CN106480009A - 一种固定化氨基酸酯酰转移酶及在制备丙谷二肽中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种固定化氨基酸酯酰转移酶及其制备方法和应用，本发明提供的固定化氨基酸酯酰转移酶由氨基酸酯酰转移酶以吸附、共价结合、包埋、微囊化或交联的固定方式固定于固定化酶载体中制备而成，其中，所述氨基酸酯酰转移酶占所述固定化酶载体的质量百分比为0.01%~5%。本发明的固定化酶与液酶相比，降低生产成本和劳动强度，提高酶的利用效率和产品质量，减少三废排，绿色环保。另外，所述固定化酶容易从反应液混合物中分离，重复使用；反应器设计较灵活；适合于多种不同的反应介质和反应系统；方便过程开发和下游处理，尤其便于过程控制。
Description
技术领域
本发明属于医药化工技术领域，具体的涉及一种固定化氨基酸酯酰转移酶，其制备方法，以及采用该固定化氨基酸酯酰转移酶制备丙谷二肽的方法。
背景技术
丙谷二肽（N-（2）-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）在水溶液中比谷氨酰胺具有较高稳定性和溶解性广泛应用于注射液和无血清培养基。谷氨酰胺具有极为重要的生理功能和药理作用，使其在肠外营养中的应用受到人们的普遍重视。丙谷二肽进入人体后即迅速分解成谷氨酰胺而发挥作用，研究证明，丙谷二肽有体内很快被分解为丙氨酸和谷氨酰胺，半衰期很短，血液中只能检测到少量的二肽，仅有微量的二肽从尿液中排出，说明丙谷二肽可有效的被利用而且不会在血液中积聚，避免了可能产生的药理及生理损害。
化学法合成丙谷二肽合成复杂路线长，环境污染大，成本高。酶法生产丙谷二肽工艺简单，绿色环保，成本低。目前大多利用液酶进行反应，与使用固定化酶相比，每批反应必须换用新的酶液，分离困难，操作繁琐，且降低了酶的利用效率，废液不可回收，产生大量三废污染物，同时产品中可能含有蛋白等菌体杂质。
固定化酶技术的发展已有100多年的历史，到上个世纪70年代末，该技术已经相当成熟，选择适当的固定化方法如包埋法、微囊化法、共价连接法、吸附法或组合方法，适当的载体如无机载体或有机载体、天然载体或合成载体、有孔载体或无孔载体、膜、颗粒、泡沫、胶囊等，以及适当的固定化条件如水相、有机溶剂、pH、温度等。随着科学技术的发展，固定化酶的技术也再不断的进步，通过固定化载体、固定化方法和酶的不断改进，提高了许多不具有工业化应用酶的性能，使其具有更高的选择性、活力和耐用性。通过固定化酶的使用，方便了反应混合物的分离，反应器设计较灵活，适用于多种不同反应介质和反应系统，方便过程开发和下游处理，尤其便于过程控制。但由于应用于产业时间较短，很多工业反应，尤其是一些医药中间体制备工艺中还未采用固定化酶技术。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有的技术不足，提供一种固定化氨基酸酯酰转移酶。
为解决以上问题，本发明采取如下技术方案为：
一种固定化氨基酸酯酰转移酶，其由氨基酸酯酰转移酶以吸附、共价结合、包埋、微囊化或交联的固定方式固定于固定化酶载体中制备而成，其中，所述氨基酸酯酰转移酶占所述固定化酶载体的质量百分比为0.01%~5%。
优选的，本发明所述的固定化氨基酸酯酰转移酶，其中，所述氨基酸酯酰转移酶占所述固定化酶载体的质量百分比为0.1%~2.5%。
本发明所述的固定化氨基酸酯酰转移酶，其中，所述氨基酸酯酰转移酶为野生型或突变型。
进一步地，本发明所述的固定化氨基酸酯酰转移酶，其中，所述固定方式为共价结合，所述固定化酶载体选自环氧基固定化酶载体或氨基固定化酶载体。
进一步地，本发明所述的固定化氨基酸酯酰转移酶，其中，所述固定化氨基酸酯酰转移酶的制备方法为：将氨基酸酯酰转移酶和固定化酶载体分别加入缓冲溶液中，所述缓冲液的pH值为5~10，控制固定化反应温度为5~40℃，搅拌反应5~72小时，收集固体，干燥，即得。
优选的，本发明所述的固定化氨基酸酯酰转移酶，其中，所述缓冲溶液的pH值为7~9，进一步优选为8，所述固定化反应温度为15℃~25℃，进一步优选为20℃，所述缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液、Tris-HCL缓冲溶液或三乙醇胺缓冲溶液。
本发明的另一目的在于提供利用上述固定化酶生产丙谷二肽的生物制备方法。
本发明提供的技术方案为：
一种采用本发明的固定化氨基酸酯酰转移酶作为生物催化剂制备丙谷二肽的方法，其以谷氨酰胺和L-丙氨酸甲酯或L-丙氨酸甲酯盐酸盐为底物，在pH值为5.0~9.5的水相溶液中，5℃~30℃的反应温度下，搅拌，使两种底物在权利要求1~4中任一项所述的固定化氨基酸酯酰转移酶的催化作用下发生反应生成丙谷二肽。
优选地，本发明所述的制备丙谷二肽的方法，其反应起始时的反应体系中，所述谷氨酰胺的浓度为1%~25%，单位g/mL，所述L-丙氨酸甲酯或L-丙氨酸甲酯盐酸盐的浓度为1%~25%，单位g/mL，所述固定化氨基酸酯酰转移酶的浓度为1%~25% ，单位g/mL。
进一步优选地，本发明所述的丙谷二肽的制备方法，其反应起始时反应体系中所述L-丙氨酸甲酯或L-丙氨酸甲酯盐酸盐的浓度为5%~25%，单位g/mL，所述谷氨酰胺的浓度为5%~15%，单位g/mL。
优选地，本发明所述的丙谷二肽的制备方法，其反应起始体系中，所述固定化氨基酸酯酰转移酶的浓度为5%~15%，单位g/mL。
优选地，本发明所述的丙谷二肽的制备方法，其反应起始时的反应体系中，所述水相溶液的pH值为7.0~9.5。
优选地，本发明所述的丙谷二肽的制备方法，其反应起始时的反应体系中，所述反应温度5℃~20℃。
优选地，本发明所述的丙谷二肽的制备方法，其中，所述水相溶液为缓冲溶液。
本发明所用的底物（L-丙氨酸甲酯或L-丙氨酸甲酯盐酸盐、谷氨酰胺）、氨基酸酯酰转移酶、固定化酶载体等均可商购获得。
本发明所述制备方法的实施过程如下：在反应容器中加入缓冲溶液，依次加入底物L-丙氨酸甲酯或L-丙氨酸甲酯盐酸盐，谷氨酰胺，固定化氨基酸酯酰转移酶，于温度5℃~30℃下搅拌反应，利用高效液相色谱监测反应的产物，至转化率达到80%以上终止反应。
本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
本发明与已有技术相比具有如下优势：
1、本发明方法通过添加廉价且来源广泛的辅料，有效地改进了传统酶催化生产过程中底物浓度低、酶反应耗时长等缺点，实现高效、低成本制备丙谷二肽。
2、本发明的固定化酶与液酶相比，降低生产成本和劳动强度，提高酶的利用效率和产品质量，减少三废排，绿色环保。
3、固定化酶容易从反应液混合物中分离，重复使用；反应器设计较灵活；适合于多种不同的反应介质和反应系统；方便过程开发和下游处理，尤其便于过程控制。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1 固定化氨基酸酯酰转移酶的制备
取250mL三口烧瓶，加 150mL磷酸盐缓冲溶液（100mM，pH值8.0），并依次加入1g氨基酸酯酰转移酶（或液体酶），40g环氧基固定化酶载体（sepabeads® EC-EP113-M），温度20℃，转速150rpm，反应24小时，收集固定化酶。
实施例2 固定化氨基酸酯酰转移酶的制备
取250mL三口烧瓶，加 150mL磷酸盐缓冲溶液（100mM，pH值8.0），并依次加入1g氨基酸酯酰转移酶（或液体酶），40g活化后的氨基固定化酶载体（sepabeads® EC-HA/M），温度20℃，转速150rpm，反应24小时，收集固定化酶。
实施例3 固定化氨基酸酯酰转移酶的制备
取250mL三口烧瓶，加 150mL磷酸盐缓冲溶液（100mM，pH值8.0），并依次加入0.04g氨基酸酯酰转移酶（或液体酶），40g活化后的氨基固定化酶载体（sepabeads® EC-HA/M），温度20℃，转速150rpm，反应36小时，收集固定化酶。
实施例4 丙谷二肽的酶法制备
在250mL三口烧瓶中加入底物L-丙氨酸甲酯盐酸盐17.25g，谷氨酰胺8克，纯化水150mL，实施例1固定化氨基酸酯酰转移酶10g，于20℃下，200rpm搅拌反应，用6moL/L盐酸控制pH值8.5，利用液相色谱监测反应的转化率，30分钟后转化率达到80%以上，分离回收固定化酶。
上述固定化酶重复使用10次，反应时间小于1小时，转化率在80%以上。
实验例5 丙谷二肽的酶法制备
在250mL三口烧瓶中加入底物L-丙氨酸甲酯盐酸盐17.25g，谷氨酰胺8克， 纯化水150mL，实施例2固定化氨基酸酯酰转移酶10g，于20℃下，200rpm搅拌反应，用6moL/L盐酸控制pH值8.5，利用液相色谱监测反应的转化率，30分钟后转化率达到80%以上，分离回收固定化酶。
上述固定化酶重复使用10次，反应时间小于1小时，转化率在80%以上。
Claims (10)
1.一种固定化氨基酸酯酰转移酶，其特征在于：由氨基酸酯酰转移酶以吸附、共价结合、包埋、微囊化或交联的固定方式固定于固定化酶载体中制备而成，其中，所述氨基酸酯酰转移酶占所述固定化酶载体的质量百分比为0.01%~5%。
2.根据权利要求1所述的固定化氨基酸酯酰转移酶，其特征在于：所述固定方式为共价结合，所述固定化酶载体选自环氧基固定化酶载体或氨基固定化酶载体，所述氨基酸酯酰转移酶占所述固定化酶载体的质量百分比为0.1%~2.5%。
3.根据权利要求2中所述的固定化氨基酸酯酰转移酶，其特征在于：所述固定化氨基酸酯酰转移酶的制备方法为：将氨基酸酯酰转移酶和固定化酶载体分别加入缓冲溶液中，所述缓冲液的pH值为5~10，控制固定化反应温度为5~40℃，搅拌反应5~72小时，收集固体，干燥，即得。
4.根据权利要求3所述的固定化氨基酸酯酰转移酶，其特征在于：所述缓冲溶液的pH值为7~9，所述固定化反应温度为15℃~25℃，所述缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液、Tris-HCL缓冲溶液或三乙醇胺缓冲溶液。
5.一种采用权利要求1~4中任一项所述的固定化氨基酸酯酰转移酶作为生物催化剂制备丙谷二肽的制备方法，其特征在于：以谷氨酰胺和L-丙氨酸甲酯或L-丙氨酸甲酯盐酸盐为底物，在pH值为5.0~9.5的水相溶液中，5℃~30℃的反应温度下，搅拌，使两种底物在权利要求1~4中任一项所述的固定化氨基酸酯酰转移酶的催化作用下发生反应生成丙谷二肽。
6.根据权利要求5所述的丙谷二肽的制备方法，其特征在于：反应起始时的反应体系中，所述谷氨酰胺的浓度为1%~25%，单位g/mL，所述L-丙氨酸甲酯或L-丙氨酸甲酯盐酸盐的浓度为1%~25%，单位g/mL,所述固定化氨基酸酯酰转移酶的浓度为1%~25% ，单位g/mL。
7.根据权利要求6所述的丙谷二肽的制备方法，其特征在于：反应起始时反应体系中所述L-丙氨酸甲酯或L-丙氨酸甲酯盐酸盐的浓度为5%~25%，单位g/mL，所述谷氨酰胺的浓度为5%~15%，单位g/mL。
8.根据权利要求5所述的丙谷二肽的制备方法，其特征在于：反应起始体系中，所述固定化氨基酸酯酰转移酶的浓度为5%~15%，单位g/mL。
9.根据权利要求5所述的丙谷二肽的制备方法，其特征在于：反应起始时的反应体系中，所述水相溶液的pH值为7.0~9.5。
10.根据权利要求5所述的丙谷二肽的制备方法，其特征在于：反应起始时的反应体系中，所述反应温度5℃~20℃。
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