CN106589104A - 人源分子伴侣样蛋白及其表达纯化、晶体结构和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体为一种人源分子伴侣样蛋白及其表达纯化、晶体结构和应用。本发明的人源分子伴侣样蛋白Archease由179个氨基酸组成，分子量为20.7kDa；在大肠杆菌表达菌株Bl21(DE3)plus中可溶性表达且表达量较高。动态光散射表明Archease在结合RNA剪切连接酶辅因子GTP后粒径变大，与其功能发挥紧密相关。Archease的晶体结构分辨率为1.96Å。该结构由7个β折叠和4个α螺旋组成。Archease在辅助同一操纵子蛋白如RNA剪切连接酶、甲基转移酶发挥作用方面起到了重要的催化调节作用，是内质网应激蛋白XBP1 mRNA的成熟加工过程中所必需。解析Archease的三维晶体结构有助于阐明其作用机理，从而更好的发挥并拓宽其作用范围。

Description

人源分子伴侣样蛋白及其表达纯化、晶体结构和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人源分子伴侣样蛋白Archease及其表达纯化、晶体结构、动态光散射结果及其在辅助多种蛋白发挥作用方面的重要作用。

背景技术

Archease从古生物到人都高度保守，具体作用底物仍未被发现，人源Archease能够催化RNA剪切连接酶RTCB发挥作用，在果蝇中缺失Archease会阻碍视神经轴突的再生，嗜热古菌Archease能催化甲基转移酶发挥作用。在Archease存在的情况下可以明显加速RNA剪切连接酶及甲基转移酶发挥作用。根据已有的报道Archease对与其同一操纵子的蛋白起到了催化剂的作用，而与Archease处于同一操纵子的许多蛋白对于生化反应的进行具有重要的调控作用，内质网应激蛋白XBP1mRNA的成熟加工过程中Archease的辅助作用是必需的。Archease辅助蛋白均在免疫过程中发挥了重要作用。因此通过结构生物学方法获得Archease的晶体结构及利用动态光散射结果表明在结合辅因子后粒径的变化对于找到其作用底物，阐明其作用机理从而进一步拓宽其应用具有重要的指导作用。

发明内容

本发明的目的在于提出人源分子伴侣样蛋白Archease及其表达纯化、晶体结构、动态光散射结果及其在辅助多种蛋白发挥作用方面的应用。

本发明涉及对人源Archease进行密码子优化，以获得在大肠杆菌中以可溶性形式表达的重组蛋白；对重组蛋白进行纯化、结晶；获得人源Archease第20位到第179位氨基酸的三维晶体结构，及其应用。

本发明首先对人源Archease进行了密码子优化，得到密码子优化的人源Archease。具体将其全长基因克隆在pet28b+表达载体上，选用Nco1及Xho1酶切位点，为避免移码突变的产生，在起始密码子ATG后的添加以鸟嘌呤开头的丙氨酸，在本发明描述过程中其他氨基酸顺序依次顺延。同时保留载体上C-端的6XHis，用于后续纯化工作。

本发明涉及的人源Archease,含179个氨基酸，分子量为20.7kDa，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

本发明优先选择使用大肠杆菌的原核细胞表达系统(但不排除其他的表达系统，如在其它细菌或者其他的真核生物细胞中进行表达)；对以上所述蛋白以融合蛋白的方式进行表达，优先选择了His标签得到了可溶性表达(但不排除其它标签，如MBP或GST等标签也有可溶性表达)。

本发明还提供表达和纯化人源Archease的方法，该方法包括：构建了人源Archease重组载体，用该载体转化大肠杆菌，从而表达带有标签的重组蛋白Archease，将上述获得的蛋白通过特异性的与所述特异标签识别的方法(优选Ni亲和层析(分离原理为：低咪唑浓度缓冲液进行上样，高咪唑浓度缓冲液进行洗脱))，分离出目的蛋白，经凝胶过滤层析，得到高纯度的重组蛋白Archease。

其中，亲和层析的平衡缓冲液优先选择50mM Tris,pH 8.0；500mM NaCl；5％甘油；10mM咪唑；2mMβ-Me；0.2mM PMSF，洗脱缓冲液优先选择50mM Tris,pH 8.0；500mM NaCl；5％甘油；250mM咪唑；2mMβ-Me。凝胶过滤层析的缓冲液优先选择20mM Tris，pH7.4；100mMNaCl；2mM DTT。

其中，表达质粒为pET28b(+)，转化方法为CaCl₂转化法，克隆菌株为大肠杆菌Top10，表达菌株为大肠杆菌BL21(DE3)plus。

本发明还提供对人源Archease进行结晶的方法，所述方法包括：将人源Archease浓缩至10-30mg/ml，在4-30℃下用气相扩散法筛选晶体生长条件，优先选择使用15-20摄氏度。

本发明还提供衍射性能良好的人源Archease的晶体。

本发明还提供人源Archease的晶体三维结构，该结构描述了人源Archease的二级结构组成，肽链走向、组织模式以及三维分子构造。其中针对人源Archease蛋白进行衍射，得到人源Archease蛋白的晶体衍射数据，以来自于嗜热古菌Archease(PDB ID:4N2P)为模型进行结构解析，最终得到人源Archease蛋白的晶体三维结构。

在具体的实施方式中，提供了人源Archease的晶体三维结构，其中所述晶体三维结构中的原子具有表1中所列的至少一部分的原子坐标，或者任何与该坐标中至少40％氨基酸残基的主链碳骨架的原子三维坐标的平均根方差小于或等于的结构。

本发明获得的人源Archease的晶体三维结构，分辨率为其结构空间群为P2₁ 2₁ 2₁，晶胞参数为：α＝β＝γ＝90°。

在一具体的实施方式中，所述的人源Archease的三维结构在一个晶体学不对称单位内有两个蛋白分子。该结构共由7个β折叠和4个α螺旋组成，其中，所述的7个β折叠位于中心，所述的4个α螺旋围绕在β折叠的周围。其中α螺旋1，即含Glu28-Lys36的氨基酸区段，β折叠1，即含Tyr44-Trp58的氨基酸区段，α螺旋2，即含Leu62-Met77的氨基酸区段，α螺旋3，即含Thr80-Thr82的氨基酸区段，β折叠2，即含Gln87-Gln94的氨基酸区段，α螺旋4，即含Leu98-Ser114的氨基酸区段，β折叠3，即含Phe119-Asp130的氨基酸区段，β折叠4，即含Lys135-Glu144的氨基酸区段，β折叠5，即含Val156-IIe159的氨基酸区段，β折叠6，即含Gln165-Tyr167的氨基酸区段，β折叠7，即含Glu173-IIe180的氨基酸区段。

Archease从古生物到人都高度保守，根据已公布古细菌Archease结构比对可知，人源Archease第51位天冬氨酸为金属离子结合位点，第156位赖氨酸高度保守,对其金属结合位点及高度保守位点突变后检测对催化反应的影响，有助于阐明其作用机理。

动态光散射DLS结果表明，Archease在结合辅因子GTP后粒径变大，复合物的均一性较蛋白自身的均一性明显提高。

研究表明，Archease在辅助同一操纵子蛋白如RNA剪切连接酶、甲基转移酶发挥作用方面起到重要的催化调节作用，是内质网应激蛋白XBP1mRNA的成熟加工过程中所必需。

解析Archease的三维晶体结构有助于阐明其作用机理，从而更好的发挥并拓宽其作用范围。

附图说明

图1为人源Archease的三维结构飘带示意图。α螺旋用蓝色表示；β折叠用紫红色表示；无规则卷曲用紫罗兰色色表示。其中，A为异构单元中两个分子结构示意图；B为单体结构示意图。

图2为人源Archease的拓扑结构示意图。其中，圆柱状为α螺旋，箭头状为β折叠。数字代表氨基酸残基位置。

图3为人源Archease的蛋白纯化图。其中，A：聚丙烯酰胺凝胶电泳分析图；B：凝胶过滤层析分析图。Superdex200 16/600，GE Healthcare。

图4为人源Archease动态光散射(DLS)检测结果。

图5为人源Archease+GTP(摩尔比1:5)动态光散射(DLS)检测结果。

具体实施方式

下面采用具体实施例进一步说明本发明的内容。

以下内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

实施例1.人源Archease的表达纯化方法

人源Archease，其氨基酸序列SEQ.ID.NO.1所示；

MKGGSRVSNPAVMAQEEEDVRDYNLTEEQKAIKAKYPPVNRKYEYLDHTADVQLHAWGDTLEEAFEQCAMAMFGYMTDTGTVEPLQTVEVETQGDDLQSLLFHFLDEWLYKFSADEFFIPREVKVLSIDQRNFKLRSIGWGEEFSLSKHPQGTEVKAITYSAMQVYNEENPEVFVIIDI

通过全基因合成将人源Archease的全长基因克隆到pET28b(+)的载体上，羧基末端融合6个His用于后续纯化，将重组载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)plus中，37℃振荡培养至OD₆₀₀值0.8左右时加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导表达，表达条件为：25℃振荡培养16h。

将构建好的重组表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)plus中进行人源Archease的可溶性表达。以50μg/ml卡那霉素和34μg/ml氯霉素为选择压力，转接重组表达菌株于含有上述选择压力的LB液体培养基中,37℃，220rpm振荡培养至OD₆₀₀值0.8左右时加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导表达,25℃,200rpm振荡培养16至20小时后6000rpm离心15min收菌。

将离心收集的表达菌以适量缓冲液(50mM Tris,pH 8.0；500mM NaCl；5％甘油；10mM咪唑；2mMβ-Me；0.2mM PMSF)悬菌，使用低温超高压细胞破碎仪(广州聚能生物科技有限公司)裂解菌体，以18000rpm高速离心1h去除沉淀和其它颗粒状杂质。将离心后上清液与Ni-NTA亲和介质结合后，用50mM Tris,pH 8.0；500mM NaCl；5％甘油；50mM咪唑；2mMβ-Me的缓冲液冲洗介质，去除杂蛋白。最终用50mM Tris,pH 8.0；500mM NaCl；5％甘油；250mM咪唑；2mMβ-Me的洗脱液将目的蛋白从亲和介质上洗脱下来，以10KDa截留的浓缩管将洗脱液浓缩。将浓缩后的蛋白溶液进一步用凝胶过滤层析(Superdex200，16/600)的方法纯化，使用的缓冲液为20mM Tris，pH7.4；100mM NaCl；2mM DTT。将洗脱下来的目的蛋白进行浓缩至浓度为15-30mg/ml，于-80℃保存，用于结晶实验。

实施例2.人源Archease的结晶方法

将如上方法表达纯化好的人源Archease浓缩至浓度约10-30mg/ml，使用结晶试剂盒(来自Hampton Research等公司的Crystal Screen Kit I/II,Index,Wizard Kit 1&2,Wizard Kit 3&4等)作为晶体生长的初筛条件，采用悬滴气象扩散法进行结晶。在多个不同的结晶试剂条件下获得了初始晶体。通过后期的优化调整，优选15-20％(w/v)PEG6000,100mM柠檬酸钠pH5.0-6.0的缓冲液作为晶体生长条件，收集到一套分辨率为的X射线衍射数据。

实施例3.人源Archease的收据收集及结构解析

本发明人将制备的晶体以25％的甘油作为防冻剂处理后，冻存于液氮中。晶体X射线衍射的数据收集在上海光源(SSRF)生物大分子晶体学光束线站(五线六站BL18U)进行。数据处理使用HKL3000，结构解析以来自于嗜热古菌Archease(PDB ID:4N2P)为模型，采用分子置换法，利用Refmac程序并辅以Coot软件做进一步修正，最终解析得到人源Archease蛋白的晶体结构。本领域的普通技术人员可知，于其中所述晶体三维结构中的原子具有表1中所列的至少40％的原子坐标，或者3D蛋白的晶体三维结构中至少40％氨基酸的主链碳骨架的原子结构坐标与表1中的坐标的平均根方差小于或等于的原子坐标，均可被认为与3D蛋白具有雷同结构。

具体而言，所述的人源Archease的晶体三维结构，一个晶体学不对称单位内有两个蛋白分子。由7个β折叠和4个α螺旋组成，其中，所述的7个β折叠位于中心，所述的4个α螺旋围绕在β折叠的周围。其中α螺旋1，即含Glu28-Lys36的氨基酸区段，β折叠1，即含Tyr44-Trp58的氨基酸区段，α螺旋2，即含Leu62-Met77的氨基酸区段，α螺旋3，即含Thr80-Thr82的氨基酸区段，β折叠2，即含Gln87-Gln94的氨基酸区段，α螺旋4，即含Leu98-Ser114的氨基酸区段，β折叠3，即含Phe119-Asp130的氨基酸区段，β折叠4，即含Lys135-Glu144的氨基酸区段，β折叠5，即含Val156-IIe159的氨基酸区段，β折叠6，即含Gln165-Tyr167的氨基酸区段，β折叠7，即含Glu173-IIe180的氨基酸区段。

表1人源Archease晶体的原子坐标群如下：

晶体空间群：P 2₁ 2₁ 2₁

晶胞参数为：α＝β＝γ＝90°。

I/σ：10.23(1.74)

Rwork/Rfree分别为：0.1906和0.2314

分辨率范围50-1.96

数据完整性(％)：100。

SEQUENCE LISTING

<110> 复旦大学

<120> 人源分子伴侣样蛋白及其表达纯化、晶体结构和应用

<130> 001

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 179

<212> PRT

<213>

<400> 1

Met Lys Gly Gly Ser Arg Val Ser Asn Pro Ala Val Met Ala Gln Glu

1 5 10 15

Glu Glu Asp Val Arg Asp Tyr Asn Leu Thr Glu Glu Gln Lys Ala Ile

20 25 30

Lys Ala Lys Tyr Pro Pro Val Asn Arg Lys Tyr Glu Tyr Leu Asp His

35 40 45

Thr Ala Asp Val Gln Leu His Ala Trp Gly Asp Thr Leu Glu Glu Ala

50 55 60

Phe Glu Gln Cys Ala Met Ala Met Phe Gly Tyr Met Thr Asp Thr Gly

65 70 75 80

Thr Val Glu Pro Leu Gln Thr Val Glu Val Glu Thr Gln Gly Asp Asp

85 90 95

Leu Gln Ser Leu Leu Phe His Phe Leu Asp Glu Trp Leu Tyr Lys Phe

100 105 110

Ser Ala Asp Glu Phe Phe Ile Pro Arg Glu Val Lys Val Leu Ser Ile

115 120 125

Asp Gln Arg Asn Phe Lys Leu Arg Ser Ile Gly Trp Gly Glu Glu Phe

130 135 140

Ser Leu Ser Lys His Pro Gln Gly Thr Glu Val Lys Ala Ile Thr Tyr

145 150 155 160

Ser Ala Met Gln Val Tyr Asn Glu Glu Asn Pro Glu Val Phe Val Ile

165 170 175

Ile Asp Ile

Claims (7)

1.一种人源分子伴侣样蛋白Archease，其特征在于，Archease的密码子进行了优化，即将其全长基因克隆在pet28b+表达载体上，选用Nco1及Xho1 酶切位点，在起始密码子ATG后添加以鸟嘌呤开头的丙氨酸，其他氨基酸顺序依次顺延，同时保留载体上C-端的6XHis；所述人源Archease, 含179个氨基酸，分子量为20.7kDa，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1 所示。

2.如权利要求1所述的人源分子伴侣样蛋白Archease的表达和纯化方法，其特征在于，包括：构建人源Archease重组载体，用该载体转化大肠杆菌，从而表达带有标签的重组蛋白Archease，将上述获得的蛋白通过特异性的与所述特异标签识别的方法，分离出目的蛋白，经凝胶过滤层析，得到高纯度的重组蛋白Archease；

其中，表达质粒为pET28b (+)，转化方法为CaCl₂转化法，克隆菌株为大肠杆菌Top10，表达菌株为大肠杆菌BL21(DE3)plus。

3.如权利要求1所述的人源分子伴侣样蛋白Archease的结晶方法，其特征在于，包括：将人源Archease浓缩至10-30mg/ml，在4-30°C下用气相扩散法筛选晶体生长条件。

4.如权利要求1所述的人源分子伴侣样蛋白Archease的晶体三维结构，其特征在于，晶体三维结构中的原子具有表1中所列的至少40%的原子坐标，或者至少40%氨基酸的主链碳骨架的原子结构坐标与表1中的坐标的平均根方差小于或等于1.7Å。

5.根据权利要求4所述的人源分子伴侣样蛋白Archease的晶体三维结构，其特征在于，分辨率为1.96Å，晶体结构空间群为P 2₁ 2₁ 2₁，一个不对称单位有两个分子；晶胞参数为：a＝46.321 Å，b＝55.921Å，c＝ 133.485 Å，α＝β＝γ＝90°。

6.根据权利要求4所述的人源分子伴侣样蛋白Archease的晶体三维结构，其特征在于，

由7个β折叠和4个α螺旋组成；7个β折叠位于中心，4个α螺旋围绕在β折叠的周围；其中，α螺旋1，即含 Glu28-Lys36的氨基酸区段，β折叠1，即含Tyr44-Trp58的氨基酸区段，α螺旋2，即含Leu62-Met77的氨基酸区段，α螺旋3，即含Thr80-Thr82的氨基酸区段，β折叠2，即含Gln87-Gln94的氨基酸区段，α螺旋4，即含Leu98-Ser114的氨基酸区段，β折叠3，即含Phe119-Asp130的氨基酸区段，β折叠4，即含Lys135-Glu144 的氨基酸区段，β折叠5，即含Val156-IIe159的氨基酸区段，β折叠6， 即含Gln165-Tyr167的氨基酸区段，β折叠7，即含Glu173- IIe180的氨基酸区段。

7.如权利要求4-6之一所述的人源分子伴侣样蛋白Archease的晶体三维结构，在辅助同一操纵子蛋白如RNA剪切连接酶、甲基转移酶方面的催化调节作用。