[go: up one dir, main page]

CN106535927A - 新颖多糖及其用途 - Google Patents

新颖多糖及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN106535927A
CN106535927A CN201580020077.8A CN201580020077A CN106535927A CN 106535927 A CN106535927 A CN 106535927A CN 201580020077 A CN201580020077 A CN 201580020077A CN 106535927 A CN106535927 A CN 106535927A
Authority
CN
China
Prior art keywords
coli
specific embodiment
host cell
antigen
carrier protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201580020077.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106535927B (zh
Inventor
M.T.科瓦里克
M.L.维特
S.J.肯勒
M.A.豪普特尔
V.甘比拉拉
M.马利
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
GlaxoSmithKline Biologicals SA
Original Assignee
Glycovaxyn AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Glycovaxyn AG filed Critical Glycovaxyn AG
Publication of CN106535927A publication Critical patent/CN106535927A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106535927B publication Critical patent/CN106535927B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
    • A61K39/0258—Escherichia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/21—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0066—Isolation or extraction of proteoglycans from organs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55583—Polysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6087—Polysaccharides; Lipopolysaccharides [LPS]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本文提供了新颖大肠杆菌O多糖O25B。本文还提供了包含用于O25B产生的酶(例如糖基转移酶)的原核宿主细胞。本文提供的宿主细胞产生O25B生物缀合物，其中所述生物缀合物包含连接至载体蛋白的O25B。本文还提供了包含O25B和/或包含O25B的生物缀合物的组合物，例如药物组合物。此类组合物可用作针对ExPEC感染的疫苗，并且还可包含一种或多种额外的生物缀合物。

Description

新颖多糖及其用途
1. 引言
本文公开了大肠杆菌抗原O25B的结构以及O25B的用途、制备O25B的方法和包含O25B的生物缀合物。申请人已鉴定出负责产生O25B的大肠杆菌基因簇且充分表征O25B抗原的结构。因此，本文提供了能够在宿主细胞中产生O25B的核酸。本文还提供了包含能够产生O25B的核酸的宿主细胞(例如重组工程改造的宿主细胞)。此类宿主细胞可用于生成包含连接至载体蛋白的O25B的生物缀合物，所述生物缀合物可用于例如配制治疗剂(例如疫苗)。本文描述的O25B抗原也可用于生成抗体，所述抗体可用于例如治疗方法(例如受试者的被动免疫)中。本文还提供了包含O25B(单独或与其它大肠杆菌抗原(例如O1、O2和O6和其亚血清型)组合)的组合物，其用于治疗方法中，例如针对大肠杆菌(例如肠外病原性(诸如尿路病原性)大肠杆菌)感染对宿主接种疫苗。
2. 背景
肠外病原性大肠杆菌(ExPEC)每年引起各种各样造成显著发病率、死亡率和成本的感染。泌尿道感染是人类中由ExPEC引起的最常见病况。然而，ExPEC还引起危及生命的病况，诸如脑膜炎和败血症。
细菌对抗生素的抗性是抵抗细菌感染中的主要问题，且多药物抗性(MDR)的大肠杆菌菌株正变得越来越普遍。Schito等人，2009, Int. J. Antimicrob. Agents 34(5):407-413;和Pitout等人，2012, Expert Rev. Anti. Infect. Ther. 10(10):1165-1176。因此，需要开发针对ExPEC的有效疫苗。
3. 概述
在一个方面，本文提供了包含编码能够产生本文公开的新颖多糖大肠杆菌O25B的酶(例如糖基转移酶)的核酸的原核宿主细胞。本文还提供了包含编码能够产生其它大肠杆菌抗原(例如O25A、O1、O2和O6和其亚血清型)的酶(例如糖基转移酶)的核酸的宿主细胞。本文提供的宿主细胞可天然表达特异性产生目标O抗原的核酸，或可使宿主细胞表达此类核酸，即，在某些实施方案中，所述核酸对宿主细胞是异源的。在某些实施方案中，本文提供的宿主细胞包含编码在蛋白N-糖基化中有活性的额外酶的核酸，例如，本文提供的宿主细胞还可包含编码寡糖基转移酶的核酸或编码其它糖基转移酶的核酸。在某些实施方案中，本文提供的宿主细胞包含编码载体蛋白(例如寡糖和/或多糖可附接以形成生物缀合物的蛋白)的核酸。在一个具体实施方案中，宿主细胞为大肠杆菌。参见部分5.3。
在一个具体实施方案中，本文提供了包含大肠杆菌rfb(upec138)基因簇(SEQ IDNO: 12)或与大肠杆菌rfb(upec138)基因簇(SEQ ID NO: 12)约或至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源的基因簇的原核宿主细胞。在一个具体实施方案中，原核宿主细胞包含编码寡糖基转移酶的核酸序列。在另一个具体实施方案中，原核宿主细胞还包含编码以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQ ID NO: 14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X和Z独立地选自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQ ID NO: 15)(参见WO 2006/119987)。在一个具体实施方案中，宿主细胞为大肠杆菌。
在另一个具体实施方案中，本文提供了包含大肠杆菌rfb(upec163)基因簇或与大肠杆菌rfb(upec163)基因簇约或至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源的基因簇的原核宿主细胞。在一个具体实施方案中，原核宿主细胞包含编码寡糖基转移酶的核酸序列。在另一个具体实施方案中，原核宿主细胞还包含编码以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQ ID NO:14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X和Z独立地选自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQ ID NO: 15)(参见WO 2006/119987)。在一个具体实施方案中，宿主细胞为大肠杆菌。
在另一个具体实施方案中，本文提供了包含大肠杆菌rfb(upec177)基因簇或与大肠杆菌rfb(upec177)基因簇约或至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源的基因簇的原核宿主细胞。在一个具体实施方案中，原核宿主细胞包含编码寡糖基转移酶的核酸序列。在另一个具体实施方案中，原核宿主细胞还包含编码以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQ ID NO:14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X和Z独立地选自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQ ID NO: 15)(参见WO 2006/119987)。在一个具体实施方案中，宿主细胞为大肠杆菌。
在另一个具体实施方案中，本文提供了经重组工程改造以包含(例如通过将一种或多种载体/质粒引入宿主细胞中)一个、两个、三个、四个或更多个以下基因(或与以下基因之一约或至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源的核酸)的原核宿主细胞：rmlB (SEQ ID NO: 1)、rmlD (SEQ ID NO: 2)、rmlA (SEQ ID NO: 3)、rmlC (SEQ IDNO: 4)、wzx (SEQ ID NO: 5)、wekA (SEQ ID NO: 6)、wekB (SEQ ID NO: 7)、wzy (SEQ IDNO: 8)、wbbJ (SEQ ID NO: 9)、wbbK (SEQ ID NO: 10)和/或wbbL (SEQ ID NO: 11)。在另一个具体实施方案中，原核宿主细胞包含编码寡糖基转移酶(例如异源性寡糖基转移酶)的核酸序列。在另一个具体实施方案中，原核宿主细胞还包含编码以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQ ID NO: 14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X和Z独立地选自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQ ID NO: 15)(参见WO 2006/119987)。在一个具体实施方案中，宿主细胞为大肠杆菌。
在另一个具体实施方案中，本文提供了经重组工程改造以包含(例如通过将一种或多种载体/质粒引入宿主细胞中)以下中的一种、两种、三种、四种或更多种的原核宿主细胞：(i)dTDP-葡萄糖4,6-脱水酶；(ii)dTDP-6-脱氧-D-葡萄糖3,5-差向异构酶；(iii)葡萄糖-1-磷酸胸苷基转移酶；(iv)dTDP-4-脱氢鼠李糖3,5-差向异构酶；(v)O抗原翻转酶；(vi)dTDP-Rha: Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP α-1,3-鼠李糖基转移酶；(vii)UDP-Glc: Rha-GlcNAc-UPP α-1,3-葡萄糖基转移酶；(viii)O抗原聚合酶；(ix)O-乙酰基转移酶；(x)UDP-Glc: Rha-GlcNAc-UPP α-1,3-葡萄糖基转移酶；和/或(xi)dTDP-Rha: GlcNAc-UPP α-1,3-鼠李糖基转移酶。在一个具体实施方案中，原核宿主细胞包含编码寡糖基转移酶(例如异源性寡糖基转移酶)的核酸序列。在另一个具体实施方案中，原核宿主细胞还包含编码以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQ ID NO: 14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X和Z独立地选自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQ ID NO: 15)(参见WO 2006/119987)。在一个具体实施方案中，宿主细胞为大肠杆菌。
在某些实施方案中，本文提供的原核宿主细胞包括一个或多个基因的缺失或功能失活。参见5.3.1部分。在一个具体实施方案中，waaL基因、gtrA基因、gtrB基因、gtrS基因或rfb基因簇(或rfb簇中的一种或多种基因)中的一个或多个从本文提供的原核宿主细胞的基因组中缺失或功能失活。
由本文提供的原核宿主细胞表达的载体蛋白可选自本领域技术人员已知的任何载体蛋白，例如脱毒的绿脓假单胞菌(P. aeruginosa)外毒素A(EPA；例如参见Ihssen等人(2010) Microbial cell factories 9, 61)、CRM197、麦芽糖结合蛋白(MBP)、白喉类毒素、破伤风类毒素、脱毒的金黄色葡萄球菌(S. aureus)溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、大肠杆菌FimH、大肠杆菌FimHC、大肠杆菌不耐热肠毒素、大肠杆菌不耐热肠毒素的脱毒变体、霍乱毒素B亚单元(CTB)、霍乱毒素、霍乱毒素的脱毒变体、大肠杆菌Sat蛋白、大肠杆菌Sat蛋白的过客(passenger)结构域、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)肺炎球菌溶血素和其脱毒变体、空肠弯曲杆菌(C. jejuni)AcrA和空肠弯曲杆菌天然糖蛋白。在一个具体实施方案中，由本文提供的原核宿主细胞表达的载体蛋白是脱毒假单胞菌外毒素(EPA)。在某些实施方案中，本文提供宿主细胞的载体蛋白包含使载体蛋白靶向入宿主细胞的周质间隙中的信号序列。在一个具体实施方案中，信号序列来自大肠杆菌DsbA、大肠杆菌外膜孔蛋白A(OmpA)、大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(MalE)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovorans)果胶酸裂合酶(PelB)、FlgI、NikA或芽孢杆菌属(Bacillus sp.)木聚糖内切酶(XynA)、不耐热大肠杆菌肠毒素LTIIb、芽孢杆菌木聚糖内切酶XynA或大肠杆菌鞭毛蛋白(FlgI)。在某些实施方案中，编码由本文提供的宿主细胞表达的载体蛋白的核酸序列已被工程改造(例如经由重组技术)以编码以下中的一种或多种：共有序列Asn-X-Ser(Thr)，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQ ID NO: 14)；和/或共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)，其中X和Z独立地选自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQ ID NO: 15)(参见WO 2006/119987)。在某些实施方案中，由本文提供的宿主细胞表达的载体蛋白包含所述共有序列中的两种、三种、四种、五种或更多种。参见5.3.2部分。
在另一个方面，本文提供了产生包含N-连接至大肠杆菌O抗原(例如大肠杆菌O25B)的载体蛋白(例如EPA)的N-糖基化载体蛋白(在本文中也称为生物缀合物)的方法，所述方法包括：在适于产生蛋白的条件下培养本文描述的宿主细胞，并纯化N-糖基化载体蛋白。使用宿主细胞(例如大肠杆菌)产生蛋白和分离由宿主细胞产生的蛋白的方法是本领域众所周知的。参见5.3部分。
在另一个方面，本文提供了由本文提供的宿主细胞产生的生物缀合物。在一个具体实施方案中，本文提供了包含N-连接至大肠杆菌O25B的载体蛋白(例如EPA)的生物缀合物。参见5.4部分。
在一个具体实施方案中，本文提供了包含连接至下文呈现的式O25B的化合物的载体蛋白(例如EPA)的生物缀合物：
其中n是1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之间的整数。在一个具体实施方案中，载体蛋白N-连接至式O25B的O抗原。
在另一个具体实施方案中，本文提供了包含连接至下文呈现的式O25B’的化合物的载体蛋白(例如EPA)的生物缀合物：
其中n是1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之间的整数。在一个具体实施方案中，载体蛋白N-连接至式O25B’的O抗原。
在另一个方面，本文提供了来自ExPEC大肠杆菌菌株的分离O抗原，其中所述菌株产生O25B。在另一个具体实施方案中，本文提供了来自大肠杆菌菌株upec138的分离O抗原。在一个具体实施方案中，本文提供了来自大肠杆菌菌株upec163的分离O抗原。在另一个具体实施方案中，本文提供了来自大肠杆菌菌株upec177的分离O抗原。参见部分5.2。
在另一个方面，本文提供了下文呈现的式O25B的分离大分子的群体：
其中n是1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之间的整数。在一个具体实施方案中，群体中至少80%的大分子的n在1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之间。
在另一个方面，本文提供了下文呈现的式O25B’的分离大分子的群体：
其中n是1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之间的整数。在一个具体实施方案中，群体中至少80%的大分子的n在1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之间。
在另一个方面，本文提供了使用O25B和/或包含O25B的生物缀合物生成抗O25B抗体的方法。本文还提供了根据此类方法产生的抗体。参见5.5部分。
在另一个方面，本文提供了包含本文提供的生物缀合物和/或本文提供的大分子(或其群体)的组合物(例如药物组合物)。参见5.6部分。
在一个具体实施方案中，本文提供了包含含有式O25B结构的大分子的组合物(例如药物组合物)：
其中n是1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之间的整数。
在另一个具体实施方案中，本文提供了包含含有式O25B’结构的大分子的组合物(例如药物组合物)：
其中n是1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之间的整数。
在另一个具体实施方案中，本文提供了包含本文描述的生物缀合物的组合物(例如药物组合物)，其中所述生物缀合物包含连接至下文呈现的式O25B的化合物的载体蛋白(例如EPA)：
其中n是1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之间的整数。在一个具体实施方案中，载体蛋白N-连接至式O25B’的O抗原。
在另一个具体实施方案中，本文提供了包含本文描述的生物缀合物的组合物(例如药物组合物)，其中所述生物缀合物包含连接至下文呈现的式O25B’的化合物的载体蛋白(例如EPA)：
其中n是1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之间的整数。在一个具体实施方案中，载体蛋白N-连接至式O25B’的O抗原。
在某些实施方案中，本文提供的药物组合物包含一种或多种额外大肠杆菌O抗原，其中所述抗原不是O25B(例如式O25B或式O25B’)，例如除来自大肠杆菌O25B血清型的抗原外的来自大肠杆菌的O抗原(例如ExPEC)；和/或一种或多种包含连接至大肠杆菌O抗原的载体蛋白的生物缀合物，其中所述抗原不是O25B(例如式O25B或式O25B’)。此类组合物可包含一种或多种包含ExPEC O抗原的额外大分子和/或一种或多种额外生物缀合物，例如O1A、O2和/或O6大分子和/或O1A、O2和/或O6生物缀合物。
在一个具体实施方案中，本文提供了除O25B大分子(例如包含式O25B或式O25B’的大分子)和/或O25B生物缀合物(例如包含连接至式O25B或式O25B’的载体蛋白的生物缀合物)外还包含一种或多种包含ExPEC O抗原的额外大分子和/或一种或多种额外生物缀合物的组合物(例如药物组合物)，其中所述额外大分子包含选自以下的结构：
a. 式O25A
b. 式O1A
c. 式O1B
d. 式O1C
e. 式O6Glc
f. 式O6GlcNAc
g. 式O2
。
在一个具体实施方案中，本文提供了除O25B大分子(例如包含式O25B或式O25B’的大分子)和/或O25B生物缀合物(例如包含连接至式O25B或式O25B’的载体蛋白的生物缀合物)外还包含一种、两种、三种、四种、五种、六种或七种大分子或包含所述大分子的生物缀合物的组合物(例如药物组合物)，其中所述额外大分子包含选自以下的结构：
a. 式O25A’
b. 式O1A’
c. 式O1B’
d. 式O1C’
e. 式O6Glc’
f. 式O6GlcNAc’
g. 式O2’
。
在另一个具体实施方案中，本文提供了包含以下的组合物(例如药物组合物)：(i)O25(例如O25A或O25B)大分子或包含O25(例如O25A或O25B)的生物缀合物；和(ii)O1大分子或包含O1的生物缀合物。在一个具体实施方案中，所述O25大分子是O25B大分子。在另一个具体实施方案中，所述O1大分子是O1A。在另一个具体实施方案中，所述O1大分子是O1B。在另一个具体实施方案中，所述O1大分子是O1C。
在另一个具体实施方案中，本文提供了包含以下的组合物(例如药物组合物)：(i)O25(例如O25A或O25B)大分子或包含O25(例如O25A或O25B)的生物缀合物；和(ii)O2大分子或包含O2的生物缀合物。在一个具体实施方案中，所述O25大分子是O25B大分子。
在另一个具体实施方案中，本文提供了包含以下的组合物(例如药物组合物)：(i)O25(例如O25A或O25B)大分子或包含O25(例如O25A或O25B)的生物缀合物；和(ii)O6大分子(例如包含支链Glc单糖(O6Glc)或支链GlcNAc单糖(O6GlcNAc)的O6大分子)或包含O6的生物缀合物。在一个具体实施方案中，所述O25大分子是O25B大分子。在另一个具体实施方案中，所述O6大分子是包含支链Glc单糖(O6Glc)的O6大分子。
在另一个具体实施方案中，本文提供了包含以下中的至少两种的组合物(例如药物组合物)：(i)O25(例如O25A或O25B)大分子或包含O25(例如O25A或O25B)的生物缀合物；(ii)O1大分子或包含O1的生物缀合物；(iii)O2或包含O2的生物缀合物；和/或(iv)O6大分子(例如包含支链Glc单糖或支链GlcNAc单糖的O6大分子)或包含O6的生物缀合物。在一个具体实施方案中，所述O25大分子是O25B大分子。在另一个具体实施方案中，所述O1大分子是O1A。在另一个具体实施方案中，所述O1大分子是O1B。在另一个具体实施方案中，所述O1大分子是O1C。在另一个具体实施方案中，所述O6大分子是包含支链Glc单糖的O6大分子(在本文中也称为O6Glc)。
在另一个具体实施方案中，本文提供了包含O25B大分子、O1A大分子、O2大分子和包含支链Glc单糖的O6大分子的组合物(例如药物组合物)。在某些实施方案中，所述大分子缀合至载体蛋白。
在另一个方面，本文提供了预防个体(例如人类个体)的ExPEC感染的方法，其包括向该个体施用药学上有效量的本文描述的组合物(例如免疫原性组合物)。参见部分5.7。
在另一个方面，本文提供了治疗个体(例如人类个体)的感染的方法，其中该个体感染ExPEC，所述方法包括向该个体施用药学上有效量的本文描述的组合物(例如免疫原性组合物)。参见部分5.7。
在另一个方面，本文提供了诱导个体(例如人类个体)的针对ExPEC的免疫反应的方法，其包括向该个体施用药学上有效量的本文描述的组合物(例如免疫原性组合物)。参见部分5.7。
在另一个方面，本文提供了诱导在个体(例如人类个体)中产生针对ExPEC的调理吞噬抗体的方法，其包括向该个体施用药学上有效量的本文描述的组合物(例如免疫原性组合物)。参见部分5.7。
术语和缩写：
OPS：O多糖；革兰氏阴性细菌的O抗原。OPS在本文中也称为O抗原。
rfb簇：编码能够合成O抗原骨架结构的酶机构的基因簇(例如大肠杆菌基因簇)。术语rfb簇可适用于任一O抗原生物合成簇，包括来自不属于埃希氏菌属的细菌的那些。
waaL：编码具有位于周质中的活性位点的膜结合酶的O抗原连接酶基因。所编码酶将十一异戊二烯基磷酸酯(UPP)结合的O抗原转移至脂质A核心，形成脂多糖。
wecA：wec簇中编码的第一基因。所编码蛋白催化GlcNAc磷酸酯从UDP-GlcNAc至UPP的转移以形成UPP结合的GlcNAc。
ECA：肠杆菌普通抗原。
RU：重复单元。如本文所使用，RU设定为等于生物重复单元BRU。BRU描述O抗原的RU，因为该抗原在体内合成。
UPP：十一异戊二烯基焦磷酸酯。
LLO：脂质连接的寡糖。
2AB：2胺基苯甲酰胺。
MS：质谱。
O25B：术语O25B是指来自本文鉴定的大肠杆菌的O25B抗原(大肠杆菌血清型O25的亚血清型)。本文提及的O25B涵盖上文鉴定的式O25B和式O25B’。
O25A：术语O25A是指大肠杆菌的O25A抗原(大肠杆菌血清型O25的亚血清型)。本文提及的O25A涵盖上文鉴定的式O25A和式O25A’。
O1A：术语O1A是指大肠杆菌的O1A抗原(大肠杆菌血清型O1的亚血清型)。本文提及的O1A涵盖上文鉴定的式O1A和式O1A’。
O1B：术语O1B是指大肠杆菌的O1B抗原(大肠杆菌血清型O1的亚血清型)。本文提及的O1B涵盖上文鉴定的式O1B和式O1B’。
O1C：术语O1C是指大肠杆菌的O1C抗原(大肠杆菌血清型O1的亚血清型)。本文提及的O1C涵盖上文鉴定的式O1C和式O1C’。
O2：术语O2是指大肠杆菌的O2抗原(大肠杆菌血清型O2)。本文提及的O2涵盖上文鉴定的式O2和式O2’。
O6：术语O6是指大肠杆菌的O6抗原(大肠杆菌血清型O6)。本文提及的O6A涵盖上文鉴定的式O6A和式O6A’。
生物缀合物：术语生物缀合物是指在宿主细胞背景中制备的蛋白(例如载体蛋白)和抗原(例如O抗原(例如O25B))之间的缀合物，其中宿主细胞机构将抗原连接至蛋白(例如N-连接)。糖缀合物包括生物缀合物以及通过其它方式(例如通过蛋白和糖抗原的化学连接)制备的糖抗原(例如寡糖和多糖)-蛋白缀合物。
当结合数值使用时，术语"约"是指在所提及数值的±1、±5或±10%内的任一数值。
如本文所使用，在向个体施用治疗剂(例如本文描述的组合物)的背景中，术语"有效量"是指具有预防和/或治疗效应的治疗剂的量。在某些实施方案中，"有效量"是指足以实现一种、两种、三种、四种或更多种以下效应的治疗剂的量：(i)降低或改善ExPEC感染或与其相关的症状的严重度；(ii)缩短ExPEC感染或与其相关的症状的持续时间；(iii)预防ExPEC感染或与其相关的症状的进展；(iv)引起ExPEC感染或与其相关的症状的消退；(v)预防ExPEC感染或与其相关的症状的发生或发作；(vi)预防ExPEC感染或与其相关的症状的复发；(vii)减少与ExPEC感染相关的器官衰竭；(viii)减少患有ExPEC感染的个体的住院；(ix)缩短具有ExPEC感染的个体的住院长度；(x)提高具有ExPEC感染的个体的存活；(xi)消除个体的ExPEC感染；(xii)抑制或减少个体中的ExPEC复制；和/或(xiii)增强或改善另一治疗的预防或治疗效应。
如本文所使用，在向个体施用两种或更多种治疗的语境中，术语"组合"是指使用不止一种治疗。术语"组合"的使用不限制向个体施用治疗的顺序。例如，第一治疗(例如本文描述的组合物)可在向个体施用第二治疗之前(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之前)、与其同时或之后(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之后)施用。
如本文所使用，术语"个体"是指动物(例如鸟类、爬行动物和哺乳动物)。在另一个实施方案中，个体是哺乳动物，包括非灵长类动物(例如骆驼、驴、斑马、牛、猪、马、山羊、绵羊、猫、狗、大鼠和小鼠)和灵长类动物(例如猴、黑猩猩和人)。在某些实施方案中，个体是非人动物。在一些实施方案中，个体是农场动物或宠物(例如狗、猫、马、山羊、绵羊、猪、驴或鸡)。在另一个实施方案中，个体是人。在另一个实施方案中，个体是人类婴儿。在另一个实施方案中，个体是人类儿童。在另一个实施方案中，个体是人类成人。在另一个实施方案中，个体是老人。在另一个实施方案中，个体是早产人类婴儿。术语"个体"和"患者"在本文中可互换使用。
如本文所使用，术语"早产人类婴儿"是指在少于37周孕龄时出生的人类婴儿。
如本文所使用，术语"人类婴儿"是指新生儿至1岁人。
如本文所使用，术语"人类幼儿"是指1岁至3岁的人。
如本文所使用，术语"人类儿童"是指1岁至18岁的人。
如本文所使用，术语"人类成人"是指18岁或以上的人。
如本文所使用，术语"老人"是指65岁或以上的人。
4. 附图简述
图1：用于O25A生物合成的途径。箭头指示个别酶转化，指示酶名称。在细胞质中通过O抗原簇中提供的酶或通过革兰氏阴性宿主细胞的管家酶来制备核苷酸活化的糖。糖基磷酸酯转移酶(WecA)将D-GlcNAc磷酸酯添加至十一异戊二烯基磷酸酯(UP)上，从而形成GlcNAc-UPP。特异性糖基转移酶然后通过添加单糖来进一步伸长UPP-GlcNAc分子，从而形成生物重复单元(BRU)寡糖(WekABC WbuB)。所指示的酶的顺序不是指在BRU合成期间的事件序列(通过< >指示)。BRU然后通过Wzx翻转至周质间隙中。Wzy线性聚合周质BRU以形成O抗原多糖。通过Wzz控制聚合物长度。许多细菌寡糖和多糖组装于UPP上且然后转移至其它分子，即，UPP是用于细菌中的寡糖和多糖的一般构建平台。在大肠杆菌和大部分其它革兰氏阴性细菌中，O抗原通过大肠杆菌酶WaaL从UPP转移至脂质A核心以形成脂多糖(LPS)。
图2：通过大肠杆菌O25A rfb簇和O抗原例举的用于wzx/wzy依赖性O抗原合成的rfb簇、结构和途径。A. 显示位于galF和gnd基因之间的大肠杆菌菌株E47a的rfb簇结构。基因显示为箭头且根据基因产物的功能指示填充：黑色是用于核苷酸活化的单糖生物合成的基因，其不是大肠杆菌的管家谱(那些在基因组中的别处编码)的一部分，黑色/白色斜条纹是负责将单一单糖单元添加至BRU、翻转酶wzx和聚合酶wzy的糖基转移酶。B. 如呈现的O25A O抗原的BRU的化学结构(参见Fundin等人，2003, Magnetic Resonance inChemistry 41,4)。
图3. A. O25A、O25B和O16 BRU结构。B. O25A、O25B和O16之间的O抗原生物合成簇(rfb簇)比较。黑色填充基因是参与核苷酸活化的单糖生物合成的基因，斜条纹是预测的糖基转移酶基因，灰色填充指示BRU处理或转运基因，且垂直条纹显示O-乙酰基转移酶同源性。灰色框指示基因之间高于25%的同源性评分；指示了详细值。黑色和灰色细箭头显示用于wzy(O25A和O25B特异性)和O25B 3’区域(O25B特异性)的分型PCR寡核苷酸的退火位置。
图4. 来自流行病学研究的血清型分布。根据发生率对社区获得性UTI样品中鉴定的大肠杆菌O抗原血清型进行分组。
图5. 来自具有O25阳性凝集表型的临床分离物的LPS的银染色和Western染色分析。菌株编号指示于凝胶泳道上方。生长单独的克隆且通过离心收获OD均一化的生物质。将沉淀溶解于SDS PAGE Lämmli缓冲液中且使用蛋白酶K处理以水解样品中的所有蛋白。将标准银染色应用于A中显示的PAGE凝胶，且在B中显示用商业O25凝集抗血清探测来自相同运行凝胶的含有电转移材料的硝基纤维素膜。
图6. O25A和O25B样品的2AB HPLC痕迹。制备来自菌株upec138(虚线)和upec436(实线)的2AB标记的LLO样品。收集各峰且通过箭头指示从图7中详述的MS/MS片段化模式推断的相应BRU结构。
图7.在母体离子m/z=1022(A；来自菌株upec138)或m/z=1021(B；来自upec_436)的50’和62’洗脱时间下从图6中所指示峰获得的MS/MS片段化离子系列。相对于假设BRU的图来显示离子系列。
图8. 源自O25B阳性临床分离物的2AB标记的LLO样品的去乙酰化。收集从具有O25B基因型的临床分离物的2AB标记的LLO获得的50’洗脱时间下的O25B特异性峰，且在使用(实线)或不使用(虚线)NaOH处理用于ND Cal的Special Patent Program O-乙酰基的水解之后通过正相HPLC来进行分析。
图9. O25A和O25B生物缀合物的单糖组成分析。产生O25生物缀合物，纯化，且处理用于单糖组成分析。显示样品的C18 HPLC痕迹。将源自O25A(实线)和O25B(虚线)的样品与来自商业来源的单糖混合物(Glc、GlcNAc、Rha、FucNAc)进行比较。单糖的洗脱时间由箭头指示。
图10. O25A生物缀合物的表征。通过SDS PAGE分析4S-EPA-O25A生物缀合物的纯化的最终主体(bulk)且通过直接考马斯染色(C)和Western印迹使用抗EPA抗血清或抗O25抗血清观察。
图11. O25B生物缀合物的表征。通过SDS PAGE分析4S-EPA-O25B生物缀合物的纯化的最终主体且通过直接考马斯染色(C)和Western印迹使用抗EPA抗血清或抗O25抗血清观察。
图12. O1 O抗原基因生物合成和化学结构。A. 显示O1A菌株大肠杆菌G1632(登录号：GU299791)的rfb簇和侧翼基因。黑色、灰色和条纹色代码与上文对于图2描述的那些是相同的。B. 显示O1亚血清型的化学BRU结构。
图13. 来自含有O1阳性凝集表型的临床分离物的LPS的分析。A.银染色和B.使用抗O1抗血清的Western印迹。
图14. O1临床分离物中的O1A的鉴定。通过LLO指纹分析来分析来自O1临床分离物的2AB标记的LLO样品。A. 显示从60’开始的正相HPLC痕迹。使每一样品的基线移位以观察共迁移峰。upec编号指示临床菌株。B. m/z=1849.6(Na+加合物)的MS/MS片段化离子系列。该图指示O1A的2 BRU的寡糖中的片段化离子模式和可能的糖苷键断裂。
图15. O1生物缀合物。通过用EPA表达质粒(pGVXN659)和以下5种不同pglB表达质粒转化的大肠杆菌细胞(W3110 △rfbO16：：rfbO1 △waaL)进行的EPA-O1糖蛋白的小规模表达测试：A，p114：表达未密码子优化的含有HA标签的pglB；B，p939：密码子优化的含有HA标签的pglB；C，p970：密码子优化的去除HA标签的pglB；D，密码子优化的含有HA标签的去除天然糖基化位点N534Q的pglB；和E，密码子优化的去除HA标签、去除天然糖基化位点N534Q的pglB。生长细胞且使用阿拉伯糖和IPTG诱导，在37℃下过夜温育之后，收获细胞且制备周质蛋白提取物。然后通过SDS PAGE分离提取物，通过电印迹转移至硝基纤维素膜，且使用抗EPA血清进行免疫检测。
图16. 用抗O1血清检测的图15中描述的生物缀合物。
图17. O6基因和化学结构。A. 大肠杆菌CFT073(Genbank AE014075.1)的O抗原生物合成簇(rfb簇)和侧翼基因。指示根据BLAST的假设基因功能且指示O6 O抗原生物合成的特异性基因。B. 报道的O6 BRU结构的化学结构(Jann等人，Carbohydr. Res. 263 (1994)217-225)。
图18. 具有支链Glc的O6的鉴定。通过LLO指纹分析来分析来自O6临床分离物的2AB标记LLO样品。A. 显示从60’开始的正相HPLC痕迹。从含有Glc和GlcNAC支链的参考菌株CCUG11309(细实线)和11311(虚线)制备提取物。重叠图显示指示BRU的洗脱时间的显著差异。B. 将如由upec编号所指示的来自临床分离物的提取物与来自A的参考菌株进行比较。
图19. O2 O抗原基因生物合成和化学结构。A. 菌株大肠杆菌G1674(登录号：GU299792)的O抗原生物合成簇(rfb簇)和侧翼基因。黑色、灰色和条纹色代码如先前图(例如图2)中所描述。B. O2抗原的化学BRU结构。
图20. 来自具有O2阳性凝集表型的临床分离物的LPS的分析。A. 银染色。B. 使用抗O2抗血清的Western印迹。
图21. 来自菌株W3110 △waaL △rfbW3110：：rfbO2 △wekS的OPS分析。显示通过正相HPLC进行的2AB标记的LLO分析的色谱图。
图22. 通过抗O25A和抗O25B MBP抗血清在Western印迹分析中识别O25A和O25BLPS。在电转移从upec436(O25A)和upec138(O25B)制备的LPS样品之后获得且通过SDS-PAGE分离的两种硝基纤维素膜。两种膜的上样模式是相同的，左泳道：来自upec438的O25A LPS，中间泳道：来自upec138的O25B LPS。使用MBP生物缀合物用于免疫兔。左图：抗O25B-MBP抗血清；右图：抗O25A-MBP抗血清。
图23. O2 OPS BRU的MS/MS光谱。来自菌株CCUG25的2AB标记的LLO提取物的43.5min时的洗脱峰的具有m/z=989.4的Na+加合物的MS/MS光谱。指示O2 BRU图和相关Y离子系列，从而证实预期单糖序列。
图24. 含有临床前研究中使用的O1A、O2和O6抗原的EPA生物缀合物。产生OPS聚糖并纯化，且通过SDS PAGE进行分析并通过考马斯染色进行观察。
图25显示用来自用O1A-EPA(G1)、仅载体蛋白(G10)、TBS(G11)或由EPA-O1A、O2、O6Glc和O25B(G12)构成的四价组合物免疫的大鼠的血清获得的平均ELISA滴度，其针对使用从菌株upec032纯化的O1A-LPS包被的ELISA板进行探测。
图26显示用来自用O2A-EPA(G4)、仅载体蛋白(G10)、TBS(G11)或由EPA-O1A、O2、O6Glc和O25B(G12)构成的四价组合物免疫的大鼠的血清获得的平均ELISA滴度，其针对使用从菌株CCUG25纯化的O2 LPS包被的ELISA板进行探测。
图27显示用来自用O6Glc-EPA(G7)、仅载体蛋白(G10)、TBS(G11)或由EPA-O1A、O2、O6Glc和O25B(G12)构成的四价组合物免疫的大鼠的血清获得的平均ELISA滴度，其针对使用从菌株CCUG11309纯化的O6Glc-LPS包被的ELISA板进行探测。
图28显示用来自用O25B-EPA(G9)、仅载体蛋白(G10)、TBS(G11)或由O1A、O2、O6Glc和O25B(G12)构成的四价组合物免疫的大鼠的血清获得的平均ELISA滴度，其针对使用从菌株upec177纯化的O25B-LPS包被的ELISA板进行探测。
图29：源自免疫前(空心圆)相比于免疫后42天(实心正方形)的大鼠的血清的调理指数，其中用一个引发剂量和两个加强剂量的指示剂量的单价疫苗免疫。(A)O2-EPA免疫；(B)O6-EPA免疫；(C)O25B-EPA免疫。
图30：用来自用包含大肠杆菌抗原O1A、O2、O6Glc和O25B的四价疫苗接种疫苗的人类个体的血清获得的ELISA滴度。仅在接种疫苗组中观察到在注射后(在注射之后30天)和注射前(第1天)之间ELISA滴度的显著增加(*代表统计学显著性)。
图31：用来自用包含大肠杆菌抗原O1A、O2、O6Glc和O25B的四价疫苗接种疫苗的人类个体的血清获得的调理指数(OI)。描绘免疫反应，如由在注射之前和之后针对安慰剂和四价疫苗的组分(O1A-EPA(31A)、O2-EPA(31B)、O6Glc-EPA(31C)和O25B-EPA(31D))的OI所指示。注射前(定义为第1天)由V2(拜访2)代表，且注射后(定义为第30天)由V4(拜访4)代表。仅在接种疫苗组中观察到在注射后和注射前之间OI的显著增加(由*指示，其中多个*代表增加的显著性程度)。NS：无显著差异。
图32：在第1天(接种疫苗前)和在30天之后(接种疫苗后)来自接种疫苗个体的血清针对O25A LPS(黑条)和O25B LPS(灰条)的ELISA滴度(表示为EC50值)。观察到在两种血清型：O25A LPS(黑条)和O25B LPS(灰条)中在注射后(在注射之后30天)和注射前(第1天)之间ELISA滴度的统计学显著增加。
图33：来自接种疫苗个体的血清针对表达O25A(黑线)和O25B(灰线)的大肠杆菌菌株的反应性。虚灰线：血清型O75菌株，阴性对照。图33显示，来自接种疫苗个体的疫苗诱导的血清IgG抗体对O25A和O25B菌株强烈反应。
5. 详述
本文公开了大肠杆菌抗原O25B的结构以及O25B的用途、制备O25B的方法和包含O25B的生物缀合物。申请人已鉴定出负责产生O25B的大肠杆菌基因簇且充分表征O25B抗原的结构。因此，本文提供了能够在宿主细胞中产生O25B的核酸。本文还提供了包含能够产生O25B的核酸的宿主细胞(例如重组工程改造的宿主细胞)。此类宿主细胞可用于生成包含连接至载体蛋白的O25B的生物缀合物，所述生物缀合物可用于(例如)配制治疗剂(例如疫苗)。本文描述的O25B抗原也可用于生成抗体，所述抗体可用于(例如)治疗方法，诸如个体的被动免疫中。本文还提供了包含O25B(单独或与其它大肠杆菌抗原(例如O1、O2和O6和其亚血清型)组合)的组合物，所述组合物用于治疗方法中，例如对宿主接种疫苗以抵抗大肠杆菌(例如尿路病原性大肠杆菌)感染。
5.1 核酸和蛋白
在一个方面，本文提供了与O25B产生相关的分离核酸，例如编码大肠杆菌O25B rfb簇的一种或多种蛋白的核酸。本领域技术人员应理解，由于遗传代码的简并性，具有特异性氨基酸序列的蛋白可由多种不同核酸编码。因此，本领域技术人员应理解，本文提供的核酸可以其序列不同于本文提供的序列的方式进行改变，而不影响由核酸编码的蛋白的氨基酸序列。
在一个具体实施方案中，本文提供了编码大肠杆菌O25B rfb簇的核酸。在一个具体实施方案中，本文提供了编码大肠杆菌rfb(upec138)基因簇的核酸(SEQ ID NO: 12)。在另一个具体实施方案中，本文提供了编码与SEQ ID NO: 12约75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源的基因簇的核酸。Upec138是O25B血清型的大肠杆菌菌株的一个实例。技术人员认识到，现在可容易地从临床分离物根据本文描述的方法获得来自该血清型的其它菌株，且此类其它菌株的实例是upec177和upec163。因此，在本文中提及此类O25B菌株的rfb基因簇或来自该簇的个别基因的任何地方，其旨在包括来自其它O25B菌株的相应基因簇或基因。此外，可通过对来自此类其它分离物的rfb基因簇或（如果需要）个别基因进行测序来发现提供的序列，且提供编码同源蛋白的同源序列作为基因簇或基因。在通过提及具有特定百分比的基因簇或基因来提及同源基因簇或基因的任何实施方案中，此类同源序列优选编码具有与来自参考菌株或序列的功能相同的功能的蛋白。
在另一个具体实施方案中，本文提供了编码大肠杆菌O25B rfb簇的核酸。在一个具体实施方案中，本文提供了编码大肠杆菌rfb(upec163)基因簇的核酸。在另一个具体实施方案中，本文提供了编码与大肠杆菌rfb(upec163)基因簇约75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源的基因簇的核酸。
在另一个具体实施方案中，本文提供了编码大肠杆菌O25B rfb簇的核酸。在一个具体实施方案中，本文提供了编码大肠杆菌rfb(upec177)基因簇的核酸。在另一个具体实施方案中，本文提供了编码与大肠杆菌rfb(upec177)基因簇约75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源的基因簇的核酸。
在另一个实施方案中，本文提供了编码大肠杆菌O25B rfb簇的蛋白的核酸。
在一个具体实施方案中，本文提供的编码大肠杆菌O25B rfb簇的蛋白的核酸包含SEQ ID NO: 1(大肠杆菌O25B rfb簇的rmlB基因)或由其组成。在另一个具体实施方案中，本文提供的编码大肠杆菌O25B rfb簇的蛋白的核酸与SEQ ID NO:1 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源。
在一个具体实施方案中，本文提供的编码大肠杆菌O25B rfb簇的蛋白的核酸包含SEQ ID NO: 2(大肠杆菌O25B rfb簇的rmlD基因)或由其组成。在另一个具体实施方案中，本文提供的编码大肠杆菌O25B rfb簇的蛋白的核酸与SEQ ID NO:2 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源。
在一个具体实施方案中，本文提供的编码大肠杆菌O25B rfb簇的蛋白的核酸包含SEQ ID NO: 3(大肠杆菌O25B rfb簇的rmlA基因)或由其组成。在另一个具体实施方案中，本文提供的编码大肠杆菌O25B rfb簇的蛋白的核酸与SEQ ID NO:3 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源。
在一个具体实施方案中，本文提供的编码大肠杆菌O25B rfb簇的蛋白的核酸包含SEQ ID NO: 4(大肠杆菌O25B rfb簇的rmlC基因)或由其组成。在另一个具体实施方案中，本文提供的编码大肠杆菌O25B rfb簇的蛋白的核酸与SEQ ID NO:4 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源。
在一个具体实施方案中，本文提供的编码大肠杆菌O25B rfb簇的蛋白的核酸包含SEQ ID NO: 5(大肠杆菌O25B rfb簇的wzx基因)或由其组成。在另一个具体实施方案中，本文提供的编码大肠杆菌O25B rfb簇的蛋白的核酸与SEQ ID NO:5 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源。
在一个具体实施方案中，本文提供的编码大肠杆菌O25B rfb簇的蛋白的核酸包含SEQ ID NO: 6(大肠杆菌O25B rfb簇的wekA基因)或由其组成。在另一个具体实施方案中，本文提供的编码大肠杆菌O25B rfb簇的蛋白的核酸与SEQ ID NO:6 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源。
在一个具体实施方案中，本文提供的编码大肠杆菌O25B rfb簇的蛋白的核酸包含SEQ ID NO: 7(大肠杆菌O25B rfb簇的wekB基因)或由其组成。在另一个具体实施方案中，本文提供的编码大肠杆菌O25B rfb簇的蛋白的核酸与SEQ ID NO:7 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源。
在一个具体实施方案中，本文提供的编码大肠杆菌O25B rfb簇的蛋白的核酸包含SEQ ID NO: 8(大肠杆菌O25B rfb簇的wzy基因)或由其组成。在另一个具体实施方案中，本文提供的编码大肠杆菌O25B rfb簇的蛋白的核酸与SEQ ID NO:8 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源。
在一个具体实施方案中，本文提供的编码大肠杆菌O25B rfb簇的蛋白的核酸包含SEQ ID NO: 9(大肠杆菌O25B rfb簇的wbbJ基因)或由其组成。在另一个具体实施方案中，本文提供的编码大肠杆菌O25B rfb簇的蛋白的核酸与SEQ ID NO:9 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源。
在一个具体实施方案中，本文提供的编码大肠杆菌O25B rfb簇的蛋白的核酸包含SEQ ID NO: 10(大肠杆菌O25B rfb簇的wbbK基因)或由其组成。在另一个具体实施方案中，本文提供的编码大肠杆菌O25B rfb簇的蛋白的核酸与SEQ ID NO:10 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源。
在一个具体实施方案中，本文提供的编码大肠杆菌O25B rfb簇的蛋白的核酸包含SEQ ID NO: 11(大肠杆菌O25B rfb簇的wbbL基因)或由其组成。在另一个具体实施方案中，本文提供的编码大肠杆菌O25B rfb簇的蛋白的核酸与SEQ ID NO:11 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源。
在另一个方面，本文提供了由本文提供的核酸编码的蛋白。在一个具体实施方案中，本文提供了由SEQ ID NO: 1编码的dTDP-葡萄糖4,6-脱水酶。在另一个具体实施方案中，本文提供了由SEQ ID NO: 2编码的dTDP-6-脱氧-D-葡萄糖3,5-差向异构酶。在另一个具体实施方案中，本文提供了由SEQ ID NO: 3编码的葡萄糖-1-磷酸胸苷基转移酶。在另一个具体实施方案中，本文提供了由SEQ ID NO: 4编码的dTDP-4-脱氢鼠李糖3,5-差向异构酶。在另一个具体实施方案中，本文提供了由SEQ ID NO: 5编码的O抗原翻转酶。在另一个具体实施方案中，本文提供了由SEQ ID NO: 6编码的dTDP-Rha: Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPPα-1,3-鼠李糖基转移酶。在另一个具体实施方案中，本文提供了由SEQ ID NO: 7编码的UDP-Glc: Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP β-1,6-葡萄糖基转移酶。在另一个具体实施方案中，本文提供了由SEQ ID NO: 8编码的O抗原聚合酶。在另一个具体实施方案中，本文提供了由SEQ ID NO: 9编码的O-乙酰基转移酶。在另一个具体实施方案中，本文提供了由SEQ IDNO: 10编码的UDP-Glc: Rha-GlcNAc-UPP α-1,3-葡萄糖基转移酶。在另一个具体实施方案中，本文提供了由SEQ ID NO: 11编码的dTDP-Rha: GlcNAc-UPP α-1,3-鼠李糖基转移酶。
5.2 大肠杆菌O抗原
在一个方面，本文提供了O25、O1、O2和O6血清型的分离大肠杆菌抗原。
在一个具体实施方案中，本文提供了来自大肠杆菌菌株 upec 138的分离O抗原。在另一个具体实施方案中，本文提供了来自大肠杆菌菌株upec163的分离O抗原。在另一个具体实施方案中，本文提供了来自大肠杆菌菌株upec177的分离O抗原。
在另一个具体实施方案中，本文提供了式O25B的分离大肠杆菌O25B抗原：
。
在另一个具体实施方案中，本文提供了式O25B’的分离大肠杆菌O25B抗原：
。
在另一个方面，本文提供了下文呈现的式O25B的分离大分子的群体：
,
其中n是1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之间的整数。在一个具体实施方案中，群体中至少80%的大分子的n在1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之间。
在另一个方面，本文提供了下文呈现的式O25B’的分离大分子的群体：
,
其中n是1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之间的整数。在一个具体实施方案中，群体中至少80%的大分子的n在1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之间。
可用于本文描述的组合物(例如治疗组合物，例如疫苗；参见部分5.6)中的其它大肠杆菌抗原包括O25A以及O1、O2和O6抗原和其亚血清型。
在一个实施方案中，将O25A抗原(例如，呈分离形式或作为生物缀合物的一部分)用于本文提供的组合物中(例如，与O25B抗原(或包含O25B抗原的生物缀合物)组合)。在一个具体实施方案中，O25A抗原是式O25A：
在另一个具体实施方案中，O25A抗原是式O25A’：
。
在一个实施方案中，将O1A抗原(例如，呈分离形式或作为生物缀合物的一部分)用于本文提供的组合物中(例如，与O25B抗原(或包含O25B抗原的生物缀合物)组合)。在一个具体实施方案中，O1A抗原是式O1A：
在另一个具体实施方案中，O1A抗原是式O1A’：
。
在一个实施方案中，将O1B抗原(例如，呈分离形式或作为生物缀合物的一部分)用于本文提供的组合物中(例如，与O25B抗原(或包含O25B抗原的生物缀合物)组合)。在一个具体实施方案中，O1B抗原是式O1B：
在另一个具体实施方案中，O1B抗原是式O1B’：
。
在一个实施方案中，将O1C抗原(例如，呈分离形式或作为生物缀合物的一部分)用于本文提供的组合物中(例如，与O25B抗原(或包含O25B抗原的生物缀合物)组合)。在一个具体实施方案中，O1C抗原是式O1C：
在另一个具体实施方案中，O1C抗原是式O1C’：
。
在一个实施方案中，将O2抗原(例如，呈分离形式或作为生物缀合物的一部分)用于本文提供的组合物中(例如，与O25B抗原(或包含O25B抗原的生物缀合物)组合)。在一个具体实施方案中，O2抗原是式O2：
在另一个具体实施方案中，O2抗原是式O2’：
。
在一个实施方案中，将O6抗原(例如，呈分离形式或作为生物缀合物的一部分)用于本文提供的组合物中(例如，与O25B抗原(或包含O25B抗原的生物缀合物)组合)。在一个具体实施方案中，O6抗原是式O6K2(在本文中也称为O6Glc)：
在另一个具体实施方案中，O6抗原是式O6K2’(在本文中也称为O6Glc’)：
在另一个具体实施方案中，O6抗原是式O6K54(在本文中也称为O6GlcNAc)：
在另一个具体实施方案中，O6抗原是式O6K54’(在本文中也称为O6GlcNAc’)：
。
5.3 宿主细胞
本文提供了能够产生大肠杆菌O抗原和包含此类大肠杆菌O抗原的生物缀合物的宿主细胞(例如原核宿主细胞)。在某些实施方案中，本文提供的宿主细胞包含(例如天然或经由基因工程改造的)一种或多种本文描述的核酸。参见部分5.1。在某些实施方案中，本文提供的宿主细胞产生一种或多种本文描述的大肠杆菌O抗原，和/或产生包含一种或多种本文描述的大肠杆菌O抗原的生物缀合物。参见部分5.2。
在一个方面，本文提供了包含编码能够产生本文公开的新颖多糖大肠杆菌O25B的酶(例如糖基转移酶)的核酸的原核宿主细胞。本文还提供了包含编码能够产生其它大肠杆菌抗原(例如O25A、O1、O2和O6和其亚血清型)的酶(例如糖基转移酶)的核酸的宿主细胞(参见部分5.2)。本文提供的宿主细胞可天然表达能够产生目标O抗原的核酸，或可使宿主细胞表达此类核酸，即，在某些实施方案中，所述核酸对宿主细胞是异源的且使用本领域已知的遗传方法引入宿主细胞中。在某些实施方案中，本文提供的宿主细胞包含编码在蛋白的N-糖基化中有活性的额外酶的核酸，例如，本文提供的宿主细胞还可包含编码寡糖基转移酶的核酸或编码其它糖基转移酶的核酸。例如参见部分5.3.3。在某些实施方案中，本文提供的宿主细胞包含编码载体蛋白(例如可附接至寡糖和多糖以形成生物缀合物的蛋白)的核酸。参见例如部分5.3.2(关于载体蛋白的描述)和部分5.4(关于生物缀合物的描述)。在一个具体实施方案中，宿主细胞为大肠杆菌。
Upec138是在本文中鉴定为属于O25B血清型的大肠杆菌菌株，且该菌株(和通常O25B血清型的菌株)的rfb基因簇已在本文中首次鉴定为包含产生新颖大肠杆菌多糖O25B的基因。在一个具体实施方案中，本文提供了包含大肠杆菌rfb(upec138)基因簇(SEQ IDNO: 12)或与SEQ ID NO: 12约或至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源的基因簇的原核宿主细胞。在一个具体实施方案中，通过基因操纵将大肠杆菌rfb(upec138)基因簇(SEQ ID NO: 12)引入宿主细胞中(例如，使基因簇表达于一种或多种质粒上或整合至宿主细胞基因组中(参见例如国际专利申请号PCT/EP2013/068737))。在另一个具体实施方案中，原核宿主细胞包含编码寡糖基转移酶的核酸序列。在另一个具体实施方案中，原核宿主细胞还包含编码以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQ ID NO: 14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X和Z独立地选自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQ ID NO:15)(参见WO 2006/119987)。在另一个具体实施方案中，rfb簇的一些或所有基因对宿主细胞是异源的。在另一个具体实施方案中，所述寡糖基转移酶对宿主细胞是异源的。在另一个具体实施方案中，所述载体蛋白对宿主细胞是异源的。在一个具体实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌。
Upec163是在本文中鉴定为属于O25B血清型的大肠杆菌菌株，且该菌株(和通常O25B血清型的菌株)的rfb基因簇已在本文中首次鉴定为包含产生新颖大肠杆菌多糖O25B的基因。在另一个具体实施方案中，本文提供了包含大肠杆菌rfb(upec163)基因簇或与大肠杆菌rfb(upec163)基因簇约或至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源的基因簇的原核宿主细胞。在一个具体实施方案中，通过基因操纵将大肠杆菌rfb(upec163)基因簇引入宿主细胞中(例如，使基因簇表达于一种或多种质粒上或整合至宿主细胞基因组中(参见例如国际专利申请号PCT/EP2013/068737))。在另一个实施方案中，原核宿主细胞包含编码寡糖基转移酶的核酸序列。在另一个具体实施方案中，原核宿主细胞还包含编码以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQ ID NO: 14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X和Z独立地选自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQ ID NO: 15)(参见WO 2006/119987)。在另一个具体实施方案中，rfb簇的一些或所有基因对宿主细胞是异源的。在另一个具体实施方案中，所述寡糖基转移酶对宿主细胞是异源的。在另一个具体实施方案中，所述载体蛋白对宿主细胞是异源的。在一个具体实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌。
Upec177是在本文中鉴定为属于O25B血清型的大肠杆菌菌株，且该菌株(和通常O25B血清型的菌株)的rfb基因簇已在本文中首次鉴定为包含产生新颖大肠杆菌多糖O25B的基因。在另一个具体实施方案中，本文提供了包含大肠杆菌rfb(upec177)基因簇或与大肠杆菌rfb(upec177)基因簇约或至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源的基因簇的原核宿主细胞。在一个具体实施方案中，通过基因操纵将大肠杆菌rfb(upec177)基因簇引入宿主细胞中(例如，使基因簇表达于一种或多种质粒上或整合至宿主细胞基因组中(参见例如国际专利申请号PCT/EP2013/068737))。在另一个实施方案中，原核宿主细胞包含编码寡糖基转移酶的核酸序列。在另一个具体实施方案中，原核宿主细胞还包含编码以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQ ID NO: 14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X和Z独立地选自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQ ID NO: 15)(参见WO 2006/119987)。在另一个具体实施方案中，rfb簇的一些或所有基因对宿主细胞是异源的。在另一个具体实施方案中，所述寡糖基转移酶对宿主细胞是异源的。在另一个具体实施方案中，所述载体蛋白对宿主细胞是异源的。在一个具体实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌。
在另一个具体实施方案中，本文提供了产生O25B的原核宿主细胞(例如，重组工程改造的原核宿主细胞)，其中所述宿主细胞包含rmlB、rmlD、rmlA、rmlC、wzx、wekA、wekB、wzy、wbbJ、wbbK和/或wbbL。可使用重组方法工程改造此类宿主细胞以包含一种或多种包含rmlB、rmlD、rmlA、rmlC、wzx、wekA、wekB、wzy、wbbJ、wbbK和/或wbbL基因的质粒。在某些实施方案中，将所述一种或多种质粒整合至宿主细胞基因组中。在一个具体实施方案中，所述rmlB包含SEQ ID NO:1或由其组成，或与SEQ ID NO:1 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源。在一个具体实施方案中，所述rmlD包含SEQ ID NO:2或由其组成，或与SEQ ID NO:2 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源。在一个具体实施方案中，所述rmlA包含SEQ ID NO:3或由其组成，或与SEQ ID NO:3 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源。在一个具体实施方案中，所述rmlC包含SEQ ID NO:4或由其组成，或与SEQ ID NO:4 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源。在一个具体实施方案中，所述wzx包含SEQ ID NO:5或由其组成，或与SEQ ID NO:5 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源。在一个具体实施方案中，所述wekA包含SEQ ID NO:6或由其组成，或与SEQ ID NO:6 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源。在一个具体实施方案中，所述wekB包含SEQ ID NO:7或由其组成，或与SEQ ID NO:7 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源。在一个具体实施方案中，所述wzy包含SEQ IDNO:8或由其组成，或与SEQ ID NO:8 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源。在一个具体实施方案中，所述wbbJ包含SEQ ID NO:9或由其组成，或与SEQ ID NO:975%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源。在一个具体实施方案中，所述wbbK包含SEQ ID NO:10或由其组成，或与SEQ ID NO:10 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源。在一个具体实施方案中，所述wbbL包含SEQ ID NO:11或由其组成，或与SEQID NO:11 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源。在另一个具体实施方案中，原核宿主细胞包含编码寡糖基转移酶的核酸序列。在另一个具体实施方案中，原核宿主细胞包含编码以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQ ID NO: 14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X和Z独立地选自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQ ID NO: 15)(参见WO 2006/119987)。在另一个具体实施方案中，基因rmlB、rmlD、rmlA、rmlC、wzx、wekA、wekB、wzy、wbbJ、wbbK和wbbL中的一些或所有对宿主细胞是异源的。在另一个具体实施方案中，所述寡糖基转移酶对宿主细胞是异源的。在另一个具体实施方案中，所述载体蛋白对宿主细胞是异源的。在一个具体实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌。
在另一个具体实施方案中，本文提供了产生O25B的原核宿主细胞(例如，重组工程改造的原核宿主细胞)，其中所述宿主细胞包含以下基因中的一个、两个、三个、四个或更多个(例如所有)(或与以下基因之一约或至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源且优选编码具有相同功能的蛋白的核酸)：rmlB (SEQ ID NO:1)、rmlD (SEQ ID NO:2)、rmlA (SEQ ID NO:3)、rmlC (SEQ ID NO:4)、wzx (SEQ ID NO:5)、wekA (SEQ ID NO:6)、wekB (SEQ ID NO:7)、wzy (SEQ ID NO:8)、wbbJ (SEQ ID NO:9)、wbbK (SEQ ID NO:10)和/或wbbL (SEQ ID NO:11)。在另一个具体实施方案中，原核宿主细胞包含编码寡糖基转移酶的核酸序列。在另一个具体实施方案中，原核宿主细胞还包含编码以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQ IDNO: 14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X和Z独立地选自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQ ID NO: 15)(参见WO 2006/119987)。在一个具体实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌。
在另一个具体实施方案中，本文提供了能够产生O25B和/或O25B生物缀合物(即连接至大肠杆菌O25B抗原的载体蛋白)的原核宿主细胞(例如，重组工程改造的原核宿主细胞)，其中所述宿主细胞天然包含或经工程改造以包含rmlB的核酸序列(SEQ ID NO:1)。在另一个具体实施方案中，本文提供了能够产生O25B和/或O25B生物缀合物(即连接至大肠杆菌O25B抗原的载体蛋白)的原核宿主细胞，其中所述宿主细胞天然包含或经工程改造以包含编码dTDP-葡萄糖4,6-脱水酶(例如，由rmlB编码的dTDP-葡萄糖4,6-脱水酶)的核酸序列。在另一个具体实施方案中，本文提供了能够产生O25B和/或O25B生物缀合物(即连接至大肠杆菌O25B抗原的载体蛋白)的原核宿主细胞，其中所述宿主细胞天然包含或经工程改造以包含与SEQ ID NO: 1约或至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核酸。在另一个具体实施方案中，原核宿主细胞包含编码寡糖基转移酶的核酸序列。在另一个具体实施方案中，原核宿主细胞还包含编码以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQ ID NO: 14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X和Z独立地选自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQ ID NO: 15)(参见WO 2006/119987)。在一个具体实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌。
在另一个具体实施方案中，本文提供了能够产生O25B和/或O25B生物缀合物(即连接至大肠杆菌O25B抗原的载体蛋白)的原核宿主细胞(例如，重组工程改造的原核宿主细胞)，其中所述宿主细胞天然包含或经工程改造以包含rmlD的核酸序列(SEQ ID NO:2)。在另一个具体实施方案中，本文提供了能够产生O25B和/或O25B生物缀合物(即连接至大肠杆菌O25B抗原的载体蛋白)的原核宿主细胞，其中所述宿主细胞天然包含或经工程改造以包含编码dTDP-6-脱氧-D-葡萄糖3,5-差向异构酶(例如，由rmlD编码的dTDP-6-脱氧-D-葡萄糖3,5-差向异构酶)的核酸序列。在另一个具体实施方案中，本文提供了能够产生O25B和/或O25B生物缀合物(即连接至大肠杆菌O25B抗原的载体蛋白)的原核宿主细胞，其中所述宿主细胞天然包含或经工程改造以包含与SEQ ID NO: 2至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核酸。在另一个具体实施方案中，原核宿主细胞包含编码寡糖基转移酶的核酸序列。在另一个具体实施方案中，原核宿主细胞还包含编码以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQ ID NO: 14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X和Z独立地选自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQ IDNO: 15)(参见WO 2006/119987)。在一个具体实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌。
在另一个具体实施方案中，本文提供了能够产生O25B和/或O25B生物缀合物(即连接至大肠杆菌O25B抗原的载体蛋白)的原核宿主细胞(例如，重组工程改造的原核宿主细胞)，其中所述宿主细胞天然包含或经工程改造以包含rmlA的核酸序列(SEQ ID NO:3)。在另一个具体实施方案中，本文提供了能够产生O25B和/或O25B生物缀合物(即连接至大肠杆菌O25B抗原的载体蛋白)的原核宿主细胞，其中所述宿主细胞天然包含或经工程改造以包含编码葡萄糖-1-磷酸胸苷基转移酶(例如，由rmlA编码的葡萄糖-1-磷酸胸苷基转移酶)的核酸序列。在另一个具体实施方案中，本文提供了能够产生O25B和/或O25B生物缀合物(即连接至大肠杆菌O25B抗原的载体蛋白)的原核宿主细胞，其中所述宿主细胞天然包含或经工程改造以包含与SEQ ID NO: 3至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核酸。在另一个具体实施方案中，原核宿主细胞包含编码寡糖基转移酶的核酸序列。在另一个具体实施方案中，原核宿主细胞还包含编码以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQ ID NO: 14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X和Z独立地选自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQ ID NO: 15)(参见WO 2006/119987)。在一个具体实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌。
在另一个具体实施方案中，本文提供了能够产生O25B和/或O25B生物缀合物(即连接至大肠杆菌O25B抗原的载体蛋白)的原核宿主细胞(例如，重组工程改造的原核宿主细胞)，其中所述宿主细胞天然包含或经工程改造以包含rmlC的核酸序列(SEQ ID NO:4)。在另一个具体实施方案中，本文提供了能够产生O25B和/或O25B生物缀合物(即连接至大肠杆菌O25B抗原的载体蛋白)的原核宿主细胞，其中所述宿主细胞天然包含或经工程改造以包含编码dTDP-4-脱氢鼠李糖3,5-差向异构酶(例如，由rmlC编码的dTDP-4-脱氢鼠李糖3,5-差向异构酶)的核酸序列。在另一个具体实施方案中，本文提供了能够产生O25B和/或O25B生物缀合物(即连接至大肠杆菌O25B抗原的载体蛋白)的原核宿主细胞，其中所述宿主细胞天然包含或经工程改造以包含与SEQ ID NO: 4至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核酸。在另一个具体实施方案中，原核宿主细胞包含编码寡糖基转移酶的核酸序列。在另一个具体实施方案中，原核宿主细胞还包含编码以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQ ID NO: 14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X和Z独立地选自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQ ID NO: 15)(参见WO 2006/119987)。在一个具体实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌。
在另一个具体实施方案中，本文提供了能够产生O25B和/或O25B生物缀合物(即连接至大肠杆菌O25B抗原的载体蛋白)的原核宿主细胞(例如，重组工程改造的原核宿主细胞)，其中所述宿主细胞天然包含或经工程改造以包含wzx的核酸序列(SEQ ID NO:5)。在另一个具体实施方案中，本文提供了能够产生O25B和/或O25B生物缀合物(即连接至大肠杆菌O25B抗原的载体蛋白)的原核宿主细胞，其中所述宿主细胞天然包含或经工程改造以包含编码O抗原翻转酶(例如由 wzx编码的O抗原翻转酶)的核酸序列。在另一个具体实施方案中，本文提供了能够产生O25B和/或O25B生物缀合物(即连接至大肠杆菌O25B抗原的载体蛋白)的原核宿主细胞，其中所述宿主细胞天然包含或经工程改造以包含与SEQ ID NO: 5至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核酸。在另一个具体实施方案中，原核宿主细胞包含编码寡糖基转移酶的核酸序列。在另一个具体实施方案中，原核宿主细胞还包含编码以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQ ID NO:14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X和Z独立地选自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQ ID NO: 15)(参见WO 2006/119987)。在一个具体实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌。
在另一个具体实施方案中，本文提供了能够产生O25B和/或O25B生物缀合物(即连接至大肠杆菌O25B抗原的载体蛋白)的原核宿主细胞(例如，重组工程改造的原核宿主细胞)，其中所述宿主细胞天然包含或经工程改造以包含wekA的核酸序列(SEQ ID NO:6)。在另一个具体实施方案中，本文提供了能够产生O25B和/或O25B生物缀合物(即连接至大肠杆菌O25B抗原的载体蛋白)的原核宿主细胞，其中所述宿主细胞天然包含或经工程改造以包含编码鼠李糖基转移酶(例如，由wekA编码的dTDP-Rha: Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP α-1,3-鼠李糖基转移酶)的核酸序列。在另一个具体实施方案中，本文提供了能够产生O25B和/或O25B生物缀合物(即连接至大肠杆菌O25B抗原的载体蛋白)的原核宿主细胞，其中所述宿主细胞天然包含或经工程改造以包含与SEQ ID NO: 6至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核酸。在另一个具体实施方案中，原核宿主细胞包含编码寡糖基转移酶的核酸序列。在另一个具体实施方案中，原核宿主细胞还包含编码以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQ ID NO: 14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X和Z独立地选自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQ ID NO:15)(参见WO 2006/119987)。在一个具体实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌。
在另一个具体实施方案中，本文提供了能够产生O25B和/或O25B生物缀合物(即连接至大肠杆菌O25B抗原的载体蛋白)的原核宿主细胞(例如，重组工程改造的原核宿主细胞)，其中所述宿主细胞天然包含或经工程改造以包含wekB的核酸序列(SEQ ID NO:7)。在另一个具体实施方案中，本文提供了能够产生O25B和/或O25B生物缀合物(即连接至大肠杆菌O25B抗原的载体蛋白)的原核宿主细胞，其中所述宿主细胞天然包含或经工程改造以包含编码wekB葡萄糖基转移酶(例如，由wekB编码的UDP-Glc: Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP β-1,6-葡萄糖基转移酶)的核酸序列。在另一个具体实施方案中，本文提供了能够产生O25B和/或O25B生物缀合物(即连接至大肠杆菌O25B抗原的载体蛋白)的原核宿主细胞，其中所述宿主细胞天然包含或经工程改造以包含与SEQ ID NO: 7至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核酸。在另一个具体实施方案中，原核宿主细胞包含编码寡糖基转移酶的核酸序列。在另一个具体实施方案中，原核宿主细胞还包含编码以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQ ID NO: 14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X和Z独立地选自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQ ID NO: 15)(参见WO 2006/119987)。在一个具体实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌。
在另一个具体实施方案中，本文提供了能够产生O25B和/或O25B生物缀合物(即连接至大肠杆菌O25B抗原的载体蛋白)的原核宿主细胞(例如，重组工程改造的原核宿主细胞)，其中所述宿主细胞天然包含或经工程改造以包含wzy的核酸序列(SEQ ID NO:8)。在另一个具体实施方案中，本文提供了能够产生O25B和/或O25B生物缀合物(即连接至大肠杆菌O25B抗原的载体蛋白)的原核宿主细胞，其中所述宿主细胞天然包含或经工程改造以包含编码O抗原聚合酶(例如，由wzy编码的O抗原聚合酶)的核酸序列。在另一个具体实施方案中，本文提供了能够产生O25B和/或O25B生物缀合物(即连接至大肠杆菌O25B抗原的载体蛋白)的原核宿主细胞，其中所述宿主细胞天然包含或经工程改造以包含与SEQ ID NO: 8至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核酸。在另一个具体实施方案中，原核宿主细胞包含编码寡糖基转移酶的核酸序列。在另一个具体实施方案中，原核宿主细胞还包含编码以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQ ID NO:14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X和Z独立地选自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQ ID NO: 15)(参见WO 2006/119987)。在一个具体实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌。
在另一个具体实施方案中，本文提供了能够产生O25B和/或O25B生物缀合物(即连接至大肠杆菌O25B抗原的载体蛋白)的原核宿主细胞(例如，重组工程改造的原核宿主细胞)，其中所述宿主细胞天然包含或经工程改造以包含wbbJ的核酸序列(SEQ ID NO:9)。在另一个具体实施方案中，本文提供了能够产生O25B和/或O25B生物缀合物(即连接至大肠杆菌O25B抗原的载体蛋白)的原核宿主细胞，其中所述宿主细胞天然包含或经工程改造以包含编码O-乙酰基转移酶(例如，由wbbJ编码的O-乙酰基转移酶)的核酸序列。在另一个具体实施方案中，本文提供了能够产生O25B和/或O25B生物缀合物(即连接至大肠杆菌O25B抗原的载体蛋白)的原核宿主细胞，其中所述宿主细胞天然包含或经工程改造以包含与SEQ IDNO: 9至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核酸。在另一个具体实施方案中，原核宿主细胞包含编码寡糖基转移酶的核酸序列。在另一个具体实施方案中，原核宿主细胞还包含编码以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQ IDNO: 14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X和Z独立地选自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQ ID NO: 15)(参见WO 2006/119987)。在一个具体实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌。
在另一个具体实施方案中，本文提供了能够产生O25B和/或O25B生物缀合物(即连接至大肠杆菌O25B抗原的载体蛋白)的原核宿主细胞(例如，重组工程改造的原核宿主细胞)，其中所述宿主细胞天然包含或经工程改造以包含wbbK的核酸序列(SEQ ID NO:10)。在另一个具体实施方案中，本文提供了能够产生O25B和/或O25B生物缀合物(即连接至大肠杆菌O25B抗原的载体蛋白)的原核宿主细胞，其中所述宿主细胞天然包含或经工程改造以包含编码葡萄糖基转移酶(例如，由wbbK编码的UDP-Glc: Rha-GlcNAc-UPP α-1,3-葡萄糖基转移酶)的核酸序列。在另一个具体实施方案中，本文提供了能够产生O25B和/或O25B生物缀合物(即连接至大肠杆菌O25B抗原的载体蛋白)的原核宿主细胞，其中所述宿主细胞天然包含或经工程改造以包含与SEQ ID NO: 10至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核酸。在另一个具体实施方案中，原核宿主细胞包含编码寡糖基转移酶的核酸序列。在另一个具体实施方案中，原核宿主细胞还包含编码以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQ ID NO: 14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X和Z独立地选自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQ ID NO: 15)(参见WO 2006/119987)。在一个具体实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌。
在另一个具体实施方案中，本文提供了能够产生O25B和/或O25B生物缀合物(即连接至大肠杆菌O25B抗原的载体蛋白)的原核宿主细胞(例如，重组工程改造的原核宿主细胞)，其中所述宿主细胞天然包含或经工程改造以包含wbbL的核酸序列(SEQ ID NO:11)。在另一个具体实施方案中，本文提供了能够产生O25B和/或O25B生物缀合物(即连接至大肠杆菌O25B抗原的载体蛋白)的原核宿主细胞，其中所述宿主细胞天然包含或经工程改造以包含编码鼠李糖基转移酶(例如，由wbbL编码的dTDP-Rha: GlcNAc-UPP α-1,3-鼠李糖基转移酶)的核酸序列。在另一个具体实施方案中，本文提供了能够产生O25B和/或O25B生物缀合物(即连接至大肠杆菌O25B抗原的载体蛋白)的原核宿主细胞，其中所述宿主细胞天然包含或经工程改造以包含与SEQ ID NO: 11至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核酸。在另一个具体实施方案中，原核宿主细胞包含编码寡糖基转移酶的核酸序列。在另一个具体实施方案中，原核宿主细胞还包含编码以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQ ID NO: 14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X和Z独立地选自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQ ID NO: 15)(参见WO2006/119987)。在一个具体实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌。
在另一个具体实施方案中，本文提供了能够产生O25B和/或O25B生物缀合物(即连接至大肠杆菌O25B抗原的载体蛋白)的原核宿主细胞(例如，重组工程改造的原核宿主细胞)，其中所述宿主细胞天然包含或经工程改造以包含以下中的至少一种、两种、三种、四种或更多种(例如所有)：(i)与SEQ ID NO: 1至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核酸序列；(ii)与SEQ IDNO: 2至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核酸序列；(iii)与SEQ ID NO: 3至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核酸序列；(iv)与SEQ ID NO: 4至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核酸序列；(v)与SEQ ID NO: 5至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核酸序列；(vi)与SEQ ID NO: 6至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核酸序列；(vii)与SEQ ID NO:7至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核酸序列；(viii)与SEQ ID NO: 8至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核酸序列；(ix)与SEQ ID NO: 9至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核酸序列；(x)与SEQ ID NO: 10至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核酸序列；和/或(xi)与SEQ ID NO: 11至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核酸序列。在一个具体实施方案中，所述宿主细胞已经工程改造以包含所述序列中的每一种，即，所述序列对所述宿主细胞是异源的。在另一个具体实施方案中，原核宿主细胞包含编码寡糖基转移酶的核酸序列。在另一个具体实施方案中，原核宿主细胞还包含编码以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQ ID NO:14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X和Z独立地选自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQ ID NO: 15)(参见WO 2006/119987)。在一个具体实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌。
在另一个具体实施方案中，本文提供了产生O25B的原核宿主细胞(例如，重组工程改造的原核宿主细胞)，其中所述宿主细胞包含以下中的至少两种：(i) wbbJ (SEQ ID NO:9)或与SEQ ID NO: 9约或至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源的核酸；(ii) wbbK (SEQ ID NO:10)或与SEQ ID NO: 10约或至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源的核酸；和/或(iii) wbbL (SEQ ID NO:11)或与SEQ ID NO: 11约或至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源的核酸。在另一个具体实施方案中，原核宿主细胞包含编码寡糖基转移酶的核酸序列。在另一个具体实施方案中，原核宿主细胞还包含编码以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQ ID NO: 14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X和Z独立地选自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQ ID NO: 15)(参见WO 2006/119987)。在一个具体实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌。
在另一个具体实施方案中，本文提供了产生O25B的原核宿主细胞(例如，重组工程改造的原核宿主细胞)，其中所述宿主细胞包含以下中的每种：(i) wbbJ (SEQ ID NO:9)或与SEQ ID NO: 9约或至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源的核酸；(ii) wbbK (SEQ ID NO:10)或与SEQ ID NO: 10约或至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源的核酸；和(iii) wbbL (SEQ ID NO:11)或与SEQ ID NO: 11约或至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源的核酸。在另一个具体实施方案中，原核宿主细胞包含编码寡糖基转移酶的核酸序列。在另一个具体实施方案中，原核宿主细胞还包含编码以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQ ID NO: 14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X和Z独立地选自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQ ID NO: 15)(参见WO 2006/119987)。在一个具体实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌。
在另一个具体实施方案中，本文提供了产生O25B的原核宿主细胞(例如，重组工程改造的原核宿主细胞)，其中所述宿主细胞包含：(i)dTDP-葡萄糖4,6-脱水酶；(ii)dTDP-6-脱氧-D-葡萄糖3,5-差向异构酶；(iii)葡萄糖-1-磷酸胸苷基转移酶；(iv)dTDP-4-脱氢鼠李糖3,5-差向异构酶；(v)O抗原翻转酶；(vi)dTDP-Rha: Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP α-1,3-鼠李糖基转移酶；(vii)UDP-Glc: Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP β-1,6-葡萄糖基转移酶；(viii)O抗原聚合酶；(ix)O-乙酰基转移酶；(x)UDP-Glc: Rha-GlcNAc-UPP α-1,3-葡萄糖基转移酶和/或(xi)dTDP-Rha: GlcNAc-UPP α-1,3-鼠李糖基转移酶。在一个具体实施方案中，原核宿主细胞包含编码寡糖基转移酶的核酸序列。在另一个具体实施方案中，原核宿主细胞还包含编码以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQ ID NO: 14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X和Z独立地选自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQ ID NO: 15)(参见WO2006/119987)。在另一个具体实施方案中，(i)dTDP-葡萄糖4,6-脱水酶；(ii)dTDP-6-脱氧-D-葡萄糖3,5-差向异构酶；(iii)葡萄糖-1-磷酸胸苷基转移酶；(iv)dTDP-4-脱氢鼠李糖3,5-差向异构酶；(v)O抗原翻转酶；(vi)dTDP-Rha: Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP α-1,3-鼠李糖基转移酶；(vii)UDP-Glc: Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP β-1,6-葡萄糖基转移酶；(viii)O抗原聚合酶；(ix)O-乙酰基转移酶；(x)UDP-Glc: Rha-GlcNAc-UPP α-1,3-葡萄糖基转移酶和/或(xi)dTDP-Rha: GlcNAc-UPP α-1,3-鼠李糖基转移酶中的一些或所有对宿主细胞是异源的。在另一个具体实施方案中，所述寡糖基转移酶对宿主细胞是异源的。在另一个具体实施方案中，所述载体蛋白对宿主细胞是异源的。在一个具体实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌。
在另一个方面，本文提供了产生大肠杆菌O25A的原核宿主细胞(例如，重组工程改造的原核宿主细胞)，即，所述宿主细胞包含能够合成大肠杆菌O25A的酶(例如参见图3)。在另一个具体实施方案中，原核宿主细胞包含编码寡糖基转移酶的核酸序列。在另一个具体实施方案中，原核宿主细胞还包含编码以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQ ID NO: 14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X和Z独立地选自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQ ID NO: 15)(参见WO 2006/119987)。在一个具体实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌。
在另一个方面，本文提供了产生大肠杆菌O1的原核宿主细胞(例如，重组工程改造的原核宿主细胞)，即，所述宿主细胞包含能够合成大肠杆菌O1的酶(例如参见图12)。在一个具体实施方案中，本文提供了产生大肠杆菌O1A的宿主细胞。在一个具体实施方案中，本文提供了产生大肠杆菌O1B的宿主细胞。在一个具体实施方案中，本文提供了产生大肠杆菌O1C的宿主细胞。在另一个具体实施方案中，原核宿主细胞包含编码寡糖基转移酶的核酸序列。在另一个具体实施方案中，原核宿主细胞还包含编码以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQ ID NO: 14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X和Z独立地选自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQ ID NO: 15)(参见WO 2006/119987)。在一个具体实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌。
在另一个方面，本文提供了产生大肠杆菌O2的原核宿主细胞(例如，重组工程改造的原核宿主细胞)，即，所述宿主细胞包含能够合成大肠杆菌O2的酶(例如参见图19)。在另一个具体实施方案中，原核宿主细胞包含编码寡糖基转移酶的核酸序列。在另一个具体实施方案中，原核宿主细胞还包含编码以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQ ID NO: 14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X和Z独立地选自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQ IDNO: 15)(参见WO 2006/119987)。在一个具体实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌。
在另一个方面，本文提供了产生大肠杆菌O6的原核宿主细胞(例如，重组工程改造的原核宿主细胞)，即，所述宿主细胞包含能够合成大肠杆菌O6的酶(例如参见图17)。在一个具体实施方案中，本文提供了产生包含支链Glc单糖的大肠杆菌O6或包含支链GlcNAc单糖的O6抗原的宿主细胞。在另一个具体实施方案中，原核宿主细胞包含编码寡糖基转移酶的核酸序列。在另一个具体实施方案中，原核宿主细胞还包含编码以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQ ID NO: 14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X和Z独立地选自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQ ID NO: 15)(参见WO 2006/119987)。在一个具体实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌。
本文还提供了能够产生不止一种类型的大肠杆菌O抗原的原核宿主细胞(例如，重组工程改造的原核宿主细胞)。在一个具体实施方案中，本文提供了能够产生以下中的至少两种的宿主细胞：O25B、O25A、O1(例如O1A、O1B、O1C)、O2和O6。在另一个具体实施方案中，本文提供了能够产生O25B和O25A、O1(例如O1A、O1B、O1C)、O2和O6中的一种或多种的宿主细胞。在另一个具体实施方案中，原核宿主细胞包含编码寡糖基转移酶的核酸序列。在另一个具体实施方案中，原核宿主细胞还包含编码以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQ ID NO: 14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X和Z独立地选自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQ ID NO: 15)(参见WO 2006/119987)。在一个具体实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌。
5.3.1 基因背景
可使用本领域技术人员已知的任何宿主细胞产生本文描述的大肠杆菌O抗原(例如O25B)和包含本文描述的大肠杆菌O抗原(例如O25B)的生物缀合物，包括古生菌(archea)、原核宿主细胞和真核宿主细胞。用于产生本文描述的大肠杆菌O抗原和包含本文描述的大肠杆菌O抗原的生物缀合物的示例性原核宿主细胞包括但不限于埃希氏菌属、志贺氏菌(Shigella)属、克雷伯氏菌(Klebsiella)属、黄单胞菌(Xhantomonas)属、沙门氏菌(Salmonella)属、耶尔森菌(Yersinia)属、乳球菌(Lactococcus)属、乳杆菌(Lactobacillus)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、链霉菌(Streptomyces)属、链球菌(Streptococcus)属、葡萄球菌(Staphylococcus)属、芽孢杆菌(Bacillus)属和梭菌(Clostridium)属。在一个具体实施方案中，用于产生本文描述的大肠杆菌O抗原和包含本文描述的大肠杆菌O抗原的生物缀合物的宿主细胞为大肠杆菌。
在某些实施方案中，用于产生本文描述的大肠杆菌O抗原和生物缀合物的宿主细胞进行工程改造以包含异源性核酸，例如编码一种或多种载体蛋白的异源性核酸和/或编码一种或多种蛋白的异源性核酸(例如编码一种或多种蛋白的基因)。在一个具体实施方案中，可将编码参与糖基化途径(例如，原核和/或真核糖基化途径)的蛋白的异源性核酸引入本文描述的宿主细胞中。此类核酸可编码蛋白，包括但不限于寡糖基转移酶和/或糖基转移酶的。可使用本领域技术人员已知的任何方法(例如电穿孔、通过热休克的化学转化、天然转化、噬菌体转导和缀合)将异源性核酸(例如，编码载体蛋白的核酸和/或编码其它蛋白(例如参与糖基化的蛋白)的核酸)引入本文描述的宿主细胞中。在具体实施方案中，使用质粒将异源性核酸引入本文描述的宿主细胞中，例如，通过质粒(例如表达载体)使异源性核酸表达于宿主细胞中。在另一个具体实施方案中，使用国际专利申请号PCT/EP2013/068737中描述的插入方法将异源性核酸引入本文描述的宿主细胞中。
在某些实施方案中，可将额外修饰引入(例如，使用重组技术)本文描述的宿主细胞中。例如，编码形成可能竞争或干扰糖基化途径(例如，竞争或干扰一种或多种重组引入宿主细胞中的参与糖基化的异源性基因)的一部分的蛋白的宿主细胞核酸(例如基因)可在宿主细胞背景(基因组)中以使其失活/功能失调的方式缺失或修饰(即，缺失/修饰的宿主细胞核酸不编码功能蛋白或不编码任何蛋白)。在某些实施方案中，当核酸从本文提供的宿主细胞的基因组缺失时，其由所需序列(例如可用于糖蛋白产生的序列)代替。
可在宿主细胞中缺失(和在一些情况下被其它所需核酸序列代替)的示例性基因包括参与糖脂生物合成的宿主细胞的基因(诸如waaL)(参见例如Feldman等人，2005, PNASUSA 102：3016-3021)、脂质A核心生物合成簇(waa)、半乳糖簇(gal)、阿拉伯糖簇(ara)、结肠酸(colonic acid)簇(wc)、荚膜多糖簇、十一葵烯醇-p生物合成基因(例如，uppS、uppP)、und-P再循环基因、参与核苷酸活化的糖生物合成的代谢酶、肠杆菌普通抗原簇和原噬菌体O抗原修饰簇(如gtrABS簇)。在一个具体实施方案中，修饰本文描述的宿主细胞，使得其不产生除来自ExPEC的所需O抗原(例如O25B)外的任何O抗原。在一个具体实施方案中，waaL基因、gtrA基因、gtrB基因、gtrS基因或rfb基因簇中的一个或多个从本文提供的原核宿主细胞的基因组中缺失或功能失活。在一个实施方案中，本文使用的宿主细胞是产生O25B抗原的大肠杆菌，其中waaL基因、gtrA基因、gtrB基因和gtrS基因从宿主细胞的基因组中缺失或功能失活。在另一个实施方案中，本文使用的宿主细胞是产生O25B抗原的大肠杆菌，其中waaL基因和gtrS基因从宿主细胞的基因组中缺失或功能失活。
在某些实施方案中，本文提供的修饰宿主细胞可用于蛋白糖基化。可设计蛋白糖基化以产生生物缀合物用于疫苗制剂，例如含有大肠杆菌多糖抗原(例如O25(例如O25B)、O1、O2和O6)的疫苗。
5.3.2 载体蛋白
可在本文中使用适用于产生结合疫苗(例如用于疫苗中的生物缀合物)的任何载体蛋白，例如，可将编码载体蛋白的核酸引入本文提供的宿主中用于产生包含连接至ExPEC抗原(例如O25B)的载体蛋白的生物缀合物。示例性载体蛋白包括但不限于脱毒的绿脓假单胞菌外毒素A(EPA；参见例如Ihssen等人(2010) Microbial cell factories 9,61)、CRM197、麦芽糖结合蛋白(MBP)、白喉类毒素、破伤风类毒素、脱毒的金黄色葡萄球菌的溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、大肠杆菌FimH、大肠杆菌FimHC、大肠杆菌不耐热肠毒素、大肠杆菌不耐热肠毒素的脱毒变体、霍乱毒素B亚单元(CTB)、霍乱毒素、霍乱毒素的脱毒变体、大肠杆菌Sat蛋白、大肠杆菌Sat蛋白的过客结构域、肺炎链球菌肺炎球菌溶血素和其脱毒变体、空肠弯曲杆菌AcrA和空肠弯曲杆菌天然糖蛋白。对于EPA，各种脱毒蛋白变体已描述于文献中且可用作载体蛋白。
在某些实施方案中，将用于生成本文所述的生物缀合物的载体蛋白修饰，例如以蛋白具有更小毒性和/或更易于糖基化的方式修饰。在一个具体实施方案中，将用于生成本文所述的生物缀合物的载体蛋白修饰，使得载体蛋白中糖基化位点的数目最大化，其方式允许施用更低浓度的蛋白(例如，在免疫原性组合物中，以其生物缀合物形式)。
在某些实施方案中，修饰本文描述的载体蛋白使其比通常与载体蛋白相关的糖基化位点(例如相对于与其原始/天然(例如"野生型")状态的载体蛋白相关的糖基化位点数)多包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个糖基化位点。在具体实施方案中，通过在蛋白一级结构的任何地方插入糖基化共有序列(例如Asn-X-Ser(Thr)，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQ ID NO: 14)；或Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)，其中X和Z独立地选自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQ ID NO: 15)(参见WO 2006/119987))来引入糖基化位点。可通过(例如)以下方式来引入此类糖基化位点：将新氨基酸添加至蛋白一级结构(即，完全或部分地添加糖基化位点)，或突变蛋白中的现有氨基酸以生成糖基化位点(即，不向蛋白添加氨基酸，但突变蛋白的所选氨基酸以形成糖基化位点)。本领域技术人员应认识到，可使用本领域已知的方法(例如包括修饰编码蛋白的核酸序列的重组方法)来容易地修饰蛋白的氨基酸序列。在具体实施方案中，将糖基化共有序列引入载体蛋白的特异性区域中，例如蛋白的表面结构，蛋白的N或C末端和/或由蛋白基础处的二硫桥键稳定的环中。在某些实施方案中，典型5氨基酸糖基化共有序列可通过赖氨酸残基延伸以用于更有效地糖基化，且因此插入的共有序列可编码5、6或7个应插入或代替受体蛋白氨基酸的氨基酸。在一个具体实施方案中，载体蛋白是包含4个共有糖基化序列Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thr(SEQ ID NO: 15)的脱毒EPA，且具有如SEQ ID NO: 13中提供的氨基酸序列。
在某些实施方案中，用于生成本文描述的生物缀合物的载体蛋白包含"标签"，即允许分离和/或鉴定载体蛋白的氨基酸序列。例如，向本文描述的载体蛋白添加标签可用于纯化该蛋白且因此纯化包含标签化的载体蛋白的缀合物疫苗。可用于本文中的示例性标签包括但不限于组氨酸(HIS)标签(例如六组氨酸标签或6Xhis-标签)、FLAG-TAG和HA标签。在某些实施方案中，本文使用的标签是可去除的，例如一旦不再需要它们(例如在纯化蛋白之后)，就通过化学试剂或通过酶促方式去除。
在某些实施方案中，本文描述的载体蛋白包含使载体蛋白靶向至表达载体蛋白的宿主细胞的周质间隙的信号序列。在一个具体实施方案中，信号序列来自大肠杆菌DsbA、大肠杆菌外膜孔蛋白A(OmpA)、大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(MalE)、胡萝卜软腐欧文氏菌果胶酸裂合酶(PelB)、FlgI、NikA或芽孢杆菌属木聚糖内切酶(XynA)、不耐热大肠杆菌肠毒素LTIIb、芽孢杆菌木聚糖内切酶XynA或大肠杆菌鞭毛蛋白(FlgI)。
5.3.3 糖基化机构
本文提供的宿主细胞包含和/或可修饰以包含编码能够产生来自ExPEC的O抗原(例如O25(例如O25B)、O1、O2和/或O6抗原)的基因机构(例如糖基转移酶)的核酸。参见部分5.1。
糖基转移酶
本文提供的宿主细胞包含编码能够产生ExPEC O抗原的糖基转移酶的核酸，所述ExPECO抗原为(例如)来自血清型O25(例如O25A或O25B，参见图3B)、O1(参见图12)、O2(参见图19)和O6(例如，产生包含支链Glc单糖的O6抗原或包含支链GlcNAc单糖的O6抗原的O6血清型，参见图17)的大肠杆菌的O抗原。示例性核酸描述于部分5.1中。在某些实施方案中，编码能够产生ExPEC O抗原的糖基转移酶的一些或所有核酸由本文提供的宿主细胞天然表达(例如，核酸存在于宿主细胞的"野生型"背景中)。在某些实施方案中，编码能够产生ExPEC O抗原的糖基转移酶的一些或所有核酸不由本文提供的宿主细胞天然表达，即，一些或所有核酸对宿主细胞是异源的。可使用本领域已知的方法(例如部分5.3中描述的方法)工程改造宿主细胞以包含特异性核酸，例如部分5.1中描述的核酸。
在一个具体实施方案中，本文提供的宿主细胞包含编码能够产生O25B血清型的大肠杆菌O抗原(即本文描述的O25B抗原)的糖基转移酶的核酸。在一个具体实施方案中，所述核酸编码来自upec138(SEQ ID NO: 12)的rfb簇或与SEQ ID NO: 12约或至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源的基因簇。
在另一个具体实施方案中，所述核酸编码来自upec163的rfb簇或与来自upec163的rfb簇约或至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源的基因簇。在另一个具体实施方案中，所述核酸编码来自upec177的rfb簇或与来自upec177的rfb簇约或至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源的基因簇。
在另一个具体实施方案中，所述编码能够产生O25B血清型的大肠杆菌O抗原的糖基转移酶的核酸是O25B血清型的基因，其中所述基因是rmlB (SEQ ID NO: 1)、rmlD (SEQID NO: 2)、rmlA (SEQ ID NO: 3)、rmlC (SEQ ID NO: 4)、 wzx (SEQ ID NO: 5)、wekA(SEQ ID NO: 6)、wekB (SEQ ID NO: 7)、wzy (SEQ ID NO: 8)、wbbJ (SEQ ID NO: 9)、wbbK (SEQ ID NO: 10)和wbbL (SEQ ID NO: 11)。参见表3和9。
在一个具体实施方案中，本文提供的宿主细胞包含编码能够产生O25A血清型的大肠杆菌O抗原(即本文描述的O25A抗原)的蛋白(例如糖基转移酶)的核酸。在另一个具体实施方案中，所述编码能够产生O25A血清型的大肠杆菌O抗原的蛋白(例如糖基转移酶)的核酸是O25血清型的基因，其中所述基因是rmlB、rmlD、rmlA、rmlC、wzx、wekA、wekB、wekC、wzy、fnlA、fnlB、fnlC、wbuB和/或wbuC。参见Wang等人(2010) J Clin Microbiol 48, 2066-2074；Genbank GU014554；和表2。
在另一个具体实施方案中，本文提供的宿主细胞包含编码能够产生O2血清型的O抗原大肠杆菌的糖基转移酶的核酸。在另一个具体实施方案中，所述编码能够产生O2血清型的大肠杆菌O抗原的糖基转移酶的核酸是O2血清型的基因，其中所述基因是rmlB、rmlD、rmlA、rmlC、wzx、wekP、wekQ、wekR、wzy、fdtA、fdtB和/或fdtC。See Li等人(2010) JMicrobiol Methods 82, 71-77；Fratamico等人，2010, Canadian Journal ofMicrobiology 56, 308-316；和表5。
在另一个具体实施方案中，本文提供的宿主细胞包含编码能够产生O6血清型的O抗原大肠杆菌的糖基转移酶的核酸。参见Welch等人，2002, PNAS USA 99(26)：17020-17024；Jann等人，Carbohydr. Res. 263 (1994) 217-225和Jansson等人，Carbohydr.Res. 131 (1984) 277-283。在一个具体实施方案中，所述O6血清型包含支链Glc单糖。
在另一个具体实施方案中，本文提供的宿主细胞包含编码能够产生O1血清型的O抗原大肠杆菌的糖基转移酶的核酸。在一个具体实施方案中，所述O1血清型是O1A。在另一个具体实施方案中，所述编码能够产生O1血清型的大肠杆菌O抗原的糖基转移酶的核酸是O1血清型的基因，其中所述基因是rmlB、rmlD、rmlA、rmlC、wzx、mnaA、wekM、wzy、wekN和/或wekO。
寡糖基转移酶
寡糖基转移酶将脂质-连接的寡糖转移至包含N-糖基化共有基序(例如Asn-X-Ser(Thr)，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQ ID NO: 14)；或Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)，其中X和Z独立地选自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQ ID NO: 15))的新生多肽链的天冬酰胺残基中(参见WO 2006/119987)。参见例如WO 2003/074687和WO 2006/119987，其公开内容以其整体通过引用并入本文。
在某些实施方案中，本文提供的宿主细胞包含编码寡糖基转移酶的核酸。编码寡糖基转移酶的核酸可对宿主细胞是天然的，或可使用遗传方法引入宿主细胞中，如上文所描述。寡糖基转移酶可来自本领域已知的任一来源。在一个具体实施方案中，寡糖基转移酶可以来自弯曲杆菌(Campylobacter)的寡糖基转移酶。在另一个具体实施方案中，寡糖基转移酶是来自空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)的寡糖基转移酶(即pglB；参见例如Wacker等人，2002, Science 298：1790-1793；还参见例如NCBI基因ID：3231775, UniProt登录号O86154)。在另一个具体实施方案中，寡糖基转移酶是来自红嘴鸥弯曲杆菌(Campylobacter lari)的寡糖基转移酶(例如参见NCBI基因ID：7410986)。
5.4 生物缀合物
在某些实施方案中，可使用本文描述的宿主细胞来产生包含连接至载体蛋白的本文描述的大肠杆菌O抗原(例如O25B；参见部分5.2)的生物缀合物。本领域已知使用宿主细胞产生所述生物缀合物的方法。参见例如WO 2003/074687和WO 2006/119987。
或者，可通过化学合成来制备糖缀合物，即，在宿主细胞之外(在体外)制备。例如，可使用本领域技术人员已知的方法(包括通过使用多糖/寡糖以及蛋白载体中的活化反应性基团)来使本文描述的大肠杆菌O抗原(例如O25B)缀合至载体蛋白。参见例如Pawlowski等人，2000, Vaccine 18：1873-1885；和Robbins等人，2009, Proc Natl Acad Sci USA106：7974-7978)，其公开内容通过引用并入本文。此类方法包括：从宿主细胞提取抗原性多糖/寡糖，纯化多糖/寡糖，化学活化多糖/寡糖，和使多糖/寡糖缀合至载体蛋白。
如本文描述的生物缀合物具有优于糖缀合物的有利性质，例如，生物缀合物在制造中需要更少化学物质且在生成的最终产物方面更一致。因此，生物缀合物优于化学产生的糖缀合物。
在一个具体实施方案中，本文提供了包含连接至本文描述的ExPEC O抗原的载体蛋白的生物缀合物。参见部分5.2。
在一个具体实施方案中，本文提供了包含N-连接至大肠杆菌O25B的载体蛋白(例如EPA)的生物缀合物。
在另一个具体实施方案中，本文提供了包含连接至下文呈现的式O25B的化合物的载体蛋白(例如EPA)的生物缀合物：
,
其中n是1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之间的整数。在一个具体实施方案中，载体蛋白N-连接至式O25B的O抗原，即，O25B连接至这样的载体蛋白的Asn残基：包含序列Asn-X-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQ ID NO: 14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的载体蛋白，其中X和Z独立地选自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQ ID NO: 15)。
在另一个具体实施方案中，本文提供了包含连接至下文呈现的式O25B’的化合物的载体蛋白(例如，EPA)的生物缀合物：
,
其中n是1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之间的整数。在一个具体实施方案中，载体蛋白N-连接至式O25B’的O抗原。
在另一个具体实施方案中，本文提供了包含连接至O25A抗原的载体蛋白(例如，EPA)的生物缀合物。在一个具体实施方案中，所述O25A抗原包含式O25A：
或O25A’：
。
在另一个具体实施方案中，本文提供了包含连接至O1抗原的载体蛋白(例如，EPA)的生物缀合物。在一个具体实施方案中，所述O1抗原是O1A，例如，所述抗原包含式O1A：
或O1A’：
在另一个具体实施方案中，所述O1抗原是O1B，例如，所述抗原包含式O1B：
或O1B’：
在另一个具体实施方案中，所述O1抗原是O1C，例如，所述抗原包含式O1C：
或O1C’：
。
在另一个具体实施方案中，本文提供了包含连接至O2抗原的载体蛋白(例如，EPA)的生物缀合物。在一个具体实施方案中，所述O2抗原包含式O2：
或O2’
。
在另一个具体实施方案中，本文提供了包含连接至O6抗原的载体蛋白(例如，EPA)的生物缀合物。在一个具体实施方案中，所述O6抗原包含式O6Glc:
O6GlcNAc：
O6Glc’：
或O6GlcNAc’：
。
可通过本领域已知用于纯化蛋白的任何方法来纯化本文描述的生物缀合物，例如通过色谱(例如离子交换、阴离子交换、亲和色谱和大小柱色谱)、离心、差异溶解性或通过用于纯化蛋白的任何其它标准技术。参见例如Saraswat等人，2013, Biomed. Res. Int.ID#312709 (p. 1-18)；还参见WO 2009/104074中描述的方法。另外，可使生物缀合物融合至本文描述或另外本领域已知的异源性多肽序列以促进纯化。用于纯化特定生物缀合物的实际条件部分地取决于合成策略(例如合成产生相比于重组产生)和因素诸如生物缀合物的净电荷、疏水性和/或亲水性，并且是本领域技术人员显而易见的。
5.5 针对O25B的抗体
本文描述的O25B抗原(参见部分5.2)和/或包含本文描述的O25B抗原的生物缀合物(参见部分5.4)可用于诱导针对ExPEC的中和抗体。在一个具体实施方案中，可将本文描述的O25B抗原和/或包含本文描述的O25B抗原的生物缀合物施用于个体(例如，人、小鼠、兔、大鼠、豚鼠等)以诱导包括产生抗体的免疫反应。可使用本领域技术人员已知的技术(例如，免疫亲和色谱、离心、沉淀等)来分离此类抗体。
此外，可使用本文描述的O25B抗原从抗体文库筛选抗体。例如，可将分离的O25B固定至固体支持物(例如，硅胶、树脂、衍生化塑料膜、玻璃珠、棉花、塑料珠、聚苯乙烯珠、氧化铝凝胶或多糖、磁性珠)，并筛选以用于结合至抗体。作为替代方案，可将待筛选的抗体固定至固体支持物且筛选以用于结合至O25B。可使用任何筛选测定(诸如淘选测定、ELISA、表面等离振子共振或本领域已知的其它抗体筛选测定)来筛选结合至O25B的抗体。筛选的抗体文库可以是市售抗体文库、体外生成文库或通过从感染EXPEC的个体鉴定和克隆或分离抗体而获得的文库。可根据本领域已知的方法来生成抗体文库。在一个具体实施方案中，通过克隆抗体且将其用于噬菌体展示文库或噬菌粒展示文库中来生成抗体文库。
使用O25B和/或O25B的生物缀合物鉴定或引发的抗体可包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有特异性结合至O25B的抗原结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、种类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的免疫球蛋白分子。抗体包括但不限于单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、Fab片段、F(ab')片段、二硫键连接的Fv(sdFv)和抗独特型(抗Id)抗体(包括，例如，针对使用本文描述的方法引发或鉴定的抗体的抗Id抗体)和任何上述的表位结合片段。在一个具体实施方案中，使用O25B和/或O25B的生物缀合物引发或鉴定的抗体是人或人源化单克隆抗体。
使用O25B和/或O25B的生物缀合物引发或鉴定的抗体可用于监测治疗效力和/或疾病进展。可使用本领域已知的任一免疫测定系统来用于该目的，包括但不限于使用下列技术的竞争性和非竞争性测定系统：放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、"夹心"免疫测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、免疫放射测定、荧光免疫测定、蛋白A免疫测定和免疫电泳测定。
使用O25B和/或O25B的生物缀合物引发或鉴定的抗体可用于(例如)从多种大肠杆菌菌株检测大肠杆菌O25B菌株和/或诊断大肠杆菌O25B菌株感染。
5.6 组合物
5.6.1 包含宿主细胞的组合物
在一个方面，本文提供了包含本文描述的宿主细胞的组合物。此类组合物可用于生成本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)的方法中，例如，可在适于产生蛋白的条件下培养组合物。随后，可使用本领域已知的方法从所述组合物分离生物缀合物。
包含本文提供的宿主细胞的组合物可包含其它适于本文描述的宿主细胞的维持和存活的组分，且可另外包含通过宿主细胞产生蛋白所需或对其有益的额外组分，例如用于诱导型启动子的诱导剂，诸如阿拉伯糖、IPTG。
5.6.2 包含抗原和/或生物缀合物的组合物
在另一个方面，本文提供了包含一种或多种本文描述的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)的组合物(例如药物组合物)和包括一种或多种本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)的组合物(例如药物组合物)。在一个具体实施方案中，本文提供的组合物包含一种或多种本文描述的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)。在另一个具体实施方案中，本文提供的组合物包含一种或多种本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)。在另一个具体实施方案中，本文提供的组合物包含一种或多种本文描述的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)和一种或多种本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)。本文描述的组合物可用于治疗和预防个体(例如人类个体)的肠外病原性大肠杆菌(ExPEC)感染。参见部分5.7。
在某些实施方案中，除包含本文描述的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)和/或本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)外，本文描述的组合物(例如药物组合物)还包含药学上可接受的载体。如本文所使用，术语"药学上可接受的"意指已获得联邦或州政府管理机构批准或列于美国药典或其它公认药典中可用于动物(且更具体而言用于人)中。在药学上可接受的载体的背景中，如本文所使用的术语"载体"是指与药物组合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。也可采用盐水溶液和右旋糖和甘油水溶液作为液体载体，具体而言用于可注射溶液。合适赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。合适药物载体的实例由E. W. Martin描述于"Remington's Pharmaceutical Sciences"中。
在一个具体实施方案中，本文提供了包含连接至本文描述的抗原(例如部分5.2中描述的ExPEC O抗原)的载体蛋白(例如部分5.3.2中描述的载体蛋白)的组合物。
在另一个具体实施方案中，本文提供的组合物包含连接至大肠杆菌O25B(参见部分5.2)的载体蛋白(例如部分5.3.2中描述的载体蛋白，例如EPA或MBP)。
在另一个具体实施方案中，本文提供的组合物包含连接至大肠杆菌O25A(参见部分5.2)的载体蛋白(例如部分5.3.2中描述的载体蛋白，例如EPA或MBP)。
在另一个具体实施方案中，本文提供的组合物包含连接至大肠杆菌O1(参见部分5.2)的载体蛋白(例如部分5.3.2中描述的载体蛋白，例如EPA或MBP)。在另一个具体实施方案中，所述O1大分子是O1A。在另一个具体实施方案中，所述O1大分子是O1B。在另一个具体实施方案中，所述O1大分子是O1C。
在另一个具体实施方案中，本文提供的组合物包含连接至大肠杆菌O2(参见部分5.2)的载体蛋白(例如部分5.3.2中描述的载体蛋白，例如EPA或MBP)。
在另一个具体实施方案中，本文提供的组合物包含连接至大肠杆菌O6(参见部分5.2)的载体蛋白(例如部分5.3.2中描述的载体蛋白，例如EPA或MBP)。在一个具体实施方案中，所述O6大分子是包含支链Glc单糖的O6大分子。
在另一个具体实施方案中，本文提供了包含以下的组合物(例如药物组合物)：(i)O25(例如O25A或O25B)大分子或包含O25(例如O25A或O25B)的生物缀合物；和(ii)O1大分子或包含O1的生物缀合物。参见部分5.2。在一个具体实施方案中，所述O25大分子是O25B大分子。在另一个具体实施方案中，所述O1大分子是O1A。在另一个具体实施方案中，所述O1大分子是O1B。在另一个具体实施方案中，所述O1大分子是O1C。
在另一个具体实施方案中，本文提供了包含以下的组合物(例如药物组合物)：(i)O25(例如O25A或O25B)大分子或包含O25(例如O25A或O25B)的生物缀合物；和(ii)O2大分子或包含O2的生物缀合物。参见部分5.2和5.4。在一个具体实施方案中，所述O25大分子是O25B大分子。
在另一个具体实施方案中，本文提供了包含以下的组合物(例如药物组合物)：(i)O25(例如O25A或O25B)大分子或包含O25(例如O25A或O25B)的生物缀合物；和(ii)O6大分子(例如包含支链Glc单糖或支链GlcNAc单糖的O6大分子)或包含O6的生物缀合物。参见部分5.2和5.4。在一个具体实施方案中，所述O25大分子是O25B大分子。在另一个具体实施方案中，所述O6大分子是包含支链Glc单糖的O6大分子。
在另一个具体实施方案中，本文提供了组合物(例如药物组合物)，其包含大肠杆菌O25B(参见部分5.2)或包含O25的生物缀合物(参见部分5.4)和以下中的至少一种：(i)大肠杆菌O1或包含O1的生物缀合物(参见部分5.2和5.4)；(ii)大肠杆菌O2或包含O2的生物缀合物(参见部分5.2和5.4)；和/或(iii)大肠杆菌O6或包含O6的生物缀合物(参见部分5.2和5.4)。在另一个具体实施方案中，所述O1是O1A。在另一个具体实施方案中，所述O1是O1B。在另一个具体实施方案中，所述O1是O1C。在另一个具体实施方案中，所述O6是包含支链Glc单糖的O6。
在另一个具体实施方案中，本文提供了包含以下中的至少两种的组合物(例如药物组合物)：(i)O25(例如O25A或O25B)大分子或包含O25(例如O25A或O25B)的生物缀合物；(ii)O1大分子或包含O1的生物缀合物；(iii)O2大分子或包含O2的生物缀合物；和/或(iv)O6大分子(例如包含支链Glc单糖或支链GlcNAc单糖的O6大分子)或包含O6的生物缀合物。在一个具体实施方案中，所述O25大分子是O25B大分子。在另一个具体实施方案中，所述O1大分子是O1A。在另一个具体实施方案中，所述O1大分子是O1B。在另一个具体实施方案中，所述O1大分子是O1C。在另一个具体实施方案中，所述O6大分子是包含支链Glc单糖的O6大分子。
在另一个具体实施方案中，本文提供了组合物(例如药物组合物)，其包含含有大肠杆菌O25B的生物缀合物和含有大肠杆菌O1A的生物缀合物。此类生物缀合物描述于部分5.4中。
在另一个具体实施方案中，本文提供了组合物(例如药物组合物)，其包含含有大肠杆菌O25B的生物缀合物和含有大肠杆菌O1B的生物缀合物。此类生物缀合物描述于部分5.4中。
在另一个具体实施方案中，本文提供了组合物(例如药物组合物)，其包含含有大肠杆菌O25B的生物缀合物和含有大肠杆菌O1C的生物缀合物。此类生物缀合物描述于部分5.4中。
在另一个具体实施方案中，本文提供了组合物(例如药物组合物)，其包含含有大肠杆菌O25B的生物缀合物和含有大肠杆菌O2的生物缀合物。此类生物缀合物描述于部分5.4中。
在另一个具体实施方案中，本文提供了组合物(例如药物组合物)，其包含含有大肠杆菌O25B的生物缀合物和含有大肠杆菌O6的生物缀合物。此类生物缀合物描述于部分5.4中。
在另一个具体实施方案中，本文提供的组合物包含：连接至大肠杆菌O25B(参见部分5.2)的载体蛋白(例如部分5.3.2中描述的载体蛋白，例如EPA或MBP)；(ii)连接至O1血清型(例如O1A)的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)的载体蛋白(例如部分5.3.2中描述的载体蛋白，例如EPA或MBP)；(iii)连接至O2血清型的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)的载体蛋白(例如部分5.1.2中描述的载体蛋白，例如EPA或MBP)；和(iv)连接至O6血清型的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)的载体蛋白(例如部分5.3.2中描述的载体蛋白，例如EPA或MBP)。
在某些实施方案中，前述组合物包含连接至除O1、O2、O6或O25外的大肠杆菌血清型的大肠杆菌O抗原的载体蛋白(例如部分5.3.2中描述的载体蛋白，例如EPA或MBP)。其它有用的大肠杆菌血清型描述于(例如)下文的实施例1和表1中。
在另一个具体实施方案中，本文提供的组合物包含O25(例如O25A或O25B)大分子。
在另一个具体实施方案中，本文提供的组合物包含O1大分子(例如O1A、O1B或O1C)。
在另一个具体实施方案中，本文提供的组合物包含O2大分子。
在另一个具体实施方案中，本文提供的组合物包含O6大分子(例如包含支链Glc单糖或支链GlcNAc单糖的O6大分子)。
在另一个具体实施方案中，本文提供的组合物包含O25(例如O25A或O25B)大分子、O1大分子、O2大分子和O6大分子(例如包含支链Glc单糖或支链GlcNAc单糖的O6大分子)。在一个具体实施方案中，所述O25大分子是O25B大分子。在另一个具体实施方案中，所述O1大分子是O1A。在另一个具体实施方案中，所述O6大分子是包含支链Glc单糖的O6大分子。
本文提供的组合物可用于引发施用组合物的宿主中的免疫反应，即是免疫原性的。因此，本文描述的组合物可用作针对ExPEC感染的疫苗，或可用于治疗ExPEC感染，且可因此配制为药物组合物。参见部分5.7。
包含本文描述的生物缀合物和/或大分子的组合物可包含适用于药物施用的任何额外组分。在具体实施方案中，本文描述的组合物是单价制剂。在其它实施方案中，本文描述的组合物是多价制剂，例如二价、三价和四价制剂。例如，多价制剂包含不止一种本文描述的生物缀合物或大肠杆菌O抗原。关于大肠杆菌O抗原和生物缀合物的描述，分别参见部分5.2和5.4。在一个具体实施方案中，本文描述的组合物是包含大分子或生物缀合物的四价制剂，其中所述化合价来自O25B、O1A、O6和O2血清型/亚血清型的大肠杆菌O抗原。
在某些实施方案中，本文描述的组合物额外包含防腐剂，例如汞衍生物硫柳汞。在一个具体实施方案中，本文描述的药物组合物包含0.001%至0.01%硫柳汞。在其它实施方案中，本文描述的药物组合物不包含防腐剂。
在某些实施方案中，本文描述的组合物(例如免疫原性组合物)包含佐剂，或与佐剂组合施用。与本文描述的组合物组合施用的佐剂可在施用所述组合物之前、同时或之后施用。在一些实施方案中，术语"佐剂"是指如下化合物：其当与本文描述的组合物结合或作为其一部分施用时增加、增强和/或加强对生物缀合物的免疫反应，但当单独施用化合物时不生成对生物缀合物的免疫反应。在一些实施方案中，佐剂生成对聚生物缀合物肽的免疫反应且不产生过敏或其它不良反应。佐剂可通过几种机制增强免疫反应，包括，例如，淋巴细胞募集、刺激B和/或T细胞和刺激巨噬细胞。
佐剂的具体实例包括但不限于铝盐(alum)(例如氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝)、3去-O-酰化单磷酰基脂质A(MPL)(参见英国专利GB2220211)、MF59(Novartis)、AS03(GlaxoSmithKline)、AS04(GlaxoSmithKline)、聚山梨醇酯80(Tween 80；ICL Americas,Inc.)、咪唑并吡啶化合物(参见国际申请号PCT/US2007/064857，公开为国际公开号WO2007/109812)、咪唑并喹喔啉化合物(参见国际申请号PCT/US2007/064858，公开为国际公开号WO2007/109813)和皂苷诸如QS21(参见Kensil等人，Vaccine Design：The Subunitand Adjuvant Approach (Powell和Newman编辑，Plenum Press, NY, 1995)；美国专利号5,057,540)。在一些实施方案中，佐剂是弗氏佐剂(完全或不完全)。其它佐剂是任选地与免疫刺激剂(诸如单磷酰基脂质A)组合的水包油型乳液(诸如角鲨烯或花生油)(参见Stoute等人，N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997))。另一佐剂是CpG(Bioworld Today, Nov.15, 1998)。
在某些实施方案中，本文描述的组合物被配制以适用于施用于个体的预期途径。例如，本文描述的组合物可被配制以适用于皮下、肠胃外、经口、皮内、经皮、结肠、腹膜内和直肠施用。在一个具体实施方案中，药物组合物可被配制以用于静脉内、经口、腹膜内、鼻内、气管内、皮下、肌内、局部、皮内、经皮或肺部施用。
在某些实施方案中，本文描述的组合物额外包含一种或多种缓冲剂，例如磷酸盐缓冲剂和蔗糖磷酸盐谷氨酸盐缓冲剂。在其它实施方案中，本文描述的组合物不包含缓冲剂。
在某些实施方案中，本文描述的组合物额外包含一种或多种盐，例如氯化钠、氯化钙、磷酸钠、谷氨酸单钠和铝盐(例如氢氧化铝、磷酸铝、alum(硫酸钾铝)或此类铝盐的混合物)。在其它实施方案中，本文描述的组合物不包含盐。
本文描述的组合物可与施用说明一起包括于容器、包装或分配器中。
可在使用之前储存本文描述的组合物，例如，组合物可冷冻(例如在约-20℃下或在约-70℃下)储存；储存于冷藏条件下(例如在约4℃下)；或储存在室温下。
5.7 预防和治疗用途
本文提供了治疗和预防个体的肠外大肠杆菌(ExPEC)感染的方法，其包括向个体施用本文描述的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)、本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)或本文描述的组合物(参见部分5.6.2)。在一个具体实施方案中，使用本文描述的组合物(参见部分5.6.2)来预防个体(例如人类个体)的ExPEC感染，即，使用本文描述的组合物来针对ExPEC感染对个体接种疫苗。在另一个具体实施方案中，使用本文描述的组合物(参见部分5.6.2)来治疗已经感染ExPEC的个体。
本文还提供了诱导个体的针对ExPEC的免疫反应的方法，其包括向个体施用本文描述的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)、本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)或本文描述的组合物(参见部分5.6.2)。在一个实施方案中，所述个体在施用时具有ExPEC感染。在另一个实施方案中，所述个体在施用时未具有ExPEC感染。
本文还提供了诱导在个体中产生针对ExPEC的调理吞噬抗体的方法，其包括向个体施用本文描述的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)、本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)或本文描述的组合物(参见部分5.6.2)。在一个实施方案中，所述个体在施用时具有ExPEC感染。在另一个实施方案中，所述个体在施用时未具有ExPEC感染。
在一个具体实施方案中，本文提供了预防个体的大肠杆菌(例如ExPEC)感染的方法，其中所述方法包括向有需要的个体施用有效量的部分5.6.2中描述的组合物。本文提供的预防个体的ExPEC感染的方法导致在个体中诱导免疫反应，其包括向个体施用部分5.6.2中描述的组合物。本领域技术人员应理解，本文描述的诱导个体的免疫反应的方法导致对个体接种疫苗以抵抗其O抗原存在于组合物中的ExPEC菌株的感染。
在一个具体实施方案中，本文提供了治疗个体的大肠杆菌(例如ExPEC)感染的方法，其中所述方法包括向有需要的个体施用有效量的部分5.6.2中描述的组合物。
在某些实施方案中，由本文描述的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)、本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)或本文描述的组合物(参见部分5.6.2)诱导的免疫反应有效预防和/或治疗由ExPEC的任何血清型、亚血清型或菌株引起的ExPEC感染。在某些实施方案中，由本文描述的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)、本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)或本文描述的组合物(参见部分5.6.2)诱导的免疫反应有效预防和/或治疗不止一种ExPEC血清型的ExPEC感染。
在一个具体实施方案中，由本文描述的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)、本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)或本文描述的组合物(参见部分5.6.2)诱导的免疫反应有效预防和/或治疗由O25血清型的大肠杆菌引起的感染。在一个具体实施方案中，所述O25血清型是O25B。在一个具体实施方案中，所述O25血清型是O25A。
在一个具体实施方案中，由本文描述的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)、本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)或本文描述的组合物(参见部分5.6.2)诱导的免疫反应有效预防和/或治疗由O1血清型的大肠杆菌引起的感染。在一个具体实施方案中，所述O1血清型是O1A。在另一个具体实施方案中，所述O1血清型是O1B。在另一个具体实施方案中，所述O1血清型是O1C。
在一个具体实施方案中，由本文描述的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)、本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)或本文描述的组合物(参见部分5.6.2)诱导的免疫反应有效预防和/或治疗由O2血清型的大肠杆菌引起的感染。
在一个具体实施方案中，由本文描述的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)、本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)或本文描述的组合物(参见部分5.6.2)诱导的免疫反应有效预防和/或治疗由O6血清型的大肠杆菌引起的感染。
在一个具体实施方案中，由本文描述的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)、本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)或本文描述的组合物(参见部分5.6.2)诱导的免疫反应有效预防和/或治疗由下列大肠杆菌血清型中的两种或更多种引起的感染：O25(例如O25B和O25A)、O1(例如O1A、O1B和O1C)、O2和/或O6。
在一个具体实施方案中，由本文描述的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)、本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)或本文描述的组合物(参见部分5.6.2)诱导的免疫反应有效预防和/或治疗由下列大肠杆菌血清型中的每一种引起的感染：O25(例如O25B和O25A)、O1(例如O1A、O1B和O1C)、O2和O6。
为了治疗具有ExPEC感染的个体或针对ExPEC感染免疫个体，可向个体施用本文描述的单一组合物，其中所述组合物包含一种、两种、三种、四种或更多种本文描述的大肠杆菌抗原。参见部分5.2。或者，为了治疗具有ExPEC感染的个体或针对ExPEC感染免疫个体，可向个体施用多种本文描述的生物缀合物，例如，可向个体施用两种、三种、四种或更多种部分5.4中描述的生物缀合物。或者，为了治疗具有ExPEC感染的个体或针对ExPEC感染免疫个体，可向个体施用多种本文描述的组合物，例如，可向个体施用两种、三种、四种或更多种部分5.6.2中描述的组合物。
在某些实施方案中，在施用本文描述的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)、本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)或本文描述的组合物(参见部分5.6.2)后在个体中诱导的免疫反应有效减少由ExPEC感染导致的症状。ExPEC感染的症状可根据感染性质而变化且可包括但不限于：排尿困难、增加的尿频或尿急、脓尿、血尿、背痛、尿痛、发烧、寒冷和/或恶心(例如在具有由ExPEC引起的泌尿道感染的个体中)；高烧、头痛、颈部僵硬、恶心、呕吐、癫痫发作、嗜睡和/或光敏性(例如在具有由ExPEC引起的脑膜炎的个体中)；发烧、增加的心率、增加的呼吸速率、降低的尿输出、减少的血小板计数、腹部疼痛、呼吸困难和/或异常心脏功能(例如在具有由ExPEC引起的败血症的个体中)。
在某些实施方案中，在施用本文描述的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)、本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)或本文描述的组合物(参见部分5.6.2)后在个体中诱导的免疫反应有效减小患有ExPEC感染的个体的住院可能。在一些实施方案中，在施用本文描述的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)、本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)或本文描述的组合物(参见部分5.6.2)后在个体中诱导的免疫反应有效缩短患有ExPEC感染的个体的住院持续时间。
在另一个方面，本文提供通过施用本文描述的抗体(即本文描述的抗O25B抗体)来预防和/或治疗个体中由O25B血清型的大肠杆菌引起的ExPEC感染的方法。在具体实施方案中，中和抗体系单克隆抗体。
5.7.1 组合治疗
在某些实施方案中，向个体施用本文描述的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)、本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)或本文描述的组合物(参见部分5.6.2)与一种或多种其它治疗剂(例如抗细菌或免疫调节治疗剂)的组合。所述一种或多种其它治疗剂可有益于治疗或预防ExPEC感染或可改善与ExPEC感染相关的症状或病况。在一些实施方案中，所述一种或多种其它治疗剂是疼痛缓解剂或抗发烧药剂。在某些实施方案中，以下列方式施用各治疗剂：间隔小于5分钟、间隔小于30分钟、间隔1小时、间隔约1小时、间隔约1小时至约2小时、间隔约2小时至约3小时、间隔约3小时至约4小时、间隔约4小时至约5小时、间隔约5小时至约6小时、间隔约6小时至约7小时、间隔约7小时至约8小时、间隔约8小时至约9小时、间隔约9小时至约10小时、间隔约10小时至约11小时、间隔约11小时至约12小时、间隔约12小时至18小时、间隔18小时至24小时、间隔24小时至36小时、间隔36小时至48小时、间隔48小时至52小时、间隔52小时至60小时、间隔60小时至72小时、间隔72小时至84小时、间隔84小时至96小时或间隔96小时至120小时。
可组合使用本领域技术人员已知的任何抗细菌剂与本文描述的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)、本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)或本文描述的组合物(参见部分5.6.2)。抗细菌剂的非限制性实例包括阿米卡星、阿莫西林、阿莫西林-克拉维酸、两性霉素-B、氨苄西林、氨苄西林-舒巴坦、安普霉素、阿奇霉素、氨曲南、杆菌肽、苄基青霉素、卡泊芬净、头孢克洛、头孢羟胺苄、头孢胺苄、头孢噻吩、头孢唑林、头孢地尼、头孢吡肟、头孢克肟、头孢甲肟、头孢哌酮、头孢哌酮-舒巴坦、头孢噻肟、头孢西丁、头孢匹罗、头孢泊肟、头孢泊肟-克拉维酸、头孢泊肟-舒巴坦、头孢丙烯、头孢喹肟、头孢他啶、头孢布烯、头孢噻呋、头孢托罗、头孢曲松、头孢呋辛、氯霉素(Chloramphenicole)、氟苯尼考(Florfenicole)、环丙沙星、克拉霉素、克林沙星、克林霉素、氯唑西林、粘菌素、Cotrimoxazol(Trimthoprim/磺胺甲噁唑)、达巴万星、达福普汀/Quinopristin、达托霉素、地贝卡星、双氯西林、多利培南、多西环素、恩氟沙星、厄他培南、红霉素、氟氯西林、氟康唑、氟胞嘧啶、磷霉素、夫西地酸、加雷沙星、加替沙星、吉米沙星、庆大霉素、亚胺培南、伊曲康唑、卡那霉素、酮康唑、左氧氟沙星、林可霉素、利奈唑胺、氯碳头孢、Mecillnam(甲亚胺青毒素(amdinocillin))、美罗培南、甲硝唑、美洛西林、美洛西林-舒巴坦、米诺环素、莫西沙星、莫匹罗星、萘啶酸、新霉素、奈替米星、呋喃妥因、诺氟沙星、氧氟沙星、苯唑西林、培氟沙星、青霉素V、哌拉西林、哌拉西林-舒巴坦、哌拉西林-三唑巴坦、利福平、罗红霉素、司帕沙星、壮观霉素、螺旋霉素、链霉素、舒巴坦、磺胺甲噁唑、替考拉宁、特拉万星、泰利霉素、替莫西林、四环素、替卡西林、替卡西林-克拉维酸、替吉环素、妥布霉素、甲氧苄啶、曲伐沙星、泰洛星、万古霉素、维吉霉素和伏立康唑。
在某些实施方案中，组合治疗包括施用两种或更多种本文描述的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)、本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)和/或本文描述的组合物(参见部分5.6.2)。
5.7.2 患者群体
在某些实施方案中，将本文描述的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)、本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)或本文描述的组合物(参见部分5.6.2)施用于未治疗个体，即不具有ExPEC感染或先前未具有ExPEC感染的个体。在一个实施方案中，将本文描述的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)、本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)或本文描述的组合物(参见部分5.6.2)施用于具有获得ExPEC感染风险的未治疗个体。
在某些实施方案中，将本文描述的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)、本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)或本文描述的组合物(参见部分5.6.2)施用于诊断有ExPEC感染的个体。在一些实施方案中，在症状显现或症状变得严重前(例如在患者需要住院前)，将本文描述的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)、本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)或本文描述的组合物(参见部分5.6.2)施用于感染ExPEC的个体。
在某些实施方案中，将本文描述的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)、本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)或本文描述的组合物(参见部分5.6.2)施用于诊断有UPEC感染的个体。在一些实施方案中，将本文描述的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)、本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)或本文描述的组合物(参见部分5.6.2)施用于患有复发性泌尿道感染的个体。在一些实施方案中，将本文描述的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)、本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)或本文描述的组合物(参见部分5.6.2)施用于患有复发性泌尿道感染、但在治疗时健康的个体。在一些实施方案中，将本文描述的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)、本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)或本文描述的组合物(参见部分5.6.2)施用于具有菌血症或败血症或具有获得菌血症或败血症风险的个体。
在一些实施方案中，待施用本文描述的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)、本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)或本文描述的组合物(参见部分5.6.2)的个体是动物。在某些实施方案中，动物是鸟。在某些实施方案中，动物是犬。在某些实施方案中，动物是猫。在某些实施方案中，动物是马。在某些实施方案中，动物是牛。在某些实施方案中，动物是哺乳动物，例如马、猪、小鼠或灵长类动物。在一个具体实施方案中，个体是人。
在某些实施方案中，待施用本文描述的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)、本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)或本文描述的组合物(参见部分5.6.2)的个体是人类成人。在某些实施方案中，待施用本文描述的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)、本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)或本文描述的组合物(参见部分5.6.2)的个体是50岁以上的人类成人。在某些实施方案中，待施用本文描述的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)、本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)或本文描述的组合物(参见部分5.6.2)的个体是老人个体。
在某些实施方案中，待施用本文描述的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)、本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)或本文描述的组合物(参见部分5.6.2)的个体是人类儿童。在某些实施方案中，待施用本文描述的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)、本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)或本文描述的组合物(参见部分5.6.2)的个体是人类婴儿。在某些实施方案中，待施用本文描述的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)、本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)或本文描述的组合物(参见部分5.6.2)的个体是早产人类婴儿。在一些实施方案中，待施用本文描述的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)、本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)或本文描述的组合物(参见部分5.6.2)的个体是人类幼儿。在某些实施方案中，待施用本文描述的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)、本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)或本文描述的组合物(参见部分5.6.2)的个体不是小于6个月龄的婴儿。
在某些实施方案中，待施用本文描述的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)、本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)或本文描述的组合物(参见部分5.6.2)的个体是怀孕的个体。在某些实施方案中，待施用本文描述的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)、本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)或本文描述的组合物(参见部分5.6.2)的个体是提前1、2、3、4、5、6、7或8周生产的女性。
在某些实施方案中，待施用本文描述的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)、本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)或本文描述的组合物(参见部分5.6.2)的个体是具有增加的ExPEC风险的个体(例如免疫减弱或免疫缺陷的个体)。在某些实施方案中，待施用本文描述大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)、本文描述生物缀合物(参见部分5.4)或本文描述组合物(参见部分5.6.2)的个体是与具有ExPEC感染或具有增加的ExPEC感染风险的个体亲密接触的个体。
在某些实施方案中，待施用本文描述的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)、本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)或本文描述的组合物(参见部分5.6.2)的个体是健康护理工作者(例如医生或护士)。在某些实施方案中，待施用本文描述的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)、本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)或本文描述的组合物(参见部分5.6.2)的个体是免疫减弱(例如患有HIV感染)或免疫抑制的。
在某些实施方案中，待施用本文描述的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)、本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)或本文描述的组合物(参见部分5.6.2)的个体患有糖尿病。在某些实施方案中，待施用本文描述的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)、本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)或本文描述的组合物(参见部分5.6.2)的个体患有多发性硬化症。
在某些实施方案中，待施用本文描述的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)、本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)或本文描述的组合物(参见部分5.6.2)的个体具有需要其使用导管的病况。在某些实施方案中，待施用本文描述的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)、本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)或本文描述的组合物(参见部分5.6.2)的个体具有脊柱损伤。
5.7.3 施用的剂量和频率
有效治疗和/或预防ExPEC感染的本文描述的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)、本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)或本文描述的组合物(参见部分5.6.2)的量取决于疾病性质，且可通过标准临床技术确定。可经由临床医师已知的各种途径来施用O抗原、生物缀合物和/或组合物，例如皮下、肠胃外、静脉内、肌内、局部、经口、皮内、经皮、鼻内等。在一个实施方案中，经由肌内注射施用。
制剂中所采用的确切剂量还将取决于施用途径和感染的严重程度，且应根据从业医师的判断和各个体的情况来决定。例如，有效剂量还可根据以下因素而变化：施用方式、目标位点、患者的生理学状态(包括年龄、体重、健康)、患者是人还是动物、所施用的其它药剂和治疗是预防性还是治疗性的。最佳地，滴定治疗剂量以优化安全性和效力。
在某些实施方案中，采用体外测定以帮助鉴定最佳剂量范围。参见部分5.8。可根据源自体外或动物模型测试系统的剂量反应曲线来外推有效剂量。
在某些实施方案中，用于基于糖缀合物的疫苗(例如包含生物缀合物的组合物)的示例性剂量范围为约0.1μg至400μg碳水化合物/剂量。在其它实施方案中，用于基于糖缀合物的疫苗(例如包含生物缀合物的组合物)的示例性剂量范围为约0.1μg至4000μg蛋白/剂量。在某些实施方案中，用于基于糖缀合物的疫苗(例如包含生物缀合物的组合物)的示例性剂量包含0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50μg碳水化合物/剂量。在某些实施方案中，用于基于糖缀合物的疫苗(例如包含生物缀合物的组合物)的示例性剂量包含50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100μg蛋白/剂量。在某些示例性实施方案中，对于所包括的每种糖缀合物，用于施用人的剂量对应于0.5ml含有约1-10μg(例如约2-6μg，例如约4μg)多糖。
在某些实施方案中，将本文描述的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)、本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)或本文描述的组合物(参见部分5.6.2)以单一剂量的形式施用于个体一次。在某些实施方案中，将本文描述的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)、本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)或本文描述的组合物(参见部分5.6.2)以单一剂量的形式施用于个体，随后在3至6周后施用第二剂量。根据这些实施方案，可在第二次接种后以6至12个月间隔向个体施用加强接种。在某些实施方案中，加强接种可利用不同的大肠杆菌O抗原、生物缀合物或组合物。在一些实施方案中，可重复施用相同大肠杆菌O抗原、生物缀合物或组合物且各施用可间隔至少1天、2天、3天、5天、7天、10天、15天、30天、45天、2个月、75天、3个月或至少6个月。在某些实施方案中，将本文描述的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)、本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)或本文描述的组合物(参见部分5.6.2)以单一剂量的形式每年施用于个体一次。
在某些实施方案中，将本文描述的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)、本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)或本文描述的组合物(参见部分5.6.2)作为2、3、4、5或更多个剂量间隔2周、3周、4周、5周或6周施用于个体。在一些实施方案中，以0.1μg至0.5mg、0.1μg至0.4mg、0.1μg至0.3mg、0.1μg至0.2mg或0.1μg至0.1mg碳水化合物内容物的剂量将2、3、4、5或更多个剂量的本文描述的大肠杆菌O抗原(参见部分5.2)、本文描述的生物缀合物(参见部分5.4)或本文描述的组合物(参见部分5.6.2)间隔2、3、4、5或6周施用于个体。在某些实施方案中，所施用的大肠杆菌O抗原、生物缀合物或组合物每次是相同的。在某些实施方案中，所施用的大肠杆菌O抗原、生物缀合物或组合物每次是不同的。
对于用抗体(例如抗O25B抗体)的被动免疫，剂量的范围可为约0.0001至100mg抗体/kg体重或0.01至5mg抗体/kg体重。例如，剂量可以为1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg范围内，或换言之，对于70kg患者，剂量分别为70mg或700mg或在70-700mg范围内。一个示例性治疗方案需要在一年或数年的时段中每两周施用一次或每月施用一次或每3至6个月施用一次，或以数年间隔施用。间隔可以是不规则的且基于患者中抗体的血液水平而进行改变。
5.8 测定
评价生物缀合物诱导免疫反应的能力的测定
可使用本领域技术人员已知或本文描述的任何方法来评价本文描述的生物缀合物/组合物在个体中生成免疫反应的能力。在一些实施方案中，可通过以下方式来评价生物缀合物在个体中生成免疫反应的能力：用本文描述的生物缀合物免疫个体(例如小鼠)或个体组并用对照(PBS)免疫额外个体(例如小鼠)或个体组。随后可用ExPEC攻击个体或个体组并可测定ExPEC在个体或个体组中引起疾病(例如UTI)的能力。本领域技术人员将认识到，如果用对照免疫的个体或个体组患有随后用ExPEC攻击的疾病，但用本文描述的生物缀合物或其组合物免疫的个体或个体组更少患有疾病或不患有疾病，则生物缀合物能够在个体中生成免疫反应。可通过，例如，免疫测定(诸如ELISA)测试本文描述的生物缀合物或其组合物诱导与来自ExPEC的O抗原交叉反应的抗血清的能力。
体外杀菌测定
可使用血清杀菌测定(SBA)或调理吞噬杀灭测定(OPK)评价本文描述的生物缀合物在个体中生成免疫反应的能力，所述测定代表已用于获得基于糖缀合物的疫苗的批准的成熟的并被接受的方法。此类测定是本领域众所周知的且简而言之包括以下步骤：通过向个体(例如小鼠)施用引发针对目标靶(例如大肠杆菌的O抗原，例如O25B)的抗体的化合物来生成和分离此类抗体。随后，可通过，例如，以下方式来评价抗体的杀菌能力：在所述抗体和补体和(根据测定)中性细胞存在的情况下培养所讨论的细菌(例如相关血清型的大肠杆菌)并例如使用标准微生物方法测定抗体杀灭和/或中和细菌的能力。
5.9 药剂盒
本文提供了药物包装或药剂盒，其包含一个或多个填充有本文描述的组合物(参见部分5.6.2)的一种或多种成分(诸如本文提供的一种或多种大肠杆菌抗原(参见部分5.2)和/或生物缀合物(参见部分5.4))的容器。任选地，此类容器可附带有监管药物或生物产品的制造、使用或销售的政府机构所规定形式的通知，该通知反映该机构已批准用于人施用的制造、使用或销售。本文涵盖的药剂盒可用于个体的上述治疗和免疫方法中。
6. 实施例
方法
凝集
在该方法中，将细胞或裂解细胞物质与含有对于聚合结构(例如O抗原)特异性的抗体的抗血清混合。当抗血清识别细胞结构时，形成可见、不溶性聚集物。通常使用此方法来鉴定O、K和H血清型。参见DebRoy,等人, (2011) Animal health research reviews /Conference of Research Workers in Animal Diseases 12, 169-185。
LPS样品制备用于SDS PAGE分析
革兰氏阴性细胞的LPS由脂质A基质构成，所述脂质A基质用核心寡糖修饰以提供用于O抗原的附接。为了分析临床分离物的LPS，使细胞在37℃下于标准LB培养基中生长24h，且收集OD600为2的对应于1ml培养物的生物质且在1x Lämmli样品缓冲液中裂解并在95℃下温育10分钟。使用1g/l蛋白酶K将提取物在65℃下进一步处理1小时以去除任何蛋白信号。通过SDS PAGE分离处理的提取物且通过银染色或使用适当抗血清的Western印迹来显现LPS。
用于包被ELISA板的LPS制备物
使用由Apicella, (2008) Methods Mol Biol 431, 3-13描述的方法来制备LPS，且进一步如由Perdomo和Montero, (2006) Biotecnología Aplicada 23:124-129所描述进行纯化。
2AB OPS HPLC："LLO指纹分析"
使用此方法来分析UPP连接的OPS的结构。
为了提取UPP-连接的聚糖，使用0.9% NaCl洗涤大肠杆菌细胞并冻干。使用有机溶剂(甲醇：水(M：W=17：3至19：1，v/v)和/或最佳比率的氯仿：甲醇：水混合物(例如C：M：W=10：10：3；v/v/v))提取干燥细胞。在N2流下干燥提取物，且以C：M：W=3：48：47再悬浮。为了纯化所提取的糖脂，使3：48：47再悬浮液通过tC18 Sep-PAK筒。用10ml甲醇调节筒，随后用10ml3：48：47(C：M：W)平衡。在样品上样之后，用10ml 3：48：47(C：M：W)洗涤筒并用5ml甲醇和5ml10：10：3(C：M：W)洗脱。在N2下干燥合并的洗脱液。通过以下水解糖脂样品：将干燥样品溶解于2ml正丙醇：2M三氟乙酸(1：1)中，加热至50℃保持15min，且然后在N2下蒸发至干燥(Glover等人，Proc Natl Acad Sci U S A 102(40): 14255-9)。将干燥样品再一次再悬浮于3：48：47中且通过tC18筒，且在N2下干燥流通物。使用如所述的纸盘方法进行2-AB标记和聚糖净化(Bigge, 等人, Anal Biochem 230(2): 229-38; Merry, 等人, Anal Biochem304(1): 91-9)。
通过HPLC使用GlycoSep-N正相柱根据Royle等人(但改进为三溶剂系统)来分离2-AB标记的聚糖(Royle等人，Anal Biochem 304(1): 70-90)。溶剂A是80%乙腈中的10mM甲酸铵(pH 4.4)。溶剂B是40%乙腈中的30mM甲酸铵(pH 4.4)。溶剂C是0.5%甲酸。柱温为30℃且通过荧光(激发λex=330nm，发射λem=420nm)检测2-AB标记的聚糖。梯度条件是如下线性梯度：在0.4ml/min的速率下经160min 100% A至100% B，随后为2min 100% B至100% C且将速率增加至1ml/min。用100% C洗涤柱5min，经2min返回至100% A且在100% A以1ml/min的速率运行15min，然后使速率返回至0.4ml/min保持5min。在水中注入样品。
去乙酰化测定：
在30℃下干燥一当量的2-AB标记的聚糖，使用(样品)或不使用(模拟物)200mM NaOH(pH ≈ 14)再悬浮于50μl水中，且在37℃下温育25小时。然后使溶液达到室温且通过添加200mM HCl溶液(pH ≈ 1)而中和。在30℃下于速度真空中干燥之后，用2AB再标记样品且通过HPLC分析。
肼解HPLC
使用上述相同正相HPLC技术来分离在肼解之后从生物缀合物释放的OPS。在肼解之前，在N2流下完全干燥对应于1mg蛋白的生物缀合物。使用Ludger Liberate肼解聚糖释放试剂盒(Ludger #LL-HYDRAZ-A2)根据制造商的说明进行多糖释放。简而言之，在N2覆盖层下将450μ1肼添加至干燥样品且在85℃下温育16小时。通过在N2和45℃下蒸发来去除肼。通过在冰上于471μl 4.5%乙酸酐/1M碳酸氢钠中温育两小时来进行多糖的再-N-乙酰化。其后，添加600μl 5% TFA溶液且将样品在冰上再水解一小时。在EB20柱上使用相应缓冲液EB20 A和B进行纯化。
用2-AB标记释放和纯化的多糖且通过NP-HPLC分析，如对于LLO样品所述。收集目标峰且通过MS/MS鉴定。
HPLC峰的MS和MS/MS
为了分析目标OPS分子上的单糖序列，进行质谱分析。将对应于特定HPLC峰的干燥、收集的级分再悬浮于5ul 10%乙腈(ACN)、0.1%三氟乙酸(TFA)中且以1：1与基质溶液(50%ACN、0.1% TFA中的40mg/ml DHB)混合于目标板上。以正离子模式在Ultraflex-II MALDI-ToF/ToF质谱仪(Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany)上人工获取MS和MS/MS数据。使用LIFT方法获得MS/MS。使用标准肽混合物(Bruker Daltonik GmbH)用于外部校准。使用Flex分析软件(Bruker Daltonik GmbH)输出光谱并人工分析。
宿主细胞
通过重组大肠杆菌细胞表达，经由质粒、载体蛋白和来自空肠弯曲杆菌(PglB)的寡糖基转移酶和来自粘粒或染色体插入突变体的OPS来产生生物缀合物。
使用基因脱毒的EPA(来自绿脓假单胞菌的含有突变L552V、△E553的外毒素A)作为载体蛋白，且进行修饰以包含2或4个糖基化位点(在本文中分别称为2S-EPA和4S-EPA)和C末端HIS标签，且从源自pBR322的阿拉伯糖诱导型质粒进行表达(参见Ihssen等人(2010)Microbial cell factories 9, 61)。
从pGVXN579表达MBP(麦芽糖结合蛋白)，一种天然周质、可溶性大肠杆菌蛋白。pGVXN579是修饰的pMAL-p2X (New England Biolabs)质粒，其编码三个连续的细菌N糖基化共有序列，随后为C末端融合至质粒上编码的麦芽糖结合蛋白ORF的Myc-Tag。此设置允许亲和纯化MBP生物缀合物，而不依赖于HIS标签。表达诱导通过tac启动子控制且可使用IPTG诱导。
从质粒pEXT21(来自pMAF10的EcoRI/BamHI片段)表达PglB蛋白(Feldman等人，2005, PNAS USA 102(8):3016-3021)且克隆至具有C末端融合的HA标签的pEXT21中。表达质粒的变化型式包括密码子优化(pGVXN939)、缺失糖基化位点的密码子优化(pGVXN948)和去除HA-T标签(pGVXN970)以及密码子优化和缺失HA标签(pGVXN971)。
使用凝集、Western印迹、银染色、LLO指纹分析、PCR血清分型或允许鉴定OPS结构特征的类似技术分析临床分离物合成特定OPS的能力，且还分析其抗生素抗性表型。进一步使某些临床分离物染色体缺失连接酶WaaL以增强用于蛋白糖基化或OPS分析的OPS可用性。
为了进一步分析临床分离物，通过从临床分离物克隆的rfb簇代替实验室菌株W3110的rfb簇，且分析OPS生物合成。使waaL基因缺失以增强生物缀合物产生的效率。
通过同源重组使用优化方法(参见国际专利申请号PCT/EP2013/068737)或公开程序(Datsenko和Wanner, (2000) Proc Natl Acad Sci U S A 97, 6640-6645)实现簇交换和waaL缺失。对于OPS簇交换，将临床分离物的目标rfb簇与抗生素抗性盒一起克隆至反选择质粒pDOC-C中，用于随后整合至大肠杆菌菌株W3110的rfb基因座中(Kuhlman和Cox,Nucleic acids research 38, e92; Lee 等人, 2009, BMC Microbiol 9, 252)。通过使用侧接W3110的长度为0.5至1.5千碱基的rfb簇编码序列的DNA并使来自质粒携带的rfb的插入DNA体内线性化来同源重组目标大rfb簇。所得菌株含有替换的rfb簇(有和没有抗生素抗性盒)，即用从临床大肠杆菌分离物分离的类似段替换W3110的rfb簇成为gale和gnd基因之间的DNA分子。
在某些实验中，使用含有编码给定大肠杆菌血清型的rfb簇的粘粒的W3110菌株作为宿主菌株。
为了产生基于W3110的菌株中重组表达的生物缀合物，缺失干扰重组OPS产生的W3110携带的基因。例如，为了产生O25B生物缀合物的宿主细胞，缺失W3110的gtrABS簇。为了实现这一点，根据公开方法(Bloor AE, Cranenburgh RM. Appl Environ Microbiol.2006 Apr;72(4):2520-5.)使用侧接gtrA基因上游和gtrS基因的下游的同源性序列进行同源重组。
为了组装产生菌株，用pglB和载体表达质粒通过转化来转化宿主菌株。参见Wacker等人，2002, Science 298:1790-1793。
生物缀合物产生
通过使宿主细胞生长且纯化在周质间隙中产生的生物缀合物来进行生物缀合物产生。在振荡烧瓶中或在工业规模进料分批发酵方法中进行生长。
在37℃下使用由terrific培养液中的适当抗生素构成的培养基(有时补充有5mMMgCl2)进行振荡烧瓶培养。以0.05的OD用来自新鲜转化的产生细胞的过夜培养物接种培养基，生长，直至对数中期，用0.2%阿拉伯糖和1mM IPTG诱导，进一步生长且在生长20h之后收获。
进料分批发酵
使用产生细胞系库的等分试样接种含有具有适当抗生素的大豆LB培养基的振荡烧瓶。将振荡烧瓶在180rpm和37℃下温育大约12小时。将不含补体的批料培养基在生物反应器内侧直接灭菌(33min，在≥ 121℃下)，冷却，且添加补体。将4M KOH或25%磷酸添加至发酵器中，用于pH调整且将pH调节至pH7。接种生物反应器和来自预培养的分批培养物以得到0.005的初始OD600。通过添加4M KOH或25%磷酸来稳定维持pH。维持溶解氧张力(DO)。将顶压力维持于600毫巴。用L-阿拉伯糖(0.1%)和/或IPTG(1mM)诱导产物形成。在诱导之后，立即通过添加含有2.5%阿拉伯糖和IPTG的进料培养基来开始进料。在诱导之后24±2小时，将生物反应器冷却至25℃，停止进料且通过切向流过滤或离心进行收获。
在0.5% Triton X-100中通过破裂在4个循环的高压均质化期间于800巴下裂解生物质。
通过柱色谱纯化生物缀合物。使用各种色谱技术来制备生物缀合物，所述技术主要为IMAC、基于Q树脂的阴离子交换色谱(AEC)和大小排阻色谱(SEC)。关于此类方法的描述，例如参见Saraswat等人，2013, Biomed. Res. Int. ID#312709 (p. 1-18)和WO 2009/104074。
产生生物缀合物用于临床前实验
从预培养物，在35±0.2℃下，将定义量转移至含有丰富培养基的生物反应器中。维持pH和溶解氧张力。搅动速率达到700rpm。
在细胞密度达到OD600 = 40 ± 5时，用L-阿拉伯糖(0.1%)和IPTG(1mM)诱导产物形成。在诱导之后24±2小时开始进料且冷却生物反应器。温度一达到25℃就停止进料，且收集细胞。
高压均质化
将对应于收获时50L的生物质在2至8℃下解冻1天。然后向容器中添加2.5L裂解和澄清缓冲液。添加Triton X-100至0.5%的最终浓度且通过4个循环的高压均质化在800巴下破裂完全解冻的细胞。收获细胞且使用标准技术洗涤。
单糖组成分析：
将含有大约8ug多糖的生物缀合物在99℃下于104μl 3M TFA中水解6小时。通过蒸发去除TFA且使用500μl 2-丙醇将样品洗涤一次。将所得单糖悬浮于100μl含有87.1mg/ml 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、50% MeOH和150mM NaOH的标记混合物中。在70℃下于60分钟期间进行标记。通过添加50μl 300mM HCl和20μl 100mM Tris/HCl(pH 7.0)来中和样品。通过用1ml二丁基醚萃取一次且使用1ml CHCl3萃取三次来纯化PMP标记的单糖。
通过RP-HPLC (Merck-Hitachi)在配备有预置柱的C18 Inertsil ODS-3柱(GLSciences)上来分离PMP衍生化的单糖。在35℃和1ml/min的速率下应用以下两步骤梯度：100%缓冲液A(13%乙腈、87% H2O(0.045% KH2PO4、0.05%三乙胺，pH 7.0)经4分钟至50%缓冲液A/50%缓冲液B(21%乙腈、79% H2O(0.045% KH2PO4、0.05%三乙胺，pH 7.0)经47分钟至100%缓冲液B。注射体积为50μl且通过在250nm下的在线UV检测来监测洗脱。通过与市售单糖标准品D-葡萄糖(Sigma-Aldrich #G7528)、L-鼠李糖(Sigma-Aldrich #R3875)、N-乙酰基-D-葡萄糖胺(Sigma-Aldrich #A8625)和N-乙酰基-L-岩藻糖胺(Omicron Biochemicals#FUC-006)的色谱图的叠加来鉴定单独的峰。
实施例1：流行病学
为了测定引起泌尿道感染(UTI)的大肠杆菌的血清型分布，进行了流行病学研究。从瑞士的个体收集来自人尿样品的超过1800份大肠杆菌分离物且使用经典凝集技术分析来自各样品的O抗原血清型(OPS)。参见图4。
分析分离的人尿样品以测定其中的病原体的身份和其抗生素抗性模式。在分析后从样品获得大肠杆菌分离物。通过涉及在铬(CPS3)和MacConkey琼脂上生长的经典微生物排除和纳入策略来鉴定大肠杆菌分离物。使用凝集测定进一步分析大肠杆菌分离物以测定其O抗原血清型。参见DebRoy等人 (2011) Animal health research reviews /Conference of Research Workers in Animal Diseases 12, 169-185。进一步分析来自相同O抗原血清组的分离物以测定来自各分离物的O链的化学结构。参见表1A。某些分离的大肠杆菌菌株被测定为抗生素抗性的，包括鉴定氟喹诺酮抗性菌株和产生广谱β-内酰胺酶(ESBL)的菌株。
表1A：来自在2012年于瑞士收集的1841份尿样品的集合的最常见UTI-相关大肠杆菌血清型的分布。显示了来自671名个体的相关亚群体的样品的血清型分布和来自所有**样品的分布。
不依赖于位置、分离时间、症状和目标群体，而从个体分离出了血清型O1、O2、O4、O6、O7、O8、O16、O18、O25、O73和O75，表明这些是尿路病原性大肠杆菌(UPEC)的主要血清型。因此，最普遍的O抗原血清型的鉴定表明，O抗原特异性疫苗可限于血清型子集，即与疾病最相关的那些，如在本实施例中描述的研究中所鉴定。
在美国过去三十年从大肠杆菌参考中心(ECRC)获得的1323份分离物中UTI血清型的回顾性分析允许与文献和来自瑞士的当前数据进行充分比较。不依赖于位置、分离时间、症状或目标群体而发现了最主要20种血清型的患病率且表明其为与UPEC相关的主要血清型(参见表1B)。
表1B：来自所选文献(范围为1987- 2011)和来自2000-2011的回顾性分析美国数据(ECRC)的最常见UTI相关血清型的患病率。
适应症 总UTI 膀胱炎 肾盂肾炎 US 2000-2010
来自1860份分离物的可用数据 来自1089份分离物的可用数据 来自373份分离物的可用数据 315(除粪便外的所有UTI样本，所有年龄，F+M)，不可分型的数目均不可用！
血清型
O1 4.8% 4.1% 5.4% 7.0%
O2 7.1% 4.9% 15.3% 14.0%
O4 7.8% 6.0% 3.2% 3.2%
O6 16.9% 16.3% 7.8% 18.7%
O7 3.3% 2.4% 2.4% 1.9%
O8 1.7% 3.2% 0.8% 3.5%
O15 0.6% 1.5% 0.8% 1.3%
O16 4.3% 3.2% 7.2% 1.9%
O18 7.0% 7.1% 6.7% 7.0%
O21 na na na 1.3%
O22 0.6% 0.6% 0.5% 0.0%
O25 3.0% 4.8% 0.5% 8.6%
O75 7.5% 6.0% 8.6% 3.8%
O83 1.9% 0.7% 0.5% 1.3%
O20 1.6%
O77 2.2%
O82 1.9%
其它和不可分型/不可用 33.3% 39.2% 40.2%
其它O-型(NT不可用) 21.0%
将来自所述血清型的分离物计算为基于分离物的总数的百分比(Andreu等人,1997, J Infect Dis 176:464-469; Blanco等人, 1996, Eur J Epidemiol 12:191-198;Fathollahi等人, 2009, Iranian Journal of Clinical Infectious Diseases 4:77-81; Johnson等人, 2005, J Clin Microbiol 43:6064-6072; Molina-Lopez等人, 2011,Journal of infection in developing countries 5:840-849;Sandberg等人, 1988, J Clin Microbiol 26:1471-1476; K. L. 2007, The Journal of infection 55:8-18;Terai等人, 1997, Int J Urol 4:289-294.)在某些情况下，特定数据不可用；因此，百分比数值仅可基于来自所述研究中的不同UTI分离物的整体血清型分布给出适应症且应当谨慎考虑。还包括其它经鉴定但较不普遍的所述血清型(O15、O20、O21、O22、O77和O82)。
综合来自流行病学分析的所有信息，假设涵盖不可分型菌株的子部分，10种主要血清型可涵盖估计60-80%的大肠杆菌感染。另外，当与文献数据和来自美国的新近数据比较时，数据显示O25血清型在来自瑞士的流行病学研究中有着出人意料的重要性。参见表1A和B。
大肠杆菌的O抗原血清型通常由不同但在结构和抗原性上类似的亚型构成。为了鉴定收集的临床分离物中的未知/未报道的亚型且为了鉴定最普遍的O抗原亚型，更详细分析了来自最普遍血清型的O抗原的化学结构。
实施例2：大肠杆菌O25
近年来，已观察到O25阳性菌株的发生增加(参见George和Manges (2010) EpidemiolInfect 138, 1679-1690)且通过实施例1中描述的研究证明，其中发现O25血清型在患病率方面的最主要4种大肠杆菌血清型之一。
O25A
先前已公开大肠杆菌O25血清型的O抗原重复单元结构(参见Kenne等人，Kenne etal., 1983, Carbohydrate Research 122, 249-256;和Fundin等人, 2003, MagneticResonance in Chemistry 41, 4)且呈现于图2B中。与来自大肠杆菌菌株E47a的O25 O抗原相关的rfb簇可公开获得(Genbank GU014554)且呈现于图2A中。使用大肠杆菌E47a作为用于O25血清分型的参考菌株。其它rfb簇序列信息可从引起无症状菌尿症的菌株大肠杆菌83972的基因组序列获得。(参见Zdziarski等人，PLoS Pathog 6, e1001078)。尽管未证实表型O25表达，但大肠杆菌E47a和83972的rfb簇序列是99.49%相同的，强烈表明其编码相同O抗原。
来自大肠杆菌菌株83972和E47a的O抗原在本文中指定为"O25A"，因为如下所述，新颖大肠杆菌O抗原(指定为"O25B")基于在上文实施例1中描述的流行病学研究中获得的临床分离物的分析来鉴定。
已提出大肠杆菌菌株83972和E47a的预测基因产物的功能性。参见表2；GenBankGU014554；和Szijarto,等人 (2012) FEMS Microbiol Lett 332, 131-136。
表2. 来自rfb簇的O25A O抗原基因预测，如Wang, 等人(2010) J ClinMicrobiol 48, 2066-2074所公开；还参见GenBank GU014554。
结构和基因簇的比较表明，O25A OPS的组装所需的所有功能都于galE和gnd之间的rfb簇内编码。rfb基因簇(参见图2A)的各种酶的功能如下：
RmlBDAC编码dTDP-L-鼠李糖的生物合成所需的酶，所述dTDP-L-鼠李糖是将L-Rha支链添加至OPS重复单元的底物。
FnlABC编码UDP-L-FucNAc的生物合成所需的酶，所述UDP-L-FucNAc是将L-FucNAc添加至O25 OPS重复的供体底物。
WekABC和wbuBC是根据同源性分析的糖基转移酶。然而，wbuC表现为短的并且截短的而不太可能具有功能。因此，最可能的功能注释表明，存在四种糖基转移酶，其生成用于组装重复单元的四种连接。
需要Wzx和Wzy以使BRU翻转至周质间隙中且使其在Und-PP上聚合。
合成公开的O25A重复单元结构所需的所有功能都由大肠杆菌E47a和83972 rfb簇编码。因此得出结论，rfb簇负责编码O25A OPS。
O25B
在2009年，表征来自西班牙医院环境的临床大肠杆菌分离物以测定克隆组。参见Blanco等人(2009) J Antimicrob Chemother 63, 1135-1141。进行以下的表征：a)ESBL类型，b)O血清型，c)毒力基因，d)多基因座序列分型(MLST)，和e)脉冲场凝胶电泳分型(PFGE)。结果表明，所有分离物中的约20%可归于相同克隆：血清型和MLST O25：H4 ST131，ESBL类型CTX-M15，Phylogroup B2，其编码特定组的毒力基因。当与来自E47a菌株和也来自由等位基因特异性PCR分型方法鉴定的临床分离物的分型菌株序列相比时，代表性临床分离物的rfb簇组分的分析显示未知的3’序列(参见Clermont等人, 2008, J AntimicrobChemother. 61(5):1024-8.; Clermont等人, Diagn. Microbiol Infect Dis. 2007, 57(2):129-36.; and Li,等人, 2010, J Microbiol Methods 82, 71-77)。在2013年，Phan等人公开了克隆O25b：H4 ST131的基因组序列，证实该克隆是与如先前所报道的其waa基因簇的结构一致的K-12衍生物。参见Phan等人，2013, PLOS Genetics 9(10):1-18(e1003834)。总而言之，数据表明，新颖O25凝集克隆已出现于从医院环境分离的大肠杆菌中，且该克隆具有特异性ESBL、MLST和PFGE表型且含有改变的O抗原基因簇。
PCR分型
为了确定O25B血清型是否存在于实施例1中描述的流行病学研究中鉴定的分离的大肠杆菌菌株中，通过针对O25和O25B的分型PCR来分析O25凝集阳性菌株。使用挑选自petri培养皿的克隆作为模板DNA来源和不同寡核苷酸引物来进行PCR。使用基于E47a O25 wzy的扩增且描述于Li等人(2010) J Microbiol Methods 82, 71-77中的O25特异性引物。还使用描述于Blanco等人 (2009) J Antimicrob Chemother 63, 1135-1141中的O25B特异性引物，其对于O25b rfb簇(LNB220)的未定义3’部分是特异性的。根据Phan等人，2013，此O25B特异性寡核苷酸对在O25B rfb簇的3’部分中退火。
在24份具有O25凝集阳性表型的测试的临床分离物中，通过PCR分型将20份指定为O25B血清型，而剩余4份通过PCR分型阳性鉴定为属于O25A血清型。因此，令人惊讶的是，在所分析的菌株中，O25B血清型菌株被确定为比O25A血清型的菌株更常见。
簇测序
为了基因分析O25B rfb簇，对O25B PCR阳性菌株(指定为"upec138")的簇进行测序。鉴定的基因和其最密切相关的蛋白同系物连同提出的命名列于下表3中。用星号指示特异于O25B且不存在于O25A中的基因。
表3. 来自rfb簇的O25B O抗原基因预测。
基因名称 假设功能 最有意义的同源性/蛋白[生物体]，登录号，最大同一性(BLAST)
rmlB dTDP-葡萄糖4,6-脱水酶 rffG基因产物[大肠杆菌NA114], YP_006139244, 99%
rmlD dTDP-6-脱氧-D-葡萄糖3,5-差向异构酶 dTDP-4-脱氢鼠李糖还原酶[大肠杆菌NA114], YP_006139243, 100%
rmlA 葡萄糖-1-磷酸胸苷基转移酶 rffH2基因产物[大肠杆菌NA114], YP_006139242, 100%
rmlC dTDP-4-脱氢鼠李糖3,5-差向异构酶 dTDP-4-脱氢鼠李糖3,5-差向异构酶[大肠杆菌NA114], YP_006139241, 99%
Wzx Wzx, O抗原翻转酶 Wzx [大肠杆菌菌株E47a], ADI43260, 99%
wekA 糖基转移酶(GT) dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP α-1,3- 鼠李糖基转移酶[大肠杆菌83972], ZP_04004894, 93%
wekB 葡萄糖基转移酶(GT) UDP-Glc:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP β-1,6- 葡萄糖基转移酶[大肠杆菌83972],YP_006106413, 93%
Wzy O抗原聚合酶 膜蛋白[大肠杆菌83972], YP_006106412, 94%
wbbJ* O-乙酰基转移酶 O-乙酰基转移酶[大肠杆菌83972], YP_006106411, 95%
wbbK* 糖基转移酶(GT) UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP α-1,3- 葡萄糖基转移酶[大肠杆菌K-12],AAB88407, 60%
wbbL* 葡萄糖基转移酶(GT) 脂多糖生物合成蛋白，C-末端片段，截短蛋白[大肠杆菌DH1], YP_006129367,62%; dTDP-Rha:GlcNAc-UPP α-1,3-鼠李糖基转移酶
簇组合物rfb显示与O25A簇的组合物的显著差异。该簇的5’部分中的基因是彼此的密切同系物(rmlD至wzy；大肠杆菌E47a和83972)。这对于rml基因是不令人惊讶的，所述rml基因在许多合成L-鼠李糖的大肠杆菌菌株中是同源的。在降至低于25%同一性的水平之前，O25A和B的基因产物的同源性到达wekC (O25A)基因中，表明蛋白序列的无关性。参见图3B。进一步发现，O25A的UDP-N-乙酰基岩藻糖胺生物合成基因不存在于菌株upec138(O25B)中，如同fnlABC下游的两种糖基转移酶。参见图3B。总而言之，此数据表明，O25B菌株不能合成UDP-L-FucNAc，除了L-FucNAc生物合成基因可于rfb簇外侧编码。然而，当L-FucNAc存在于O抗原的BRU中时，关于rfb簇外侧的fnlABC基因座没有一例报道。因此，菌株138能够合成公开的O25A基本重复单元(BRU)是不可能的。
在O25B rfb簇中鉴定的不存在于血清型O25A的rfb簇中的基因编码两种糖基转移酶和O-乙酰基转移酶。该三种基因共享相同的组织且编码的蛋白与发现且表征于O16 rfb簇基因型的大肠杆菌的K-12菌株中的wbbJKL基因具有高度同源性。参见图3B。根据O25B和O16血清型之间的基因相关性，O16 rfb基因wbbJKL的命名适用于O25B rfb簇中鉴定的同源基因。
已知O16 BRU的结构且已测定wbbJKL的基因功能。参见Steveneson等人(1994) JBacteriol. 176(13):4144-56。WbbJKL负责L-鼠李糖的乙酰化，将D-Glc残基转移至L-Rha-D-Glc-UndPP，且将L-Rha转移至D-GlcNAc-UPP(其通过来自ECA簇的wecA形成)中。基于与O16 WbbJKL的同源性和O16 WbbJKL的已知功能，据推断，O25B rfb簇合成一起含有部分O16和部分O25A元件的结构。其原因在于非常可能是，WbbJKLO25B与WbbJKLO16合成相同结构，即α-D-Glc-1,3-α-L-Rha(2Ac)-1,3-α-D-GlcNAc。此三糖结构与O25A的无支链"核心"骨架相同，唯一区别在于L-Rha(2Ac)代替L-FucNAc。该代替因此是保守代替，因为D-FucNAc和L-RhaOAc均为具有6-脱氧基和2-乙酰基功能的单糖。唯一差异在于构型，因为岩藻糖与半乳糖相关，且鼠李糖与甘露糖相关，导致在3位的OH基团和5位的甲基处的不同定向。单糖之间的连接是相同的(都是α-1,3)，表明该结构在形状和化学特征方面是类似的。类似地，编码于O25A和B rfb簇的上游部分中的蛋白(rmlDCAB和wekAB)通过将支链D-Glc和L-Rha附接至任一"核心"骨架三糖上而使O25A或B的BRU支链化。这意味着其接受任一骨架(具有L-FucNAc或L-Rha(2Ac))作为底物。
L-Rha作为来自O25B BRU的还原端的第二单糖的存在解释了L-FucNAc生物合成为何可以不存在于O25B中。UDP-L-FucNAc是不需要的，因为其被存在于簇(rmlDBAC)的5’端中的dTDP-L-Rha生物合成基因代替。
Phan等人，在2013年对O25B临床分离物进行了类似的基因分析，但结论不同。他们也对整个基因组进行测序以搜索UDP-FucNAc生物合成基因簇；然而，他们记载，用于菌株O25B:H4 ST131 EC958中的UDP-L-FucNAc的机构不仅在O25B rfb簇中缺失，而且在整个菌株中缺失。然而，Phan得出结论，假设O25B:H4 ST131 EC958与E47a制备相同的O抗原结构(即O25A)，则UDP-L-FucNAc必须以不同方式合成。相反，本文公开了，最可能情形为，O25B菌株不能制备L-FucNAc，但反而用O-乙酰化L-鼠李糖残基代替BRU的第二残基，且此变化所需的基因排他性地编码于rfb簇中。
此外，在O25B簇中存在O-乙酰基转移酶同系物表明在O25BBRU中的O-乙酰化，O25A中不存在的修饰。因此，确定来自血清型O25A和O25B的O25抗原的结构必须是不同的。
O25B结构分析
为了证实不同O25抗原结构的假设，分析实施例1中描述的O25临床分离物的O抗原的化学组成和排列。为了更详细地表征O25 OPS结构，使用几种方法。
首先，通过SDS PAGE分析O抗原结构。使用不同染色方法在SDS PAGE之后分析来自临床分离物的脂多糖(LPS)的电泳迁移率的差异。为了显现LPS量，进行银染色和抗O25特异性的Western印迹。参见图5，其描绘10种分离物的分析结果。数据显示，通过不同LPS制备物的银染色获得类似信号强度。相反，用特异性抗血清的探测在10种样品中的3种(分离物upec436、upec767、upec827)中显示更强的信号强度。据推测，由于OPS结构的差异而产生不同信号强度。
为了详细阐明O25B结构，应用不同分析方法。临床分离物upec138通过PCR是O25B阳性的，且O25凝集抗血清对其的识别弱于O25A菌株。参见图5。此外，该菌株是ESBL，但对于FOS、IPM和TZP是敏感的，且对于AM、CXM、NOR和CIP是抗性的。另一种临床分离物，菌株upec436，通过PCR是O25B阴性的，但通过PCR是一般O25(O25A)阳性的。还发现，当通过Western印迹分析其LPS时，upec436与O25凝集抗血清是强烈反应的。参见图5。提取来自两种菌株的LLO，用2AB标记且通过正相HPLC分析。参见图6；upec138和upec436的LLO，9.079和9.081)。洗脱模式显示两种提取物之间的显著差异。菌株特异性峰的MS/MS分析检测到与预期BRU结构一致的信号。
菌株upec436中的信号(9.081)：通过MS分析62’洗脱时间处的峰且发现含有m/z=1021Da的分子作为主要物质，即对应于完整O25A OPS BRU的预期物质的分子。MS/MS产生与O25A的单糖序列一致的片段化模式(图7A；m/z=1021的MS/MS)。
菌株upec138中的信号：50’洗脱时间处的峰中的主要物质是m/z 1022Da，即比完整O25A重复单元多一个Da。MS/MS分析(图7B；O25B MS/MS)显示与O25A重复单元几乎相同的片段化行为，且以1Da差异位于来自还原端的第2单糖(通过O25A MS/MS中的m/z=551的片段化Y离子鉴定，且通过菌株upec138中m/z=552的片段化Y离子鉴定)。60’处的额外洗脱峰显示类似的片段化，但母体离子物质(m/z=980)中的42Da差异，其位于相同单糖(m/z=510)，即来自还原端的第二单糖。这些结果的解释在下文中给出。
OPS提取、水解和2AB标记程序涉及酸处理以从OPS去除Und-PP。据显示，处理条件部分地去除O-乙酰化，但并不去除N-乙酰化。因此，60’处的峰可能代表源自50’峰的材料的化学水解的去乙酰化BRU物质。总而言之，此数据表明，在O25B中与O25A的L-FucNAc中存在N-乙酰化的相同单糖位置处存在O-乙酰化。
为了化学证实来自还原端的第二残基处的乙酰化是O-连接的，进行去乙酰化测定。从O25B PCR阳性菌株收集在50’洗脱时间处来自2AB LLO HPLC的O25B特异性峰且用在"方法"下描述的碱进行处理。通过HPLC的再分析导致含有m/z=979的主要物质的60’洗脱时间处的峰，如来自图6的O25B峰中所鉴定，其中MS/MS片段化离子模式与已失去O-乙酰基的O25B BRU一致。N-乙酰基对于碱处理是稳定的，如通过相同分子中还原端D-GlcNAc中的剩余N-乙酰基所示。
总而言之，据确定，O25B代表性菌株upec138在结构上和基因上与来自大肠杆菌的O25A和O16 OPS相关(图3A和B)。O25B与O25A的不同在于在重复单元的第二单糖处具有含有O-乙酰基代替N-乙酰基的重复单元结构，其为L-Rha残基而非D-FucNAc。这些变化最可能通过由编码两种糖基转移酶和O-乙酰基转移酶的DNA段代替UDP-FucNAc生物合成机构和D-FucNAc转移酶所引起。基于同源性和功能性分析，这些基因与O16基因簇相关。最终结构是不同但类似的，阐释了用O25凝集抗血清观察到的交叉反应性。
如上所讨论，基于其rfb簇的分析推论且提出，O25A OPS含有L-FucNAc，而该结构不存在于O25B中。为了研究FucNAc是否不存在于O25B中，使用上述PMP标记方法和HPLC分析方法进行O25A和O25B菌株中产生的EPA生物缀合物的单糖组成分析(图9)。为了产生生物缀合物，制备具有O25A和O25B表型的临床大肠杆菌分离物，且修饰用于最佳生物缀合物产生。作为修饰的一部分，使来自菌株upec_436(O25A)和uepc_138(O25B)的waaL基因缺失，如先前所述(参见Datsenko和Wanner, (2000) Proc Natl Acad Sci U S A 97, 6640-6645)和用于核心类型测定的方法所知(参见Amor等人(2000) Infect Immun 68, 1116-1124)。用用于4S-EPA的表达质粒(pGVXN659)和寡糖基转移酶PglB的表达质粒(pGVXN939)(用于O25A产生)且用pGVXN114和pGVXN539(产生2S-EPA)(用于产生O25B生物缀合物)来转化所得菌株。在2L振荡烧瓶中产生O25B生物缀合物，随后通过IMAC从周质提取物亲和纯化。通过进料分批发酵产生O25A缀合物，且通过两步骤纯化程序从通过高压均质化(如上文方法部分中所述)生成的澄清的全细胞均质物开始进行纯化。如上文所述进行单糖组成分析。
结果证实不存在源自O25B的生物缀合物中的FucNAc的信号，而含有O25A的生物缀合物显示在预期洗脱时间处的峰，如通过使单糖的混合物进行相同样品处理程序(作为对照)所测定。因此证实，如基于rfb簇的分析所预期，O25B的假设结构为L-FucNAc-less。
在EPA载体蛋白部分的部分酶消化之后，通过生物缀合物的核磁共振测定来自大肠杆菌O25B O-抗原的O-抗原多糖(O-PS)的重复单元(RU)的完整结构。分析证实，O25B O-PS由五糖RU构成。通过2D NMR关联技术指定1H和13C信号，其证实O25B O-PS RU的结构与公开的O25A O-PS RU结构(Kenne, L., 等人1983. Carbohydr. Res. 122:249-256;Fundin, J., 等人2003. Magn. Reson. Chem. 41:202-205)的不同在于α-3-FucpNAc残基被α-3-Rhap残基取代，其中多于90%的此残基在C2位处是O-乙酰化的。下面显示完整O25BO-PS RU(O25B’)：
。
生物缀合物的产生和表征
为了进一步分析O25A和O25B多糖抗原，产生更多生物缀合物材料。对于O25A，来自上文的O25A-EPA的纯化批料用于其它表征实验。对于O25B-EPA产生，用质粒pGVXN1076和pGVXN970构建具有基因组整合的O25B簇的菌株：W3110 ΔwaaL ΔgtrABS ΔrfbO16::rfb(upec138)。从W3110开始通过Datsenko和Wanner的方法和用于将较大插入物定向整合至细菌染色体中的同源重组技术来构建此菌株(参见国际专利申请号PCT/EP2013/071328)。
使用标准释放和表征测定来表征所得O25B生物缀合物。使用两个连续阴离子交换和大小排阻色谱步骤来纯化生物缀合物，分别得到97.2%和98.1%纯O25A和O25B生物缀合物制剂。使用SDS PAGE定量用于纯度分析。参见图10(O25A)和图11(O25B)。基于糖定量通过蒽酮测定(参见Laurentin和Edwards, (2003) Anal Biochem 315, 143-145)和针对蛋白浓度的BCA测定来计算糖/蛋白比率，得到O25A和O25B生物缀合物的40.2%和26.6%的比率。分析型大小排阻色谱显示与具有附接聚糖链的EPA的预期流体动力学半径一致的颗粒的单体状态。
应用
为了探究O25B结构的免疫原性潜能，使用O25B和O25A生物缀合物进行几种临床前实验。如图5中所示，实施例1中鉴定为O25阳性的所有临床分离物(即O25A和O25B分离物两者)对Western印迹中常用于检测O25血清型(对来自O25A菌株E47a的血清进行分型)的O25A抗血清是阳性的。因此，抗O25A抗血清似乎与来自O25B菌株的LPS是交叉反应的。为了详细分析抗体反应和交叉反应性，产生O25生物缀合物。使用麦芽糖结合蛋白(MBP)作为载体蛋白，且使载体蛋白连接至O25A或O25B。表4描绘用于蛋白产生的菌株。通过PCR针对其O25A或B基因型鉴定所用菌株。在TB培养基中进行表达且从周质提取物纯化蛋白产物。
表4：
生物缀合物 菌株 pglB质粒 载体治疗 纯化程序
MBP-O25A upec436 ΔwaaL::kanR pGVXN939 pGVXN659 Q, A
MBP-O25B upec350 ΔwaaL::clmR pGVXN939 pGVXN659 Q, A, S
Q：Resource Q纯化；A：直链淀粉树脂；S：大小排阻色谱。
使用标准兔免疫方案(eurogentech 28天快速方案)用获得的生物缀合物进行免疫。在第0、7、8和18天注射50μg结合至MBP的多糖与专属弗氏游离免疫刺激性化合物。测试在第一次免疫之后第28天获得的所得最终血液抗血清对于O25A或O25B LPS的特异性。图22显示对各个LPS(O25A或O25B)的抗血清反应性的比较。从upec436和upec138通过在SDS-PAGE Lämmli缓冲液中蛋白酶K消化全细胞样品来制备LPS。将相同量的LPS上样至两个SDS-PAGE凝胶中，随后电转移至硝基纤维素膜且使用O25A和O25B抗血清进行检测。结果显示，O25A抗血清比O25B LPS更好地识别O25A LPS，而O25B抗血清比O25A LPS更好地识别O25BLPS。此结果指示，自体抗原产生更好的抗原。因此，将O25B抗原包括入疫苗中比O25A抗原提供针对O25组的主要O25B临床菌株的更好保护。
实施例3：大肠杆菌O1
结构数据库列出大肠杆菌O1的不同亚血清型结构。具体而言，为O1A、O1A1、O1B、O1C。O1A和O1A1在结构上相同且据信与疾病相关，但并没有报道O1B和O1C是病原性的(参见Gupta等人(1992) J Bacteriol 174, 7963-7970)，且其代表O1分离物中的少数。O1A/O1A1、O1B和O1C的结构显示于图12B中。为了分析实施例1的UPEC流行病学研究中的O1亚血清型分布，详细分析来自该研究的几种临床分离物的O抗原结构。首先，通过SDS PAGE分析通过凝集分析确定为O1阳性的12种菌株的LPS结构。参见图13：O1银染色和Western印迹。
银染色显示所有含有来自O1临床分离物的提取物的泳道中的典型LPS信号。在约10-15kDa的电泳迁移率的强染色显示脂质A核心，而更慢迁移率的梯状信号代表用由不同数量的O抗原重复单元构成的碳水化合物聚合物修饰的脂质A核心。当比较来自不同分离物的LPS时，差异出现于模式长度分布、个别带的电泳迁移率和梯状模式。基于这些观察，可鉴定三个组：(i)大部分分离物(upec002、upec010、upec032、upec140、upec108、upec143、upec276、upec399和upec425)展现单独带的不可区分的电泳迁移率，不同仅在于信号强度和平均链长度(模式长度分布)；(ii)两种分离物(upec119和upec256)显示在每一重复单元LPS带中具有稍微更快的迁移率，表明不同的结构，例如脂质A核心的不同修饰；和(iii)从分离物upec1096获得的信号显示为模糊状(smear)而非梯状，表明不同的OPS结构。参见图13A。
通过Western印迹分析和使用抗O1抗血清检测显示，通过特异性O1抗体检测到来自除upec1096外的所有分离物的LPS，表明交叉反应性LPS分子。这意味着分离物中的11种是O1，且upec1096最可能不是O1分离物(即，其通过凝集分析是假阳性的)。
为了详细分析O1抗原的结构类似性，如上所述使用LLO的2AB标记和高分辨率正相HPLC技术。图14A显示从11种临床分离物中的5种获得的色谱图的重叠图(overlay)。OPS的指纹分析区出现于110分钟至150分钟的保留时间。所述概况表明所有样品都具有出现于相同保留时间的信号，表明相同的分子结构。观察到的差异是强度分布(即平均最大信号的洗脱时间)和一般信号强度。剩余6种提取物导致在相同洗脱时间具有强度差异的峰。仅样品upec1096就峰模式而言是不同的，证实上述结构差异。
使用个别峰的通过MALDI-TOF/TOF分析的MS/MS分析来鉴定O1样品中单糖的序列(参见图14B)。对并非从临床分离物提取、但从含有具有upec032 rfb簇的粘粒的W3110 △waaL菌株提取的样品进行MS分析。在50、80、96和108分钟洗脱时间处洗脱的峰含有m/z=1021.4、1849.6、2693.9、3540.4的主要物质。在MS/MS之后获得的片段化离子系列与HexNAc、三种脱氧己糖和支链HexNAc的1、2、3和4个重复单元一致。此数据仅可由O1A亚血清型结构进行解释。描述的峰系列代表临床分离物中附接至UPP的O1 OPS，且每一连续峰与前一峰差异在于一个重复单元。
此数据证实了来自文献的陈述，即来自实施例1中描述的研究的临床UTI分离物中大肠杆菌的O1 O血清型的代表性结构是亚型O1A。
为了产生携带O1A多糖的生物缀合物，将W3110大肠杆菌菌株工程改造以表达O1AOPS。所得菌株为W3110 △rfbO16：：rfbO1 △waaL，其含有O1阳性临床分离物的rfb簇(GU299791*，范围为rmlB-wekO的簇)。通过同源重组构建表达O1A OPS的宿主菌株。使用在侧接rfb簇的DNA中的PCR寡核苷酸退火来扩增O1A临床分离物的rfb簇。然后通过国际专利申请号PCT/EP2013/071328中描述的同源重组使用扩增的DNA来代替充分表征的实验室菌株W3110的内源性O抗原簇。通过转化插入用于载体蛋白的表达质粒pGVXN659和PglB的表达质粒(pGVXN114、939、970、971)且证实O1表达(参见图15和图16)。
在单独实验中，将临床O1分离物upec032工程改造以产生生物缀合物。工程改造需要考虑临床分离物的抗生素敏感表型。构建upec032 △waaL且用用于生物缀合物产生的pGVXN939和pGVXN579使用MBP作为载体蛋白进行转化。使用MBP和EPA作为载体蛋白的优点是用两者产生抗血清、导致产生对多糖组分而非载体交叉反应的抗血清。此类抗血清是用于评估临床前实验的有用工具，例如用作开发多糖特异性ELISA测定的包被剂。
实施例4：大肠杆菌O6
大肠杆菌O6血清型是迄今为止的报道的最常见ExPEC(George, D. B.,和Manges, A.R. (2010) Epidemiol Infect 138, 1679-1690)。不仅实施例1中描述的研究、而且取自文献的数据证实，O6血清型属于许多ExPEC引起的表现中的最主要4种血清型(参见图4)。
文献中已报道了O6 OPS的两种结构(参见Jann等人, Carbohydr. Res. 263(1994) 217-225,和Jansson等人, Carbohydr. Res. 131 (1984) 277-283)。报道的O6抗原的结构显示于图17B中。它们是相同的，除了各自的支链单糖是Glc或GlcNAc。然而，文献尚未鉴定出临床分离物中参与UTI的主要O6结构。
为了选择用于疫苗目的的O6抗原的最具代表性的结构，使用与上文针对O1血清型所述相同的方法研究来自实施例1研究的O6凝集阳性临床大肠杆菌分离物的OPS结构。使用抗O6抗血清的银染色和Western印迹鉴定出12种临床分离物中之一对于抗O6血清不反应，尽管LPS在所有样品中都被银染色(未显示)，表明假阳性凝集结果。然而，可能Glc或GlcNAc差异无法通过凝胶上的电泳迁移率位移进行检测。
对于详述的结构分析，使用LLO指纹分析。作为用于两种报道的结构中的任一者的参考，分析中包括来自具有报道的支链Glc (CCUG11309)和GlcNAc (CCUG11311)的菌株的提取物。两种HPLC痕迹的比较显示CCUG11309衍生样品在70.8、103.3和122.2’处洗脱的峰系列和CCUG11311样品在68.8、100.3和118.3’处洗脱的峰系列。参见图18A。通过MS针对存在于峰中的主要物质且通过MS/MS针对这些主要物质的单糖序列分析峰。数据证实CCUG11311提取物衍生峰系列m/z=1094.4、2027.6和2962(MSO154)，其如所预期对应于GlcNAc分枝的1、2和3 BRU聚合物。先前在来自表达CFT O6临床分离物的克隆的rfb簇的W3110菌株的提取物中鉴定出具有分枝Glc的m/z=1053.4、1945.7和2836.9，其与CCUG11309(MSO138)具有相同2AB指纹分析峰洗脱时间。当比较从12种临床分离物获得的色谱图与参考菌株时，11种信号含有指示表明分枝Glc残基的O6 OPS的峰系列。这11种色谱图中的5种显示于图18B中。一种在O6特异性洗脱时间处不生成信号的样品不是O6，即最可能是来自凝集测试的假阳性物。因此，具有Glc支链的O6 OPS(图17B，顶部)是从实施例1中描述的流行病学分离的O6血清型中的最具代表性的结构。
为了产生携带O6Glc多糖的生物缀合物，通过用来自菌株CCUG11309的rfb簇代替W3110 rfb簇来工程改造W3110大肠杆菌菌株以表达O6 OPS。参见表7和13。所得菌株是W3110 △rfbO16：：rfbCCUG11309 △waaL，其含有在BRU中具有报道的Glc支链的O6阳性大肠杆菌菌株的rfb簇(参见上文)。通过同源重组构建表达O6Glc OPS的宿主菌株。使用侧接rfb簇的DNA中的PCR寡核苷酸退火扩增rfb簇。然后通过国际专利申请号PCT/EP2013/071328中描述的同源重组使用扩增的DNA代替充分表征的实验室菌株W3110的内源性O抗原簇。通过转化插入用于载体蛋白和PglB的表达质粒且通过Western印迹证实预期OPS在EPA上的表达。
实施例5：大肠杆菌O2
自1987年已知O2多糖的重复单元结构(Jansson, 等人, (1987) Carbohydrateresearch 161, 273-279)。其显示于图19B中。两种O2 O抗原基因簇序列可得自公开数据库(GenBank EU549863和GU299792)。已进行对比分析且已提示糖基转移酶活性(表5；Fratamico等人， 2010, Canadian journal of microbiology 56, 308-316;和Li, 等人., (2010) J Microbiol Methods 82, 71-77)。
表5. 括号中指示如由Li, 等人和Fratamico, 等人公开的来自rfb簇的O2 O抗原簇基因预测。
结构和基因同源性的比较表明，存在用于生物合成聚合物的所有功能：
rmlBDAC编码dTDP-L-鼠李糖的生物合成所需的酶，所述dTDP-L-鼠李糖是用于通过糖基转移酶wekPOR将L-Rha添加至骨架的底物；
fdtABC提供用于支链糖基转移酶的dTDP-D-Fuc3Nac；
wzy和wzx同系物负责将Und-PP结合的重复单元从细胞质翻转至周质；且
wekPOR是预测的糖基转移酶，且被预测形成O2 BRU的糖苷连接(三个L-Rha和一个L-FucNAc)。
公开的O2 rfb簇序列中发现的wekS基因是预测的膜结合的硫酸酯酶，且因此最可能不参与BRU形成。这意味着-如果假设一种酶对应一种连接的规则成立-则wekPOR组中的一种酶必须是双功能性的，以提供所述4个糖苷连接。
多个实施例中显示一种酶-一个连接的规则不是绝对的，在所述实施例中已知糖基转移酶少于连接，例如在福氏志贺氏菌Y(Shigella flexneri Y)、福氏志贺氏菌6(S. flexneri 6)、空肠弯曲杆菌和大肠杆菌O1A中。在这些实施例中，多功能糖基转移酶负责形成多于一个糖苷连接，它们是"双功能的"或"多功能的"。其总是是多次添加的同一单糖。重复鼠李糖残基 - 如在血清型O2中所发现 - 通常与此类多功能酶相关。
由于侧接wekS序列的截短转位子元件的存在，已推测，通过DNA重组事件将wekS基因座插入rfb簇中(参见Fratamico等人, 2010, Canadian journal of microbiology 56,308-316)。wekS基因座的转位子介导的插入表明，O2 OPS生物合成的确存在，且之前不存在wekS，且因此O2 OPS聚合物的合成不需要wekS。为了证实此假设，在重组表达系统(含有缺乏wekS基因的O2 rfb簇的"清洁"基因组背景)中重构O2 OPS形成。为了实现这一点，通过来自缺乏wekS DNA的O2阳性菌株upec116的rfb簇代替来自菌株W3110的O抗原簇。通过同源重组进行染色体代替，如国际专利申请号PCT/EP2013/071328中所述。所得菌株是W3110 △waaL △rfbW3110：：rfbO2 △wekS。制备OPS且通过2AB标记和正相HPLC以及荧光检测进行分析，如针对O1A和O6 OPS所进行(参见上文)，且通过正相HPLC进行分析(图21)并与来自野生型菌株CCUG25的信号进行比较。分析导致产生40分钟和140分钟洗脱时间之间的一系列重叠峰。
rfbO2簇独立的峰系列的MS分析显示在连续峰间具有相同差异(即单一O2 RU)的主要物质。
进行在各个峰中收集的分子的MS分析以分析OPS的结构。收集从野生型菌株CCUG25获得的在43.5、73.1、81.4和90’处获得的峰且通过MS和MS/MS进行分析。发现与预期1、2和3重复单元O2 OPS分子一致的物质和Y片段离子系列(m/z=989.4(图23)、1817.8、2646.1，都是Na+加合物)。
为了确认来自临床分离物的O2 OPS，分析了12种克隆的OPS结构，如上文针对O1血清型所述。首先，制备LPS以通过银染色和Western印迹进行分析。结果描绘于图20中。所有样品都显示具有两种表观不同平均梯长度的梯状带模式。抗O2抗血清检测到所有LPS样品，表明凝集准确地将所有分离物都鉴定为O2血清型。
为了产生携带O2多糖的生物缀合物，使用W3110 △waaL △rfbW3110：：rfbO2 △wekS。通过转化插入用于载体蛋白和用于PglB的表达质粒且通过Western印迹证实预期OPS在EPA上的表达。参见表7和13和上文。
实施例6：不同O抗原的免疫学分析
为了评估含有所选抗原性多糖的生物缀合物的免疫学潜力，进行了临床前研究。产生O1A-EPA、O2-EPA、O6Glc-EPA和O25B-EPA生物缀合物，纯化，且如上文和方法部分中所述进行表征。
使用纯化的生物缀合物免疫9周龄雌性Sprague Dawley大鼠。在第1、22和43天将100μl相同剂量溶液肌内(i.m.)注射至大鼠中，对大鼠进行末端放血且在第56天处死。
不同组的大鼠接受以下不同的疫苗：总是未配制、包含单独或组合的生物缀合物，如表6中所示。在第一注射之后56天的末端放血时间点，使用以waaL阳性菌株中产生的同源LPS包被的ELISA板以大鼠血清的ELISA滴度形式来测量免疫原性(图25-28)。总而言之，对于针对对照(未糖基化的EPA或TBS缓冲液)测量的所有接种疫苗组都观察到统计学显著的免疫原性。因此，选择和产生的生物缀合物代表有用的疫苗候选化合物。
对于测试的所有O抗原-EPA缀合物，对于针对对照(未糖基化的EPA或TBS缓冲液)测量的所有接种疫苗组都观察到统计学显著的免疫原性。因此，选择和产生的生物缀合物代表用于诱导O抗原特异性抗体的有用疫苗候选化合物。
实施例7：生物缀合物的物理化学表征
将上述实施例中描述的四种生物缀合物(分别缀合至作为载体蛋白的EPA的O25B、O1A、O2和O6的O抗原)制备为单价批料(活性医药成分，API)或作为针对ExPEC的多价疫苗组合于单一制剂中。产生各种批料：临床前批料、毒性研究批料和临床批料。表7表明用于产生缀合物的宿主菌株。
表7：用于产生临床前、毒理学研究和临床批料的宿主菌株
产物 菌株 EPA表达质粒 PglB表达质粒
EPA-O1A W3110 ∆rfb::rfb(upec032) ∆waaL pGVXN1076 pGVXN970
EPA-O2 W3110 ∆rfb::rfb(upec116) ∆waaL pGVXN1076 pGVXN971
EPA-O6Glc W3110 ∆rfb::rfb(CCUG11309) ∆waaL pGVXN659 pGVXN114
EPA-O25B W3110 ∆rfb::rfb(upec138) ∆waaL ∆gtrABS pGVXN1076 pGVXN970
因此通过具有多角度光散射的大小排阻色谱(SEC-MALS)分析四种单价GMP前批料和未糖基化的EPA参考标准品以定量个别生物缀合物的单-和二糖基化水平且测定蛋白载体和与之附接的O-PS的分子量(MW)。在TSKgel-G3000 SWx1柱上于磷酸盐缓冲液(pH 7.0；50mM NaCl、150mM磷酸钠)中分离样品且通过UV(214和280nm)、折射指数(RI)和多角度光散射(MALS)进行监测。
对于未糖基化的EPA载体蛋白，测定63-67kDa的MW(基于氨基酸序列，70.5kDa的理论MW)。在生物缀合物中，仅在280nm检测到EPA，允许从通过RI和MALS测量的总MW提取其MW：在生物缀合物中，EPA部分的测量的MW为65-71kDa。
GMP前API产物标准品的分析显示于表8中，表明单糖基化和二糖基化缀合物的存在，其中MW分别在75-79kDa和87-91kDa的范围内。O-PS部分的特征分别在于16-24kDa的MW(对于二糖基化的物质)和8-14kDa的MW(对于单糖基化的物质)。考虑每一血清型的RU的MW，测定每多糖链的10-16个RU的平均数，这与肼解和MS数据良好一致。
表8：单价GMP前API产物标准品的SEC-MALS分析
峰1：二糖基化的形式。
峰2：单糖基化的形式。
在Tris缓冲盐水(TBS)中配制的O25B生物缀合物批料的圆二色性(CD)分析显示，制剂在pH 6.8至7.4具有类似于未糖基化的EPA载体蛋白的光谱且具有α螺旋和β折叠结构的混合物，如基于EPA的公开晶体结构所预期。因此，基于这些CD分析，用O25B O-PS链的糖基化似乎不影响EPA载体蛋白的二级结构。
pH 6.8至7.4的TBS和pH 7.1至7.8的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的O25B生物缀合物批料制剂的差示扫描量热法(DSC)分析显示与未糖基化EPA相当的熔解曲线，具有大约52℃的熔点。此结果表明，EPA载体蛋白的生物物理学特征在用O25B O-PS链修饰后不改变。
实施例8：单价主体和四价疫苗制剂的稳定性
在大规模产生之前，以小规模评价制造方法的一致性。在包括加速和应力储存条件的深度稳定性研究中评估一致性批料以鉴定降解途径。经3个月时段测试四种单价疫苗组分(API)的稳定性。
临床前API的稳定性数据的分析表明当储存于-75±15℃(正常储存条件)时经至少3个月的稳定性。在预期储存条件下通过统计学线性消退分析观察到没有统计学显著的趋势。同样在加速(+5±3℃)和应力储存条件(+25±5℃)下，产物经至少3个月是稳定的，如通过稳定性指示参数的低变化性所证明。O1A临床前API的数据显示于表9中。三种其它血清型(O2、O6、O25B)表明类似的稳定性数据。
表9：O1A临床前API批料的稳定性数据
S/P：糖/蛋白比率，如分别通过蒽酮和BCA测定法所测定。
纯度：如通过反相高分辨率液相色谱(RP-HPLC)所测定。
在3个月时段期间测试四价疫苗组合物(O25B、O1A、O2和O6生物缀合物)的稳定性。研究包括加速和应力储存条件以鉴定降解途径。所得数据可视为对于初始证实GMP IMP(研究性医学产物，四价ExPEC疫苗组合物)保质期是相关的。
四价ExPEC疫苗临床前批料的稳定性数据的分析指示当储存于+5±3℃(正常储存条件)下时经至少3个月的稳定性，如表10中所显示。在预期储存条件下通过统计学线性消退分析观察到无统计学显著趋势。同样在加速储存条件(+25±5℃)下，产物稳定，如通过稳定性指示参数的低变化性所证明。
表 10：临床前四价疫苗批料的稳定性数据
MW(分子大小分布)：两种主要产物峰(即单糖基化和二糖基化物质)，如通过大小排阻高分辨率液相色谱(SE-HPLC)所测定。
纯度：如通过反相高分辨率液相色谱(RP-HPLC)所测定。
总而言之，这些研究显示，API和四价ExPEC疫苗组合物持续至少三个月是稳定的，因此就稳定性而言是合适的疫苗组合物。
实施例9：对四价疫苗制剂的毒性研究
在第1和14天于Sprague Dawley大鼠中两次肌内施用(使用股四头肌用于治疗)四价疫苗制剂(O25B、O1A、O2和O6生物缀合物)后评价其毒性和局部耐受性。在14天恢复期之后于第28天评价任何变化的可逆性、持久性或延迟发生。在第17天对主要组(对于接种疫苗组和对照组两者而言，10只雄性和10只雌性)中的动物进行尸检，且在第28天(在14天恢复期之后)对恢复组(对于接种疫苗组和对照组两者而言，5只雄性和只5雌性)进行尸检。这与可归因于治疗的被视为不良的任何效应并不相关。所施用剂量(即等效于4μg/O抗原(对于四价疫苗而言，16μg总O抗原)的全人剂量，如在第1和14天所施用)视为在该研究条件下用于四价ExPEC疫苗的未观察到的不良效应值(NOAEL)。此外，在评价血清样品后，在第17天和第28天证实四价ExPEC疫苗的免疫原性。与仅接受制剂缓冲液(25mM Tris、130mM NaCl、2.7mMKCl，pH 7.4)相比，在接种疫苗组中诱导抗O1A、抗O2、抗O6和抗O25B IgG抗体的更高滴度。
这些数据证实，四价ExPEC疫苗具有用于作为疫苗施用的合适的毒性概况，且诱导针对来自存在于疫苗中的O抗原的至少所有4种大肠杆菌血清型(即O25B、O1A、O2和O6)的抗体。
实施例10：与菌血症相关的O-血清型的流行病学
为了测定引起老年人菌血症的肠外大肠杆菌中的O-血清型分布，对一组从60岁以上患者收集的大肠杆菌血液分离物进行流行病学研究。从美国、英国、德国、西班牙和荷兰的个体总共收集860份来自时段2011-2013的血液分离物，且通过经典O凝集进行分析。如表11中所显示，菌血症分离物的O-血清型分布类似于在患有泌尿道感染(UTI，参见表1A)的患者中发现的O-血清型分布。血清型O25最常见于研究的菌血症群体中；通过PCR对57种分离物的亚分型显示，56种(98%)O25血清型可分型为O25B。在两个目标群体(UTI和菌血症)中，血清型O1、O2、O6和O25可鉴定为4种最普遍血清型。总而言之，这些数据证实，泌尿道感染和菌血症分离物两者中的血清型分布高度类似且与地理位置、分离时间和适应症无关。
表 11：来自在2011-2013时段于美国和欧盟收集的860份血液分离物的集合的最常见菌血症-相关大肠杆菌O-血清型的分布。指示样品的相对O-血清型分布。
O-血清型 ≥ 60岁中的菌血症，美国/欧盟，2011-2013 (n=860)
25 19.2
2 8.8
6 8.3
1 7.8
75 3.3
4 2.8
16 2.7
18 2.7
15 2.3
8 2.0
153 1.6
73 1.6
实施例11：功能抗体反应的诱导
用体外调理吞噬杀灭(OPK)测定研究在用上述单价和四价疫苗制剂接种疫苗之后产生的抗体功能性。此类测定已被接受作为抵抗肺炎链球菌的缀合物疫苗(Prevenar®)的保护相关性。OPK测定测量血清促进不同大肠杆菌血清型的调理吞噬和杀灭的能力。在96孔板中，在每一孔中将样品血清的定义稀释液与以下物质一起温育：来自4种疫苗特异性大肠杆菌血清型之一的细菌、定义量的HL60细胞和幼兔补体。在温育之后，将一定比例的混合物点样于胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)上且对细菌克隆的数量进行计数。将抗体结合细菌细胞且活化补体沉积以及通过HL60细胞介导细菌的摄取和杀灭的能力表示为调理滴度。调理滴度或调理指数(OI)对应于血清杀灭50%的细菌细胞的稀释度。提供免疫前和免疫后血清的调理指数。OI从免疫前至免疫后>4倍的增加可视为显著的。确立三种血清型O2、O6Glc和O25B的OPK测定。
通过单价疫苗诱导的抗体反应的功能性
为了评价O25B、O1A、O2和O6Glc生物缀合物的疫苗诱导的抗体反应的功能活性，使用调理吞噬杀灭(OPK)测定来分析来自接种疫苗大鼠的血清，所述测定测量细菌(例如大肠杆菌)的体外补体-和抗体依赖性吞噬和杀灭。使用来自接种疫苗大鼠的血清稀释液预调理大肠杆菌，与补体和吞噬细胞(分化的HL60细胞)一起温育，且测定菌落形成单位(CFU)。随后，计算最大杀灭%和调理指数(OI：杀灭50%的大肠杆菌的血清稀释度)。选择用于OPK测试的大肠杆菌是OC 24453(血清型O2)、OC 24781(血清型O6Glc)和OC 24176(血清型O25B)。如图29中所显示，观察到对O2-EPA(图29A)、O6Glc-EPA(图29B)和O25B-EPA(图29C)的稳健功能免疫反应。
数据表明，本文描述的疫苗组分诱导针对其O抗原包括于疫苗中的大肠杆菌血清型的抗体反应，且此类抗体反应可用于杀灭来自这些血清型的大肠杆菌。
通过四价疫苗诱导的抗体反应的功能性
表12显示来自用含有0.4或4μg/O抗原的四价疫苗免疫的动物的O抗原O2、O6Glc和O25B的总OI滴度。在两个单独实验中测定滴度。0.4μg剂量在所有动物中针对O2和O6Glc血清型都诱导显著OI。对于O25B，3/8的动物显示OI在用0.4μg剂量免疫后的显著增加。与0.4μg剂量相比，4μg剂量在所有动物中都针对O2诱导较低的OI增加。当针对O25B大肠杆菌测试来自4μg剂量组的血清时，3/8的动物显示OI增加。数据证实，四价疫苗能够引发针对O2、O6Glc和O25BO的抗原特异性调理抗体。
数据显示，本文描述的疫苗组分诱导针对其O抗原包括于疫苗中的大肠杆菌血清型的抗体反应，且此类抗体反应在杀灭来自这些血清型的大肠杆菌中是有功能的。
表 12：针对大肠杆菌O2、O6和O25的OI。显示所有动物的来自两次单独实验的个别接种疫苗前和接种疫苗后3天血清的OI。
计算最大杀灭%和调理指数(OI：杀灭50%的大肠杆菌的血清稀释度)。选择用于OPK测试的大肠杆菌是OC 24453(血清型O2)、OC 24781(血清型O6Glc)和OC 24176(血清型O25B)。观察到针对O2-EPA、O6Glc-EPA和O25B-EPA的稳健功能免疫反应。
实施例12：在具有复发性泌尿道感染(RUTI)临床史的女性中评价针对尿路病原性大肠杆菌的候选疫苗
在阶段I临床研究中使用大肠杆菌生物缀合物疫苗。疫苗包含盐水缓冲溶液中的4种生物缀合物。4种生物缀合物是：(i)缀合至EPA载体蛋白的大肠杆菌O1A、(ii)缀合至EPA载体蛋白的大肠杆菌O2、(iii)缀合至EPA载体蛋白的大肠杆菌O6Glc和(iv)缀合至EPA载体蛋白的大肠杆菌O25B。
研究群体包括194名健康女性，其年龄≥18至70岁且具有复发性泌尿道感染(RUTI)病史(定义为在先前12个月中≥3次独立发作或在最近6个月中≥2次发作)。至少一次泌尿道感染(UTI)发作由大肠杆菌(作为单一病原或多种微生物感染的一部分)引起且培养证实并记载病因。出于研究目的，UTI定义为存在至少一种指定UTI症状(排尿困难、尿急、尿频、侧腹疼痛、膀胱触痛、耻骨上疼痛、发烧、恶心、呕吐)且细菌计数(CFU) ≥103 CFU/ml中段尿中的尿路病原。
该研究包含两个组：(i)候选疫苗和(ii)安慰剂。该研究是在具有RUTI病史的健康女性中的交错、随机、单盲、安慰剂对照多中心研究。
用于研究的估计登记时段为4个月，其中每一个体的随访时间段为9个月。
研究目标是评价大肠杆菌生物缀合物疫苗的安全性、免疫原性和效力。
研究设计
在注射之后追踪个体9个月，且在整个研究时段中仅追踪注射个体。个体参加总共5个安排拜访：筛选(第一拜访)、第1天(第二拜访)、第7天、第30天和第270天。个体在第2天、第90天、第150天和第210天接受4次电话随访。
由发生UTI导致的任何未安排拜访包括使用协调治疗选择进行标准护理。收集尿和血液(如果可能)以用于诊断和血清分型目的。随研究持续时间记录非诱导不良事件(AE)和严重不良事件(SAE)，而在注射之后记录诱导的AE 7天。
在每一拜访时，给予个体新日记卡且讨论前一日记卡。
给药和施用
在第一拜访时，筛选已提供知情同意的合格个体且证实对于纳入/安排标准的顺从性。抽血且采尿。
在拜访2(第1天)时，每一个体在三角肌中接受一次0.5ml溶液的肌内注射(候选疫苗或安慰剂)。减小剂量的候选疫苗含有1μg每一多糖(总共4μg多糖)。候选疫苗的目标剂量含有4μg每一多糖(总共16μg多糖)。
目标
主要目标是评价在注射候选疫苗后在整个研究时段中与安慰剂组相比诱导和非诱导不良事件(AE)和严重不良事件(SAE)的发生、强度、关系和持续时间。
次要目标是：(i)比较在注射候选疫苗之前(在初始筛选时和第1天)和在注射后(在第7天和第30天)与安慰剂组相比血液学和生物化学安全性终点的变化；(ii)评估基线(第1天)和注射后(第30天和第270天)之间候选疫苗的免疫反应；(iii)比较在两个注射候选疫苗或安慰剂的组之间在整个研究时段期间由大肠杆菌疫苗-血清型引起的症状性泌尿道感染(UTI)发作的数量作为最相关效力终点；(iv)评价在疫苗组中与安慰剂组相比随研究持续时间疫苗-血清型特异性大肠杆菌UTI的发生率；和(v)评价在疫苗组中与安慰剂组相比随研究持续时间疫苗-血清型特异性大肠杆菌UTI的临床症状的强度和持续时间。
探索目标是：(i)比较在疫苗组中与安慰剂组相比在整个研究时段中由任一大肠杆菌血清型引起的UTI发生率；和(ii)比较在疫苗组中与安慰剂组相比在整个研究时段中由任一病原引起的UTI发生率。
收录标准
用于研究的收录标准如下：(i)女性个体具有复发性UTI病史，其定义为：在先前12个月中≥3次UTI独立发作或在最近6个月中≥2次UTI发作；在最近5年期间的至少一次UTI由大肠杆菌(作为单一病原或多种微生物感染的一部分)引起且进行培养证实并记载；(ii)年龄≥18岁且≤70岁；(iii)个体在筛选拜访时和在注射日(拜访2)处于无进行性或怀疑症状性UTI的健康状态；(iv)一般良好健康，根据研究者的临床判断无临床显著医学史、身体检查发现或临床实验室异常；和(v)在已解释所有方案方面且完全理解之后愿意参与研究，且获得书面知情同意形式。
排除标准
用于研究的排除标准如下：(i)在筛选拜访前一年具有多于10次复发性UTI病史；(ii)在筛选之前7天内使用任何短期尿管；(iii)在筛选之前30天内使用任何永久性导管；(iv)具有任何未解决泌尿道疾病/异常病史；(v)具有受损免疫功能的证据；(vi)显著的心血管、肝、肾脏疾病和/或机能不全；(vii)不受控糖尿病；(viii)在血液学、血清化学或尿分析的筛选结果中具有显著异常；(ix)HIV阳性测试和/或HBV或HCV的证据；(x)BMI>34；(xi)在最近3个月中进行用于UTI预防的先前免疫刺激治疗(例如Urovaxom®、Strovac®或Urovac®)，或计划在研究时段期间使用；(xii)当前使用任一已知影响免疫功能的药剂(例如皮质类固醇≥0.5mg/kg BW/天)；(xiii)在注射之前小于6个月新开始使用UTI相关阴道雌激素治疗且在研究期间继续使用或在积极研究时段期间计划开始；(xiv)在注射前1周内使用任何抗生素治疗；(xv)在研究时段期间计划使用性交后抗生素用于UTI预防；(xvi)在注射之前30天和在注射之后30天内使用任何计划的接种疫苗；(xvii)在登记前60天和研究持续时间内参与其它临床试验；(xviii)先前在注射前3个月内使用免疫球蛋白或血液产物进行治疗；(xix)对疫苗的任一组分具有已知超敏性；(xx)存在在研究者的观点中妨碍参与研究的显著医学或精神病学病况；(xxi)在注射时具有急性病况；(xxii)具有阳性妊娠测试或拒绝使用有效避孕措施的可能怀孕的女性；(xxiii)在整个研究时段中的任一时间处于哺乳期的女性；(xxiv)计划在研究时段期间使用可选手术干预的个体；和(xxv)在研究者的观点中从参与研究会增加具有不良结果的风险的任何其它显著发现。
统计学方法和分析
如果适应，则由治疗组和/或拜访提供描述性统计学(n、平均值、标准偏差、连续变量的中值和范围、类别变量的频率和百分比)。所有数据都通过个体、治疗组和(如果适用)拜访来列出。组合所有组B的接受安慰剂的个体以形成安慰剂治疗组。
实施例13：阶段I临床研究结果
本实施例呈现实施例12中描述的阶段I临床研究的期中分析的某些结果。
12.1：安全性
不良事件和严重不良事件的发生率在安慰剂组和接种疫苗组之间是相当的。报告了10个严重不良事件，且无一与研究药物相关。
12.2：免疫原性
为了评估疫苗组分的免疫原性，获得来自参与临床研究的女性的血清且通过ELISA分析以定量针对四价疫苗中包括的4种不同O抗原(大肠杆菌O1、大肠杆菌O2、大肠杆菌O6和大肠杆菌O25B)的IgG。
在包被有O1A、O2、O6Glc和O25B-LPS和EPA的板中温育来自接种疫苗女性的血清。随后，将板与HRP标记的二级抗体(抗人IgG)一起温育。使用TMB底物检测结合抗体且测量吸光度。通过4PL拟合计算EC50值。
如图30中所显示，在大部分接种疫苗女性中出现对O1A-EPA、O2-EPA、O6Glc-EPA和O25B-EPA的稳健免疫反应。
这些数据显示四价疫苗的每一组分的免疫原性。
12.3：功能抗体反应
使用OPK分析(其测量大肠杆菌细菌的体外补体-和抗体依赖性吞噬和杀灭)来评价参与临床研究的女性的功能抗体反应。
从研究参与者收集血清。用来自接种疫苗女性的血清稀释液预调理大肠杆菌，与补体和吞噬细胞(分化的HL60细胞)一起温育，且测定剩余菌落形成单位(CFU)。随后，计算最大杀灭百分比和调理指数(OI：杀灭50%的大肠杆菌的血清稀释度)。选择用于OPK测试的大肠杆菌是OC 24452(血清型O1A)、OC 24453(血清型O2)、OC 24454(血清型O6Glc)和OC24176(血清型O25B)。
如图31中所显示，观察到对O1A-EPA(图31A)、O2-EPA(图31B)、O6Glc-EPA(图31C)和O25B-EPA(图31D)的稳健功能免疫反应。
这些数据显示，四价疫苗的每一组分诱导血清型特异性抗体反应，且此类抗体反应在杀灭来自这些血清型的大肠杆菌中是有功能的。因此，本文描述的疫苗组合物在人是有功能的。
12.4：用包含O25B-EPA的四价O抗原缀合物免疫在人中引发O25A/O25B交叉反应性 IgG抗体
为了测定疫苗诱导的血清IgG抗体针对两种已知大肠杆菌O25血清亚型O25A和O25B的交叉反应性水平，将源自接种疫苗个体的血清的连续稀释液与纯化O25A LPS、O25B LPS或完整细菌细胞一起温育，且通过ELISA进行测试。
如图32中所显示，当测试接种疫苗后30天针对O25A LPS(黑条)和O25B LPS(灰条)的反应性时，观察到类似的EC50值。总而言之，数据表明，O25B生物缀合物充分地作用于O25B和O25A，但在大部分情况/测试个体中，O25B在针对O25B的抗体反应方面的作用略好于O25A。该结果表明，在发生一些天然变化的情况下，四价疫苗诱导识别O25A和O25B LPS两者的抗体。为了测试是否同样适用于全部细菌细胞和多种O25A/O25B菌株，还测试针对一组源自血液或尿的临床O25A或O25B分离物的反应性。在该情况下，使用血清型O75菌株(不是四价疫苗中的代表性血清型)作为阴性对照(图33中的灰色虚线)。如图33中所显示，疫苗诱导的血清IgG抗体针对个别O25菌株中的每一种都显示强反应。尽管菌株-菌株变化明显，但观察到针对O25A(黑线)和O25B菌株(灰线)的反应性。这些数据显示，四价疫苗的O25B疫苗组分引发识别O25A和O25B纯化LPS和大肠杆菌O25A和O25B菌株的抗体。
下表13和14分别提供前述实施例中使用的某些菌株和质粒的细节。
表13：菌株
名称 基因型 描述
upec032 wt 来自GVXN流行病学研究的O1A临床分离物
upec436 wt 来自GVXN流行病学研究的O25A临床分离物
upec138 wt 来自GVXN流行病学研究的O25B临床分离物
upec116 wt 来自GVXN流行病学研究的O2临床分离物
upec163 wt 来自GVXN流行病学研究的O25B临床分离物
upec177 wt 来自GVXN流行病学研究的O25B临床分离物
W3110 F-, λ - , IN(rrnD-rrnE) 1,rph-1 用于产生菌株合成的K-12实验室菌株，CGSC#: 4474
CCUG25 wt 从培养物保藏中心，University of Göteborg (CCUG), Sweden获得的O2分离物(参见Jansson, 等人,(1987) Carbohydrate research 161, 273-27)
CCUG11309 wt 来自CCUG的O6分离物，具有支链Glc的OPS(参见Jann, 等人, (1994) Carbohydrate research 263,217-225)
CCUG11311 wt 来自CCUG的O6分离物，具有支链GlcNAc的OPS(参见Jann, 等人, (1994) Carbohydrate research 263,217-225)
表14：质粒
名称 描述 评注
pGVXN150 编码2个糖基化位点的遗传脱毒的EPA-his6的基于pBR322的表达质粒 参见Ihssen, 等人, (2010) Microbial cell factories9, 61
pGVXN659 编码4个糖基化位点的遗传脱毒的EPA的基于pBR322的表达质粒 修饰pGVXN150以编码额外的N和C末端糖基化位点
pGVXN1076 pGVXN659 ΔampR::kanR
pGVXN579 用于表达具有C末端柔性接头、随后3个糖基化位点序列和myc表位的基于pMAL-p2X的载体 允许快速生物缀合物纯化以避免his标签
pGVXN114 用于具有HA标签的PglB的基于pEXT21的表达质粒 参见Ihssen, 等人, (2010) Microbial cell factories9, 61
pGVXN939 用于具有HA标签、密码子优化的PglB的基于pEXT21的表达质粒
pGVXN970 用于无HA标签、密码子优化的PglB的基于pEXT21的表达质粒
pGVXN539 用于编码2个糖基化位点(如pGVXN150)的遗传脱毒的、密码子使用优化的、his标签化的EPA的基于pACT3的表达质粒 通过来自pGVXN161 (寡核苷酸:#1399/#1400)的卡那霉素代替氯霉素抗性
pGVXN161 pKD4 参见Datsenko and Wanner, (2000) Proc Natl AcadSci U S A 97, 6640-6645
pGVXN112 用于具有HA标签的PglB的基于pACT3的表达质粒
表15：序列
本文描述的实施例仅意欲为示例性的，且本领域技术人员仅使用常规实验即可认识到或能够确定本文描述的特定程序的多种等效形式。所有此类等效形式都被认为在本发明范围内且由以下权利要求所涵盖。
本文引用的所有参考文献(包含专利申请、专利和出版物)以其整体且出于所有目的通过引用并入本文，其并入程度如同每一个别出版物或专利或专利申请都具体且个别地指出以其整体出于所有目的通过引用并入一样。
7. 实施方案
实施方案1：
1. 原核宿主细胞，其包含：
a. rfb(upec138)基因簇(SEQ ID NO: 12)、rfb(upec163)基因簇或rfb(upec177)基因簇；
b. 编码寡糖基转移酶的核苷酸序列；和
c. 编码包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的载体蛋白的核苷酸序列，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQ ID NO: 14)。
2. 原核宿主细胞，其包含：
a. rmlB、rmlD、rmlA、rmlC、wzx、wekA、wekB、wzy、wbbJ、wbbK和wbbL；
b. 编码寡糖基转移酶的核苷酸序列；
c. 编码包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的载体蛋白的核苷酸序列，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQ ID NO: 14)。
3. 原核宿主细胞，其包含：
a. 编码以下的核苷酸序列：
i. dTDP-葡萄糖4,6-脱水酶；
ii. dTDP-6-脱氧-D-葡萄糖3,5-差向异构酶；
iii. 葡萄糖-1-磷酸胸苷基转移酶；
iv. dTDP-4-脱氢鼠李糖3,5-差向异构酶；
v. O抗原翻转酶；
vi. dTDP-Rha: Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP α-1,3-鼠李糖基转移酶；
vii. UDP-Glc: Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP β-1,6-葡萄糖基转移酶；
viii. O抗原聚合酶；
ix.O-乙酰基转移酶；
x. UDP-Glc: Rha-GlcNAc-UPP α-1,3-葡萄糖基转移酶；和
xi. dTDP-Rha: GlcNAc-UPP α-1,3-鼠李糖基转移酶；
b. 编码寡糖基转移酶的核苷酸序列；
c. 编码包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的载体蛋白的核苷酸序列，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQ ID NO: 14)。
4. 权利要求3的宿主细胞，其中：
a. 所述dTDP-葡萄糖4,6-脱水酶包含与由SEQ ID NO: 1编码的dTDP-葡萄糖4,6-脱水酶至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列；
b. 所述dTDP-6-脱氧-D-葡萄糖3,5-差向异构酶包含与由SEQ ID NO: 2编码的dTDP-6-脱氧-D-葡萄糖3,5-差向异构酶至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列；
c. 所述葡萄糖-1-磷酸胸苷基转移酶包含与由SEQ ID NO: 3编码的葡萄糖-1-磷酸胸苷基转移酶至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列；
d. 所述dTDP-4-脱氢鼠李糖3,5-差向异构酶包含与由SEQ ID NO: 4编码的dTDP-4-脱氢鼠李糖3,5-差向异构酶至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列；
e. 所述O抗原翻转酶包含与由SEQ ID NO: 5编码的O抗原翻转酶至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列；
f. (xi)的鼠李糖基转移酶包含与由SEQ ID NO: 6编码的鼠李糖基转移酶至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列；
g. (xii)的葡萄糖基转移酶包含与由SEQ ID NO: 7编码的葡萄糖基转移酶至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列；
h. 所述O抗原聚合酶包含与由SEQ ID NO: 8编码的O抗原聚合酶至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列；
i. 所述O-乙酰基转移酶包含与由SEQ ID NO: 9编码的O-乙酰基转移酶至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列；
j. (x)的葡萄糖基转移酶包含与由SEQ ID NO: 10编码的葡萄糖基转移酶至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列；且
k. (xi)的鼠李糖基转移酶包含与由SEQ ID NO: 11编码的鼠李糖基转移酶至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列。
5. 权利要求1至4中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞为大肠杆菌。
6. 权利要求5的宿主细胞，其中waaL基因、gtrA基因、gtrB基因、gtrS基因和rfb簇中的至少一个从所述宿主细胞的基因组中缺失或功能失活。
7. 权利要求1至6中任一项的宿主细胞，其中所述载体蛋白选自：脱毒的绿脓假单胞菌外毒素A(EPA)、CRM197、麦芽糖结合蛋白(MBP)、白喉类毒素、破伤风类毒素、脱毒的金黄色葡萄球菌溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、大肠杆菌FimH、大肠杆菌FimHC、大肠杆菌不耐热肠毒素、大肠杆菌不耐热肠毒素的脱毒变体、霍乱毒素B亚单元(CTB)、霍乱毒素、霍乱毒素的脱毒变体、大肠杆菌Sat蛋白、大肠杆菌Sat蛋白的过客结构域、肺炎链球菌肺炎球菌溶血素和其脱毒变体、空肠弯曲杆菌AcrA和空肠弯曲杆菌天然糖蛋白。
8. 权利要求1至7中任一项的宿主细胞，其中所述载体蛋白包含优化的N-糖基化共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)，其中X和Z独立地选自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQ ID NO: 15)。
9. 权利要求1至8中任一项的宿主细胞，其中所述载体蛋白包含一个或多个重组引入的共有序列。
10. 权利要求1至9中任一项的宿主细胞，其中所述载体蛋白包含用于将载体蛋白靶向于所述宿主细胞的周质间隙中的信号序列。
11. 权利要求10的宿主细胞，其中所述信号序列选自：大肠杆菌DsbA、大肠杆菌外膜孔蛋白A(OmpA)、大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(MalE)、胡萝卜软腐欧文氏菌果胶酸裂合酶(PelB)、FlgI、NikA或芽孢杆菌属木聚糖内切酶(XynA)、不耐热大肠杆菌肠毒素LTIIb、芽孢杆菌木聚糖内切酶XynA或大肠杆菌鞭毛蛋白(FlgI)。
12. 制备N-糖基化的载体蛋白的方法，所述方法包括：
a. 培养权利要求1至11中任一项的宿主细胞；和
b. 纯化所述N-糖基化的载体蛋白。
13. N-糖基化的载体蛋白，其通过权利要求12的方法产生。
14. 权利要求13的N-糖基化的载体蛋白，其包含式O25B的化合物：
其中n是1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之间的整数。
15. 权利要求13的N-糖基化的载体蛋白，其包含式O25B’的化合物：
其中n是1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之间的整数。
16. 分离的O抗原，其来自O25B菌株诸如upec138、upec163或upec177。
17. 载体蛋白，其N-连接至权利要求15的O抗原。
18. 分离大分子的群体，所述分离大分子包含式O25B的结构：
其中n是1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之间的整数。
19. 分离大分子的群体，所述分离大分子包含式O25B’的结构：
其中n是1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之间的整数。
20. 药物组合物，其包含含有式O25B的结构的大分子：
其中n是1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之间的整数。
21. 药物组合物，其包含含有式O25B’的结构的大分子：
其中n是1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之间的整数。
22. 权利要求20的药物组合物，其中所述式O25B的结构共价结合至载体蛋白中的Asn残基。
23. 权利要求21的药物组合物，其中所述式O25B’的结构共价结合至载体蛋白中的Asn残基。
24. 权利要求20或21的药物组合物，其中所述Asn残基位于共有序列Asn-X-Ser(Thr)中，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQ ID NO: 14)。
25. 权利要求1至11中任一项的原核宿主细胞，其中所述寡糖基转移酶对所述宿主细胞是异源的。
26. 权利要求1至11的原核宿主细胞，其中所述寡糖基转移酶是空肠弯曲杆菌寡糖基转移酶pglB。
27. 权利要求1至11中任一项的原核宿主细胞，其中所述载体蛋白对所述宿主细胞是异源的。
28. 权利要求1至11、25、26或27中任一项的原核宿主细胞，其中所述载体蛋白不是大肠杆菌蛋白。
29. 生成包含L-Rha(2Ac)的寡糖的方法，其包括将糖或寡糖与包含SEQ ID NO:11的鼠李糖基转移酶一起温育，其中所述糖或寡糖包含末端D-GlcNAc。
30. 权利要求29的方法，其中所述L-Rha(2Ac)和D-GlcNAc经由α 1,3键连接。
31. 权利要求29的方法，其中所述温育在体外发生。
32. 权利要求29的方法，其中所述寡糖在重组表达包含SEQ ID NO: 11的鼠李糖基转移酶的宿主细胞中生成。
实施方案2：
1. 组合物，其包含：(i)O25B生物缀合物，其包含共价结合至载体蛋白的Asn残基的大肠杆菌O25B抗原；(ii)O1A生物缀合物，其包含共价结合至载体蛋白的Asn残基的大肠杆菌O1A抗原；(iii)O2生物缀合物，其包含共价结合至载体蛋白的Asn残基的大肠杆菌O2抗原；和(iv)O6生物缀合物，其包含共价结合至载体蛋白的Asn残基的大肠杆菌O6抗原。
2. 权利要求1的组合物，其中所述O25B抗原、O1A抗原、O6抗原和O2抗原分别包含下式：
a. 式O25B’
b. 式O1A’
c. 式O6Glc’
d. 式O2’
。
3. 权利要求1或2的组合物，其中所述载体蛋白选自：脱毒的绿脓假单胞菌外毒素A(EPA)、CRM197、麦芽糖结合蛋白(MBP)、白喉类毒素、破伤风类毒素、脱毒的金黄色葡萄球菌溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、大肠杆菌FimH、大肠杆菌FimHC、大肠杆菌不耐热肠毒素、大肠杆菌不耐热肠毒素的脱毒变体、霍乱毒素B亚单元(CTB)、霍乱毒素、霍乱毒素的脱毒变体、大肠杆菌Sat蛋白、大肠杆菌Sat蛋白的过客结构域、肺炎链球菌肺炎球菌溶血素和其脱毒变体、空肠弯曲杆菌AcrA和空肠弯曲杆菌天然糖蛋白。
4. 权利要求3的组合物，其中所述载体蛋白是脱毒的EPA、CRM197或MBP。
5. 权利要求1至4中任一项的组合物，其中所述载体蛋白的Asn残基位于共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)中，其中X和Z独立地选自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQ IDNO: 15)。
6. 治疗具有肠外病原性大肠杆菌的个体的感染的方法，其中所述方法包括向所述个体施用有效量的权利要求1至5中任一项的组合物。
7. 预防具有肠外病原性大肠杆菌的个体的感染的方法，其中所述方法包括向所述个体施用有效量的权利要求1至5中任一项的组合物。
8. 在个体中诱导针对肠外病原性大肠杆菌的免疫反应的方法，其中所述方法包括向所述个体施用有效量的权利要求1至5中任一项的组合物。
9. 在个体中诱导产生特异于肠外病原性大肠杆菌的调理吞噬抗体的方法，其中所述方法包括向所述个体施用有效量的权利要求1至5中任一项的组合物。
10. 权利要求6、8或9的方法，其中所述个体已诊断出患有泌尿道感染。
11. 权利要求7、8或9的方法，其中所述个体具有发生泌尿道感染的风险。
12. 权利要求6、8或9的方法，其中所述个体已诊断出患有菌血症。
13. 权利要求7、8或9的方法，其中所述个体具有发生菌血症的风险。
14. 权利要求6、8或9的方法，其中所述个体已诊断出患有败血症。
15. 权利要求7、8或9的方法，其中所述个体具有发生败血症的风险。
16. 权利要求6至16中任一项的方法，其中所述个体是人。
序列表
<110> GlycoVaxyn AG
<120> 新颖多糖及其用途
<130> 13064-042
<140> TBA
<141> 与之同一日
<150> 61/943,710
<151> 2014-02-24
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1086
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> rmlB (upec138)
<400> 1
gtgaagatac ttgttactgg tggcgcagga tttattggtt ctgctgttgt tcgtcacata 60
ataaataata cgcaagatag tgttgttaat gtcgataaat taacatacgc cggaaacctg 120
gaatcacttg cagatgtttc tgattctgaa cgctatttct ttgaacatgc ggatatttgt 180
gatgcagctg caatggcacg gatttttgct cagcatcagc cggatgcagt gatgcacctg 240
gcagctgaaa gccatgttga ccgttcaatt acaggccctg cggcatttat tgaaaccaat 300
attgtgggta cttatgtcct tttagaagcg gctcggaatt attggtctgg tctggatgat 360
gaaaagaaaa aaaacttccg ttttcatcat atttctactg atgaggtgta tggtgactta 420
ccccatccgg atgaagtaaa tagcaatgaa acgttgccgc tatttacgga aacgacagca 480
tacgcgccaa gtagtccata ttctgcttct aaagcttcca gcgatcattt ggttcgcgca 540
tggaaacgta cttatggttt accgaccatt gtgactaatt gctcgaacaa ctatggtcct 600
tatcatttcc cggaaaagct tattccactg gttattctta attcactgga aggtaaggca 660
ttacctattt atggcaaagg agatcagatc cgcgactggt tgtatgtaga ggatcatgct 720
cgagcgttat ataccgtcgt aaccgaaggt aaagcgggcg aaacttataa cattggtgga 780
cacaacgaaa agaaaaacat cgacgtagtg ttcactattt gtgatttgtt ggatgagata 840
gtcccgaaag agaaatctta ccgcgagcaa attacttatg ttaccgatcg tccgggacac 900
gatcgccgtt atgcgattga tgctgagaag attggtcgcg aattgggatg gaaaccacag 960
gaaacgtttg agagtgggat tcgtaaaacg gtggaatggt acctgtccaa tacaaaatgg 1020
gttgataatg tgaaaagtgg tgcctatcaa tcgtggattg aacagaacta tgagggccgc 1080
cagtaa 1086
<210> 2
<211> 900
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> rmlD (upec138)
<400> 2
atgaatatcc tcctttttgg caaaacaggg caggtaggtt gggaactaca gcgtgctctg 60
gcacctctgg gtaatttgat tgctcttgat gttcactcca ctgattactg tggtgatttt 120
agtaatcctg aaggtgtagc tgaaaccgta agaagcattc ggcctgatat tattgtcaac 180
gcagccgctc acaccgcagt agacaaagca gaatcagaac cgaagtttgc acaattactg 240
aacgcgacga gtgtcgaagc gatcgcgaaa gcagccaatg aagtcggcgc ctgggttatt 300
cactactcta ctgactacgt atttccgggg accggtgaaa taccatggca ggaggaggat 360
gcaaccgcac cgctaaatgt ttacggtgaa accaagttag cgggagaaaa agcattacaa 420
gagcattgtg cgaagcacct tattttccgg accagctggg tctatgcagg taaaggaaat 480
aacttcgcca aaacaatgtt gcgtctggca aaagagcgtg aagaattagc cgttattaat 540
gatcagtttg gtgcgccaac tggcgcagag ttactggctg attgtacggc acatgctatt 600
cgtgtggcac tgaataaacc ggaagtcgca ggcttgtacc atctggtagc tagtggtacc 660
acaacgtggc acgattatgc tgcgctggtt tttgaagagg cgcgcaaagc aggcattccc 720
cttgcactca acaagctcaa cgcagtacca acaacagcct atcctacacc agctcgtcgt 780
ccacataact ctcgccttaa tacagaaaaa tttcagcaga actttgcgct tgtcttgcct 840
gactggcagg ttggcgtgaa acgaatgctt aacgaattat ttacgactac agcaatttaa 900
<210> 3
<211> 879
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> rmlA (upec138)
<400> 3
atgaaaacgc gtaaaggtat tattttggcg ggtggttctg gtactcgtct ttatcctgtg 60
acgatggccg tcagtaaaca gctgttaccg atttatgata aaccgatgat ctattacccg 120
ctctctacac tgatgttagc gggtattcgc gatattctga ttatcagtac accacaggat 180
actcctcgtt ttcaacaact gctgggtgac gggagccagt ggggcctgaa tcttcagtac 240
aaagtgcaac cgagtccgga tggtcttgcg caggcgttta ttatcggtga agagtttatt 300
ggtggtgatg attgtgcttt ggtacttggt gataatatct tctacggcca cgacctgccg 360
aagttaatgg acgtagctgt taacaaagaa agtggtgcaa cggtatttgc ctatcacgtt 420
aatgatcctg aacgttatgg tgtcgtggag tttgataata acggtactgc aattagcctg 480
gaagaaaaac cgctggaacc aaaaagtaac tatgcggtta ctgggcttta tttctatgac 540
aatgacgttg tggaaatggc gaaaaacctt aagccttctg cccgaggtga actggaaatt 600
accgatatta accgtattta tatggaacaa ggacgtttgt ctgtcgctat gatggggcgt 660
ggctatgcat ggctggatac agggacgcat caaagtctta ttgaagcaag caacttcatt 720
gccaccattg aagagcgcca gggactaaag gtttcctgtc cggaagaaat tgcttatcgt 780
aaagggttta ttgatgctga gcaggtaaaa gtattagccg aaccgttgaa gaaaaatgct 840
tatggtcagt atctgctcaa aatgattaaa ggttattaa 879
<210> 4
<211> 543
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> rmlC (upec138)
<400> 4
atgaacgtaa ttaaaactga aattcctgat gtgctgattt ttgaaccaaa agtttttggg 60
gatgaacgtg gcttcttttt tgagagtttt aatcagagga tttttgaaga agcagtaggt 120
cgtaaggttg agtttgttca ggataaccat tctaagtcca gtaaaggtgt tttacgtggt 180
cttcattatc agttagaacc ttatgctcaa ggaaaactgg tgcgctgtgt tgttggcgag 240
gtttttgatg ttgcggttga tattcgtaaa tcgtcaccta catttgggaa atgggttggg 300
gtgaatttgt ctgctgagaa taagcgtcag ttgtggattc ctgagggatt tgcacatggt 360
tttttggtgc tgagtgattt agcagaagtt ttatataaaa cgaatcaata ttatgctcca 420
tcacatgaaa aaaatattat atggaatgac ctcttgctta atattaaatg gccgagcaca 480
gcactgatca ctctgtctga taaggatgca aatggggaaa gatttgaact aagtgagttt 540
tga 543
<210> 5
<211> 1260
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> wzx (upec138)
<400> 5
atgtctctct taaaacatag tatatggaat gttgcgggct actttatacc aacattaatt 60
gcaattcccg cctttggatt aattgcgagg aaaattggtg tagaactatt tggtttgtat 120
acgttagcaa tgatttttat agggtatgca agtatatttg atgctgggtt aacaagagct 180
gttgtgcgtg aaatagcatt actaaaaaac agagtggacg attgtaatac gataatagta 240
acttctatta tcgctgtgat atttttaggg tttatcggag gcgggggagt gtttctgctt 300
aaaggcgata ttattgaact gttaaatatc tcaccaatat attacgccga ttcgataaag 360
tctctagtat tattatcatc tctgatacct gtattcttag tcacgcaaat actattagca 420
gagcttgagg gtcgggaata ttttgggatt ctaaatatac aaaaaagtgt agggaattct 480
ttaattgcag ggttacctgc attatttgtt ttaattaatc aaacgctttt ttctgcaatt 540
attggtgtag cgattgcaag agttatatgc ttgtggttaa gctacattat gagcagggaa 600
agaataacta tcgatatctc atttttttca ataactgttt taaagcggtt atttagatat 660
ggcgggtggg taactataag taacataata tctcctatat tagcgagtat ggatagattt 720
attctatccc atatccaggg agcatcaaaa atatcattct atacagtccc taatgagctg 780
gtaactaggc ttggaatagt tccaggctct cttgggaaag ctgtttttcc aaaattaagt 840
catgcaagga attttacagc gtcatatgca gagcaaaaaa aagcttatat attaatgact 900
gtcattgtaa tgcctttggt tttatttgta tattattacg caaagtttat tttaacattg 960
tggatggggg ctgagtatgc agggatttcg gtcgaaatat tacggattat gcttataggg 1020
tatattttta actgttattc acaaatctct tttgccaaca tacaggcctt tggaaaagca 1080
aaatacactg catacatcca tatgatggaa tttattcctt atttgataat gttatatata 1140
atttcaaagg aatatggggt tattggtgtt gcgtggttat ggacaattcg agtaataatt 1200
gattttttga tgcttttata tatgagttat cgttgtaata atcttatgaa aaaagggtag 1260
<210> 6
<211> 966
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> wekA (upec138)
<400> 6
atgatatata ttgtggtatt aaattggaat ggggctatag ataccattaa ttgtgttaaa 60
agtttaatgg atttaaatgt tagcgattat aaaattatca ttgttgataa ctgttctatg 120
gataactcat atgatactat aaaagaaaat cttaattcat tatatattgc tgataaaagt 180
atcattgagg tgaagtatga ggatagaaat aaatataaaa ccttagaaaa cgataaaatc 240
atattaatac aatctccgca aaataatggg tacgcaagtg gtaataatat tggcatagag 300
ttcgctctta atcaggagaa tatgaaatac gtctgggttc tgaataatga tactgaagtg 360
gataaagagg ctttaactca tttaattagt aaatgtgatt cagataaaag tatagggatt 420
tgcggttctc gtttagtcta ttttgccgac agagagatgc agcaaggact aggtggggtg 480
cataacaaat ggttatgcac tacaaaaaat tatgaaatgg gaagattagt ttccaaaaaa 540
tatgatgatg aagtcattag taatgatata gattatataa ttggcgcatc gatgtttttc 600
tctagagaat gtttggaaac agttggattg atgaatgaag aatatttttt atactatgaa 660
gagttagata tttgcctcag agcaaaagca aagaacttta aattaggtat ttgctcagaa 720
agtttggttt atcataaaat aggtgcaagt actgatgggg gaaagagcat gatggctgat 780
ctttgctcaa taaaaaatag gctggtcatt acagaaaggt tttatcccca atattattgg 840
acggtatggt tgtcactttt tgttgtagca tttaaccgtg ctagaagagg tgagtttaat 900
aagatgaaaa gatgtttgaa tgttatgttt aacttcaaac gaaacaaagg tagcaaatgc 960
cattag 966
<210> 7
<211> 1149
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> wekB (upec138)
<400> 7
atgaaagtgg cttttttatc tgcttatgat ccactatcta catccagttg gtctggcaca 60
ccttattata tgctaaaggc attatcgaag agaaatattt ccattgaaat attaggaccg 120
gtaaatagct atatgatata catgttaaaa gtatataaat taatattaag gtgtttcgga 180
aaagaatatg attatagtca ttcgaagttg ctttccaggt attacggtag aatattcggt 240
aggaaattaa aaaaaattga tggtttggat tttattatcg cacctgcagg ttcctcacaa 300
attgcttttt taaaaacaac cataccaata atatatctat cggatacaac atatgatcaa 360
ttaaaaagct attatccgaa tttaaataaa aaaacaatta taaatgatga ggatgcaagt 420
ttaatcgaac gcaaggctat tgaaaaagca acagtagtat ctttcccatc taaatgggca 480
atggattttt gcaggaatta ttacagatta gattttgata aattagttga aataccatgg 540
ggggctaatt tatttgatga tattcacttt gctaataaaa atataattca aaagaatagt 600
tatacttgtc ttttcttggg agttgattgg gaaagaaaag gtgggaaaac agccttgaaa 660
gcaattgaat atgtaaggca gttatatggg atcgatgtta gactaaaaat ttgtggatgt 720
actccgaatc aaaagatttt acctacttgg gttgaattaa ttgataaagt agataaaaat 780
aacgttgacg aatatcagaa attcatcgat gtgttatcta acgctgatat acttctttta 840
ccaaccattg ctgaatgtta tggaatggta ttttgtgaag ctgctgcttt tggattgcct 900
gttgtcgcta cagatacagg tggagtcagt tctatagtta tcaacgaaag gacggggata 960
ttaattaaag acccgttaga ctataagcac tttggaaatg caattcataa aataattagt 1020
tccgtagaga cttatcaaaa ctactcccaa aacgcaagaa ttagatataa taatatattg 1080
cattgggaca attgggctaa aaagataatt gagattatgt atgagcataa gaatagaaga 1140
atcaaatag 1149
<210> 8
<211> 1218
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> wzy (upec138)
<400> 8
atgagcataa gaatagaaga atcaaatagc acaaaaagaa ttatatgttt atttatactt 60
tttcttgttt tccctgattt tttgttttat acattagggg ttgataattt tagcatttca 120
acgataatct caattacatt gctttttgtt tttttaagag ctaaaaatat ttgcaaagat 180
aattttctaa taatagtagc gttattcata ttgttgtgtt ttaactgttt gttaagtatg 240
ctatttaata ttgaacaggc tttaacattt aaagttgtac tttcaatata tagcatctta 300
ataatggcat acgtctcctc ttgttatgca cagacgttgt ggttatgttc tgaagaaata 360
cttaagagat ccgtctttta tttgttcgca tttctttgcc ttattggcat tataagtatt 420
cttttacaga agactgagat tatacatgat aaaagtatga ttctttttcc tgaaccatca 480
gcatttgcat tggtttttat acctatcttt tcattttgtt tatactatac aagagggggg 540
gggctactat tgctctatat attatctttg ggtattgcgt taggtatcca gaatttaaca 600
atgttggtag gcattgtgat tagtgttttt gtgatgaaaa aaataactat aaggcaaact 660
attgttatac ttttgggggc atggattttt tccatgatat taagtgattt agacatttct 720
tactatacat cgcggcttga ttttaaaaat actacgaacc tatcagtgct tgtatatctt 780
tcaggaattg aaagagcttt cttgaatttt attacaagtt atggtcttgg tattggtttt 840
caacaaatgg gagtgaatgg ggagatagga atatatcaac aaattttagc tgaacttgat 900
gcccctatgt taaatatata cgatggctca tttatttctt ctaagttaat atctgagttt 960
ggggttattg gtgcattaat gtgtattttc tatttttttt atttttcccg attttatctg 1020
cgtttcaaaa aaagtaagag atattcaccg cagtatattt tagcatatag cttctacatg 1080
tgtttcttca tccctctttt tatacgtggt gctggttata taaaccccta tgtgtttatg 1140
ttattttcat caatattttt gtgcaaatat cacgctaaaa atatcttgat gaaatctaat 1200
gtccagatag ctatataa 1218
<210> 9
<211> 606
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> wbbJ (upec138)
<400> 9
atgtgcatta aaaaaaaact taagttaatt aaacgatatg gcctttatgg tggtcttagg 60
cttcttaaag atatattctt aacaaaattt ttattttgtt caaatgttag gattattaga 120
tttccatgtt atattagaaa agatggaagt gttagttttg gaaaaggttt tacatcaggt 180
gtaggattac gagttgatgc atttatggat gccgtagttt ccattggaga aaatgttcaa 240
attaatgact atgttcacat cgcggctatt aataatgtca ttattggtag agatacatta 300
atagcaagta aagtatttat tagtgatcat aatcatggta ttttttctaa atccgatatc 360
catagttcac caactattat tccttcgtct aggccccttg aatctgcacc tgtgtatatt 420
ggagagcgtg tgtggattgg cgaaaatgtg acaatattac caggtgcgtg tataggtaat 480
ggtgtagtta ttggcgcaaa cagtgttgtt cgtggtgaga ttcctaataa tgtgatcatt 540
gctggtgttc cagctaaaat tgttaaaaaa tataactatg agcgtatgca atgggaaaga 600
atatag 606
<210> 10
<211> 1101
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> wbbK (upec138)
<400> 10
atgggaaaga atatagttgt aatatcggct gttaatttta caaccggagg cccctttacc 60
gtactaaaaa atgtgcttac agcaactaaa gatagagccg aatgtaaatt tattgcactg 120
gttcatagct ctgctgaact aatggaatta tttccgtggg ttgaatttat agagtatcca 180
gaagtcaagt cttcgtgggt taaaagatta tatttcgaat atataacttg caatagatta 240
tctaaggtga ttaaggcaac tcattgggta tgcttacatg atattacagc aaatgttagt 300
gtaccctata gatttgttta ttgccacaat cctgcaccgt tctataaata tttaagctat 360
cgagatatta taggagaacc taaattttat cttttttatc ttttttatgg gcttttatac 420
aatatcaata taaaaaagaa cacagcagtt tttgttcagc agcagtggct aaaaaaagaa 480
ttcgaaaaaa aatataagtt aaagaatgtt gttgttagtc gccctgaaga tatttgccct 540
tttgaaagtg atggtttggt aagaaataat aataaaaagg atgtgaggat attttaccca 600
gcagtgcccc gtatatttaa aaactttgaa gttatcatac gtgctgcaca aatattacaa 660
gataaaaata ttcattttta tcttactttt gatggtactg aaaataagta tgcaaaaaga 720
atatataaat tagcttccga actgaaaaat gtacatttcc tcggttacct taatgcaacc 780
gagatggtta acttttatca agattcagat attatttgtt tcccatcgaa actagaaacg 840
tggggattac cattatcaga agctaaaaca tacaaaaaat ggatatttgc ggcagactta 900
ccttatgctc atgaagtttt atataactat tcaaaaacta gatattttcc atttgacgat 960
gagaaaatac ttgttcgcta catattagag tacacaagta aaaatatgca tgaagatata 1020
aaaaatagta gggtgaattt taataatgat gcattgactg gttttgaaca gtttattgaa 1080
tatatcctca aggggaactg a 1101
<210> 11
<211> 564
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> wbbL (upec138)
<400> 11
atgattatga ataatgatta ttttctcttt cttaaccccg atgtattcat aaccagtgaa 60
agtttgatta attatgttga ttatataatt agtaatgatt ataagtttag cacattatgt 120
ctttatcgag attttactaa aagcaaacat gattattcaa tacggagttt tccaacttta 180
tatgattttc tttgttcttt tttattgggg gtgaataaaa gtaaaattaa gaaggaaaat 240
atactttctg atactgtagt tgattggtgt gctggctcat ttatgcttat tcatgcttta 300
agtttcttaa atgtgaatgg ttttgatcaa aaatatttta tgtattgtga agatattgac 360
ctttgtatgc gtttaaaatt aagtggagta gatctttact atactcccca ttttgatgct 420
attcattatg cgcagcatga aaatagaaga atatttacta aagcatttcg atggcatata 480
aggagtatta cgcgctacat attacggaaa ccaattcttt cttataaaaa ctatagaaaa 540
attacatccg aactggtaaa gtga 564
<210> 12
<211> 10653
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> 大肠杆菌 rfb(upec138)基因簇
<400> 12
gtgaagatac ttgttactgg tggcgcagga tttattggtt ctgctgttgt tcgtcacata 60
ataaataata cgcaagatag tgttgttaat gtcgataaat taacatacgc cggaaacctg 120
gaatcacttg cagatgtttc tgattctgaa cgctatttct ttgaacatgc ggatatttgt 180
gatgcagctg caatggcacg gatttttgct cagcatcagc cggatgcagt gatgcacctg 240
gcagctgaaa gccatgttga ccgttcaatt acaggccctg cggcatttat tgaaaccaat 300
attgtgggta cttatgtcct tttagaagcg gctcggaatt attggtctgg tctggatgat 360
gaaaagaaaa aaaacttccg ttttcatcat atttctactg atgaggtgta tggtgactta 420
ccccatccgg atgaagtaaa tagcaatgaa acgttgccgc tatttacgga aacgacagca 480
tacgcgccaa gtagtccata ttctgcttct aaagcttcca gcgatcattt ggttcgcgca 540
tggaaacgta cttatggttt accgaccatt gtgactaatt gctcgaacaa ctatggtcct 600
tatcatttcc cggaaaagct tattccactg gttattctta attcactgga aggtaaggca 660
ttacctattt atggcaaagg agatcagatc cgcgactggt tgtatgtaga ggatcatgct 720
cgagcgttat ataccgtcgt aaccgaaggt aaagcgggcg aaacttataa cattggtgga 780
cacaacgaaa agaaaaacat cgacgtagtg ttcactattt gtgatttgtt ggatgagata 840
gtcccgaaag agaaatctta ccgcgagcaa attacttatg ttaccgatcg tccgggacac 900
gatcgccgtt atgcgattga tgctgagaag attggtcgcg aattgggatg gaaaccacag 960
gaaacgtttg agagtgggat tcgtaaaacg gtggaatggt acctgtccaa tacaaaatgg 1020
gttgataatg tgaaaagtgg tgcctatcaa tcgtggattg aacagaacta tgagggccgc 1080
cagtaatgaa tatcctcctt tttggcaaaa cagggcaggt aggttgggaa ctacagcgtg 1140
ctctggcacc tctgggtaat ttgattgctc ttgatgttca ctccactgat tactgtggtg 1200
attttagtaa tcctgaaggt gtagctgaaa ccgtaagaag cattcggcct gatattattg 1260
tcaacgcagc cgctcacacc gcagtagaca aagcagaatc agaaccgaag tttgcacaat 1320
tactgaacgc gacgagtgtc gaagcgatcg cgaaagcagc caatgaagtc ggcgcctggg 1380
ttattcacta ctctactgac tacgtatttc cggggaccgg tgaaatacca tggcaggagg 1440
aggatgcaac cgcaccgcta aatgtttacg gtgaaaccaa gttagcggga gaaaaagcat 1500
tacaagagca ttgtgcgaag caccttattt tccggaccag ctgggtctat gcaggtaaag 1560
gaaataactt cgccaaaaca atgttgcgtc tggcaaaaga gcgtgaagaa ttagccgtta 1620
ttaatgatca gtttggtgcg ccaactggcg cagagttact ggctgattgt acggcacatg 1680
ctattcgtgt ggcactgaat aaaccggaag tcgcaggctt gtaccatctg gtagctagtg 1740
gtaccacaac gtggcacgat tatgctgcgc tggtttttga agaggcgcgc aaagcaggca 1800
ttccccttgc actcaacaag ctcaacgcag taccaacaac agcctatcct acaccagctc 1860
gtcgtccaca taactctcgc cttaatacag aaaaatttca gcagaacttt gcgcttgtct 1920
tgcctgactg gcaggttggc gtgaaacgaa tgcttaacga attatttacg actacagcaa 1980
tttaatagtt tttgcatctt gttcgtaatg gtggagcaag atgtattaaa aggaatgatg 2040
aaatgaaaac gcgtaaaggt attattttgg cgggtggttc tggtactcgt ctttatcctg 2100
tgacgatggc cgtcagtaaa cagctgttac cgatttatga taaaccgatg atctattacc 2160
cgctctctac actgatgtta gcgggtattc gcgatattct gattatcagt acaccacagg 2220
atactcctcg ttttcaacaa ctgctgggtg acgggagcca gtggggcctg aatcttcagt 2280
acaaagtgca accgagtccg gatggtcttg cgcaggcgtt tattatcggt gaagagttta 2340
ttggtggtga tgattgtgct ttggtacttg gtgataatat cttctacggc cacgacctgc 2400
cgaagttaat ggacgtagct gttaacaaag aaagtggtgc aacggtattt gcctatcacg 2460
ttaatgatcc tgaacgttat ggtgtcgtgg agtttgataa taacggtact gcaattagcc 2520
tggaagaaaa accgctggaa ccaaaaagta actatgcggt tactgggctt tatttctatg 2580
acaatgacgt tgtggaaatg gcgaaaaacc ttaagccttc tgcccgaggt gaactggaaa 2640
ttaccgatat taaccgtatt tatatggaac aaggacgttt gtctgtcgct atgatggggc 2700
gtggctatgc atggctggat acagggacgc atcaaagtct tattgaagca agcaacttca 2760
ttgccaccat tgaagagcgc cagggactaa aggtttcctg tccggaagaa attgcttatc 2820
gtaaagggtt tattgatgct gagcaggtaa aagtattagc cgaaccgttg aagaaaaatg 2880
cttatggtca gtatctgctc aaaatgatta aaggttatta ataagatgaa cgtaattaaa 2940
actgaaattc ctgatgtgct gatttttgaa ccaaaagttt ttggggatga acgtggcttc 3000
ttttttgaga gttttaatca gaggattttt gaagaagcag taggtcgtaa ggttgagttt 3060
gttcaggata accattctaa gtccagtaaa ggtgttttac gtggtcttca ttatcagtta 3120
gaaccttatg ctcaaggaaa actggtgcgc tgtgttgttg gcgaggtttt tgatgttgcg 3180
gttgatattc gtaaatcgtc acctacattt gggaaatggg ttggggtgaa tttgtctgct 3240
gagaataagc gtcagttgtg gattcctgag ggatttgcac atggtttttt ggtgctgagt 3300
gatttagcag aagttttata taaaacgaat caatattatg ctccatcaca tgaaaaaaat 3360
attatatgga atgacctctt gcttaatatt aaatggccga gcacagcact gatcactctg 3420
tctgataagg atgcaaatgg ggaaagattt gaactaagtg agttttgaaa tgtctctctt 3480
aaaacatagt atatggaatg ttgcgggcta ctttatacca acattaattg caattcccgc 3540
ctttggatta attgcgagga aaattggtgt agaactattt ggtttgtata cgttagcaat 3600
gatttttata gggtatgcaa gtatatttga tgctgggtta acaagagctg ttgtgcgtga 3660
aatagcatta ctaaaaaaca gagtggacga ttgtaatacg ataatagtaa cttctattat 3720
cgctgtgata tttttagggt ttatcggagg cgggggagtg tttctgctta aaggcgatat 3780
tattgaactg ttaaatatct caccaatata ttacgccgat tcgataaagt ctctagtatt 3840
attatcatct ctgatacctg tattcttagt cacgcaaata ctattagcag agcttgaggg 3900
tcgggaatat tttgggattc taaatataca aaaaagtgta gggaattctt taattgcagg 3960
gttacctgca ttatttgttt taattaatca aacgcttttt tctgcaatta ttggtgtagc 4020
gattgcaaga gttatatgct tgtggttaag ctacattatg agcagggaaa gaataactat 4080
cgatatctca tttttttcaa taactgtttt aaagcggtta tttagatatg gcgggtgggt 4140
aactataagt aacataatat ctcctatatt agcgagtatg gatagattta ttctatccca 4200
tatccaggga gcatcaaaaa tatcattcta tacagtccct aatgagctgg taactaggct 4260
tggaatagtt ccaggctctc ttgggaaagc tgtttttcca aaattaagtc atgcaaggaa 4320
ttttacagcg tcatatgcag agcaaaaaaa agcttatata ttaatgactg tcattgtaat 4380
gcctttggtt ttatttgtat attattacgc aaagtttatt ttaacattgt ggatgggggc 4440
tgagtatgca gggatttcgg tcgaaatatt acggattatg cttatagggt atatttttaa 4500
ctgttattca caaatctctt ttgccaacat acaggccttt ggaaaagcaa aatacactgc 4560
atacatccat atgatggaat ttattcctta tttgataatg ttatatataa tttcaaagga 4620
atatggggtt attggtgttg cgtggttatg gacaattcga gtaataattg attttttgat 4680
gcttttatat atgagttatc gttgtaataa tcttatgaaa aaagggtagc ctgatgatat 4740
atattgtggt attaaattgg aatggggcta tagataccat taattgtgtt aaaagtttaa 4800
tggatttaaa tgttagcgat tataaaatta tcattgttga taactgttct atggataact 4860
catatgatac tataaaagaa aatcttaatt cattatatat tgctgataaa agtatcattg 4920
aggtgaagta tgaggataga aataaatata aaaccttaga aaacgataaa atcatattaa 4980
tacaatctcc gcaaaataat gggtacgcaa gtggtaataa tattggcata gagttcgctc 5040
ttaatcagga gaatatgaaa tacgtctggg ttctgaataa tgatactgaa gtggataaag 5100
aggctttaac tcatttaatt agtaaatgtg attcagataa aagtataggg atttgcggtt 5160
ctcgtttagt ctattttgcc gacagagaga tgcagcaagg actaggtggg gtgcataaca 5220
aatggttatg cactacaaaa aattatgaaa tgggaagatt agtttccaaa aaatatgatg 5280
atgaagtcat tagtaatgat atagattata taattggcgc atcgatgttt ttctctagag 5340
aatgtttgga aacagttgga ttgatgaatg aagaatattt tttatactat gaagagttag 5400
atatttgcct cagagcaaaa gcaaagaact ttaaattagg tatttgctca gaaagtttgg 5460
tttatcataa aataggtgca agtactgatg ggggaaagag catgatggct gatctttgct 5520
caataaaaaa taggctggtc attacagaaa ggttttatcc ccaatattat tggacggtat 5580
ggttgtcact ttttgttgta gcatttaacc gtgctagaag aggtgagttt aataagatga 5640
aaagatgttt gaatgttatg tttaacttca aacgaaacaa aggtagcaaa tgccattaga 5700
atatgcactt aatcatggtg ttaataaatc tatagtttga tatgttatta aagggtattt 5760
aatgaaagtg gcttttttat ctgcttatga tccactatct acatccagtt ggtctggcac 5820
accttattat atgctaaagg cattatcgaa gagaaatatt tccattgaaa tattaggacc 5880
ggtaaatagc tatatgatat acatgttaaa agtatataaa ttaatattaa ggtgtttcgg 5940
aaaagaatat gattatagtc attcgaagtt gctttccagg tattacggta gaatattcgg 6000
taggaaatta aaaaaaattg atggtttgga ttttattatc gcacctgcag gttcctcaca 6060
aattgctttt ttaaaaacaa ccataccaat aatatatcta tcggatacaa catatgatca 6120
attaaaaagc tattatccga atttaaataa aaaaacaatt ataaatgatg aggatgcaag 6180
tttaatcgaa cgcaaggcta ttgaaaaagc aacagtagta tctttcccat ctaaatgggc 6240
aatggatttt tgcaggaatt attacagatt agattttgat aaattagttg aaataccatg 6300
gggggctaat ttatttgatg atattcactt tgctaataaa aatataattc aaaagaatag 6360
ttatacttgt cttttcttgg gagttgattg ggaaagaaaa ggtgggaaaa cagccttgaa 6420
agcaattgaa tatgtaaggc agttatatgg gatcgatgtt agactaaaaa tttgtggatg 6480
tactccgaat caaaagattt tacctacttg ggttgaatta attgataaag tagataaaaa 6540
taacgttgac gaatatcaga aattcatcga tgtgttatct aacgctgata tacttctttt 6600
accaaccatt gctgaatgtt atggaatggt attttgtgaa gctgctgctt ttggattgcc 6660
tgttgtcgct acagatacag gtggagtcag ttctatagtt atcaacgaaa ggacggggat 6720
attaattaaa gacccgttag actataagca ctttggaaat gcaattcata aaataattag 6780
ttccgtagag acttatcaaa actactccca aaacgcaaga attagatata ataatatatt 6840
gcattgggac aattgggcta aaaagataat tgagattatg tatgagcata agaatagaag 6900
aatcaaatag cacaaaaaga attatatgtt tatttatact ttttcttgtt ttccctgatt 6960
ttttgtttta tacattaggg gttgataatt ttagcatttc aacgataatc tcaattacat 7020
tgctttttgt ttttttaaga gctaaaaata tttgcaaaga taattttcta ataatagtag 7080
cgttattcat attgttgtgt tttaactgtt tgttaagtat gctatttaat attgaacagg 7140
ctttaacatt taaagttgta ctttcaatat atagcatctt aataatggca tacgtctcct 7200
cttgttatgc acagacgttg tggttatgtt ctgaagaaat acttaagaga tccgtctttt 7260
atttgttcgc atttctttgc cttattggca ttataagtat tcttttacag aagactgaga 7320
ttatacatga taaaagtatg attctttttc ctgaaccatc agcatttgca ttggttttta 7380
tacctatctt ttcattttgt ttatactata caagaggggg ggggctacta ttgctctata 7440
tattatcttt gggtattgcg ttaggtatcc agaatttaac aatgttggta ggcattgtga 7500
ttagtgtttt tgtgatgaaa aaaataacta taaggcaaac tattgttata cttttggggg 7560
catggatttt ttccatgata ttaagtgatt tagacatttc ttactataca tcgcggcttg 7620
attttaaaaa tactacgaac ctatcagtgc ttgtatatct ttcaggaatt gaaagagctt 7680
tcttgaattt tattacaagt tatggtcttg gtattggttt tcaacaaatg ggagtgaatg 7740
gggagatagg aatatatcaa caaattttag ctgaacttga tgcccctatg ttaaatatat 7800
acgatggctc atttatttct tctaagttaa tatctgagtt tggggttatt ggtgcattaa 7860
tgtgtatttt ctattttttt tatttttccc gattttatct gcgtttcaaa aaaagtaaga 7920
gatattcacc gcagtatatt ttagcatata gcttctacat gtgtttcttc atccctcttt 7980
ttatacgtgg tgctggttat ataaacccct atgtgtttat gttattttca tcaatatttt 8040
tgtgcaaata tcacgctaaa aatatcttga tgaaatctaa tgtccagata gctatataat 8100
agtagattat attatcatta tcacgtaaat tacatattaa tagcatatat gataactagg 8160
acataaataa tgtgcattaa aaaaaaactt aagttaatta aacgatatgg cctttatggt 8220
ggtcttaggc ttcttaaaga tatattctta acaaaatttt tattttgttc aaatgttagg 8280
attattagat ttccatgtta tattagaaaa gatggaagtg ttagttttgg aaaaggtttt 8340
acatcaggtg taggattacg agttgatgca tttatggatg ccgtagtttc cattggagaa 8400
aatgttcaaa ttaatgacta tgttcacatc gcggctatta ataatgtcat tattggtaga 8460
gatacattaa tagcaagtaa agtatttatt agtgatcata atcatggtat tttttctaaa 8520
tccgatatcc atagttcacc aactattatt ccttcgtcta ggccccttga atctgcacct 8580
gtgtatattg gagagcgtgt gtggattggc gaaaatgtga caatattacc aggtgcgtgt 8640
ataggtaatg gtgtagttat tggcgcaaac agtgttgttc gtggtgagat tcctaataat 8700
gtgatcattg ctggtgttcc agctaaaatt gttaaaaaat ataactatga gcgtatgcaa 8760
tgggaaagaa tatagttgta atatcggctg ttaattttac aaccggaggc ccctttaccg 8820
tactaaaaaa tgtgcttaca gcaactaaag atagagccga atgtaaattt attgcactgg 8880
ttcatagctc tgctgaacta atggaattat ttccgtgggt tgaatttata gagtatccag 8940
aagtcaagtc ttcgtgggtt aaaagattat atttcgaata tataacttgc aatagattat 9000
ctaaggtgat taaggcaact cattgggtat gcttacatga tattacagca aatgttagtg 9060
taccctatag atttgtttat tgccacaatc ctgcaccgtt ctataaatat ttaagctatc 9120
gagatattat aggagaacct aaattttatc ttttttatct tttttatggg cttttataca 9180
atatcaatat aaaaaagaac acagcagttt ttgttcagca gcagtggcta aaaaaagaat 9240
tcgaaaaaaa atataagtta aagaatgttg ttgttagtcg ccctgaagat atttgccctt 9300
ttgaaagtga tggtttggta agaaataata ataaaaagga tgtgaggata ttttacccag 9360
cagtgccccg tatatttaaa aactttgaag ttatcatacg tgctgcacaa atattacaag 9420
ataaaaatat tcatttttat cttacttttg atggtactga aaataagtat gcaaaaagaa 9480
tatataaatt agcttccgaa ctgaaaaatg tacatttcct cggttacctt aatgcaaccg 9540
agatggttaa cttttatcaa gattcagata ttatttgttt cccatcgaaa ctagaaacgt 9600
ggggattacc attatcagaa gctaaaacat acaaaaaatg gatatttgcg gcagacttac 9660
cttatgctca tgaagtttta tataactatt caaaaactag atattttcca tttgacgatg 9720
agaaaatact tgttcgctac atattagagt acacaagtaa aaatatgcat gaagatataa 9780
aaaatagtag ggtgaatttt aataatgatg cattgactgg ttttgaacag tttattgaat 9840
atatcctcaa ggggaactga cgtggtttat attataatcg tttcacatgg ccatgatgac 9900
tatatagaaa atcttttatt aaatttaaag ttgccctctg gaagatttaa aataatagtt 9960
cgtgataaca aaagttcaat ggttttaaaa aaaacatgcg aaaaaaattg cgtaacctat 10020
ttgcatggag ggcaatatgg atttggacat aataataaca tagcagtgtc atatataatt 10080
aataacttca tgattatgaa taatgattat tttctctttc ttaaccccga tgtattcata 10140
accagtgaaa gtttgattaa ttatgttgat tatataatta gtaatgatta taagtttagc 10200
acattatgtc tttatcgaga ttttactaaa agcaaacatg attattcaat acggagtttt 10260
ccaactttat atgattttct ttgttctttt ttattggggg tgaataaaag taaaattaag 10320
aaggaaaata tactttctga tactgtagtt gattggtgtg ctggctcatt tatgcttatt 10380
catgctttaa gtttcttaaa tgtgaatggt tttgatcaaa aatattttat gtattgtgaa 10440
gatattgacc tttgtatgcg tttaaaatta agtggagtag atctttacta tactccccat 10500
tttgatgcta ttcattatgc gcagcatgaa aatagaagaa tatttactaa agcatttcga 10560
tggcatataa ggagtattac gcgctacata ttacggaaac caattctttc ttataaaaac 10620
tatagaaaaa ttacatccga actggtaaag tga 10653
<210> 13
<211> 652
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含4个优化的N-糖基化序列的脱毒的EPA蛋白
<400> 13
Gly Ser Gly Gly Gly Asp Gln Asn Ala Thr Gly Ser Gly Gly Gly Lys
1 5 10 15
Leu Ala Glu Glu Ala Phe Asp Leu Trp Asn Glu Cys Ala Lys Ala Cys
20 25 30
Val Leu Asp Leu Lys Asp Gly Val Arg Ser Ser Arg Met Ser Val Asp
35 40 45
Pro Ala Ile Ala Asp Thr Asn Gly Gln Gly Val Leu His Tyr Ser Met
50 55 60
Val Leu Glu Gly Gly Asn Asp Ala Leu Lys Leu Ala Ile Asp Asn Ala
65 70 75 80
Leu Ser Ile Thr Ser Asp Gly Leu Thr Ile Arg Leu Glu Gly Gly Val
85 90 95
Glu Pro Asn Lys Pro Val Arg Tyr Ser Tyr Thr Arg Gln Ala Arg Gly
100 105 110
Ser Trp Ser Leu Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly His Glu Lys Pro Ser
115 120 125
Asn Ile Lys Val Phe Ile His Glu Leu Asn Ala Gly Asn Gln Leu Ser
130 135 140
His Met Ser Pro Ile Tyr Thr Ile Glu Met Gly Asp Glu Leu Leu Ala
145 150 155 160
Lys Leu Ala Arg Asp Ala Thr Phe Phe Val Arg Ala His Glu Ser Asn
165 170 175
Glu Met Gln Pro Thr Leu Ala Ile Ser His Ala Gly Val Ser Val Val
180 185 190
Met Ala Gln Ala Gln Pro Arg Arg Glu Lys Arg Trp Ser Glu Trp Ala
195 200 205
Ser Gly Lys Val Leu Cys Leu Leu Asp Pro Leu Asp Gly Val Tyr Asn
210 215 220
Tyr Leu Ala Gln Gln Arg Cys Asn Leu Asp Asp Thr Trp Glu Gly Lys
225 230 235 240
Ile Tyr Arg Val Leu Ala Gly Asn Pro Ala Lys His Asp Leu Asp Ile
245 250 255
Lys Asp Asn Asn Asn Ser Thr Pro Thr Val Ile Ser His Arg Leu His
260 265 270
Phe Pro Glu Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys
275 280 285
His Leu Pro Leu Glu Ala Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp
290 295 300
Glu Gln Leu Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu
305 310 315 320
Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg
325 330 335
Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile
340 345 350
Arg Glu Gln Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala
355 360 365
Glu Ser Glu Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly
370 375 380
Ala Ala Ser Ala Asp Val Val Ser Leu Thr Cys Pro Val Ala Lys Asp
385 390 395 400
Gln Asn Arg Thr Lys Gly Glu Cys Ala Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp
405 410 415
Ala Leu Leu Glu Arg Asn Tyr Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp
420 425 430
Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val
435 440 445
Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val
450 455 460
Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val
465 470 475 480
Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg
485 490 495
Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln
500 505 510
Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu
515 520 525
Arg Val Tyr Val Pro Arg Trp Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Gly
530 535 540
Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile
545 550 555 560
Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu
565 570 575
Glu Gly Gly Arg Val Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr
580 585 590
Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly
595 600 605
Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala
610 615 620
Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu
625 630 635 640
Lys Leu Gly Ser Gly Gly Gly Asp Gln Asn Ala Thr
645 650
<210> 14
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-糖基化共有序列
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(2)
<223> Xaa = 任何氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> (3)..(3)
<223> Xaa = Ser或Thr
<400> 14
Asn Xaa Xaa
1
<210> 15
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-糖基化共有序列
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = Asp或Glu
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(2)
<223> Xaa = 独立地选自除Pro外的任何天然氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> (4)..(4)
<223> Xaa = 独立地选自除Pro外的任何天然氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> (5)..(5)
<223> Xaa = Ser或Thr
<400> 15
Xaa Xaa Asn Xaa Xaa
1 5

Claims (20)

1.组合物，其包含共价偶联至载体蛋白的大肠杆菌O25B抗原的生物缀合物，其中所述大肠杆菌O25B抗原包含式O25B的结构：
其中n是1至30之间的整数。
2.权利要求1的组合物，其中所述大肠杆菌O25B抗原包含式O25B’的结构：
其中n是1至30之间的整数。
3.权利要求1或2的组合物，其中所述大肠杆菌O25B抗原共价结合至所述载体蛋白中的Asn残基。
4.权利要求1至3中任一项的组合物，其还包含：(i)O1A生物缀合物，其包含共价结合至载体蛋白的Asn残基的大肠杆菌O1A抗原；(ii)O2生物缀合物，其包含共价结合至载体蛋白的Asn残基的大肠杆菌O2抗原；和(iii)O6生物缀合物，其包含共价结合至载体蛋白的Asn残基的大肠杆菌O6抗原。
5.权利要求4的组合物，其中所述O1A抗原、O6抗原和O2抗原分别包含下式：
a. 式O1A’
b. 式O6Glc’
和
c. 式O2’
。
6.权利要求1至5中任一项的组合物，其中所述载体蛋白选自：脱毒的绿脓假单胞菌外毒素A(EPA)、CRM197、麦芽糖结合蛋白(MBP)、白喉类毒素、破伤风类毒素、脱毒的金黄色葡萄球菌溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、大肠杆菌FimH、大肠杆菌FimHC、大肠杆菌不耐热肠毒素、大肠杆菌不耐热肠毒素的脱毒变体、霍乱毒素B亚单元(CTB)、霍乱毒素、霍乱毒素的脱毒变体、大肠杆菌Sat蛋白、大肠杆菌Sat蛋白的过客结构域、肺炎链球菌肺炎球菌溶血素及其脱毒变体、空肠弯曲杆菌AcrA和空肠弯曲杆菌天然糖蛋白。
7.权利要求6的组合物，其中所述载体蛋白是脱毒EPA。
8.权利要求3至7中任一项的组合物，其中所述载体蛋白的Asn残基位于共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)中，其中X和Z独立地选自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQ ID NO:15)。
9.针对肠外病原性大肠杆菌对个体接种疫苗的方法，其中所述方法包括向所述个体施用有效量的权利要求1至8中任一项的组合物。
10.在个体中诱导针对肠外病原性大肠杆菌的免疫反应的方法，其中所述方法包括向所述个体施用有效量的权利要求1至8中任一项的组合物。
11.在个体中诱导产生特异于肠外病原性大肠杆菌的调理吞噬抗体的方法，其中所述方法包括向所述个体施用有效量的权利要求1至8中任一项的组合物。
12.权利要求9至11中任一项的方法，其中所述个体具有发生泌尿道感染的风险。
13.权利要求9至11中任一项的方法，其中所述个体具有发生菌血症的风险。
14.权利要求9至11中任一项的方法，其中所述个体具有发生败血症的风险。
15.权利要求9至14中任一项的方法，其中所述个体是人。
16.原核宿主细胞，其包含：
a. 编码以下的核苷酸序列：
i. dTDP-葡萄糖4,6-脱水酶；
ii. dTDP-6-脱氧-D-葡萄糖3,5-差向异构酶；
iii. 葡萄糖-1-磷酸胸苷基转移酶；
iv. dTDP-4-脱氢鼠李糖3,5-差向异构酶；
v. O抗原翻转酶；
vi. dTDP-Rha: Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP α-1,3-鼠李糖基转移酶；
vii. UDP-Glc: Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP β-1,6-葡萄糖基转移酶；
viii. O抗原聚合酶；
ix.O-乙酰基转移酶；
x. UDP-Glc: Rha-GlcNAc-UPP α-1,3-葡萄糖基转移酶；和
xi. dTDP-Rha: GlcNAc-UPP α-1,3-鼠李糖基转移酶；
b. 编码寡糖基转移酶的核苷酸序列；和
c. 编码包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的载体蛋白的核苷酸序列，其中X和Z独立地选自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQ ID NO: 15)。
17.权利要求16的宿主细胞，其中waaL基因、gtrA基因、gtrB基因、gtrS基因或rfb簇中的至少一个从所述宿主细胞的基因组中缺失或功能失活。
18.权利要求16或17的宿主细胞，其中所述载体蛋白选自：脱毒的绿脓假单胞菌外毒素A(EPA)、CRM197、麦芽糖结合蛋白(MBP)、白喉类毒素、破伤风类毒素、脱毒的金黄色葡萄球菌溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、大肠杆菌FimH、大肠杆菌FimHC、大肠杆菌不耐热肠毒素、大肠杆菌不耐热肠毒素的脱毒变体、霍乱毒素B亚单元(CTB)、霍乱毒素、霍乱毒素的脱毒变体、大肠杆菌Sat蛋白、大肠杆菌Sat蛋白的过客结构域、肺炎链球菌肺炎球菌溶血素及其脱毒变体、空肠弯曲杆菌AcrA和空肠弯曲杆菌天然糖蛋白。
19.权利要求16至18中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞为大肠杆菌宿主细胞。
20.制备包含大肠杆菌O25B抗原的N-糖基化的载体蛋白的方法，所述方法包括：
a. 培养权利要求16至19中任一项的宿主细胞；和
b. 纯化包含大肠杆菌O25B抗原的N-糖基化的载体蛋白。
CN201580020077.8A 2014-02-24 2015-02-23 新颖多糖及其用途 Active CN106535927B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461943710P 2014-02-24 2014-02-24
US61/943710 2014-02-24
PCT/EP2015/053739 WO2015124769A1 (en) 2014-02-24 2015-02-23 Novel polysaccharide and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106535927A true CN106535927A (zh) 2017-03-22
CN106535927B CN106535927B (zh) 2019-09-20

Family

ID=52589386

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580020077.8A Active CN106535927B (zh) 2014-02-24 2015-02-23 新颖多糖及其用途

Country Status (28)

Country Link
US (5) US9700612B2 (zh)
EP (1) EP3110441B1 (zh)
JP (2) JP6276427B2 (zh)
KR (1) KR101855142B1 (zh)
CN (1) CN106535927B (zh)
AR (1) AR100859A1 (zh)
AU (1) AU2015220723C1 (zh)
CA (1) CA2940547C (zh)
CL (1) CL2016002123A1 (zh)
DK (1) DK3110441T5 (zh)
EA (1) EA035991B9 (zh)
ES (1) ES2978870T3 (zh)
FI (1) FI3110441T3 (zh)
HR (1) HRP20240847T1 (zh)
HU (1) HUE066507T2 (zh)
IL (1) IL247344B (zh)
LT (1) LT3110441T (zh)
MX (1) MX380438B (zh)
NZ (1) NZ723328A (zh)
PH (1) PH12016501671A1 (zh)
PL (1) PL3110441T3 (zh)
PT (1) PT3110441T (zh)
RS (1) RS65631B1 (zh)
SG (1) SG11201606889PA (zh)
SI (1) SI3110441T1 (zh)
TW (1) TWI639439B (zh)
WO (1) WO2015124769A1 (zh)
ZA (1) ZA201605858B (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108531439A (zh) * 2018-04-16 2018-09-14 南京工业大学 一种大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用
CN110018253A (zh) * 2019-04-15 2019-07-16 艾美卫信生物药业（浙江）有限公司 一种生物制品中游离蛋白含量的高效液相测定方法
CN113924112A (zh) * 2019-03-18 2022-01-11 杨森制药公司 大肠杆菌o-抗原多糖的生物缀合物、其生产方法及其使用方法
CN114555817A (zh) * 2019-06-13 2022-05-27 敦提大学 鼠李糖多糖
CN115803087A (zh) * 2020-09-17 2023-03-14 杨森制药公司 多价疫苗组合物及其用途
CN116406445A (zh) * 2020-11-30 2023-07-07 杨森制药公司 使用基于毛细管的免疫测定系统进行的用于糖缀合物的分析方法

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ707777A (en) 2013-01-17 2019-12-20 X4 Pharmaceuticals Austria Gmbh Mdr e. coli specific antibody
EP3110441B1 (en) 2014-02-24 2024-04-03 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Novel polysaccharide and uses thereof
US10722580B2 (en) * 2015-05-13 2020-07-28 University Of Washington Compositions and methods for treatment and prevention of uropathogenic E. coli infection
TWI715617B (zh) 2015-08-24 2021-01-11 比利時商葛蘭素史密斯克藍生物品公司 對抗腸道外病原性大腸桿菌之免疫保護之方法及組合物
AR109621A1 (es) 2016-10-24 2018-12-26 Janssen Pharmaceuticals Inc Formulaciones de vacunas contra glucoconjugados de expec
GB201711637D0 (en) * 2017-07-19 2017-08-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic composition
US20190275134A1 (en) 2018-03-12 2019-09-12 Janssen Pharmaceuticals, Inc Vaccines against urinary tract infections
US11260119B2 (en) 2018-08-24 2022-03-01 Pfizer Inc. Escherichia coli compositions and methods thereof
KR102574882B1 (ko) 2019-03-18 2023-09-04 얀센 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 대장균 o-항원 다당류의 바이오컨쥬게이트의 생성 방법, 이의 조성물 및 이의 사용 방법
CN111855826B (zh) * 2019-04-24 2022-09-16 岛津企业管理（中国）有限公司 破伤风类毒素或白喉类毒素的监测方法
JP7485771B2 (ja) 2020-01-16 2024-05-16 ヤンセン ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド ＦｉｍＨ変異体、その組成物、及びその使用
US20230085173A1 (en) * 2020-02-21 2023-03-16 Pfizer Inc. Purification of saccharides
PE20230170A1 (es) * 2020-02-23 2023-02-01 Pfizer Composiciones de escherichia coli y sus metodos
US20230346902A1 (en) 2020-06-18 2023-11-02 Glaxosmithkline Biologicals Sa Shigella-Tetravalent (Shigella4V) Bioconjugate
CA3185639A1 (en) 2020-06-25 2021-12-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccine
US12138302B2 (en) 2020-10-27 2024-11-12 Pfizer Inc. Escherichia coli compositions and methods thereof
US12357681B2 (en) 2020-12-23 2025-07-15 Pfizer Inc. E. coli FimH mutants and uses thereof
KR102746713B1 (ko) 2021-01-12 2024-12-24 얀센 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 FimH 돌연변이체, 이를 포함하는 조성물 및 이의 용도
WO2022178020A1 (en) 2021-02-16 2022-08-25 Duke University Vaccine compositions and methods for the treatment and prevention of urinary tract infections
KR20230164108A (ko) 2021-04-01 2023-12-01 얀센 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 E. coli O18 생물접합체의 생산
WO2022214620A1 (en) 2021-04-08 2022-10-13 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Process for bioconjugate production
EP4452308A1 (en) 2021-12-22 2024-10-30 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Vaccine
US12014256B2 (en) * 2022-01-12 2024-06-18 Dell Products L.P Polysaccharide archival storage
CN114150005B (zh) * 2022-02-09 2022-04-22 广州恩宝生物医药科技有限公司 用于预防SARS-CoV-2奥密克戎株的腺病毒载体疫苗
CN120569210A (zh) * 2022-12-05 2025-08-29 杨森制药公司 生物缀合物组合物以及生物缀合物的生产方法
GB202302579D0 (en) 2023-02-23 2023-04-12 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic composition
EP4478050A1 (en) 2023-06-12 2024-12-18 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Method for quantifying bound acetate in glycoconjugates

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101983070A (zh) * 2008-02-20 2011-03-02 格林考瓦因有限公司 由来源于原核细胞的重组n-糖基化蛋白制备生物共轭物
WO2013034664A1 (en) * 2011-09-06 2013-03-14 Glycovaxyn Ag Bioconjugate vaccines made in prokaryotic cells

Family Cites Families (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3700612A (en) 1971-06-23 1972-10-24 Tenneco Chem Aqueous surface-coating compositions containing hydroxyalkyl ethers of galactomannan gums as thickeners
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
GB8422653D0 (en) 1984-09-07 1984-10-10 Technology Licence Co Ltd Monoclonal antibodies
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
US5370872A (en) 1991-08-12 1994-12-06 Swiss Serum And Vaccine Institute Berne Escherichia coliO-polysaccharide-protein conjugate vaccine
AUPM399594A0 (en) 1994-02-21 1994-03-17 Csl Limited Antigenic preparation for treatment or prevention of helicobacter infection
FI102976B1 (fi) 1994-02-28 1999-03-31 Valtion Teknillinen Menetelmä lisäkeittokemikaalien tuottamiseen ja käyttämiseen sulfaattiprosessissa
US6858211B1 (en) 1998-07-20 2005-02-22 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Vaccines against Escherichia coli O157 infection
EP1278548A2 (en) 2000-04-18 2003-01-29 Endobiologics, Incorporated Lipopolysaccharide-conjugate vaccine for sepsis treatment
RU2189253C1 (ru) 2001-04-09 2002-09-20 Государственный научный центр прикладной микробиологии Диагностикум для идентификации escherichia coli o157 : h7 и способ его получения
US7117096B2 (en) 2001-04-17 2006-10-03 Abmaxis, Inc. Structure-based selection and affinity maturation of antibody library
AU2003217912A1 (en) 2002-03-01 2003-09-16 Xencor Antibody optimization
PT1481057E (pt) 2002-03-07 2006-05-31 Eidgenoess Tech Hochschule Sistema e metodo para a producao de proteinas glicosiladas recombinantes num hospedeiro procariota
AU2003901008A0 (en) 2003-03-04 2003-03-20 Anadis Ltd Composition for the treatment and prevention of bacterial infections
CN1324134C (zh) 2003-12-22 2007-07-04 南开大学 对大肠杆菌o81型的o－抗原特异的核苷酸
ATE430763T1 (de) 2004-03-30 2009-05-15 Nsgene As Therapeutische verwendung des wachstumsfaktors nsg33
EP2311972B1 (en) 2005-05-11 2015-01-21 ETH Zurich Recombinant N-glycosylated proteins from procaryotic cells
US8063063B2 (en) 2006-03-23 2011-11-22 Novartis Ag Immunopotentiating compounds
US8173657B2 (en) 2006-03-23 2012-05-08 Novartis Ag Imidazoquinoxaline compounds as immunomodulators
JP4791866B2 (ja) 2006-03-24 2011-10-12 国立大学法人秋田大学 下痢原性大腸菌感染症の判別に用いられる固相等
US8877688B2 (en) 2007-09-14 2014-11-04 Adimab, Llc Rationally designed, synthetic antibody libraries and uses therefor
CN101855242B (zh) 2007-09-14 2014-07-30 阿迪马布有限责任公司 合理设计的合成抗体文库及其用途
CN102037004A (zh) 2008-01-08 2011-04-27 生物种属学股份公司 使用寡糖基转移酶的多肽的糖缀合
JP5740390B2 (ja) 2009-04-27 2015-06-24 イミューロン リミテッドＩｍｍｕｒｏｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ 病的障害の治療および／または予防において使用するための抗ｌｐｓ強化免疫グロブリン製剤
AU2010322454B2 (en) 2009-11-19 2016-05-19 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Biosynthetic system that produces immunogenic polysaccharides in prokaryotic cells
DK2593594T3 (en) 2010-07-16 2017-12-11 Adimab Llc ANTIBODY LIBRARIES
BR112013012626A2 (pt) 2010-12-10 2016-07-19 Merck Sharp & Dohme formulação, composição imunogênica, e, seringa pré-carregada
US9932598B2 (en) 2012-08-02 2018-04-03 The Regents Of The University Of California Metabolic engineering of microbial organisms
AU2013311534A1 (en) 2012-09-10 2015-03-12 Glycovaxyn Ag Bioconjugates comprising modified antigens and uses thereof
US20150267207A1 (en) 2012-10-12 2015-09-24 Glycovaxyn Ag Methods of host cell modification
SG11201503308XA (en) 2012-11-07 2015-05-28 Glycovaxyn Ag PRODUCTION OF RECOMBINANT VACCINE IN <i>E. COLI</i> BY ENZYMATIC CONJUGATION
CA2896157A1 (en) 2012-12-27 2014-07-03 Glycovaxyn Ag Methods and compositions relating to crm197
NZ707777A (en) 2013-01-17 2019-12-20 X4 Pharmaceuticals Austria Gmbh Mdr e. coli specific antibody
EP3055416B1 (en) 2013-10-11 2020-01-22 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Methods of host cell modification
EP2870974A1 (en) 2013-11-08 2015-05-13 Novartis AG Salmonella conjugate vaccines
KR102301188B1 (ko) 2014-02-06 2021-09-13 엑스4 파마슈티컬스 (오스트리아) 게엠베하 이. 콜라이 특이성 항체 서열
EP3110441B1 (en) * 2014-02-24 2024-04-03 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Novel polysaccharide and uses thereof
BE1022998B1 (fr) 2014-12-30 2016-10-28 Glycovaxyn Ag Compositions et procédés de glycosylation de protéines
TWI715617B (zh) 2015-08-24 2021-01-11 比利時商葛蘭素史密斯克藍生物品公司 對抗腸道外病原性大腸桿菌之免疫保護之方法及組合物
AR109621A1 (es) 2016-10-24 2018-12-26 Janssen Pharmaceuticals Inc Formulaciones de vacunas contra glucoconjugados de expec
GB201711635D0 (en) 2017-07-19 2017-08-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic composition
JOP20210256A1 (ar) 2019-03-18 2023-01-30 Janssen Pharmaceuticals Inc متقارن حيوي لعديدات سكاريد المستضدات-o للإشريكية القولونية، طرائق إنتاجه، وطرائق استخدامه
KR102574882B1 (ko) 2019-03-18 2023-09-04 얀센 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 대장균 o-항원 다당류의 바이오컨쥬게이트의 생성 방법, 이의 조성물 및 이의 사용 방법
FR3098334B1 (fr) 2019-07-05 2021-07-23 Airbus Operations Sas Procédé et système de surveillance d’un état de conscience d’un opérateur dans un poste de pilotage d’un aéronef
KR20230164108A (ko) 2021-04-01 2023-12-01 얀센 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 E. coli O18 생물접합체의 생산

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101983070A (zh) * 2008-02-20 2011-03-02 格林考瓦因有限公司 由来源于原核细胞的重组n-糖基化蛋白制备生物共轭物
WO2013034664A1 (en) * 2011-09-06 2013-03-14 Glycovaxyn Ag Bioconjugate vaccines made in prokaryotic cells

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ROGERS,B.A.等: "Escherichia coli O25b-ST131: a pandemic, multiresistant, community-associated strain", 《JOURNAL OF ANTIMICROBIAL CHEMOTHERAPY》 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108531439A (zh) * 2018-04-16 2018-09-14 南京工业大学 一种大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用
CN108531439B (zh) * 2018-04-16 2020-04-07 南京工业大学 一种大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用
CN113924112A (zh) * 2019-03-18 2022-01-11 杨森制药公司 大肠杆菌o-抗原多糖的生物缀合物、其生产方法及其使用方法
CN110018253A (zh) * 2019-04-15 2019-07-16 艾美卫信生物药业（浙江）有限公司 一种生物制品中游离蛋白含量的高效液相测定方法
CN114555817A (zh) * 2019-06-13 2022-05-27 敦提大学 鼠李糖多糖
CN114555817B (zh) * 2019-06-13 2025-06-10 敦提大学 鼠李糖多糖
CN115803087A (zh) * 2020-09-17 2023-03-14 杨森制药公司 多价疫苗组合物及其用途
CN116406445A (zh) * 2020-11-30 2023-07-07 杨森制药公司 使用基于毛细管的免疫测定系统进行的用于糖缀合物的分析方法
CN116406445B (zh) * 2020-11-30 2024-07-12 杨森制药公司 使用基于毛细管的免疫测定系统进行的用于糖缀合物的分析方法

Also Published As

Publication number Publication date
AR100859A1 (es) 2016-11-09
US20200129605A1 (en) 2020-04-30
FI3110441T3 (fi) 2024-05-06
HUE066507T2 (hu) 2024-08-28
DK3110441T5 (da) 2024-10-14
CA2940547C (en) 2021-01-05
CA2940547A1 (en) 2015-08-27
SI3110441T1 (sl) 2024-07-31
JP2017507178A (ja) 2017-03-16
EA035991B1 (ru) 2020-09-10
US20170340718A1 (en) 2017-11-30
EP3110441A1 (en) 2017-01-04
IL247344B (en) 2020-06-30
MX380438B (es) 2025-03-12
US11738076B2 (en) 2023-08-29
KR20160125494A (ko) 2016-10-31
WO2015124769A1 (en) 2015-08-27
PH12016501671B1 (en) 2016-10-03
US12214029B2 (en) 2025-02-04
US10940192B2 (en) 2021-03-09
ES2978870T3 (es) 2024-09-23
EA201691478A1 (ru) 2017-02-28
LT3110441T (lt) 2024-04-25
JP2018087197A (ja) 2018-06-07
IL247344A0 (en) 2016-11-30
ZA201605858B (en) 2025-05-28
US20210154286A1 (en) 2021-05-27
TWI639439B (zh) 2018-11-01
KR101855142B1 (ko) 2018-05-08
PT3110441T (pt) 2024-05-03
RS65631B1 (sr) 2024-07-31
HRP20240847T1 (hr) 2024-09-27
PH12016501671A1 (en) 2016-10-03
MX2016011055A (es) 2017-10-24
JP6771499B2 (ja) 2020-10-21
DK3110441T3 (da) 2024-05-06
CL2016002123A1 (es) 2018-02-16
US20230364214A1 (en) 2023-11-16
JP6276427B2 (ja) 2018-02-07
AU2015220723A1 (en) 2016-09-22
CN106535927B (zh) 2019-09-20
AU2015220723B2 (en) 2017-12-14
US9700612B2 (en) 2017-07-11
NZ723328A (en) 2018-01-26
SG11201606889PA (en) 2016-09-29
EA035991B9 (ru) 2020-10-21
PL3110441T3 (pl) 2024-08-05
US20150238588A1 (en) 2015-08-27
AU2015220723C1 (en) 2018-04-05
EP3110441B1 (en) 2024-04-03
TW201615211A (zh) 2016-05-01
BR112016019341A2 (pt) 2018-01-16
US10441647B2 (en) 2019-10-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12214029B2 (en) Polysaccharide and uses thereof
JP7370391B2 (ja) 大腸菌ｏ抗原多糖のバイオコンジュゲート、その製造方法およびその使用方法
JP7589164B2 (ja) 大腸菌ｏ抗原多糖のバイオコンジュゲートを製造する方法、その組成物およびその使用方法
JP6682451B2 (ja) 改変型宿主細胞およびその使用
CN115803087A (zh) 多价疫苗组合物及其用途
EA046636B1 (ru) Способы получения биоконъюгатов полисахаридных о-антигенов e. coli, их композиции и способы их применения
BR112016019341B1 (pt) Composição, uso da composição, célula hospedeira procariótica recombinantemente modificada por engenharia genética, e, método para produção de uma proteína carreadora n-glicosilada

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20180419

Address after: Belgium Sutter Rixon

Applicant after: Glazo Smithkline Beecham Biologicals S. A.

Address before: Swiss Shi Lilun

Applicant before: Glycovaxyn AG

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant