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CN106521006A - Ndrg4基因甲基化检测用试剂体系和试剂盒及其应用 - Google Patents

Ndrg4基因甲基化检测用试剂体系和试剂盒及其应用 Download PDF

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CN106521006A
CN106521006A CN201611228261.4A CN201611228261A CN106521006A CN 106521006 A CN106521006 A CN 106521006A CN 201611228261 A CN201611228261 A CN 201611228261A CN 106521006 A CN106521006 A CN 106521006A
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CN
China
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seq
reagent system
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plasmid
ndrg4
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王菁蕊
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Abstract

本发明涉及NDRG4基因甲基化检测用试剂体系和试剂盒及其应用，所述试剂体系或试剂盒包括特异性引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，以及特异性探针SEQ ID NO.3，探针上连有报告基团和淬灭基团；所述试剂体系还包括阳性标准品、阴性标准品、缓冲液、dNTPs和DNA聚合酶。本发明所述试剂盒的使用方法包括(1)甲基化处理样本DNA；(2)利用特异性引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2以及特异性探针SEQ ID NO.3对步骤(1)甲基化处理后的样本DNA进行荧光定量PCR反应；同时对阳性标准品和阴性标准品进行荧光定量PCR反应；通过分析PCR过程的荧光变化，判断基因的甲基化状态。本发明提供的试剂盒制备方法简单，该试剂盒使用方便，速度快，检测结果准确、直观，灵敏度高。

Description

NDRG4基因甲基化检测用试剂体系和试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种NDRG4基因甲基化检测试剂体系和试剂盒及其应用。
背景技术
结直肠癌是人类主要恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率分别位于第三位和第四位。每年有120万新确诊的病例，并且有超过60万名患者死于结直肠癌。结直肠癌发病率在50岁以下年龄段较低，但会随着年龄的增大而增加。发达国家的结直肠癌发病中位年龄为70岁。结直肠癌早期症状不明显，随着肿瘤的增大而表现排便习惯改变、便血、腹泻、腹泻与便秘交替、局部腹痛等症状，晚期则表现贫血、体重减轻等全身症状。结直肠癌可以发生在结肠或直肠的任何部位，但以直肠、乙状结肠最为多见，其余依次见于盲肠、升结肠、降结肠及横结肠。癌瘤大多数为腺癌，少数为鳞状上皮癌及粘液癌。本病可以通过淋巴、血液循环及直接蔓延等途径，播散到其他组织和脏器。目前结直肠癌的诊断方法主要有便潜血检测、X射线钡剂灌肠或纤维结肠镜检查，但上述方法准确度和灵敏度均较低，尤其是纤维结肠镜检查给病人带来很大的痛苦，病人的依从性较差。因此一种新的检测方法是迫在眉睫的。
在肿瘤研究中，许多肿瘤的产生都伴随有基因的甲基化，癌基因的去甲基化和抑癌基因的甲基化状态，可导致癌基因的激活、抑癌基因的失活。癌基因的低甲基化和抑癌基因的高甲基化改变是肿瘤细胞的一个重要特征。
NDRG4基因为抑癌基因NDRG基因家族成员，该基因家族在人体多种其他正常组织中高表达，在某些肿瘤组织中不表达或低表达，低表达则可能与启动子高甲基化相关。近年来，研究表明NDRG4基因存在于结直肠癌肿瘤组织和体液中，且稳定性高，NDRG4基因的高甲基化会导致NDRG4基因的低表达，即抑癌基因失活，指示结直肠癌的发生。研究表明，粪便中的NDRG4甲基化异常可作为结直肠癌早期诊断的肿瘤标志物。
经过大量临床试验确定了NDRG4基因的甲基化会导致结直肠癌的发生，一般通过检测病人肠道内大量脱落癌细胞中的NDRG4基因甲基化状态，从而诊断结直肠癌的发生。现有技术中，有大量文献阐述了NDRG4基因及NDRG4基因甲基化与结直肠癌的关系，但是缺乏对NDRG4基因甲基化进行快速、简便、灵敏、特异性检测的方法，不能及时有效的诊断结直肠癌。
发明内容
本发明解决的技术问题是：结直肠癌早期诊断困难，现有技术的检测方法灵敏度低、准确度低并且不方便，尚未有能够快速、简便地检测NDRG4基因甲基化状态的试剂体系和试剂盒。
本发明的目的是提供一种NDRG4基因甲基化检测试剂体系和试剂盒，利用该试剂盒结合荧光定量PCR方法快速、方便地定性检测结直肠癌的发生；利用所述试剂盒检测NDRG4基因甲基化状态的灵敏度高、准确度高、特异性强，操作简便，周期短。
具体来说，针对现有技术的不足，本发明提供了如下技术方案：
一方面，本发明提供了一种NDRG4基因甲基化检测用试剂体系，其特征在于，所述试剂体系包括特异性引物和特异性探针，所述特异性引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述特异性探针如SEQ ID NO.3所示。
优选的，在所述试剂体系中，所述特异性探针上连接有荧光报告基团和荧光淬灭基团，其中，所述荧光报告基团选自6-羧基荧光素(FAM)、六氯-6-甲基荧光素(HEX)、四氯-6-羧基荧光素(TET)、异硫氰酸荧光素(FITC)或VIC中的一种，优选6-羧基荧光素；所述荧光淬灭基团选自BHQ或四甲基罗丹明(TAMRA)。
优选的，所述试剂体系还包括阳性标准品，所述阳性标准品中含有插入了NDRG4基因甲基化特异性序列SEQ ID NO.4的重组质粒。
优选的，所述试剂体系还包括阴性标准品，所述阴性标准品中含有没有插入NDRG4基因甲基化特异性序列的质粒。
优选的，所述阳性标准品中的重组质粒浓度为1.0×103copies/μL，所述阴性标准品中的质粒浓度为1.0×103copies/μL。
优选的，所述重组质粒与质粒相同，选自pETs、pUCs、pGM-T、pBR322或pMD-T中的一种，优选pGM-T或pBR322。
优选的，所述阳性标准品中的重组质粒和所述阴性标准品中的质粒的制备方法如下：
(1)以序列SEQ ID NO.4为模板，利用引物序列SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6进行扩增，得到目的基因；
(2)将目的基因连接到质粒载体上，得到连接产物；
(3)将连接产物转化到宿主细胞内；
(4)筛选含有目的基因的重组质粒作为阳性标准品；不含目的基因的质粒作为阴性标准品。
优选的，所述试剂体系还包括缓冲液和dNTPs，所述缓冲液的组成包括三羟甲基氨基甲烷、氯化钾和氯化镁。
优选的，所述三羟甲基氨基甲烷的浓度为50～200mM，优选为100～150mM；氯化钾的浓度为300～800mM，优选为400～600mM；氯化镁的浓度为10～30mM，优选为10～20mM。
优选的，所述试剂体系还包括DNA聚合酶，优选为TaqDNA聚合酶。
另一方面，本发明提供了一种NDRG4基因甲基化检测用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含前述的试剂体系。
再一方面，本发明提供了特异性引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2以及特异性探针SEQ ID NO.3在制备NDRG4基因甲基化检测用试剂或试剂盒中的应用，优选在制备NDRG4基因甲基化结直肠癌检测用试剂或试剂盒中的应用。
优选的，所述NDRG4基因甲基化检测用试剂或试剂盒的使用方法包括以下步骤：
(1)甲基化处理样本DNA；
(2)利用特异性引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2以及特异性探针SEQ ID NO.3对步骤(1)甲基化处理后的样本DNA进行荧光定量PCR反应。
优选的，前述使用方法还包括：将含有插入了NDRG4基因甲基化特异性序列SEQ IDNO.4的重组质粒作为阳性标准品，进行荧光定量PCR反应；
将含有没有插入NDRG4基因甲基化特异性序列SEQ ID NO.4的质粒作为阴性标准品，进行荧光定量PCR反应。
优选的，所述甲基化处理样本DNA的步骤包括：(1)从粪便样本中提取基因组DNA；(2)利用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，得到甲基化处理的样本DNA。
优选的，在所述应用中，所述荧光定量PCR反应条件为：94～95℃预变性2～5min，1个循环；94～95℃15～20s，53～55℃30～50s，58～60℃30～50s，共40～50个循环。
与现有技术相比，本发明的效果和益处在于：
1)本发明试剂盒定量准确，兼有PCR的高灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，结果直观，能直接检测PCR过程中的变化，与普通PCR相比，其结果可实时观察，产物不需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了污染。
2)本发明试剂盒检测灵敏度和特异性高，由于采取特异性引物和探针的双保险设计，灵敏度和特异性均有很大提高，能在临床症状出现之前检测结直肠癌。
3)本发明试剂盒检测速度快，总共仅需2个小时，步骤简单，可同时进行高通量样本检测。
附图说明
图1为阳性标准品和阴性标准品在荧光PCR扩增过程的荧光曲线；
图2为样品在荧光PCR扩增过程的荧光曲线。
其中，图1中的曲线1为阴性标准品在PCR扩增过程的荧光曲线，曲线2为阳性标准品在PCR扩增过程的荧光曲线；
图2中的曲线1为样品1的荧光曲线，曲线2为样品2的荧光曲线，曲线3为样品3的荧光曲线，曲线4为样品4的荧光曲线，曲线5为样品5的荧光曲线；其中，样品1的提供者不是结直肠癌患者，样品2-5的提供者患有结直肠癌。
具体实施方式
荧光PCR技术在1995年由美国PE公司率先研制成功，它兼有PCR的高灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，结果直观，能直接检测PCR过程中的变化。与普通PCR相比，其结果可实时观察，产物不需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了污染。
本发明将荧光PCR技术应用于检测NDRG4基因的甲基化状态，从而定性检测结直肠癌的发生。具体而言，本发明提供了一种NDRG4基因甲基化检测用的试剂体系和试剂盒，所述试剂体系中含有特异性引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，以及特异性探针SEQ ID NO.3；特异性探针的5’和3’端分别含有荧光报告基团和荧光淬灭基团，所述荧光报告基团选自FAM、HEX、TET、、FITC或VIC中的一种，所述荧光淬灭基团选自BHQ或TAMRA。当探针上同时含有荧光报告基团和荧光淬灭基团时，不发出荧光；当特异性探针被DNA聚合酶降解时，荧光报告基团和荧光淬灭基团分开，发出荧光。试剂体系还包括阳性标准品、阴性标准品，也含有聚合酶链式反应需要的基本组分，比如缓冲液和dNTPs。
在一优选实施方式中，试剂体系中的缓冲液组成为50～200mM三羟甲基氨基甲烷，300～800mM氯化钾和10～30mM氯化镁。试剂体系中的DNA聚合酶为TaqDNA聚合酶。本发明提供了一种含有NDRG4基因甲基化序列的重组质粒，所述NDRG4基因甲基化序列如SEQ IDNO.4所示，所述质粒选自pETs、pUCs、pGM-T、pBR322和pMD-T中的一种。在重组质粒筛选过程中，转化成功的含有NDRG4基因甲基化序列的重组质粒作为阳性标准品，即作为阳性对照；没有转化成功的空白质粒作为阴性标准品，即作为阴性对照。
在另一优选实施方式中，本发明提供了一种NDRG4基因甲基化检测用试剂盒，所述试剂盒包括阳性标准品，阴性标准品，反应液以及DNA聚合酶。所述反应液含有特异性引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，以及特异性探针SEQ ID NO.3，反应液的组成为：每18μL反应液中含有的SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和dNTP的量依次为200-300nM，200-300nM，200-300nM和100-200mM。阳性标准品(重组质粒)和阴性标准品(空白质粒)的筛选方法包括以下步骤：
(1)以序列SEQ ID NO.4为模板，利用引物序列SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6进行扩增，得到目的基因；
(2)将目的基因连接到质粒载体上，得到连接产物；
(3)将连接产物转化到宿主细胞内；
(4)筛选含有目的基因的重组质粒作为阳性标准品；不含目的基因的质粒作为阴性标准品。
采用本发明所述试剂盒检测NDRG4基因甲基化的情况，检测方法包括以下步骤：样品预处理，将处理后的样品加入样品管内。制备待测溶液的步骤包括，取新反应管编号，然后分别加入阳性标准品、阴性标准品和样品，再往其中分别加入反应液和DNA聚合酶，混匀；各组待测溶液中的样品量或阳性标准品含量或者阴性标准品含量相同，且反应液和DNA聚合酶的含量也相同；通常，待测溶液中阳性标准品、阴性标准品或者样品与反应液、DNA聚合酶的比为：(1-2)μL：(18-20)μL：(5-20)U。将待测溶液放入荧光定量PCR仪中进行测定，PCR测定的条件为：94～95℃预变性2～5min，1个循环；94～95℃15～20s，53～55℃30～50s，58～60℃30～50s，共40～50个循环；最后分析荧光定量PCR测定结果，判断样品提供者是否患有结直肠癌。
检测前的样品处理方法包括，先利用基因组DNA提取试剂盒从粪便样本中提取DNA，再利用基因组DNA甲基化处理试剂盒处理提取得到的DNA。甲基化处理试剂盒的原理为亚硫酸氢盐法甲基化处理，经甲基化处理试剂盒处理后的DNA作为样品。
样本基因组DNA经甲基化处理试剂盒处理后，若样本基因组中的NDRG4基因序列中的胞嘧啶(C)已经被甲基化，则经甲基化处理试剂盒处理之后的NDRG4基因序列不变，如SEQID NO.4所示，特异性引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2以及特异性探针SEQ ID NO.3能与SEQ ID NO.4结合，荧光定量PCR反应过程中，在DNA聚合酶的作用下探针SEQ ID NO.3上的5’荧光报告基团与3’淬灭基团分离，发出荧光；若样本基因组中的NDRG4基因序列中的胞嘧啶(C)没有被甲基化，则经甲基化处理试剂盒处理后，NDRG4基因序列中的C变成尿嘧啶(U)，即甲基化处理后的NDRG4基因序列与SEQ ID NO.4不同，特异性引物SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2以及特异性探针SEQ ID NO.3无法与处理后的样本DNA结合，荧光定量PCR反应过程中，探针SEQ ID NO.3保持完整，由于同时连接有5’荧光报告基团与3’淬灭基团，荧光PCR反应过程中不发出荧光；即经甲基化处理试剂盒后，甲基化的NDRG4基因在荧光定量PCR检测过程中会发出荧光，而没有甲基化的NDRG4基因不发荧光。因此，本发明所述的试剂体系和试剂盒与荧光定量PCR检测相结合后，可以用于检测NDRG4基因的甲基化状态。NDRG4基因高度甲基化是结直肠癌的重要分子标志，故本发明所述的试剂体系和试剂盒及其使用在结直肠癌诊断中具有重要意义。
采用本发明所述试剂盒检测NDRG4基因甲基化状态的方法简单，灵敏度高，特异性强；通过检测NDRG4基因甲基化能有效判断样本供体是否为结直肠癌患者。
下面通过具体的实施例对本发明做进一步的说明，实施例中所用试剂和仪器的厂家如下：
三羟甲基氨基甲烷，厂家：百灵威科技有限公司；
氯化钾，厂家：百灵威科技有限公司；
氯化镁，厂家：百灵威科技有限公司；
dNTPs，厂家：TAKARA，日本；
Taq DNA聚合酶，厂家：TAKARA，日本；
SAP酶EF0511，厂家：赛默飞世尔科技有限公司；
ExoI酶，厂家：TAKARA，日本；
荧光定量PCR仪，厂家：美国ABI实时荧光定量PCR仪7500，美国；
基因组DNA提取试剂盒，购自QIAGEN公司；
基因组DNA甲基化处理试剂盒，购自QIAGEN公司；
pGM-T质粒载体，均购自天根生化科技(北京)有限公司；
本发明中用到的特异性引物，以及特异性探针序列均由上海英骏生物技术有限公司合成，其中，特异性探针上连接的荧光报告基团和荧光淬灭基团均由上海英俊生物技术有限公司合成。
实施例1试剂盒的制备
本实施例制备的试剂盒包括含有NDRG4基因甲基化序列的阳性标准品，含空白质粒的阴性标准品，反应液和DNA聚合酶。其中，装DNA聚合酶的试管容积为500μL，管内含有浓度为5U/μL的TaqDNA聚合酶22μL。
(一)阳性标准品和阴性标准品的制备
通过对大量临床结直肠癌患者以及正常人群的DNA序列进行比对分析，设计得到一条和结直肠癌疾病有关的序列，NDRG4基因甲基化序列SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.4序列如下：
以SEQ ID NO.4的序列为目的基因，设计引物序列SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，进行常规的PCR扩增，PCR反应体系见表1。
引物序列SEQ ID NO.5：5’-TAGTATAGTTCGCGCGGC-3’
引物序列SEQ ID NO.6：5’-CGAACGAACCGCGATC-3’
PCR反应参数为：
表1 PCR反应体系
组成 体积(μL)
目的基因 1(30μg/mL)
10×Buffer 2.5
dNTP 0.2(20mM，each)
Taq DNA聚合酶 0.25(5U/μL)
引物序列SEQ ID NO.5 0.25(25μM)
引物序列SEQ ID NO.6 0.25(25μM)
ddH2O 15.55
总体积 20
表1中的缓冲液为pH8.0的Tris-HcL缓冲液。
扩增结束后，将经过纯化的PCR产物连接到pGM-T质粒载体上，得到连接有目的基因的质粒；所述PCR产物的纯化体系如表2所示：
表2 PCR产物纯化体系
组分 体积(μL)
PCR产物 20
SAP酶 0.85(1U/μL)
ExoI酶 0.375(10U/μL)
ddH2O 3.775
总体积 25
将PCR产物纯化体系放置于PCR扩增仪内进行反应，反应条件为37℃、20min，73℃、20min。
接着将重组质粒通过热激法转化到大肠杆菌TOP10感受态细胞中，将构建的重组质粒进行双向DNA测序鉴定，目的基因与质粒连接成功的重组质粒作为阳性标准品，采用紫外分光光度计定量，并将阳性标准品稀释到103拷贝每微升的浓度后装入阳性标准品管内，保存于-20℃。双向DNA测序表明没有重组的pGM-T质粒作为阴性标准品，将其稀释到103拷贝每微升的浓度后装入阴性标准品管内。阳性标准品管和阴性标准品管的容量均为200μL，其中，阳性标准品和阴性标准品的体积均为50μL。
(二)反应液的制备
根据NDRG4基因的高甲基化序列SEQ ID NO.4设计特异性引物SEQ ID NO.1和SEQID NO.2，以及特异性探针SEQ ID NO.3。反应液中含有所述的特异性引物和探针；
其中，正向引物SEQ ID NO.1为5’-CGGTTTTCGTTCGTTTTT TCG-3’；
反向引物SEQ ID NO.2为5’-GTAACTTCCGCCTTCTACGC-3’；
探针SEQ ID NO.3为5’-TCGTTTATCGGGTATTTTAGTCGCG-3’；
特异性探针上含有荧光报告基团FAM和荧光淬灭基团BHQ，FAM和BHQ分别连接在特异性探针序列的5’和3’端。
表3列出了反应液的配方，按照该配方制备反应液。
表3 本实施例中反应液的配方
组成 体积(μL)
10x Buffer 2
SEQ ID NO.1 0.4(200nM)
SEQ ID NO.2 0.4(200nM)
SEQ ID NO.3 0.2(200nM)
dNTP 0.8(100mM)
H2O 14.2
总体积 18
其中，所述缓冲液(buffer)溶液的组成为：Tris-HCl 100mM、KCl 400mM、MgCl210mM，其中Tris-HCl的pH值为8.5。
按照表3的配比配制反应液，本实施例所述试剂盒中的反应液总体积为380μL。
由此，装有步骤(一)制备的阳性标准品和阴性标准品，步骤(二)制备的反应液，以及TaqDNA聚合酶组成了本实施例所述的试剂盒。
实施例2试剂盒的制备
本实施例制备的试剂盒与实施例1制备的试剂盒中的阳性标准品和阴性标准品相同，本实施例与实施例1的区别在于：本实施例反应液的配方如表4所示，其中，引物SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2，以及特异性探针SEQ ID NO.3与实施例1相同。本实施例中DNA聚合酶管内的酶为TaqDNA聚合酶，其浓度为4U/μL，体积为30μL。
表4 本实施例中反应液的配方
组成 体积(μL)
10x Buffer 2
SEQ ID NO.1 0.5(300nM)
SEQ ID NO.2 0.5(300nM)
SEQ ID NO.3 0.3(300nM)
dNTP 1.0(200mM)
H2O 13.7
总体积 18
其中，所述缓冲液(buffer)溶液的组成为：Tris-HCl 150mM、KCl 600mM、MgCl220mM，其中Tris-HCl的pH值为8.3。
按照表4的配比配制反应液，本实施例所述试剂盒中的反应液总体积为350μL。
实施例3试剂盒的制备
本实施例制备的试剂盒与实施例1制备的试剂盒中的阳性标准品和阴性标准品相同，本实施例与实施例1的区别在于：本实施例反应液的配方如表5所示，其中，引物SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2，以及特异性探针SEQ ID NO.3与实施例1相同，但探针上的荧光报告基团为HEX，荧光淬灭基团为BHQ；本实施例中DNA聚合酶管内的酶为TaqDNA聚合酶，其浓度为5U/μL，体积为30μL。
表5 本实施例中反应液的配方
组成 体积(μL)
10x Buffer 3
SEQ ID NO.1 0.4(250nM)
SEQ ID NO.2 0.4(250nM)
SEQ ID NO.3 0.3(250nM)
dNTP 1.0(200mM)
H2O 12.9
总体积 18
其中，所述缓冲液(buffer)溶液的组成为：Tris-HCl 50mM、KCl 300mM、MgCl210mM，其中Tris-HCl的pH值为8.2。
按照表5的配比配制反应液，本实施例所述试剂盒中的反应液总体积为400μL。
实施例4试剂盒的制备
本实施例制备的试剂盒与实施例1制备的试剂盒中的阳性标准品和阴性标准品相同，本实施例与实施例1的区别在于：本实施例反应液的配方如表6所示，其中，引物SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2，以及特异性探针SEQ ID NO.3与实施例1相同；本实施例中DNA聚合酶为TaqDNA聚合酶，其浓度为5U/μL，体积为30μL。
表6 本实施例中反应液的配方
组成 体积(μL)
10x Buffer 2
SEQ ID NO.1 0.4(250nM)
SEQ ID NO.2 0.4(250nM)
SEQ ID NO.3 0.2(250nM)
dNTP 0.9(150mM)
H2O 14.1
总体积 18
其中，所述缓冲液(buffer)溶液的组成为：Tris-HCl 200mM、KCl 800mM、MgCl230mM，其中Tris-HCl的pH值为8.5。
按照表6的配比配制反应液，本实施例所述试剂盒中的反应液总体积为380μL。
实施例5
本实施例利用实施例1制备的试剂盒检测样本的NDRG4基因甲基化状态。
试剂盒中已经含有阳性标准品、阴性标准品、反应液和TaqDNA聚合酶，应用试剂盒检测NDRG4甲基化的步骤如下：
(1)样本预处理
从天津总医院获得临床结直肠癌患者或者潜在患者的粪便样本，按照基因组DNA提取试剂盒上的操作说明提取基因组DNA，然后利用DNA甲基化处理试剂盒处理上述提取到的基因组DNA，处理后的DNA作为样品。
(2)制备待测溶液
取新反应管，分别标记为阳性标准品管、阴性标准品管和样品管，然后往各个管中分别加入阳性标准品、阴性标准品和样品，再往各个管中分别加入反应液和DNA聚合酶，各个管中的待测溶液组成见表7。
需说明的是，可以同时检测多个样品，即同时准备多个样品管，每个样品管中装有按照相同的方法处理过的来自不同供体的粪便样本，本实施例同时检测了5个样品，并依次标记为样品1-5。
表7 待测溶液的组成
(3)荧光定量PCR
探针SEQ ID NO.3上的荧光报告基团FAM发出绿色荧光，当探针中的序列无法与待测溶液中的DNA模板配对时，探针保持完整，即同时含有荧光报告基团FAM和荧光淬灭基团BHQ，PCR扩增后无法检测到荧光；而当探针能够与待测溶液中的DNA发生碱基互补配对时，探针被TaqDNA聚合酶降解，探针5’的报告基团与3’的淬灭基团分离，PCR扩增过程中能够检测到荧光。探针序列SEQ ID NO.3是以NDRG4基因高甲基化后的DNA序列为模板设计的，若PCR扩增过程能检测到荧光则说明体系中存在NDRG4基因高甲基化后的序列，结直肠癌检测结果很可能为阳性；若PCR扩增过程中无法检测到荧光，则结直肠检测结果可能为阴性；具体的结直肠癌检测结果判断还需要结合PCR扩增后的定量分析。
荧光定量PCR的反应参数设置为：95℃5分钟，1个循环；95℃15秒，53℃40秒，58℃40秒，共40个循环。
(4)结果分析
本实施例检测了5个样品以及1个阳性标准品和1个阴性标准品。利用ABI 7500Software软件记录PCR扩增过程，其结果如图1和图2所示。如果荧光强度增长曲线不呈S型曲线或Ct值>＝35，则判断样品为阴性或样品的总含量小于检测极限。如果增长曲线呈S型曲线且Ct值<35，则样品的诊断结果为阳性。
图1给出的是阳性标准品和阴性标准品在PCR扩增过程中的荧光曲线图，其中，荧光强度增长曲线呈S型增长，且Ct值小于35的曲线为阳性标准品的检测结果，阴性标准品的浓度与阳性标准品相同，均在检测范围内，故随着循环数的增加，荧光强度变化非常小的曲线为阴性标准品的检测结果。
图2给出的是5个样品在PCR扩增过程中的荧光曲线图，所有样品的浓度均在检测范围内。曲线1的荧光强度几乎不变，可以推断该样品的检测结果为阴性，该样本(样品1)的提供者不是结直肠癌患者；曲线2、曲线3、曲线4和曲线5的荧光强度增长呈S型，且Ct值均小于35，故样品2-5的检测结果为阳性，样品2-5的提供者为大肠癌患者。该检测结果与样本的实际来源相同，证明了本发明所述试剂盒和检测方法的可靠性。
以上所述仅为本发明较佳实施例，并不用于局限本发明，凡在本发明的精神和原则之内所做的修改、等同替换和改进等，均需要包含在发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 刘鹏飞
<120> NDRG4基因甲基化检测用试剂体系和试剂盒及其应用
<130> OICN160092
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cggttttcgt tcgttttttc g 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gtaacttccg ccttctacgc 20
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tcgtttatcg ggtattttag tcgcg 25
<210> 4
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tagtatagtt cgcgcggcgg agcgggtgag aagtcggcgg gggcgcggat cgatcggggt 60
gttttttagg tttcgcgtcg cggttttcgt tcgttttttc gttcgtttat cgggtatttt 120
agtcgcgtag aaggcggaag ttacgcgcga gggatcgcgg ttcgttcg 168
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tagtatagtt cgcgcggc 18
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cgaacgaacc gcgatc 16

Claims (16)

1.一种NDRG4基因甲基化检测用试剂体系，其特征在于，所述试剂体系包括特异性引物和特异性探针，所述特异性引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述特异性探针如SEQID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的试剂体系，其特征在于，所述特异性探针上连接有荧光报告基团和荧光淬灭基团，其中，所述荧光报告基团选自6-羧基荧光素、六氯-6-甲基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、异硫氰酸荧光素或VIC中的一种，优选6-羧基荧光素；所述荧光淬灭基团选自BHQ或四甲基罗丹明。
3.根据权利要求1或2所述的试剂体系，其特征在于，所述试剂体系还包括阳性标准品，所述阳性标准品中含有插入了NDRG4基因甲基化特异性序列SEQ ID NO.4的重组质粒。
4.根据权利要求1-3任一项所述的试剂体系，其特征在于，所述试剂体系还包括阴性标准品，所述阴性标准品中含有没有插入NDRG4基因甲基化特异性序列的质粒。
5.根据权利要求3或4所述的试剂体系，其特征在于，所述阳性标准品中的重组质粒浓度为1.0×103copies/μL，所述阴性标准品中的质粒浓度为1.0×103copies/μL。
6.根据权利要求3-5任一项所述的试剂体系，其特征在于，所述重组质粒与质粒相同，选自pETs、pUCs、pGM-T、pBR322或pMD-T中的一种，优选pGM-T或pBR322。
7.根据权利要求3-6任一项所述的试剂体系，其特征在于，所述阳性标准品中的重组质粒和所述阴性标准品中的质粒的制备方法如下：
(1)以序列SEQ ID NO.4为模板，利用引物序列SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6进行扩增，得到目的基因；
(2)将目的基因连接到质粒载体上，得到连接产物；
(3)将连接产物转化到宿主细胞内；
(4)筛选含有目的基因的重组质粒作为阳性标准品；不含目的基因的质粒作为阴性标准品。
8.根据权利要求1-7任一项所述的试剂体系，其特征在于，所述试剂体系还包括缓冲液和dNTPs，所述缓冲液的组成包括三羟甲基氨基甲烷、氯化钾和氯化镁。
9.根据权利要求8所述的试剂体系，其特征在于，所述三羟甲基氨基甲烷的浓度为50～200mM，优选为100～150mM；氯化钾的浓度为300～800mM，优选为400～600mM；氯化镁的浓度为10～30mM，优选为10～20mM。
10.根据权利要求1-9任一项所述的试剂体系，其特征在于，所述试剂体系还包括DNA聚合酶，优选为TaqDNA聚合酶。
11.一种NDRG4基因甲基化检测用试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-10任一项所述的试剂体系。
12.特异性引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2以及特异性探针SEQ ID NO.3在制备NDRG4基因甲基化检测用试剂或试剂盒中的应用，优选在制备NDRG4基因甲基化结直肠癌检测用试剂或试剂盒中的应用。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述NDRG4基因甲基化检测用试剂或试剂盒的使用方法包括以下步骤：
(1)甲基化处理样本DNA；
(2)利用特异性引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2以及特异性探针SEQ ID NO.3对步骤(1)甲基化处理后的样本DNA进行荧光定量PCR反应。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述使用方法还包括：
将含有插入了NDRG4基因甲基化特异性序列SEQ ID NO.4的重组质粒作为阳性标准品，进行荧光定量PCR反应；
将含有没有插入NDRG4基因甲基化特异性序列SEQ ID NO.4的质粒作为阴性标准品，进行荧光定量PCR反应。
15.根据权利要求13或14所述的应用，其特征在于，所述甲基化处理样本DNA的步骤包括：
(1)从粪便样本中提取基因组DNA；
(2)利用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，得到甲基化处理的样本DNA。
16.根据权利要求13-15任一项所述的应用，其特征在于，所述荧光定量PCR反应条件为：94～95℃预变性2～5min，1个循环；94～95℃15～20s，53～55℃30～50s，58～60℃30～50s，共40～50个循环。
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