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CN106568969B - 一种丝氨酸129位磷酸化alpha‑突触核蛋白聚集体的ELISA检测方法 - Google Patents

一种丝氨酸129位磷酸化alpha‑突触核蛋白聚集体的ELISA检测方法 Download PDF

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CN106568969B CN201610913085.1A CN201610913085A CN106568969B CN 106568969 B CN106568969 B CN 106568969B CN 201610913085 A CN201610913085 A CN 201610913085A CN 106568969 B CN106568969 B CN 106568969B
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Abstract

本发明涉及一种丝氨酸129位磷酸化alpha‑突触核蛋白聚集体的ELISA检测方法，所述方法包括使用单克隆抗体C140S，和多克隆抗体‑SN16进行夹心法ELISA，以测定人血液样本中的丝氨酸129位磷酸化alpha‑突触核蛋白聚集体的含量。

Description

一种丝氨酸129位磷酸化alpha-突触核蛋白聚集体的ELISA检 测方法
技术领域
本发明涉及聚集化的丝氨酸129位磷酸化alpha-突触核蛋白(α-syn)检测方法的建立。
背景技术
帕金森病(Parkinson’s Disease,PD)作为最常见的神经退行性疾病之一，分别影响65岁和85岁年龄中1％和5％的人口，alpha-突触核蛋白(α-syn)作为2014年新修订的对PD定义的核心蛋白，已引起人们高度重视α-syn在PD早期诊断、病程和药物疗效检测中的实际应用。因此，现在急需一种或多种灵敏且特异的检测方法，检测各种形式的α-syn随着PD的发生发展在人体液中的变化趋势，这就要求这种检测方法要客观、可行，并易于在临床上得以推广。路易体(Lewy’s Body,LB)作为PD主要的病理标志物，其主要成分由α-syn组成，而在LB中有90％的α-syn在129位发生了磷酸化(pS129-α-syn)。为了研究PD病程的进展，人们利用了多种方法监测α-syn在体内的变化趋势，纵观近几年的检测α-syn的文献，报道PD患者体液中的α-syn含量不尽相同，但是磷酸化α-syn和α-syn聚集体的含量增加是基本一致的报道。在上述有意义的研究报道中，检测的磷酸化α-syn是单体形式和α-syn的聚集体形式，而没有明确聚集体中α-syn是磷酸化形式还是非磷酸化形式，更没有检测聚集状态的磷酸化α-syn，因为目前尚没有检测聚集化pS129-α-syn的方法。而聚集的磷酸化α-syn在PD发生发展过程中发挥更关键的作用。而且有文献报道，活性醛类——包括ONE(4-oxo-2-nonenal),HNE(4-hydroxynonenal)——在PD患者的脑脊液中的含量随疾病进展而不断升高，它们作为脂质过氧化的产物，可以与α-syn的第50位组氨酸发生加合(如下)。而促使α-syn更易发生聚集。考虑到建立标准曲线所需使用的标准抗原的单一性，本专利使用HNE的氧化副产物(Oxidative Counterpart)ONE促进人源α-syn和pS129-α-syn发生聚集，建立基于夹心法ELISA的检测方法，以便将来观察临床脑脊液、血浆、大脑匀浆中聚集化的pS129-α-syn随病程的变化趋势。
HNE和蛋白质的组氨酸通过1,4-Michael加合对蛋白进行翻译后修饰
因此，我们发明的聚集化丝氨酸129位磷酸化α-突触核蛋白的检测方法具有重要意义。为临床PD的血液及脑脊液样品及基础研究的PD模型的聚集化丝氨酸129位磷酸化α-突触核蛋白的检测提供了检测手段，也有可能通过此方法建立PD的诊断试剂盒。
ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。加入酶标记的抗原或抗体，通过反应也结合在固相载体上。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，根据呈色的深浅进行定性或定量分析。酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法,操作步骤如下:
1)将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体，洗涤除去未结合的抗体及杂质，
2)加受检标本,保温反应，标本中的抗原与固相抗体结合,形成固相抗原抗体复合物，洗涤除去其他未结合物质，
3)加酶标抗体,保温反应，固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合，彻底洗涤未结合的酶标抗体，此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关，
4)加底物显色，固相上的酶催化底物成为有色产物，通过比色,测知标本中抗原的量，这种双位点夹心法具有很高的特异性。
在临床检验中,双抗体夹心法法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原,例如HBsAg,HBeAg,AFP,hCG等.只要获得针对受检抗原的异性抗体,就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清,包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体,一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗,分别用于包被固相载体和制备酶结合物。
本专利提供了可以用于ELISA实验的特异性捕获α-syn的N段蛋白(氨基酸1-60)的兔多克隆抗体-SN16和特异性检测pS129-α-syn的小鼠单克隆抗体C140S，并探索出抗体用于检测的最适浓度，分别为1ug/ml的SN16捕获抗原，0.02ug/ml的C140S检测目的抗原。本专利首次明确提出用于检测聚集化pS129-α-syn的双抗体夹心ELISA，验证检测抗体C140S的反应性标准，即纯化为干粉状态的C140S抗体在配制为4mg/ml浓度的蛋白溶液后，对于1000ng/ml的阳性抗原OP(oligomerized 129-serine phosphorylated human alpha-synuclein,聚集化的129位丝氨酸磷酸化的人源alpha型突触核蛋白)和阴性抗原OW(Oligomerized wild-type human alpha-synuclein,聚集化的野生型人源alpha型突触核蛋白)，使用0.125ug/ml的C140S，和1:10000稀释的m-HRP做间接法ELISA时，在背景信号和阴性对照组490nm波长吸光光度值信号均小于0.2的情况下，阳性组的490nm波长吸光光度值要达到2.0-2.5之间，该批次纯化的C140S抗体方可用于双抗体夹心ELISA。
发明内容
本发明提供一种丝氨酸129位磷酸化alpha-突触核蛋白聚集体的夹心ELISA检测方法，所述方法包括使用单克隆抗体C140S，和多克隆抗体SN16进行夹心法ELISA，以测定人血液样本中的丝氨酸129位磷酸化alpha-突触核蛋白聚集体的含量。
本发明还提供一种细胞株，保藏编号为CGMCC12993。
本发明还提供一种单克隆抗体C140S，由上述细胞株制备得到。
本发明还提供一种用于ELISA方法的捕获alpha-突触核蛋白抗原的兔多克隆抗体SN16。
本发明还提供一种抗原，为通过hPLK3激酶催化的丝氨酸129位磷酸化的α-syn标准蛋白。
本发明还提供一种丝氨酸129位磷酸化alpha-突触核蛋白聚集体的夹心ELISA 检测方法的建立方法，包括如下步骤：
1)制备人源α-syn；
2)将人源α-syn129位的丝氨酸磷酸化；
3)使用ONE将步骤1)中的人源α-syn和步骤2)中129位磷酸化的人源α-syn(pS129-α-syn)聚集化；
4)制备可识别人源pS129-α-syn的单克隆抗体C140S；
5)制备特异性捕获α-syn的兔多克隆抗体SN16；
6)使用单克隆抗体C140S和兔多克隆抗体SN16做夹心法ELISA；
优选的，所述的建立方法，包括如下步骤：
1)制备人源α-syn，并使用谷胱甘肽琼脂糖珠-4B纯化人源α-syn；
2)使用hPLK3催化步骤1)中得到的人源α-syn使其在129位丝氨酸发生磷酸化；
3)使用ONE使步骤1)中的人源α-syn和步骤2)中129位磷酸化的人源α-syn聚集化；
4)用斑点印迹实验筛选可识别人源pS129-α-syn的免疫Balb/c小鼠的腹水C140S,获得单克隆抗体C140S，使用蛋白G琼脂糖珠FF亲和层析柱纯化单克隆抗体C140S；
5)制备特异性捕获α-syn的兔多克隆抗体SN16；
6)确定检测抗体的浓度；
7)使用单克隆抗体C140S和特异性捕获α-syn的兔多克隆抗体SN16做夹心法ELISA。
本发明还提供一种试剂盒，其中包括以下试剂：小鼠源单克隆抗体C140S，和兔源多克隆抗体SN16。
本发明的的试剂盒，还包括以下试剂：磷酸化试剂，和试剂ONE。
本发明的试剂盒，还包括以下试剂：ELISA酶标板，PBS，NaHCO3缓冲液，封闭液，PBST等，所述试剂盒，各试剂分别包装，每个包装中装入试剂的量以够一个样本使用量为基本量，可以扩大到10个，100个，1000个样本的使用量。
本发明所述的ELISA检测方法，需要用到标准曲线来确定有关物质的含量，所述标准曲线的制作方法如下：
使用OP建立标准曲线，在各个浓度点使用OW作为阴性对照，显色方法为AP(碱性磷酸酶)催化pNPP(p-nitrophenyl phosphate，p-硝基苯基磷酸盐，SurModics,货号PNPS-1000-01)延迟显色，即从30分钟为第一次扫描，每隔10分钟扫描一次选取反应性和灵敏度范围满意的时间点用作最终的标准曲线的建立。将建立标准曲线使用的各浓度OP和OW的A405(405nm处的吸光度值)输入到Excel表格中，选中用于建立标准曲线的数据，单击插入菜单，选择散点图，在生成的散点图中，右键单击任一一个数据点，在弹出的菜单中选择“添加趋势线”，在窗口中选择趋势线选项为“线性”，并勾选“显示公式”和“显示R平方值”。
采用本发明的ELISA检测方法，可以得到吸光度数据，将得到的吸光度数据用上述标准曲线比对，可以计算出样本中的OP含量，本发明检测方法的具体操作见本发明实施例。
以下为本发明方法中的名称术语的解释：
样本为建立标准曲线使用的纯蛋白样本。
人源α-syn人源α型突触核蛋白，广泛分布于中枢神经系统神经末梢，现认为此蛋白与维持神经元可塑性有关。
谷胱甘肽琼脂糖珠-4B为琼脂糖珠上包被有谷胱甘肽，在纯化大肠杆菌表达GST-α-syn融合蛋白时，利用融合蛋白N端上的GST(谷胱甘肽转移酶)标签，与其结合，达到纯化的目的，之后再使用人凝血酶将此标签切除，即得到纯化的人源α-syn纯蛋白。
hPLK3为人源Polo样激酶家族(Polo-Like Kinase Family)中的一个亚型，在体外实验中显示，hPLK3可以将全部的人源α-syn催化磷酸化，在本专利中的质谱实验部分也确认了磷酸化的位点仅发生在第129位丝氨酸。
ONE：4-oxo-2-nonenal,4-氧代壬烯醛人体内脂质过氧化(lipid peroxide)产物之一，还包括HNE(4-hydro-2-nonenal,4-羟代壬烯醛)，是HNE的氧化副产物(oxidativecounterpart)。
人源α-syn聚集体，英文缩写OW(Oligomerized Wild-Type hα-syn)由ONE对人源α-syn第50位组氨酸翻译后修饰，形成ONE-蛋白加合物(ONE-protein adduct)，当人源α-syn收到这种翻译后修饰后，会更容易形成聚集体，且文献中HPLC结果显示，其分子量集中在2000kD。
129位磷酸化的人源α-syn(pS129-α-syn)聚集体，英文缩写OP(Oligomerized129-serine-phosphorylated hα-syn)由ONE对129位磷酸化的人源α-syn第50位组氨酸翻译后修饰，形成ONE-蛋白加合物(ONE-protein adduct)，促进形成聚集体。
斑点印迹实验中使用硝酸纤维素膜(NC膜)，在其上点1μl蛋白样本，并使用抗体与其反应，用于检测抗体反应的特异性和灵敏性。
免疫Balb/c小鼠Balb/c小鼠是用于生产抗体的最常用的实验动物品系，将目的肽段免疫这种小鼠，为后期提取脾脏做融合细胞做准备。
腹水C140S在初步使用间接法ELISA筛选出抗体的其中一个克隆号，根据所处孔板的位置命名为C140S，由于是腹水，还没有纯化，因此命名为腹水C140S和纯化后的抗体相区分。
蛋白G琼脂糖珠FF在从腹水C140S和其他克隆号中纯化抗体使用的琼脂糖珠，其上包被有G蛋白，可以结合抗体，从而通过结合、洗柱等流程除去腹水中非抗体的成分，得到纯化抗体。
为建立本发明所述的ELISA检测方法，特制备了一种针对129位磷酸化的人源α-syn的小鼠源单克隆抗体C140S，该单克隆抗体的制备方法如下：
使用P1(M18631-1hz-1-1,Ac-CEAYEMP(pS)EGG-NH2,人源129位丝氨酸磷酸化α-syn的123-131肽段)肽段免疫balb-c小鼠，取脾制备融合骨髓瘤细胞系，间接法ELISA筛选出克隆号为C140S的细胞系，使用该细胞系注射入4只balb-c/nu小鼠腹腔，间接法ELISA验证腹水反应特异性后纯化抗体，再次使用间接法ELISA验证纯化的抗体的反应性后(即0.125ug/ml的抗体识别1000ng/ml的阳性组490nm波长吸光光度值高于阴性组至少30倍，且背景和阴性组读数小于0.2)，方可用作本方法中的检测抗体，最终浓度为4mg/ml。
(该细胞株已经保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC12993，保藏日期2016年9月14日，分类命名：杂交瘤细胞株，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号)。
为建立本发明所述的ELISA检测方法，特制备一种针对人源α-syn的N端(1-60位氨基酸)的兔源多克隆抗体SN16；该多克隆抗体的制备方法如下：
使用α-syn的N端(1-60位氨基酸)肽段免疫2只新西兰白兔，颈动脉放血收集血清后纯化抗体，最终浓度为192ug/ml。
由于本发明效果的优越性，本发明人根据上述方法制备了一种检测试剂盒，所述试剂盒包括以下试剂：
小鼠源单克隆抗体C140S
兔源多克隆抗体SN16
本发明所述试剂盒，必要时还可包括以下试剂：
磷酸化试剂(包括hPLK3激酶和催化磷酸化反应的缓冲液)；
试剂ONE
本发明所述试剂盒，根据需要，所述试剂盒还可包括任何一种适合本发明方法的辅助试剂：如，ELISA酶标板，PBS(磷酸盐缓冲液)，NaHCO3缓冲液，封闭液，PBST(PBS中加入0.2％的Tween-20)等。
本发明的上述试剂盒的使用是以血浆中重组人α-突触核蛋白聚合体作为标准蛋白，以该聚集体浓度与吸光度值的关系曲线作为标准曲线，通过测定样本中的血浆-重组人α-突触核蛋白聚合体的浓度以及形成率达到诊断帕金森病的目的。
本发明的试剂盒，各试剂分别包装，优选使用包装管，每个包装管中装入试剂的量以够一个样本使用量为基本量，可以扩大到10个，100个，1000个样本的使用量。
本发明的试剂盒的使用是根据上述检测血浆中重组人α-突触核蛋白聚集体的方法进行的，使用时将试剂盒中的试剂根据需要配制成相应的浓度，按照所述方法测定即可。
为研究本发明，还进行了重复性试验，精密度试验，检测方法的筛选等试验以确保本发明的应用性。
质谱分析PLK3催化人源α-syn磷酸化位点的特异性
2010年Martial K.Mbefo等人使用同位素标记蛋白质观察PLK3磷酸化α-syn时发现，在30℃反应时间达到2.5小时，所有的α-syn均发生了磷酸化，本专利使用这一方法将制备的人源Pα-syn做质谱分析发现，PLK3使α-syn仅在129位丝氨酸发生了磷酸化(图3)，而S87位和Y125位均没有发生磷酸化(图4)，证实PLK3对于α-syn的磷酸化位点具有特异性。
本发明的灵敏度实验：
制备C140S抗体使用的免疫肽段：P1(M18631-1hz-1-1,Ac-CEAYEMP(pS)EGG-NH2，人源129位丝氨酸磷酸化α-syn的123-131肽段)
对照包括：P2(M18631-1hz-2-1,Ac-EMP(pS)EEGYQDC-NH2，人源129位丝氨酸磷酸化α-syn的126-135肽段)，W(Z18631-1hz-3-1,Ac-CEAYEMPSEEGYQD-NH2，人源α-syn的123-135肽段)，ASWT(hα-syn-FL，FL代表全长)，SE(hα-syn/S129E，为模拟磷酸化突变体)
实验结果如下表：
抗体名称 体积(ml) 理论灵敏度(ng) 实际稀释比例 使用体积(μl)
C140S 0.1 0.01 1:500 10
显示C140S抗体可以特异性识别100ng的P1肽段(图1)。
间接法ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，酶联免疫吸附测定)筛选抗体识别磷酸化位点特异性
α-syn在S87,Y125,S129位点是三个磷酸化翻译后修饰位点，C140S抗体仅可以识别S129位磷酸化的肽段，对于S87、Y125磷酸化的肽段和野生型肽段均不识别(图2)。
使用的抗原列表：
编码 全称 序列 浓度 检测抗体
P① P1 CEAYEMP(pS)EEG 4mg/ml C140S&C54S
P② P2 EMP(pS)EEGYQDC 4mg/ml C48S
S 22667-1-1 KTVEGAGS(p)IAAATG 8mg/ml
Y 22667-1-2 VDPDNEAY(p)EMPSEE 8mg/ml
W Z18631-1hz-3-1 CEAYEMPSEEGYQD 4mg/ml
本发明的优点在于：
本发明使用捕获抗体SN16和检测抗体C140S，可以特异性检测出聚集体形式的129位丝氨酸磷酸化的人源α-syn，而不识别其单体形式，亦不识别野生型α-syn单体和聚集体；识别的信号显著高于非磷酸化的聚集体、磷酸化单体、野生syn单体。
本发明可以自行调整pNPP的显色时间，以控制背景，并得到检测所需的灵敏度范围，对于聚集体形式的129位丝氨酸磷酸化的人源α-syn，最大灵敏度可达10ng/ml。
附图说明
图1是Dot blot结果提示1:500稀释的C140S腹水对于P1肽段的灵敏度为100ng，对于P2肽段、野生型肽段W、野生型α-syn蛋白全长(ASWT)、α-syn-S129E突变体(SE)则没有反应性。
图2表示C140S，C48S，C54S为Dot-Blot筛选出的功能相同的三株抗体，间接法ELISA提示三株抗体对于免疫肽段P均有反应性，对于87位磷酸化肽段(S)、125位磷酸化肽段(Y)、野生型肽段(W)则没有反应性，间接法ELISA结果中使用的3D5抗体为宣武医院于顺教授制备的小鼠单克隆抗hα-syn115-121抗体，WAKO为日本制造的小鼠单克隆抗129位磷酸化hα-syn抗体(pSyn#64)，CWRA为本室制造的兔源多克隆抗hα-syn-FL抗体，结果提示后三者对于四种肽段均无反应性。
图3显示Glu-C切割的肽段之一α-syn124-131质谱显示129位丝氨酸发生了磷酸化，而125位酪氨酸没有发生磷酸化。
图4显示Trypsin切割的肽段之一α-syn84-104质谱显示87位丝氨酸未发生磷酸化。
图5是在间接法实验中，C140S腹水对于129位磷酸化α-syn全长蛋白的反应性和WAKO抗体没有显著性差异，且反应性显著高于C48S和C54S腹水，3D5抗体对于野生型α-syn全长(W)、S129E(模拟磷酸化α-syn蛋白突变体，E)、S129A(阻断磷酸化α-syn蛋白突变体，A)均有反应性，且无显著性差异，3A5抗体为本室前期自制小鼠源单克隆抗磷酸化α-syn抗体，在ELISA中可特异性识别129位模拟磷酸化α-syn蛋白突变体(E)。
图6在同一张PVDF膜(polyvinylidene difluoride，聚偏二氟乙烯)先后孵育两种抗体观察，左侧C140S抗体仅识别17kD的129位磷酸化hα-syn(P)，洗膜后孵育BD抗体可见129位磷酸化hα-syn(P)和野生型hα-syn(W)上样量一致。
图7为间接法ELISA筛选出符合应用标准的纯化抗体批次。
图8使用Santa的多克隆抗磷酸化α-syn抗体(Santa Cruz,sc-135638)为捕获抗体，生物素化3D5单克隆抗人α-syn115-121为检测抗体，发现不识别磷酸化(P)和野生型α-syn单体(W)，以及α-syn聚集体(OW)，仅识别聚集化Pα-syn (OP)。
图9为本室自制SN16为多克隆抗人α-syn-N端抗体做捕获抗体，C140S抗体做检测抗体，发现不识别磷酸化(P)和野生型α-syn单体(W)，以及α-syn聚集体(OW)，仅识别聚集化Pα-syn(OP)。
图10为使用SN16/C140S抗体建立OP的标准曲线，抗原浓度包括64000，32000，16000，8000，4000，2000，1000，500pg/ml的OP和OW的A405读数，AP-pNPP显色时间60分钟。
图11为间接法ELISA验证SN16抗体的对于α-syn的N端可以特异性识别。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明。
实施例1
α-syn的表达和纯化：
实验材料：
质粒：pGEX-4T-1-hαsyn-WT(4969bp+423bp)
AMP(Ampicillin,氨苄霉素)抗性，表达GST-hαsyn-WT融合蛋白，分子量26kD+16kD；
LB(lysogeny broth or Luria-Bertani，溶菌肉汤)固体及液体培养基，AMP+；100mM IPTG(Isopropylβ-D-1-Thiogalactopyranoside，异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)、0.1mM PBS(phosphate buffer saline，磷酸缓冲盐溶液)、Thrombin(人源凝血酶1kuSigma，货号T1063)、Glutathione Sepharose-4B(谷胱甘肽琼脂糖凝胶10ml GE，货号17-0756-01)、20％乙醇溶液、10mM还原型谷胱甘肽、50mM Tris-HCl pH8.0(Tris,Aminomethylidinetrimethanol,三甲醇氨基甲烷)、6mol盐酸胍(GuanidineHydrochloride)溶液；
超声破碎仪、离心机、小摇管、1L三角烧瓶、500mL大烧杯、50mL离心管、50mL平底烧瓶、5mL滴管、Polypropylene Column(聚丙烯柱QIAGEN，货号34924)。
实验步骤：
实验一：目的蛋白的表达
将质粒转化至BL21(DE3)(A.Roca(University of Wisconsin)构建的BL21recA衍生菌，能稳定某些带有重复序列的目的基因)细胞中，37℃200rpm孵育50min 激活菌种后，取10μl菌液至氨苄抗性LB固体培养基上，在37℃环境中孵育12-16小时；
挑取1个单克隆菌落，将其感染盛有6ml AMP+LB液体培养基的小摇管中，37℃220rpm孵育；
12小时后，使小摇管脱离原孵育环境，取2.5ml菌液，(此处可以考虑保菌)加入到盛有250ml氨苄抗性LB液体培养基的1L三角烧瓶中，37℃260rpm孵育3小时；
取终浓度为0.1mM的IPTG诱导细菌表达蛋白4小时；
诱导4小时完成后，及时让烧瓶脱离孵育环境，进行细菌破碎实验。
实验二：细菌破碎实验
可以在实验一进行时预冷离心机转子至4℃；
从制冰机中盛取一盒碎冰，压实备用；
取50mL专业离心管，每次倒入40mL菌液，10000g持续4分钟集菌；
集菌完成后，弃去上清液，将离心管放入冰中，使用5ml滴管加入10ml 0.1M PBS充分重悬；
重悬完成后，将菌液倒入或用滴管移入50ml离心管中，将菌液置于冰水浴中(可适当加水，以保证低温)，按照每次2秒超声、2秒间歇、共计150次的条件实施超声破碎，超声探头浸入液面1/3处，注意不要打出泡沫；
等量菌液倒回两个专业离心管，使用15000g离心力离心45min，取上清液，在冰上进行下一步实验，或者在-20℃中保存蛋白上清液。
实验三：亲和色谱法纯化目的蛋白
取1ml Glutathione Sepharose-4B(GE，货号17-0756-01)直接置于Polypropylene Column(QIAGEN，货号34924)中，总共用10ml 0.1mMPBS平衡三次。注意把液面控制在柱子的中间部位，如果过高，会因为液体对柱床的压强过大，导致支持体贴到柱床过紧，不利于液体顺利下滴；
用上一步实验中制备的上清液将柱中的Sepharose-4B重悬，吸净、放入一个50ml离心管后，将柱子置于室温备用；
将离心管封好，室温下垂直振摇1h，不要加热，速度不要太快；
把小烧杯中的混合液倒入一干净的50ml非专业离心管中，使用4℃离心机3000rpm离心10min；
取出离心管，弃去上清，用1ml 0.1M PBS重悬沉于离心管底部的Sepharose-4B，并移回柱子，用3个柱床体积的PBS洗柱，最后留下的PBS体积与Sepharose-4B体积比保持为1:3；
20U(40μl)凝血酶(Sigma，货号T1063)加入到1ml 0.1M PBS中稀释，吸出1ml稀释液到柱子中重悬，并用封口膜封好柱子；
在室温下摇床上孵育16h，摇速不要太快；
打开Column流出口开关，回收流出液后，再加入0.1M PBS洗脱四次，每次1ml；收集洗脱液。
实验四：Glutathione Sepharose-4B及空柱回收
现配好2-3个柱子体积的溶液，其中含有10mM还原性谷胱甘肽和50mM pH8.0Tris-HCl,用此溶液洗过柱子后，向柱内加入20％乙醇溶液；
重悬充分后，将柱内溶液移至一单独有旋盖容器内，表明为回收的GlutathioneSepharose-4B；
柱内溶液取净后，向其加入1mL 6mol的盐酸胍溶液把柱子中全部残余蛋白清除干净，用双蒸水将柱子洗干净后，即回收空柱完毕。
实施例2
α-syn的129位磷酸化：
第一部分：所需试剂
HEPES：N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2'-ethanesulfonic Acid，4-羟乙基哌嗪乙磺酸；N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸，pH7.4
MgCl2：Magnesium Chloride，氯化镁
DTT：dithiothreitol，二硫苏糖醇，1M
HCl：Hydrochloride，盐酸
hPLK3：homo sapiens Polo-Like Kinase 3,人源Polo样激酶3，10ug(0.42mg/ml)，母管内有23.8μl的液体，-80℃保存
hα-syn：homo sapiens alpha synuclein,人源α型突触核蛋白，4mg/ml
ATP：adenosine triphosphate，腺苷三磷酸，100mM
EDTA Na2：Ethylenediaminetetraacetic Acid-2Na，乙二胺四乙酸二钠盐
Tris：Aminomethylidinetrimethanol,三甲醇氨基甲烷，50mM pH7.5
NaCl：Sodium Chloride,氯化钠150mM
Triton X-100：Polyethylene Glycol Octylphenol Ether，聚乙二醇辛基苯基醚
Glycerol：甘油
第二部分：缓冲液
储存缓冲液(Storage buffer)：
1.1目的：用于储存hPLK3激酶，以及反应体系过小时，使用此缓冲液稀释
1.2组成成分及配制方法：
以总体积100ml计算
配制100ml的50mM Tris-HCl pH7.5溶液：
取0.606g的Tris碱加入到90ml高压过的超纯水中，溶解后使用HCl调整pH至7.5，定容到100ml，配好后，此溶液室温保存即可；
A.取50ml Tris-HCl溶液，向其中加入0.88g NaCl，混匀；
B.加入200μl的1M DTT；
C.称取18mg EDTA Na2加入混匀；
D.加入20μl的Triton X-100；
E.最后加入50ml甘油混匀；
1.3储存方法：-20℃保存
2.反应缓冲液(Working buffer)：
2.1目的：为α-syn磷酸化反应提供激酶、ATP及反应环境
2.2组成成分及配制方法：
以总体积100ml计算：
取0.477g HEPES加入到90ml高压过的超纯水中，HCl调pH至7.4；
加入95.2mg MgCl2；
加入200μl的1M DTT；
超纯水定容到100ml；
2.3储存方法：-20℃保存
3.底物溶液：
3.1目的：为α-syn磷酸化反应提供反应环境
3.2组成成分及配制方法：
A.取少量0.1M PBS溶解的α-syn至5ml的5MWCO超滤管中(MWCO为MolecularWeight Cut Off，表示截留分子量)；
B.在超滤管上半部分容器中，用反应缓冲液定容至5ml；
C.使用低温离心机10000g离心10min；
D.吸取容器中残留液体，BCA测定浓度为1269ug/ml
4.终止反应：
置于-80℃
第三部分：磷酸化反应
设定反应体积为50μl；
将11.3μl含有α-syn(144ug)的工作缓冲液加入到37μl工作缓冲液中，加入hPLK31.2μl，加入ATP 0.5μl，30℃反应3小时，放入-80℃终止反应α-syn的聚集化和129位磷酸化α-syn(Pα-syn)的聚集化：
Thomas等人在2011年使用ONE(4-oxo-2-nonenal，4-氧代壬烯醛)制备聚集化α-syn，HPLC(Chromatography High Pressure Liquid，高压液相)结果显示α-syn收到ONE的翻译后修饰后会形成2000kD的可溶性聚集体。
PBS为20mM，ONE分装、使用完后立即放于-80℃保存。
试剂名称 Pα-syn α-syn ONE
原始浓度 2500μg/ml 2314.6μg/ml 5mg/ml
原始体积 30μl 1000μl 200μl
原始质量 75μg 2.3mg 1mg
目标反应体积 20μl 100μl 100μl
目标反应浓度 140μM 140μM 1mM
目标反应质量 39.2μg 202.44μg 15.42μg
吸取体积 15.68μl 87.46μl 3.09μl
PBS补足体积 1.32μl 9.45μl -
反应后浓度 1960μg/ml 2024.4μg/ml
反应条件为37℃o/n(18-24hrs)
实施例3
Dot Blot筛选鼠源单克隆抗人Pα-syn抗体细胞株C140S
使用Dot-Blot(斑点印迹)实验方法筛选Abmart公司制备的鼠源单克隆抗人Pα-syn抗体细胞株。在每一张NC膜(硝酸纤维素膜)上有两行五列各1μl蛋白样本，上行为100ng肽段，下行为500ng肽段，筛选出的C140S抗体的免疫肽段为P1(M18631-1hz-1-1,Ac-CEAYEMP(pS)EGG-NH2人源129位丝氨酸磷酸化α-syn的123-131肽段)，对照包括：
P2(M18631-1hz-2-1,Ac-EMP(pS)EEGYQDC-NH2人源129位丝氨酸磷酸化α-syn的126-135肽段)；
W(Z18631-1hz-3-1,Ac-CEAYEMPSEEGYQD-NH2人源α-syn的123-135肽段)；
ASWT(hα-syn-FL，Full Length，全长)；
SE(hα-syn/S129E，Ser129Glu，129位丝氨酸突变为谷氨酸)
抗体名称 体积(ml) 理论灵敏度(ng) 实际稀释比例 使用体积(μl)
C140S 0.1 0.01 1:500 10
Protein G-Sephrose FF亲和层析纯化C140S抗体IgG
材料：
Protein G-Sephrose-FF
小鼠免疫腹水10ml
方法：
1.Protein G-sephrose FF(G蛋白琼脂糖凝胶FF)亲和柱用PBS平衡，存放在4℃待用。将腹水与等体积的PBS混合进行二倍稀释，低温高速离心后，再经0.22um微孔滤膜过滤。
2.将腹水-PBS溶液混合均匀后上Protein G sephrose FF柱，缓慢过柱有利于IgG与Protein G结合。重复上样5次。
3.腹水溶液过柱完毕后，用PBS充分冲洗柱子使光吸收值降至基线(至少10个柱床体积，目的是要将非特异结合的杂蛋白从柱上彻底洗脱干净)。
4.用0.1M Glycine-HCl pH 2.7将柱上的IgG解离下来并收集蛋白洗脱液(大约5个柱床体积)。
5.向收集的洗脱液中加入1/10体积的1M Tris-HCl pH 8.0和0.1M NaHCO3，0.5MNaCl pH 8.3的溶液，(达到中和的目的)。
6.将收集的IgG溶液脱盐、浓缩、做蛋白定量、分装、冷冻干燥。
7.-20℃保存。
产品分装：
纯化得到13mg IgG，取6mg做生物素标记，剩余一支7mg(干粉)
实施例4
间接法ELISA验证纯化的C140S抗体的反应性
一、试剂配置：
1.包被液、洗涤与稀释液、封闭液与1.7中相同，
2.底物溶液：OPD(邻苯二胺)-H2O2配制法，磷酸盐-柠檬酸缓冲液
0.1M柠檬酸19.2g加H2O至1000ml 取48.6ml
0.2M Na2HPO2·12H2O 71.7g加H2O至1000ml 取51.4ml
显色剂：取出10ml+4mgOPD+5μl H2O2现用现配
3.终止液：100ml
10％2N H2SO4 10ml+H2O 90ml
二、操作流程：
1.包板：取抗原OP和OW加CB稀释，每孔100μl加到96孔板中，4℃过夜；
2.用200μl洗涤液洗板5分钟，洗涤3次，拍干；
3.用封闭液封板200μl/孔，37℃封闭2小时；
4.洗板3次；
5.加稀释液稀释的C140S抗体100μl；
6.37℃孵育2小时后，洗板3次；
7.加100μl HRP标记的抗小鼠IgG 37℃孵育1小时；
8.洗板4次；
9.加底物显色剂，37℃显色20分钟；
10.加终止液；
11.用ELISA检测仪测定490nm波长吸光光度值；
实施例5
间接法ELISA验证纯化前C140S抗体的灵敏度与特异性
使用抗原：
使用抗体和稀释比例：C140S(1:1000)、C54S(1:1000)、C48S(1:1000)、3D5(1:2000)、WAKO(1:4000)、3A5(1:4000)(图5)
WB(Western Blot,蛋白质印迹)验证C140S抗体的特异性
对Pα-syn和α-syn单体，先后使用C140S和BD(BD，货号610787)总α-syn单克隆抗体观察，确定C140S可以用于WB实验，且可以识别Pα-syn单体(图6)。间接法ELISA验证纯化后的C140S抗体的反应性(HRP催化底物显色，A490)在C140S小鼠腹水使用Protein G-Sephrose-FF亲和层析柱纯化后，需要使用间接法ELISA验证纯化后的C140S抗体是否具有满意的反应性和特异性。在实验中，使用1000ng/ml的阳性抗原OP和阴性抗原OW包被在孔板底部，0.125ug/ml的纯化的C140S抗体检测，1:10000稀释的HRP标记的抗小鼠IgG抗体孵育后，催化显色。则背景读数和阴性对照490nm波长吸光光度值均在小于0.2的情况下，阳性组490nm波长吸光光度值必须在2.0-2.5之间，该批次纯化的抗体方可用于双抗体夹心ELISA实验方法建立针对聚集化的129位磷酸化人源α-syn的检测标准曲线(图7)，此步骤为重要步骤。
特异性识别聚集化Pα-syn的双抗体夹心ELISA(HRP催化底物显色，观察490nm吸光光度值)
使用Santa的多克隆抗磷酸化α-syn抗体(Santa Cruz,sc-135638)为捕获抗体，生物素化3D5单克隆抗人α-syn115-121为检测抗体，发现不识别磷酸化(P)和野生型α-syn单体(W)，以及α-syn聚集体(OW)，仅识别聚集化Pα-syn(OP)(图8)。
本室自制SN16为多克隆抗人α-syn-N端抗体做捕获抗体，C140S抗体做检测抗体，发现不识别磷酸化(P)和野生型α-syn单体(W)，以及α-syn聚集体(OW)，仅识别聚集化Pα-syn(OP)(图9)。
实施例6
SN16的制备：
1.预放血
轻轻的将兔子放在特制兔盒中，处于放松状态的兔子采血会较容易。按压兔子耳根部直至血管突出,然后将针头插入耳部血管的中上部，观察到进针后小心推出活塞收集血液1ml-5ml。结束收集后，退出针头并按压伤处以制止血流，再用乙醇消毒。取收集的血液在37℃恒温箱中放置30分钟以防止激活补体系统，再将试管在4℃放置过夜使血液凝固。用药铲将血凝块从管壁上拨落，将血液转移至塑料离心管中，4℃，10,000g离心10分钟，收集上清液在4℃保存。
2.注射抗原
⑴准备两只成年兔，将100μg抗原/兔溶入1ml磷酸缓冲溶液中待用。在1ml福氏不完全佐剂中加入分枝杆菌制成完全佐剂，并加入1ml抗原溶液(含有人源α-syn的N端)，剧烈震荡使之充分乳化，用3ml注射器抽取该乳化液，接上25G针头，排除注射器中的气泡。从笼中取出兔子放在平坦处，在4个不同的部位进行皮下注射，两处在后背，两处在大腿处。抚去注射处的兔毛并用乙醇消毒暴露的皮肤。捏出皮肤，将针头以相对皮肤15度的角度进针，进针深度为1cm-2cm，小心不要刺入肌肉中，在4个不同部位分别各注射约500μl抗原溶液。注射结束后，将针在注射处放置几秒钟后再轻轻拔出，并用乙醇在注射处消毒。在4个部位重复上述操作。用相同方法免疫另一只家兔。
⑵每4-6周注射抗原，并在注射后的7天-10天按照步骤2收集血液。将收集的血液与注射前收集的血液进行比较，检查是否有抗体产生。待确定产生抗体后可大量收集血液，但每只兔子收集血液不能多于40ml以防止休克。
3.收集血液
⑴将家兔轻轻放入固定架上,二甲苯涂于耳部血管的上中部，用刀片倾斜45°在该处切出0.23cm-0.3cm的切口使血液能自由的流出。用消毒后的管收集滴出的血液，若在结束之前出现凝固可用温水轻擦切口处，再继续收集。收集适量血液后可用消毒后的纱布轻擦患处，轻按患处10秒-20秒确定血流停止后方可结束。
⑵将血液在37℃恒温箱中放置30分钟，然后在4℃放置过夜。用药铲将血凝块从管壁上拨落，将血液转移至塑料离心管中，4℃，10,000g离心10分钟，收集上清液即为抗血清，可在-20℃保存数年。
4.使用专利中提到的方法纯化部分抗体。
实施例7
SN16/C140S夹心法ELISA检测聚集化Pα-syn(OP)
一、试剂配置：
1.包被液：CB(Coating Buffer,pH 9.6)500ml
2.洗涤液与稀释液：0.01M PBS+0.2％Tween-20(Polysorbate 20，聚山梨酯20),pH 7.4
首先配制0.1M PBS，pH 7.4
NaH2PO4·2H2O 2.964g
Na2HPO4·12H2O 28.998g
NaCl 9.0g
ddH2O(超纯水) 1.0L
每次再配成500ml的工作液
取0.1M PBS pH7.4 50ml，加ddH2O 450ml，加1ml Tween-20使其终浓度为0.2％(v/v)。
3.封闭液：5％BSA(Bovine Serum Albumin，牛血清白蛋白，25ml)，此为一个96孔板的量，现用现配
BSA 1.25g+25ml稀释液
4.显色液：pNPP(p-nitrophenyl phosphate，p-硝基苯基磷酸盐，SurModics,货号PNPS-1000-01)
二、实验流程：
1.包被捕获抗体：
将SN16(本室自产兔源多克隆抗人α-syn-N端抗体，浓度192ug/ml)用包被液稀释为1μg/ml，每孔加入100μl，4℃包被过夜(约16-20小时)；
2.洗板：
将包被液弃去，每孔加入200μl的洗涤液，每次室温静置5min，洗涤三次，以下简称“洗涤×3”
3.封闭孔板：
每孔加入200μl的封闭液，37℃封闭2小时；
4.洗板×3；
5.加入检测抗体：
使用稀释液将C140S(本室自产小鼠原单克隆抗人pα-syn抗体，浓度4mg/ml，批次6.4)稀释为0.02μg/ml，每孔加入100μl，37℃孵育2小时；
6.洗板×3；
7.加入二抗m-AP(碱性磷酸酶标记的抗小鼠IgG)：
使用稀释液将AP(alkaline phosphatase，碱性磷酸酶)标记的抗小鼠IgG抗体以1:10000稀释，37℃孵育1小时；
8.洗板×4；
9.配好底物溶液，每孔加入100μlpNPP进行连续显色，时间以10min为间隔从20min开始到80min，专利中根据回收率采用80min的读数建立标准曲线；
10.使用PerkinElmer Victor3读取405nm波长吸光光度值
实施例8
SN16/C140S制作ELISA标准曲线(AP催化pNPP显色)
建立标准曲线使用1μg/ml的SN16做捕获抗体，0.02μg/ml的C140S做检测抗体，OP为目的蛋白，OW为对照蛋白，建立了标准曲线(图10)。
实施例9
使用本发明方法对真实的病人样品进行检测，并计算样品中OP含量，
步骤1，使用含有EDTA的抗凝管抽取5ml肘静脉血，
步骤2，在4℃环境下2000g离心20分钟分离血浆和红细胞，立即在-80℃保存
步骤3，使用实施例7中的方法做ELISA标准曲线，同时对患者血浆分别按照不同的稀释比例稀释，使测出OP的浓度在标准曲线的线性范围内，做好复孔，然后测出的值再乘上稀释比例，即为实际每毫升血浆中OP的含量。
实施例10
本发明试剂盒的制备
试剂盒含有包被缓冲液，捕获抗体SN16，洗涤/稀释液，标准抗原OP，检测抗体C140S，碱性磷酸酶标记的抗小鼠IgG，pNPP底物显色液
此试剂盒各组分的含量分别为：
1.10x包被缓冲液50ml
2.捕获抗体SN16以1ug/ml的浓度包被在96孔板上(孔板可拆卸，密封好-20℃保存)
3.10x洗涤/稀释液100ml
4.标准抗原OP 44.8ng/0.7ml洗涤液中(建立曲线浓度范围64000pg/ml至500pg/ml)
5.检测抗体C140S浓度为0.2μg/ml,含1ml，使用时稀释到10ml
6.碱性磷酸酶标记的抗小鼠IgG以1:1000稀释共1ml，使用时用稀释液稀释到1:10000
7.pNPP底物显色液10ml。

Claims (3)

1.一种细胞株，其特征在于，保藏编号为CGMCC12993。
2.一种单克隆抗体C140S，其特征在于，由权利要求1的细胞株制备。
3.权利要求2所述的单克隆抗体C140S用于检测聚集体形式的129位丝氨酸磷酸化的人源α-syn。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111044721B (zh) * 2020-01-02 2020-11-17 山东帝俊生物技术有限公司 一种利用间接elisa法检测破伤风抗体效价的检测方法
CN111544584A (zh) * 2020-04-16 2020-08-18 首都医科大学 一种单克隆抗体对帕金森病的治疗作用

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008003943A2 (en) * 2006-07-03 2008-01-10 Zapaloid Limited Inhibition of alpha-synuclein aggregation
CN101308144A (zh) * 2007-05-16 2008-11-19 首都医科大学宣武医院 检测受试者体液内疾病相关蛋白聚合能力的方法
CN101692092A (zh) * 2009-09-24 2010-04-07 首都医科大学宣武医院 定量检测人血清中自体α-突触核蛋白抗体的方法
WO2010069603A1 (en) * 2008-12-19 2010-06-24 Neurimmune Therapeutics Ag Human anti-alpha-synuclein autoantibodies
CN103954763A (zh) * 2014-05-08 2014-07-30 首都医科大学宣武医院 一种检测受实验者体液体外促进疾病相关蛋白磷酸化修饰能力的方法
CN104215777A (zh) * 2014-09-18 2014-12-17 首都医科大学宣武医院 一种检测血红蛋白结合磷酸化alpha-突触核蛋白的方法
CN104619724A (zh) * 2012-01-27 2015-05-13 尼奥托普生物科学有限公司 识别α-突触核蛋白的人源化抗体
CN105247367A (zh) * 2013-03-15 2016-01-13 彼德·史戴斯 用于分析血液以检测与异常蛋白质聚集相关的疾病的方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008003943A2 (en) * 2006-07-03 2008-01-10 Zapaloid Limited Inhibition of alpha-synuclein aggregation
CN101308144A (zh) * 2007-05-16 2008-11-19 首都医科大学宣武医院 检测受试者体液内疾病相关蛋白聚合能力的方法
WO2010069603A1 (en) * 2008-12-19 2010-06-24 Neurimmune Therapeutics Ag Human anti-alpha-synuclein autoantibodies
CN101692092A (zh) * 2009-09-24 2010-04-07 首都医科大学宣武医院 定量检测人血清中自体α-突触核蛋白抗体的方法
CN104619724A (zh) * 2012-01-27 2015-05-13 尼奥托普生物科学有限公司 识别α-突触核蛋白的人源化抗体
CN105247367A (zh) * 2013-03-15 2016-01-13 彼德·史戴斯 用于分析血液以检测与异常蛋白质聚集相关的疾病的方法
CN103954763A (zh) * 2014-05-08 2014-07-30 首都医科大学宣武医院 一种检测受实验者体液体外促进疾病相关蛋白磷酸化修饰能力的方法
CN104215777A (zh) * 2014-09-18 2014-12-17 首都医科大学宣武医院 一种检测血红蛋白结合磷酸化alpha-突触核蛋白的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Novel antibodies to phosphorylated alpha-synuclein serine 129 and NFL serine 473 demonstrate the close molecular homology of these epitopes;Rutherford,Nicola J等;《Acta neuropathologica communications》;20160808;第4卷(第1期);第80页 *
一种检测帕金森患者血浆促进α-突触核蛋白寡聚体形成能力的方法;李昕等;《首都医科大学学报》;20131205;第34卷(第6期);第830-834页 *

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