CN106544336A

CN106544336A - 一种对脂肪族二腈区域选择性提高的腈水合酶

Info

Publication number: CN106544336A
Application number: CN201611108474.3A
Authority: CN
Inventors: 周哲敏; 程中; 程中一; 崔文璟; 刘中美; 周丽; 张甲蕾
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2016-12-06
Filing date: 2016-12-06
Publication date: 2017-03-29

Abstract

本发明公开了一种对脂肪族二腈区域选择性提高的腈水合酶，属于微生物基因工程领域。本发明将恶臭假单胞菌来源的腈水合酶的第37位的亮氨酸分别突变为苯丙氨酸、色氨酸或者酪氨酸之后，相比野生型，腈水合酶催化己二腈转化得到的产物以己二酰二胺为主，产物中，己二酰二胺的含量在90％以上。本发明提供的腈水合酶突变体将在针对性合成己二酰二胺的过程中，更好地发挥作用，减少分离纯化目标产物的成本。

Description

一种对脂肪族二腈区域选择性提高的腈水合酶

技术领域

本发明涉及一种对脂肪族二腈区域选择性提高的腈水合酶，属于微生物基因工程领域。

背景技术

腈水合酶(Nitrile hydratase，简称NHase，EC 4.2.1.84)，是一种能将腈类物质水合成更有价值的酰胺类化合物的金属酶。NHase在微生物中分布比较广泛，目前已经在红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、诺卡氏菌属(Nocardia)、丛毛单胞菌属(Comamonas)中都可以得到腈水合酶的基因序列。

各国研究者改造生物酶选择性的方法基本相同，一般包含非理性设计、半理性设计和理性设计。较为普遍的方法是通过蛋白质的氨基酸序列比对，通过同源建模的手段构建目的蛋白的三维结构，利用分子对接技术找到影响选择性的潜在热点，通过定点突变的方法找到改变选择性的正向突变体。

酶的区域选择性是酶在特定的反应条件下，优先选择催化底物分子内不同位置的某一相同功能基团。目前关于腈水合酶区域选择性的报道较少。现有研究仅发现腈水合酶能催化己二腈以及多聚物如聚丙稀腈，而对其催化过程和机理尚不明确。Moreau等人的研究发现腈水合酶催化己二腈可生成中间产物5-氰基戊酰胺和终产物己二酰二胺，具有催化的区域选择性。与此不同，睾丸酮从毛单胞菌(Comamonas testosterone)腈水合酶能将底物己二腈全部转化为己二酰二胺，不生成中间产物5-氰基戊酰胺。

5-氰基戊酰胺是一种农药中间体，可以用来生产三唑啉酮类除草剂，也可以作生产已内酰胺和碱性红29的前体。终产物己二酰二胺，是重要的精细化工原料，医药中间体，价格较昂贵。如能提高腈水合酶特异性生产5-氰基戊酰胺或己二酰二胺的能力，将能大大减少这些物质的合成成本。

发明内容

本发明提供了一种腈水合酶突变体，是将来源于恶臭假单胞菌的腈水合酶的第37位的亮氨酸分别突变为苯丙氨酸或者色氨酸或者酪氨酸，得到突变体L37F、L37W、L37Y。

本发明还提供制备所述突变体的方法，是将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的恶臭假单胞菌来源的腈水合酶基因与表达质粒pET-24a(+)都用Nde I和EcoR I进行双酶切，然后连接得到重组质粒pET24a-PpNHase；以该重组质粒为模版，通过PCR制备得到携带编码相应腈水合酶突变体的基因的重组质粒；将重组质粒转化大肠杆菌，培养所得重组菌，诱导其表达出腈水合酶突变体。

相比野生型，将恶臭假单胞菌来源的腈水合酶的第37位的亮氨酸分别突变为苯丙氨酸、色氨酸或者酪氨酸之后，腈水合酶催化己二腈转化得到的产物以己二酰二胺为主，产物中，己二酰二胺的含量在90％以上。本发明提供的腈水合酶突变体将在针对性合成己二酰二胺的过程中，更好地发挥作用，减少分离纯化目标产物的成本。

附图说明

图1.A：来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas Putida)的腈水合酶晶体结构；B：来源于睾丸酮从毛单胞菌(Comamonas testosterone)的腈水合酶的模拟结构。

具体实施方式

5-氰基戊酰胺和己二酰二胺的液相检测方法：使用柱子为Diamonsil 5μm,250×4.6mm C18柱，流动相采用25mmol·L^-1H₃PO₄和色谱纯甲醇(89.01:10.09,vol:vol)(pH2.5)，柱温为30℃，检测波长为200nm，流速1.0mL·min^-1。

实施例1腈水合酶β突变体的制备方法

(1)质粒DNA提取方法

将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的恶臭假单胞菌来源的腈水合酶基因的PCR产物与表达质粒pET-24a(+)都用Nde I和EcoR I进行双酶切，然后连接得到重组质粒pET24a-PpNHase。将重组质粒pET24a-PpNHase的E.coli JM109接种于LB/Kan(抗生素终浓度50μg·mL^-1)培养基中，37℃、200r·min^-1培养7h后，收集菌体2～4h，使用质粒小量提取试剂盒按照说明书上步骤提取pET24a-PpNHase。

(2)PCR反应条件

以pET24a-PpNHase为模板，运用PrimeSTARHS DNA Polymerase试剂进行全质粒PCR，分别扩增得到携带编码突变体L37F、L37W、L37Y的基因的重组质粒。扩增反应总体积为50μL，各组分如下表1：

表1

全质粒PCR反应过程为：共18个循环

(3)PCR产物的纯化及消化

PCR产物经过1.0％琼脂糖凝胶电泳分析验证，切胶回收pET24a-PpNHase的基因全质粒，再用DNA纯化试剂盒将其进行纯化，最后将纯化产物用QuickCut^Tm Dpn I于37℃消化约1h去除甲基化的模板质粒，20μL的消化体系如下：

10×buffer 2μL

DNA 17.6μL

Dpn I 0.4μL

(4)感受态制备

从活化的E.coli JM109平板上挑取单菌落，接种于5mL LB液体培养中，置于37℃恒温摇床中培养9h左右，待菌体生长到对数生长期。将该菌悬液以1:100转接于20mL LB培养基中，置于37℃恒温摇床中培养到OD₆₀₀为0.4～0.8(约2～3h)时停止培养。

将菌液转入离心管中，冰浴10min，于4℃，5000r·min^-1离心10min。

留沉淀，用10mL预冷的CaCl₂溶液(0.1mol·L^-1)缓缓悬浮细胞，冰浴10min，0～4℃，5000r·min^-1离心10min。重复一次。

弃上清液，加入3.75mL预冷的CaCl₂溶液(0.1mol·L^-1)，缓缓悬浮细胞，冰上放置5～10min，加入1.25mL预冷的60％甘油混匀，在超净工作台中将菌悬液按50～100μL每管分装到离心管中，即完成了感受态细胞的制备。置于-80℃超低温冰箱备用。

注：所有接触到感受态细胞的器材均通过高压蒸汽灭菌，并预冷，注意实验过程中的无菌环境。E.coli BL21(DE3)感受态细胞制备方法亦相同。

(5)转化及突变菌株的鉴定

采用热击转化法：取10μL 5×KCM，2～5μL质粒于无菌EP管中，用无菌水补足到50μL，混匀后冰上放置5min，加入到半融状态的感受态中，小心混匀后放置在冰上20min，再在42℃热击90s，再次置于冰上5min，加入500μL LB培养基，于37℃震荡培养1h，然后取50μL涂布到Kan(终浓度50μg·mL^-1)抗性的平板，于37℃培养。

挑取单菌落于LB培养基培养到OD值1左右，委托上海生物工程有限公司测序，确认基因序列正确之后，再将JM109中质粒富集，然后转化到表达宿主E.coli BL21(DE3)，均匀地涂布到含Kan抗性的平板中培养，再挑取单菌落在液体培养基培养后，诱导表达腈水合酶，纯化收集发酵液上清液中的腈水合酶。

实施例2腈水合酶βL37Y突变体催化己二腈生成5-氰基戊酰胺和己二酰二胺的方法

取pH7.4的20mmol·L^-1Tris-HCl缓冲液440μL，加入50μL(200mmol·L^-1)的底物己二腈，加入纯化后稀释的腈水合酶10μL(浓度600μg·mL^-1)，于35℃反应10min后用500μL甲醇终止反应，每组二个平行。表2、3中，PpNHase-WT为来源于恶臭假单胞菌的腈水合酶原始酶；L37F、L37W、L37Y为以PpNHase-WT为基础得到的突变体。相比野生型，将恶臭假单胞菌来源的腈水合酶的第37位的亮氨酸分别突变为苯丙氨酸、色氨酸或者酪氨酸之后，腈水合酶催化己二腈转化得到的产物以己二酰二胺为主。

表2各酶催化己二腈生成5-氰基戊酰胺及己二酰二胺的选择性

表3腈水合酶及其突变体催化己二腈和5-氰基戊酰胺的动力学常数

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种对脂肪族二腈区域选择性提高的腈水合酶

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1045

<212> DNA

<213> 恶臭假单胞菌

<400> 1

atgaatggca ttcacgatac tggcggagca catggttatg ggccggttta cagagaaccg 60

aacgaacccg tctttcgcta cgactgggaa aaaacggtca tgtccctgtt tccggcgctg 120

ctcgccaacg gcaacttcaa cctcgatgaa tttcggcatt cgatcgagcg aatgggcccg 180

gcccactatc tggagggaac ctactacgaa cactggcttc atgtctttga gaacctgctg 240

gtcgagaagg gtgtgctcac ggccacggaa gtcgcgaccg gcaaggcttc tggcaagacg 300

gcgacgccgg tgctgacgcc ggccatcgtg gacggactgc tcagcaccgg ggcttctgcc 360

gcccgggagg agggtgcgcg ggcgcggttc gctgtggggg acaaggttcg cgtcctcaac 420

aagaacccgg tgggccatac ccgcatgccg cgctacacgc ggggcaaagt ggggacagtg 480

gtcatcgacc atggtgtgtt cgtgacgccg gacaccgcgg cacacggaaa gggcgagcac 540

ccccagcacg tttacaccgt gagtttcacg tcggtcgaac tgtgggggca agacgcttcc 600

tcgccgaagg acacgattcg cgtcgacttg tgggatgact acctggagcc agcgtgaaag 660

gagaccgcac catggggcaa tcacacacgc atgaccacca tcacgacggg taccaggcac 720

cgcccgaaga catcgcgctg cgggtcaagg ccttggagtc tctgctgatc gagaaaggtc 780

ttgtcgaccc agcggccatg gacttggtcg tccaaacgta tgaacacaag gtaggccccc 840

gaaacggcgc caaagtcgtg gccaaggcct gggtggaccc tgcctacaag gcccgtctgc 900

tggcagacgg cactgccggc attgccgagc tgggcttctc cggggtacag ggcgaggaca 960

tggtcattct ggaaaacacc cccgccgtcc acacgtcttc gtttgcacct tgtgctcttg 1020

ctacccatgg ccgacgcctg ggcct 1045

<210> 2

<211> 430

<212> PRT

<213> 恶臭假单胞菌

<400> 2

Met Asn Gly Ile His Asp Thr Gly Gly Ala His Gly Tyr Gly Pro Val

1 5 10 15

Tyr Arg Glu Pro Asn Glu Pro Val Phe Arg Tyr Asp Trp Glu Lys Thr

20 25 30

Val Met Ser Leu Leu Pro Ala Leu Leu Ala Asn Gly Asn Phe Asn Leu

35 40 45

Asp Glu Phe Arg His Ser Ile Glu Arg Met Gly Pro Ala His Tyr Leu

50 55 60

Glu Gly Thr Tyr Tyr Glu His Trp Leu His Val Phe Glu Asn Leu Leu

65 70 75 80

Val Glu Lys Gly Val Leu Thr Ala Thr Glu Val Ala Thr Gly Lys Ala

85 90 95

Ala Ser Gly Lys Thr Ala Thr Pro Val Leu Thr Pro Ala Ile Val Asp

100 105 110

Gly Leu Leu Ser Thr Gly Ala Ser Ala Ala Arg Glu Glu Gly Ala Arg

115 120 125

Ala Arg Phe Ala Val Gly Asp Lys Val Arg Val Leu Asn Lys Asn Pro

130 135 140

Val Gly His Thr Arg Met Pro Arg Tyr Thr Arg Gly Lys Val Gly Thr

145 150 155 160

Val Val Ile Asp His Gly Val Phe Val Thr Pro Asp Thr Ala Ala His

165 170 175

Gly Lys Gly Glu His Pro Gln His Val Tyr Thr Val Ser Phe Thr Ser

180 185 190

Val Glu Leu Trp Gly Gln Asp Ala Ser Ser Pro Lys Asp Thr Ile Arg

195 200 205

Val Asp Leu Trp Asp Asp Tyr Leu Glu Pro Ala Met Gly Gln Ser His

210 215 220

Thr His Asp His His His Asp Gly Tyr Gln Ala Pro Pro Glu Asp Ile

225 230 235 240

Ala Leu Arg Val Lys Ala Leu Glu Ser Leu Leu Ile Glu Lys Gly Leu

245 250 255

Val Asp Pro Ala Ala Met Asp Leu Val Val Gln Thr Tyr Glu His Lys

260 265 270

Val Gly Pro Arg Asn Gly Ala Lys Val Val Ala Lys Ala Trp Val Asp

275 280 285

Pro Ala Tyr Lys Ala Arg Leu Leu Ala Asp Gly Thr Ala Gly Ile Ala

290 295 300

Glu Leu Gly Phe Ser Gly Val Gln Gly Glu Asp Met Val Ile Leu Glu

305 310 315 320

Asn Thr Pro Ala Val His Asn Val Phe Val Cys Thr Leu Cys Ser Cys

325 330 335

Tyr Pro Trp Pro Thr Leu Gly Leu Pro Pro Ala Trp Tyr Lys Ala Ala

340 345 350

Pro Tyr Arg Ser Arg Met Val Ser Asp Pro Arg Gly Val Leu Ala Glu

355 360 365

Phe Gly Leu Val Ile Pro Ala Asn Lys Glu Ile Arg Val Trp Asp Thr

370 375 380

Thr Ala Glu Leu Arg Tyr Met Val Leu Pro Glu Arg Pro Ala Gly Thr

385 390 395 400

Glu Ala Tyr Ser Glu Glu Gln Leu Ala Glu Leu Val Thr Arg Asp Ser

405 410 415

Met Ile Gly Thr Gly Leu Pro Thr Gln Pro Thr Pro Ser His

420 425 430

Claims

1.一种腈水合酶突变体，其特征在于，是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的腈水合酶的第37位的亮氨酸分别突变为苯丙氨酸或者色氨酸或者酪氨酸。

2.编码权利要求1所述的腈水合酶突变体的基因。

3.携带权利要求2所述基因的载体或细胞。

4.一种重组大肠杆菌，其特征在于，是将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的恶臭假单胞菌来源的腈水合酶基因与表达质粒pET-24a(+)都用Nde I和EcoR I进行双酶切，然后连接得到重组质粒pET24a-PpNHase；以该重组质粒为模版，通过PCR制备得到携带编码相应腈水合酶突变体的基因的重组质粒；将重组质粒转化大肠杆菌，制备得到重组大肠杆菌。

5.一种制备权利要求1所述突变体的方法，其特征在于，是将核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示的恶臭假单胞菌来源的腈水合酶基因与表达质粒pET-24a(+)都用Nde I和EcoR I进行双酶切，然后连接得到重组质粒pET24a-PpNHase；以该重组质粒为模版，通过PCR制备得到携带编码相应腈水合酶突变体的基因的重组质粒；将重组质粒转化大肠杆菌，培养所得重组菌，诱导其表达出腈水合酶突变体。

6.权利要求1所述的腈水合酶突变体在制备己二酰二胺中的应用。

7.权利要求4所述的重组大肠杆菌在制备己二酰二胺中的应用。