CN106562999B - 治疗肿瘤的成套试剂与重组流感病毒 - Google Patents
治疗肿瘤的成套试剂与重组流感病毒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106562999B CN106562999B CN201510649463.5A CN201510649463A CN106562999B CN 106562999 B CN106562999 B CN 106562999B CN 201510649463 A CN201510649463 A CN 201510649463A CN 106562999 B CN106562999 B CN 106562999B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- rna
- influenza virus
- hckp
- hckpp
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明公开了治疗肿瘤的成套试剂与重组流感病毒。本发明所提供的治疗肿瘤的成套试剂，由阿霉素和重组流感病毒组成；所述重组流感病毒表达下述B1)或B2)的蛋白质：B1)氨基酸序列为序列1的蛋白质；B2)在序列1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由B1)衍生的蛋白质。实验证明，本发明的成套试剂及重组流感病毒可以抑制肝癌的生长并可以延长动物的生存时间，可以用来治疗肝癌。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域中治疗肿瘤的成套试剂与重组流感病毒。
背景技术
原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。我国的肝癌的发病数高居世界第一，世界上近一半的发病人口位于中国。目前临床治疗肝癌常应用手术、放疗、化疗等手段，但均难以根治肝癌。传统的放、化疗治疗方法在杀伤肿瘤细胞的同时，对人体的正常细胞也造成巨大伤害。因此治疗肝癌的一大难题是，如何高效、特异性杀伤肿瘤细胞的同时，减少对正常细胞组织的损伤。
人H1N1流感病毒毒株A/PR/8/34(简称PR8)是一株鸡胚适应病毒株，能在鸡胚中有效地复制。PR8为单股负链、分节段的RNA，共有8个独立的RNA片段组成，编码10种蛋白质。片段1-3编码RNA依赖的RNA聚合酶，片段1编码聚合酶亚基PB2，片段2编码聚合酶亚基PB1，片段3编码聚合酶亚基PA；片段4编码血凝素HA，是一种与病毒附着感染有关的表面糖蛋白；片段5编码核蛋白NP，是病毒RNA的主要结构部分；片段6编码神经氨酸酶NA，是一种包膜糖蛋白；片段7编码两种基质蛋白M1和M2，是非糖基化的结构蛋白；片段8编码两种非结构蛋白NS1和NS2。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何治疗肝癌。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了治疗肿瘤的成套试剂。
本发明所提供的治疗肿瘤的成套试剂，由阿霉素和重组流感病毒组成；所述重组流感病毒表达HCKP，HCKP为下述B1)或B2)的蛋白质：
R1)氨基酸序列为序列1的蛋白质；
B2)在序列1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由B1)衍生的蛋白质。
上述成套试剂中，所述重组流感病毒的基因组为单股负链、分节段的RNA，所述重组流感病毒的负链RNA转录出与所述负链RNA互补的成套正链RNA，所述成套正链RNA包括PB1-RNA、PB2-RNA、PA-RNA、NP-RNA、M-RNA、HA-RNA、NA-RNA和HCKP-RNA；
所述PB1-RNA为编码流感病毒毒株中PB1的RNA；
所述PB2-RNA为编码所述流感病毒毒株中PB2的RNA；
所述PA-RNA为编码所述流感病毒毒株中PA的RNA；
所述NP-RNA为编码所述流感病毒毒株中NP的RNA；
所述M-RNA为编码所述流感病毒毒株中M1和M2的RNA：
所述HA-RNA为编码所述流感病毒毒株中HA的RNA；
所述NA-RNA为编码所述流感病毒毒株中NA的RNA；
所述HCKP-RNA为编码HCKP的RNA。
上述成套试剂中，所述编码HCKP的RNA的序列可为将序列表中序列2的第104-1303位中的所有T均替换为U，其它核苷酸均不变得到的序列。
其中，序列2的第104-1303位所示的DNA分子(将其命名为HCKP的编码基因)编码序列1所示的HCKP。所述编码HCKP的RNA的序列由1200个核苷酸组成，所述编码HCKP的RNA的序列仅为将HCKP的编码基因序列中的所有T均替换为U，其它核苷酸均不变得到的序列。
上述成套试剂中，所述流感病毒毒株可为流感病毒毒株A/PR/8/34。
上述成套试剂中，所述重组流感病毒的基因组可包括与所述编码HCKP的RNA反向互补的单链RNA与流感病毒毒株A/PR/8/34的部分基因组，所述重组流感病毒的基因组也可由与所述编码HCKP的RNA反向互补的单链RNA与流感病毒毒株A/PR/8/34的部分基因组组成；所述流感病毒毒株A/PR/8/34的部分基因组由流感病毒毒株A/PR/8/34基因组中编码所述PB1的负链RNA、编码所述PB2的负链RNA、编码所述PA的负链RNA、编码所述NP的负链RNA、编码所述M1的负链RNA、编码所述M2的负链RNA、编码所述HA的负链RNA和编码所述NA的负链RNA组成。
上述成套试剂中，所述HCKP的编码基因的表达可由序列2的第4010-5179位所示的DNA分子启动。
序列2由5200个核苷酸组成，序列2的第104-1303位为所述HCKP的编码基因的序列，序列2的第4010-5179位为启动所述HCKP的编码基因表达的启动子的序列。
为解决上述技术问题，本发明还提供了所述成套试剂中重组流感病毒的构建方法
本发明所提供的所述成套试剂中重组流感病毒的构建方法，包括将含有编码所述PB1-RNA的DNA分子的重组载体、含有编码所述PB2-RNA的DNA分子的重组载体、含有编码所述PA-RNA的DNA分子的重组载体、含有编码所述NP-RNA的DNA分子的重组载体、含有编码所述M-RNA的DNA分子的重组载体、含有编码所述HA-RNA的DNA分子的重组载体、含有编码所述NA-RNA的DNA分子的重组载体和含有编码所述HCKP-RNA的DNA分子的重组载体导入包装细胞中，得到重组流感病毒。
上述方法中，所述HCKP-RNA的DNA分子的表达可由序列2的第4010-5179位所示的DNA分子启动。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一产品：
P1、所述重组流感病毒；
P2、所述重组流感病毒的基因组；
P3、含有所述HCKP的编码基因的载体；
P4、含有所述HCKP的编码基因的表达盒；
P5、所述HCKP的编码基因；
P6、HCKP。
上述产品中，P3所述载体具体可为序列2所示的载体。
上述产品中，所述HCKP的编码基因可为序列2的第104-1303位所示的DNA分子。
为解决上述技术问题，本发明还提供了与所述重组流感病毒相关的生物材料。
本发明所提供的与所述重组流感病毒相关的生物材料，为下述E1)至E18)中的任一种：
F1)含有编码所述重组流感病毒的成套正链RNA的成套DNA分子的重组载体；
E2)成套载体，由下述E2a)、E2b)、E2c)、E2d)、E2e)、E2f)、E2g)和E2h)组成：
E2a)含有编码所述PB1-RNA的DNA分子的重组载体；
E2b)含有编码所述PB2-RNA的DNA分子的重组载体；
E2c)含有编码所述PA-RNA的DNA分子的重组载体；
E2d)含有编码所述NP-RNA的DNA分子的重组载体；
E2e)含有编码所述M-RNA的DNA分子的重组载体；
E2f)含有编码所述HA-RNA的DNA分子的重组载体；
E2g)含有编码所述NA-RNA的DNA分子的重组载体；
E2h)含有编码所述HCKP-RNA的DNA分子的重组载体；
E3)含有编码E1)所述成套DNA分子的重组微生物；
E4)含有E1)所述重组载体的重组微生物；
E5)含有E2)所述成套载体的重组微生物；
E6)含有编码E1)所述成套DNA分子的转基因动物细胞系；
E7)含有E1)所述重组载体的转基因动物细胞系；
E8)含有E2)所述成套载体的转基因动物细胞系；
E9)含有编码E1)所述成套DNA分子的转基因动物组织；
E10)含有E1)所述重组载体的转基因动物组织；
F11)含有E2)所述成套载体的转基因动物组织；
E12)含有编码E1)所述成套DNA分子的转基因动物器官；
E13)含有E1)所述重组载体的转基因动物器官；
E14)含有E2)所述成套载体的转基因动物器官；
E15)含有所述重组流感病毒的微生物；
E16)含有所述重组流感病毒的动物细胞系；
E17)含有所述重组流感病毒的动物组织；
E18)含有所述重组流感病毒的动物器官；
所述成套DNA分子由编码所述PB1-RNA的DNA分子、编码所述PB2-RNA的DNA分子、编码所述PA-RNA的DNA分子、编码所述NP-RNA的DNA分子、编码所述M-RNA的DNA分子、编码所述HA-RNA的DNA分子、编码所述NA-RNA的DNA分子和编码所述HCKP-RNA的DNA分子组成。
上述生物材料中，所述编码HCKP的正链RNA的DNA分子可为序列2的第104-1303位所示的DNA分子。
上述生物材料中，所述转基因动物细胞系、所述转基因动物组织、所述转基因动物器官、所述动物细胞系、所述动物组织和所述动物器官均不包括繁殖材料。
上述生物材料中，所述重组微生物可为重组流感病毒。
上述生物材料中，E15)所述微生物、E16)所述动物细胞系、E17)所述动物组织和E18)所述动物器官均可为流感病毒的寄主。
在本发明的一个实施例中，E2a)所述重组载体为pHW-PB1；E2b)所述重组载体为pHW-PB2；E2c)所述重组载体为pHW-PA；E2d)所述重组载体为pHW-NP；E2e)所述重组载体为pHW-M；E2f)所述重组载体为pHW-HA；E2g)所述重组载体为pHW-NA。E2h)所述重组载体为序列2所示的载体pHW-HCKPP-HCKP。pHW-HCKPP-HCKP中，序列2的第4010-5179位所示的DNA分子启动序列2的第104-1303位所示基因(即HCKP的编码基因)的表达，所述HCKP的编码基因编码序列1所示的HCKP。
为解决上述技术问题，本发明还提供了治疗肿瘤药物。
本发明所提供的治疗肿瘤药物的活性成分可为所述成套试剂。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一应用：
I、所述成套试剂在制备治疗肿瘤药物中的应用；
II、所述重组流感病毒在制备治疗肿瘤药物中的应用；
III、所述基因组在制备治疗肿瘤药物中的应用；
IV、所述生物材料在制备治疗肿瘤药物中的应用；
V、所述成套试剂在治疗肿瘤中的应用；
VI、所述重组流感病毒在治疗和/或肿瘤药物中的应用；
VII、所述基因组在治疗肿瘤中的应用；
VIII、所述生物材料在治疗肿瘤中的应用。
本发明中所述肿瘤可为实体肿瘤，如肝癌。所述肝癌具体可为原发性肝癌，也可为HepG2、SMMC-7721、HuH-7或HuH-7.5细胞系诱发的肝癌。
本发明中，阿霉素可为深圳万乐药业有限公司产品，产品目录号为国药准字44024359。
实验证明，本发明的成套试剂及重组流感病毒FLU-HCKPP-HCKP可以抑制肝癌的生长并可以延长动物的生存时间：FLU-HCKPP-HCKP治疗组的肿瘤体积分别为A/PR/8/34治疗组和PBS治疗组的0.43倍和0.41倍；成套试剂治疗组的肿瘤体积分别为DOX组、FLU-HCKPP-HCKP组、A/PR/8/34+DOX组和PBS组的0.73倍、0.65倍、0.71倍、0.26倍；在FLU-HCKPP-HCKP治疗组动物生存率为40％时距第1次治疗的时间分别为A/PR/8/34组和PBS组动物存活率为40％时距第1次治疗的时间的1.30倍和1.37倍；在成套试剂治疗组裸鼠生存率为40％时距第1次治疗的时间分别为DOX组、FLU-HCKPP-HCKP组、A/PR/8/34+DOX组和PBS组裸鼠存活率为40％时距第1次治疗的时间的1.27倍、1.46倍、1.46倍、2倍。
实验证明，本发明的重组流感病毒FLU-HCKPP-HCKP可以特异抑制肝癌细胞的增殖，并且该抑制作用具有重组流感病毒剂量依赖性：FLU-HCKPP-HCKP对肝癌细胞系HepG2、SMMC-7721、HuH-7和HuH-7.5的抑制率分别为FLU-HCKPP-HCKP对人正常肝细胞L-02的抑制率5.33、4.14、5.61、4.87倍。
实验证明，本发明的成套试剂及重组流感病毒FLU-HCKPP-HCKP可以用来治疗肝癌。
附图说明
图1为重组流感病毒感染不同细胞后细胞的存活率。
图2为不同TCID50感染系数MOI条件下重组流感病毒对不同肝癌细胞系(HepG2、HuH-7)的影响。其中，A为重组流感病毒对HepG2的影响；B为重组流感病毒对HuH-7的影响。
图3为本发明的重组流感病毒与成套试剂对裸鼠肝癌的治疗结果。
图4为本发明的重组流感病毒与成套试剂治疗裸鼠后裸鼠的的存活时间。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的非洲绿猴SV40转化的肾细胞(COS-1)为ATCC(American TypeCulture Collection)细胞库产品。下述实施例中的狗肾细胞(MDCK)为ATCC(AmericanType Culture Collection)细胞库产品。
下述实施例中的SPF鸡胚为北京实验动物研究中心产品。
下述实施例中的重组载体pHW-PB1、pHW-PB2、pHW-PA、pHW-NP、pHW-M、pHW-HA和pHW-NA(Hoffmann E，Mrauss S，Perez D，etal.Eight一Plasmid system for rapidgeneration of influenza virus vaccines.Vaccine，2002，20：3165-70)公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。重组载体pHW-PB1、pHW-PB2、pHW-PA、pHW-NP、pHW-M、pHW-HA和pHW-NA分别含有分别与流感病毒株A/PR/8/34(Hoffmann E，Mrauss S，Perez D，etal.Fight一Plasmid system for rapidgeneration of influenza virus vaccines.Vaccine，2002，20：3165-70)的内部病毒基因骨架PB1、PB2、PA、NP、M、HA、NA反向互补的DNA片段，pHW-PB1、pHW-PB2、pHW-PA、pHW-NP、pHW-HA和pHW-NA分别编码流感病毒株A/PR/8/34的PB1、PB2、PA、NP、HA和NA；pHW-M编码流感病毒株A/PR/8/34的M1和M2。
下述实施例中的HepG2、SMMC-7721、HuH-7、HuH-7.5、L-02均为中国人民解放军第三〇二医院产品。
下述实施例中的SPF级裸鼠为北京维通利华实验动物技术有限公司产品，货号为401。下述实施例中的阿霉素(Doxorubicin，DOX)为深圳万乐药业有限公司产品，产品目录号为国药准字44024359。
实施例1、重组流感病毒的拯救
1、重组载体的构建
将序列2所示的载体命名为pHW-HCKPP-HCKP，pHW-HCKPP-HCKP中，序列2的第4010-5179位所示的DNA分子(将该DNA分子命名为HCKPP)启动序列2的第104-1303位所示基因(将该基因命名为HCKP基因)的表达，HCKP基因编码序列1所示的蛋白质(将该蛋白质命名为HCKP)。
在载体pHW2000的BsmB I识别序列间插入由序列2的第4010-5200位所示DNA分子的3′端连接序列2的第54-1499位所示DNA分子的5′端得到的DNA分子，保持载体pHW2000的其他序列不变，得到重组载体，将该重组载体命名为p-HCKPP-HCKP。
2、重组流感病毒的拯救
将步骤1的pHW-HCKPP-HCKP与重组载体pHW-PB1、pHW-PB2、pHW-PA、pHW-NP、pHW-M、pHW-HA和pHW-NA各0.2μg混合后加入10μL转染试剂(Effectene，Qiagen公司产品)中室温作用10min，共转染到非洲绿猴SV40转化的肾细胞(COS-1)和狗肾细胞(MDCK)中，于37℃、5％CO2下培养60-72小时，得细胞悬液，将细胞悬液接种9-11日龄SPF鸡胚，37℃培养72h，收获鸡胚尿囊液并按照OIE标准对其进行血凝(HA)试验和血凝抑制(HI)试验。HA和HI试验结果均为阳性的样品含有拯救成功的重组流感病毒(将其命名为FLU-HCKPP-HCKP)，经过扩增、浓缩、纯化得到FLU-HCKPP-HCKP，-70℃冻存。
按照上述方法，将pHW-HCKPP-HCKP替换为p-HCKPP-HCKP，其他步骤均不变，进行重组流感病毒的拯救，结果并未得到重组流感病毒。
3、FLU-HCKPP-HCKP的鉴定
步骤2获得的重组流感病FLU-HCKPP-HCKP经负染后透射电镜观察病毒形态，结果表明FLU-HCKPP-HCKP符合流感病毒典型形态特征，有包膜，表面有刺突结构，病毒颗粒大小在80-120nm之间。
将步骤2的FLU-HCKPP-HCKP接种9-11日龄SPF鸡胚传代，取第二代鸡胚尿囊液提取病毒RNA，经过RT-PCR，扩增出序列正确的PB2、PB1、PA、NP、HA、NA和M基因片段以及HCKP基因。
将步骤2的FLU-HCKPP-HCKP经鸡胚大量培养，超滤浓缩、蔗糖梯度离心纯化后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶染色、脱色后，可检测到相应大小的NP、HA1、HA2、NEP蛋白，表明抗原的主要成分没有丢失。
实施例2、FLU-HCKPP-HCKP可以靶向肝癌细胞并抑制肝癌细胞的增殖
1、重组流感病毒FLU-HCKPP-HCKP可以特异抑制肝癌细胞的增殖
将实施例1步骤2的FLU-HCKPP-HCKP用PBS重悬，得到FLU-HCKPP-HCKP悬浮液。利用MTS试剂盒(Promega)检测重组流感病毒FLU-HCKPP-HCKP对肝癌细胞的杀伤作用，实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：
将肝癌细胞系HepG2、SMMC-7721、HuH-7、HuH-7.5以及人正常肝细胞L-02分别接种在含有培养基的96孔板中，每孔培养基的量相同，每孔一种细胞，每种细胞两个孔，每孔104个细胞，于37℃、5％CO2下培养24小时后，按照活细胞TCID50的感染系数MOI为10，分别对每种细胞接种FLU-HCKPP-HCKP悬浮液(每种细胞分别接种等体积的PBS作为对照)，于37℃、5％CO2下进行培养6天，利用MTS试剂盒(Promega)检测490nm下的吸光值，计算各孔细胞的存活率，结果如图1和表1所示。
表1、FLU-HCKPP-HCKP对不同细胞的抑制率
结果显示，FLU-HCKPP-HCKP对肝癌细胞系HepG2、SMMC-7721、HuH-7和HuH-7.5的抑制率分别为FLU-HCKPP-HCKP对人正常肝细胞L-02的抑制率的5.33、4.14、5.61、4.87倍。表明，FLU-HCKPP-HCKP可以特异抑制肝癌细胞的增殖。
2、重组流感病毒FLU-HCKPP-HCKP对肝癌细胞增殖的抑制作用具有剂量依赖性
实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：
将肝癌细胞系HepG2接种在含有培养基的96孔板中，每孔培养基的量相同，每孔104个细胞，于37℃、5％CO2下培养24小时后，按照活细胞TCID50的感染系数MOI为10、5、1和0.1分别向每孔中接种步骤1的FLU-HCKPP-HCKP悬浮液，每孔一种活细胞TCID50的感染系数MOI，于37℃、5％CO2下进行培养6天，每天利用MTS试剂盒(Promega)检测490nm下的吸光值，计算FLU-HCKPP-HCKP处理后各孔HepG2的存活率(图2中A)。
按照上述方法，将HepG2替换为HuH-7，保持其他步骤均不变，得到FLU-HCKPP-HCKP处理后各孔HepG2的存活率(图2中B)。
结果显示，重组流感病毒FLU-HCKPP-HCKP对肝癌细胞增殖的抑制作用随活细胞TCID50的感染系数MOI的增加而增强，表明重组流感病毒FLU-HCKPP-HCKP对肝癌细胞增殖的抑制作用具有剂量依赖性。
3、RT-PCR检测HCKP的表达
实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：
将肝癌细胞系HepG2和HuH-7以及人正常肝细胞L-02分别接种在含有培养基的96孔板中，每孔培养基的量相同，每孔一种细胞，每种细胞两个孔，每孔104个细胞，于37℃、5％CO2下培养24小时后，向每孔中接种步骤1的FLU-HCKPP-HCKP悬浮液，每孔1×109pfu重组流感病毒FLU-HCKPP-HCKP，于37℃、5％CO2下培养48小时，收集细胞提取细胞的RNA，反转录后以Primer-1：5’-CACTTATATT CACCTGCCTCAGGG-3’和Primer-2：5’-CCTAACATATCACCTGCCTC G-3’为引物进行PCR反应，以未接种FLU-HCKPP-HCKP的HepG2、HuH-7和L-02作为阴性对照。结果显示，接种FLU-HCKPP-HCKP的HepG2和HuH-7均扩增到了大小为1446bp的DNA片段，接种FLU-HCKPP-HCKP的L-02、未接种FLU-HCKPP-HCKP的HepG2、HuH-7和L-02均未扩增到目的DNA片段。表明，重组流感病毒FLU-HCKPP-HCKP在HepG2和HuH-7中得到了表达，在L-02中没有表达，说明重组流感病毒FLU-HCKPP-HCKP的HCKP在肝癌细胞中特异表达。
实施例3、重组流感病毒FLU-HCKPP-HCKP对肝癌的体内抑制作用
实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：
将实施例1的FLU-HCKPP-HCKP用PBS重悬，得到滴度为2×109pfu/100μl的FLU-HCKPP-HCKP悬浮液；将流感病毒株A/PR/8/34用PBS重悬，得到滴度为2×109pfu/100μl的流感病毒株A/PR/8/34悬浮液；将DOX溶于PBS中得到DOX溶液。
取4周龄SPF级裸鼠(体重18-20g)，每只于右侧腋下皮下接种5×106个人肝癌细胞HuH-7。每周两次测量肿瘤长径和短径，肿瘤体积＝(最长直径×最短直径2)/2。当肿瘤体积为100-150mm3时，对裸鼠进行随机分组，每组5只裸鼠，分别为FLU-HCKPP-HCKP组、DOX组、FLU-HCKPP-HCKP+DOX组、A/PR/8/34组、A/PR/8/34+DOX组和PBS组。
FLU-HCKPP-HCKP组进行以下治疗：直接向裸鼠的肿瘤内注射100μl的FLU-HCKPP-HCKP悬浮液，连续注射5天，将第一次注射记为治疗第0天。
DOX组进行以下治疗：按照每千克体重8mg DOX的标准，分别在治疗第0天和第3天向裸鼠尾静脉注射DOX溶液。
FLU-HCKPP-HCKP+DOX组进行以下治疗：分别在治疗第0天、第1天、第2天、第3天和第4天向裸鼠的肿瘤内注射100μl的FLU-HCKPP-HCKP悬浮液，并按照每千克体重8mg DOX的标准，分别在治疗第0天和第3天向裸鼠尾静脉注射DOX溶液。
A/PR/8/34组进行以下治疗：分别在治疗第0天、第1天、第2天、第3天和第4天向裸鼠的肿瘤内注射100μl的A/PR/8/34悬浮液。
A/PR/8/34+DOX组进行以下治疗：分别在治疗第0天、第1天、第2天、第3天和第4天向裸鼠的肿瘤内注射100μl的A/PR/8/34悬浮液，并按照每千克体重8mg DOX的标准，分别在治疗第0天和第3天向裸鼠尾静脉注射DOX溶液。
PBS组进行以下治疗：分别在治疗第0天、第1天、第2天、第3天和第4天向裸鼠的肿瘤内注射100μl的PBS。
分别在治疗第0天、第4天、第8天、第12天、第16天、第20天、第24天、第28天、第32天、第36天和第40天测量肿瘤体积，结果如图3和表2所示；在治疗第0-84天内观察小鼠的死亡情况，统计各组裸鼠在不同存活率时距第一次治疗的时间，结果如图4所示。
表2、不同组别肿瘤体积随治疗时间的变化(mm3)
结果显示，在治疗第40天，FLU-HCKPP-HCKP组的肿瘤体积分别为A/PR/8/34组和PBS组的0.43倍和0.41倍，表明，FLU-HCKPP-HCKP可以抑制肝癌的生长，FLU-HCKPP-HCKP对肝癌具有治疗作用。在治疗第40天，FLU-HCKPP-HCKP+DOX组的肿瘤体积分别为DOX组、FLU-HCKPP-HCKP组、A/PR/8/34+DOX组和PBS组的0.73、0.65、0.71、0.26倍，表明，成套试剂FLU-HCKPP-HCKP+DOX可以进一步抑制肝癌的生长，FLU-HCKPP-HCKP+DOX对肝癌具有很好的治疗作用。
结果显示，FLU-HCKPP-HCKP可以延长荷肝癌裸鼠的生存时间：在FLU-HCKPP-HCKP组裸鼠生存率为40％时距第1次治疗的时间分别为A/PR/8/34组和PBS组裸鼠存活率为40％时距第1次治疗的时间的1.30倍和1.37倍。成套试剂FLU-HCKPP-HCKP+DOX可以进一步延长荷肝癌裸鼠的生存时间：在FLU-HCKPP-HCKP+DOX组裸鼠生存率为40％时距第1次治疗的时间分别为DOX组、FLU-HCKPP-HCKP组、A/PR/8/34+DOX组和PBS组裸鼠存活率为40％时距第1次治疗的时间的1.27倍、1.46倍、1.46倍、2倍。
Claims (4)
1.治疗肝癌的成套试剂，由阿霉素和重组流感病毒组成；所述重组流感病毒表达蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如序列表中序列1所示；所述重组流感病毒的基因组为单股负链、分节段的RNA，所述重组流感病毒的负链RNA转录出与所述负链RNA互补的成套正链RNA，所述成套正链RNA包括PB1-RNA、PB2-RNA、PA-RNA、NP-RNA、M-RNA、HA-RNA、NA-RNA和HCKP-RNA；
所述PB1-RNA为编码流感病毒毒株中PB1的RNA；
所述PB2-RNA为编码所述流感病毒毒株中PB2的RNA；
所述PA-RNA为编码所述流感病毒毒株中PA的RNA；
所述NP-RNA为编码所述流感病毒毒株中NP的RNA；
所述M-RNA为编码所述流感病毒毒株中M1和M2的RNA；
所述HA-RNA为编码所述流感病毒毒株中HA的RNA；
所述NA-RNA为编码所述流感病毒毒株中NA的RNA；
所述HCKP-RNA为编码所述蛋白质的RNA。
2.根据权利要求1所述的成套试剂，其特征在于：所述编码所述蛋白质的RNA的序列为将序列表中序列2的第104-1303位中的所有T均替换为U，其它核苷酸均不变得到的序列；所述流感病毒毒株为流感病毒毒株A/PR/8/34。
3.治疗肝癌药物，其活性成分为权利要求1或2所述的成套试剂。
4.权利要求1或2所述的成套试剂在制备治疗肝癌药物中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510649463.5A CN106562999B (zh) | 2015-10-09 | 2015-10-09 | 治疗肿瘤的成套试剂与重组流感病毒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510649463.5A CN106562999B (zh) | 2015-10-09 | 2015-10-09 | 治疗肿瘤的成套试剂与重组流感病毒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106562999A CN106562999A (zh) | 2017-04-19 |
| CN106562999B true CN106562999B (zh) | 2019-11-01 |
Family
ID=58507766
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510649463.5A Expired - Fee Related CN106562999B (zh) | 2015-10-09 | 2015-10-09 | 治疗肿瘤的成套试剂与重组流感病毒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106562999B (zh) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1810961A (zh) * | 2006-02-22 | 2006-08-02 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 | 一种重组流感病毒及其制备方法与应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015063085A1 (en) * | 2013-10-28 | 2015-05-07 | Thomas Muster | Novel influenza virus vector for virotherapy |
-
2015
- 2015-10-09 CN CN201510649463.5A patent/CN106562999B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1810961A (zh) * | 2006-02-22 | 2006-08-02 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 | 一种重组流感病毒及其制备方法与应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| "Generation of Replication-Competent Recombinant Influenza A Viruses";Feng Li et al.,;《JOURNAL OF VIROLOGY》;20101231;第84卷(第22期);第12075-12081页 * |
| "甲型H1N1 流感重组病毒模型的建立及应用";吴彦霖;《药物分析杂志》;20161231;第36卷(第7期);第1162-1168页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN106562999A (zh) | 2017-04-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2011103897A (ja) | 変異体水疱性口内炎ウイルスおよびそれらの使用 | |
| CN110996980B (zh) | 一种用于治疗肿瘤的病毒 | |
| CN105734023A (zh) | 一种重组新城疫病毒在制备抗肝癌药物中的应用 | |
| AU2002341356B2 (en) | Compositions and methods for treatment of cancer | |
| EP3022297B1 (en) | Genetically stable oncolytic rna virus, method of manufacturing and use thereof | |
| US10980873B2 (en) | Use of a genetically modified infectious measles virus with enhanced pro-apoptotic properties (MV-deltaC virus) in cancer therapy | |
| CN110520526A (zh) | 基因改造柯萨奇病毒和药物组合物 | |
| EP3783100A1 (en) | Coxsackie virus b for treating tumors | |
| CN105176937A (zh) | 一种重组新城疫病毒及其在制备抗癌药物中的应用 | |
| CN105821009B (zh) | 靶向肝癌溶瘤流感病毒的构建及其应用 | |
| CN106562999B (zh) | 治疗肿瘤的成套试剂与重组流感病毒 | |
| WO2016101326A1 (zh) | 溶瘤异源重组新城疫病毒及其制备方法与应用 | |
| CN106591248B (zh) | 重组溶瘤流感病毒制备方法和应用 | |
| CN109419818B (zh) | 一种用于治疗肿瘤的埃可病毒 | |
| US20240318147A1 (en) | Recombinant oncolytic virus, and construction method therefor and use thereof | |
| CN115068632A (zh) | Ago2在制备治疗心衰的药物方面的用途及其蛋白、基因、转化体、药物与制备方法 | |
| WO2021197506A1 (zh) | 重组新城疫病毒及制备方法、重组质粒、及其应用 | |
| Yuan et al. | A 2B Protein‐Derived Peptide Effectively Inhibits Coxsackievirus B3 Infection | |
| CN113583977A (zh) | 可受微小rna调控的分离的重组溶瘤痘病毒及其应用 | |
| EP4361257A1 (en) | Oncolytic virus and use thereof | |
| CN111094324A (zh) | 一种溶瘤病毒、合成dna序列及其应用 | |
| CA3070628C (en) | Enterovirus d68 (ev-d68) for treatment of tumor | |
| CN116445423A (zh) | 一种重组流感病毒基因治疗药物及其应用 | |
| HK40056184A (zh) | 可受微小rna调控的分离的重组溶瘤痘病毒及其应用 | |
| HK40105653A (zh) | 一种溶瘤病毒及其用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20191101 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |