蛋白表达而WB可以检测到蛋白表达。

上述结果表明，截短蛋白truncated-γ是一种出乎意料地特别适合使用果蝇S2细胞进行表达，并保留类似于原ATIp蛋白构象的截短蛋白。

本发明的上述实验已表明，该截短蛋白作为免疫原免疫小鼠所制备单克隆抗体或多克隆抗体(如抗血清)，可以有效结合ATIp。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种抗原多肽，其特征在于，所述的抗原多肽的序列如SEQ ID NO.:2中第497-919位所示。

2.一种特异性抗权利要求1所述的抗原多肽的抗体。

3.如权利要求2所述的抗体，其特征在于，所述的抗体为多克隆抗体或抗血清。

4.如权利要求2所述的抗体，其特征在于，所述的抗体为单克隆抗体。

5.一种检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有权利要求1所述的抗原多肽和/或权利要求2所述的抗体。

6.一种权利要求1所述的抗原多肽和/或权利要求2所述的抗体的用途，其特征在于，用于制备检测红斑性肢痛症相关痘病毒(erythromelalgia-related poxvirus，ERPV)的检测试剂或试剂盒。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的检测试剂包括侧流片。

8.一种用于检测红斑性肢痛症相关痘病毒的检测试剂，其特征在于，所述的检测试剂含有权利要求1所述的抗原多肽和/或权利要求2所述的抗体。

9.如权利要求8所述的检测试剂，其特征在于，所述的检测试剂包括测试条。

10.如权利要求9所述的检测试剂，其特征在于，所述检测条包括：

样品垫、结合垫、反应膜、吸收垫、和背衬，其中所述反应膜上设置有检测区和质控区；以及

其中，所述的检测区固定有如权利要求1所述的多肽，且所述结合垫固定有如权利要求2所述的抗体。