CN106459928A

CN106459928A - 猪细小病毒

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Publication number: CN106459928A
Application number: CN201580019301.1A
Authority: CN
Inventors: L.格伦; A.格罗夫; C.C.施里尔; M.戴吉斯; C.M.赫克范德
Original assignee: Intervet International BV
Current assignee: Intervet International BV
Priority date: 2014-04-17
Filing date: 2015-04-16
Publication date: 2017-02-22
Also published as: CA2944865A1; KR20160144383A; MX383506B; KR102392649B1; BR112016023787A2; US10398773B2; RU2016144766A; US20170056492A1; RU2020111219A; JP6938155B2; JP2017517248A; EP3132026B1; EP3132026A1; MX2016013584A; WO2015158798A1; CA2944865C; JP2020167992A; ES2771850T3; RU2016144766A3; KR20210123413A

Abstract

本发明涉及新猪细小病毒、所述病毒的蛋白和基于所述病毒及其蛋白的疫苗。本发明也涉及包含所述病毒的基因的DNA片段和基于所述病毒的基因的DNA疫苗。另外，本发明涉及与所述新病毒反应的抗体和用于检测所述病毒或针对所述病毒的抗体的诊断测试。

Description

猪细小病毒

本发明涉及新猪细小病毒、所述病毒的蛋白和基于所述病毒及其蛋白的疫苗。本发明也涉及包含所述病毒的基因的DNA片段和基于所述病毒的基因的DNA疫苗。另外，本发明涉及可与所述新病毒反应的抗体和用于检测所述病毒或针对所述病毒的抗体的诊断测试。

在最近的数十年中，观察到猪肉消费的世界性强烈增加。结果，观察到农场的数目和大小的增加，以便满足逐渐增大的市场需求。如从畜牧业已知的，一般而言，亲密地一起生活的大量动物易发所有种类的疾病，甚至在大规模商业畜牧之日之前几乎没有知道或见到或甚至未知的疾病。

现在已经知道超过60年的猪疾病之一是出血性肠综合征(HBS)。该疾病由于以下事实而被称作综合征：该疾病的原因不清楚，并且各种临床体征的一致性不总是完全清楚。

HBS是一种以频繁的爆炸性爆发而发生的疾病。主要影响4-6个月龄的快速生长中的猪。在大多数情况下，在育肥猪中观察到该疾病。猪在没有腹泻证据的情况下突然死亡，尽管死亡的程度会变化^(1-3)。基于超过16000头猪的瑞士尸体剖检数据表明2.66%的HBS发生率。在美国，据报道HBS造成生长-完成阶段的所有死亡的0.5%-7%⁽³⁾。

出血性肠综合征不应当视作具有单一原因的单一疾病。

HBS的最显著征状是肠出血，经常伴有肠扭转(肠的扭转)。但是，这些征状也是胃溃疡和回肠炎的指征，这使得HBS的诊断复杂化。整个肠的旋转可能发生，从而造成血液汇集和淤积。可以在多达80%的HBS病例中观察到肠扭转^(1-3)。该疾病的其它经常注意到的征状是薄肠壁和肠中的带血流体。

HBS的精确病原学是不清楚的。如上面指出的，不是具有单一原因，所述综合征的病原学最可能是多因素的。应激、几个环境和管理方面可能起作用。倾向因素可以包括剧烈运动、搬运、打架、拥挤（piling）或不规则进食。没有明确的证据表明传染性病原体(细菌或病毒)可以造成HBS ^(1,3)，尽管已经从遭受HBS的动物分离出梭菌属（Clostridium sp.）和大肠杆菌（E. coli）。通过将过滤的来自遭受HBS的动物的肠内容物静脉内地或口服地施用给健康动物来再现疾病的尝试失败了。通过口服接种从被感染的猪分离的大肠杆菌和A型产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）来再现疾病的尝试同样失败了。

另一方面，已知的是，通过在饲料中施用抗生素，可以使所述疾病的频率下降至某种程度。这强化了以下理论，所述疾病实际上是多因素的：例如应激和一种或多种病原体的组合效应。

本发明的一个目的是，提供与该疾病有关的新传染性病原体以及目的在于与所述疾病斗争或至少降低所述疾病的死亡率的疫苗。此外，本发明的一个目的是，提供检测和鉴别所述疾病相关的传染性病原体的方式。

近年来，在墨西哥的疾病爆发过程中从几个农场收集诊断出HBS的猪。

受影响的猪不具有疾病的早先征状且在疾病的第一体征以后2-6小时之间突然死亡。

在尸检时，所述猪表现出小肠中的异常（具体地（i.a.）出血征状）、薄肠壁和肠中的带血流体。在其它器官中没有发现异常，但是观察到增大的、肿胀的淡红色淋巴结。疾病被证实为HBS。

针对病毒的存在分析了来自不同农场的尸检受影响的猪的样品，令人惊讶的是，在76%的动物中发现了新病毒。所述病毒并非在所有动物中检测到的事实可能必须考虑在动物的死亡与对它们进行死后切开的时刻之间经过的时间的量。这可以具体地从以下事实推断：在每只动物中发现的病毒的量在很大程度上变化。发明人预见到，在其中看起来不存在所述病毒的猪中，这可能是由于在那些猪中存在的病毒的量低于在分析时刻的检测水平的事实。此外，对于该新病毒而言不知道最初病毒复制的位点，且因而在感染以后病毒复制的主要位点可能没有被取样。

由于在这些诊断出HBS的猪中检测到新病毒，所述病毒还将被称作HBS相关病毒。出血性肠综合征现在可以通过与下述临床征状组合的、根据本发明的新病毒在所述疾病中的某个阶段在遭受HBS的动物的器官中的存在来表征：肠出血，经常伴有肠扭转，薄肠壁和肠中的带血流体。

分析了病毒基因组的序列，并揭示所述新病毒与最近鉴别出的细小病毒科（Parvoviridae）内的细小病毒亚科（Parvovirinae subfamily）的属具有某种（尽管相对低的）水平的相似性。

细小病毒是直链的、不分段的单链DNA病毒，具有5000个核苷酸的平均基因组大小和在18-26 nm范围内的直径大小。

新猪细小病毒的代表的几乎全长DNA序列呈现在SEQ ID NO: 10中。

所述新病毒包含两个大开放读码框(ORF)：在SEQ ID NO: 10的位置0134-2122处发现了编码由662个氨基酸组成的非结构蛋白1 (NS1)的ORF1，和在SEQ ID NO: 10的位置2130-5699处发现了编码由1189个氨基酸组成的衣壳蛋白(CP)的ORF2。

ORF2（编码衣壳蛋白的基因）的DNA序列的一个例子描绘在SEQ ID NO: 1中。SEQID NO: 2表现了衣壳蛋白的氨基酸序列。

编码非结构蛋白NS1的ORF1的DNA序列的一个例子描绘在SEQ ID NO: 3中。SEQ IDNO: 4表现了非结构蛋白NS1的氨基酸序列。

细小病毒亚科目前包括7个属⁽¹⁵⁾：

1)PARV4-样病毒

2)红病毒属

3)博卡病毒属

4)依赖病毒属

5)阿留申病毒属

6)细小病毒属

7)新提出的细小病毒进化枝

在此时，已经鉴别出6种不同的感染猪的细小病毒：

a)经典的猪细小病毒1型(PPV1)，细小病毒属的一个成员

b)猪细小病毒2型(PPV2)，PARV4-样病毒的一个成员

c)猪细小病毒3型(PPV3，也被称作猪PARV4、hokovirus或partetravirus)，也是PARV4-样病毒属的一个成员

d)猪细小病毒4型(PPV4)，新提出的进化枝的一个成员

e)猪细小病毒5型(PPV5)，也是新提出的进化枝的一个成员

f)猪博卡病毒(PBoV)，博卡病毒属的一个成员

已知PPV1是SMEDI（一种与死产、木乃伊化、胚胎死亡和不育关联的综合征）的致病因子^(4,5)

未知PPV2会造成这样的疾病，但是被提示是猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)的发生的辅因子^(6,7)。

也未知PPV3会造成这样的疾病，但是也可能是猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)的发生的辅因子^(8-11)。

PPV4最初分离自猪的肺组织。所述组织似乎被猪圆环病毒共感染。不知道它会造成疾病，并且还没有令人信服地与另一种病原体造成的疾病相关联^(12-14)。

还未知PPV5会造成任何征状或损害，并且没有与另一种病原体造成的疾病相关联^(15-16)。

猪博卡病毒一种相对新猪细小病毒类型，其临床意义和流行病学在很大程度上有待探索⁽¹⁷⁾。

基于最大似然法、Poisson校正模型和自举分析(500个重复)，使用所述新病毒的ORF1和ORF2的氨基酸序列来制备系统树。

使用程序MEGA, 5版，使用标准设置制备这些树(MEGA5: MolecularEvolutionary Genetics Analysis Using Maximum Likelihood, EvolutionaryDistance, and Maximum Parsimony Methods. Koichiro Tamura, Daniel Peterson,Nicholas Peterson, Glen Stecher, Masatoshi Nei and Sudhir Kumar. Mol. Biol.Evol. 28(10): 2731-2739. 2011 doi:10.1093/molbev/msr121 Advance Accesspublication 2011年5月4日)。

ORF1的系统树呈现在图1中，ORF2的系统树呈现在图2中。在结点中指定了自举支持百分比。距离条指示每个位点的核苷酸置换的数目。

从这些系统树可见，新猪细小病毒与猪细小病毒5 (PPV5)和猪细小病毒4 (PPV4)的相关性高于PPV1、2或3或博卡病毒。发现NS1编码序列和衣壳蛋白编码序列显示出某种匹配，因为细小病毒亚科系统树的部分也包含无关的病毒PPV4和PPV5。由于该原因，发明人决定试验性地将所述新病毒放入新进化枝病毒的组中。

但是，甚至在新进化枝病毒的组内与现有猪细小病毒的序列同一性是相对低的。由于该原因，甚至想象所述新病毒属于细小病毒亚科内的新属。

SEQ ID NO: 1和3显示了编码根据本发明的病毒的衣壳蛋白和非结构蛋白NS1的基因的核苷酸序列的典型例子。

应该理解，对于这些蛋白，在HBS相关病毒的各个代表之间可以存在天然变异。导致例如衣壳蛋白序列中的微小变化的遗传变异确实存在。这对于NS1基因同样适用。首先，存在所谓的“第二和第三碱基中的摇摆”，从而解释了核苷酸变化可能发生，所述变化在它们编码的氨基酸序列中保持不被注意到：例如三联体TTA、TTG、TCA、TCT、TCG和TCC都编码亮氨酸。另外，在氨基酸序列中可能见到根据本发明的新猪细小病毒的代表之间的微小变异。这些变异可以由全部序列中的氨基酸差异或由所述序列中的氨基酸的缺失、置换、插入、反转或添加反映。已经描述了基本上不会改变生物学和免疫学活性的氨基酸置换，例如Neurath等人在“The Proteins”Academic Press New York (1979)中。有关的氨基酸之间的氨基酸置换或在进化中已经频繁发生的替换尤其是Ser/Ala、Ser/Gly、Asp/Gly、Asp/Asn、Ile/Val (参见Dayhof, M.D., Atlas of protein sequence and structure, Nat.Biomed. Res. Found., Washington D.C., 1978, 第5卷, 增刊3)。其它氨基酸置换包括Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Thr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Leu/Ile、Leu/Val和Ala/Glu。基于该信息，Lipman和Pearson开发了一种用于快速且灵敏的蛋白对比并确定同源蛋白之间的功能相似性的方法(Science 227, 1435-1441, 1985)。本发明的示例性实施方案的这样的氨基酸置换、以及具有缺失和/或插入的变异是在本发明范围内。

这解释了为什么衣壳蛋白和非结构蛋白NS1当从根据本发明的猪细小病毒的不同代表分离时可能具有显著低于100%的同源性水平，同时仍然代表根据本发明的猪细小病毒的衣壳蛋白和非结构蛋白NS1。

这清楚地反映在例如Xiao等人的论文⁽⁶⁾的图1的系统树中，其中表明甚至在一个单个属内，由高度相关的细小病毒组成的PARV4-样病毒属仍然具有显著不同的总基因组核苷酸序列以及显著不同的NS1基因核苷酸序列。

因而，根据本发明的病毒具体地描述为分离的病毒，其为细小病毒科的细小病毒亚科的一个成员，所述病毒特征在于，

a)所述病毒是HBS相关病毒，且

b)所述病毒具有包含编码衣壳蛋白(CP)的基因的病毒基因组，其中所述CP基因的核苷酸序列与SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平。

就本发明的目的而言，同一性水平应理解为SEQ ID NO: 1的序列与要确定其同一性水平的编码猪细小病毒的衣壳蛋白的对应区域的同一性水平。

用于确定同一性水平的合适程序是NCBI的Basic Local Alignment Search Tool的核苷酸blast程序(blastn)，使用“比对2个或多个序列（Align two or moresequences）”选项和标准设置(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。

就本发明的目的而言，分离是指：脱离所述病毒天然地相关的组织。分离的病毒的一个例子是存在于细胞培养物中的病毒。

该实施方案的一种优选形式涉及这样的病毒：其衣壳蛋白基因与SEQ ID NO: 1所示的衣壳蛋白的核苷酸序列具有至少82%、更优选地84%、86%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或甚至100%（按优先顺序）的同一性水平。

描述根据本发明的病毒的一种替代方式涉及所述病毒的NS1基因的序列。

SEQ ID NO: 3显示了根据本发明的病毒的NS1基因的核苷酸序列的一个典型例子。如上面所解释的，但是发现了导致NS1序列的微小变化的天然变异。

因而，根据本发明的病毒因而也可以描述为分离的病毒，其为细小病毒科的细小病毒亚科的一个成员，所述病毒特征在于，

a)所述病毒是HBS相关病毒，且

b)所述病毒具有包含编码非结构蛋白1 (NS1)的基因的病毒基因组，其中所述NS1基因的核苷酸序列与SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平。

该实施方案的一种优选形式涉及这样的病毒：其NS1基因与SEQ ID NO: 3所示的NS1基因的核苷酸序列具有至少82%、更优选地84%、86%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或甚至100%（按优先顺序）的同一性水平。

因而，总之，根据本发明的病毒是分离的病毒，其为细小病毒科的细小病毒亚科的一个成员，所述病毒特征在于，

a)所述病毒是HBS相关病毒，且

b)所述病毒具有包含编码衣壳蛋白(CP)的基因和编码非结构蛋白1 (NS1)的基因的病毒基因组，其中所述CP基因的核苷酸序列与SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平或所述NS1基因的核苷酸序列与SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平。

该实施方案的一种优选形式涉及分离的病毒，其为细小病毒科的细小病毒亚科的一个成员，所述病毒特征在于，

a)所述病毒是HBS相关病毒，且

b)所述病毒具有包含编码衣壳蛋白(CP)的基因和编码非结构蛋白1 (NS1)的基因的病毒基因组，其中所述CP基因的核苷酸序列与SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平且所述NS1基因的核苷酸序列与SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平。

表征根据本发明的病毒的另一种替代方式依赖于PCR测试，所述PCR测试使用对根据本发明的病毒的衣壳蛋白基因序列或NS1基因序列特异性的引物集合。关于它们对所述病毒的特异性，选择两个不同的引物集合，其序列描绘在SEQ ID NO: 5-6和SEQ ID NO: 7-8中。使用与所述病毒的衣壳蛋白基因特异性地反应的第一引物集合(SEQ ID NO: 5-6)的PCR测试使用两种引物Bowl_Q_ORF2_FW: CTACATCTGCGCCTGAC和Bowl_Q_ORF2_REV:GTGGTGAGAAGGCAAGAC，

对于定量(Q)-PCR测试，除了这两种引物以外使用PCR探针Bowl_Q_ORF2_PROBE: 如SEQDI NO.: 9所示的6FAM-CACGAGCTAGAGCGTGCTAAACAG-BHQ1。

使用第二引物集合(SEQ ID NO: 7-8)的PCR测试与所述病毒的NS1基因特异性地反应，并使用两种引物Bowl_ORF1_774_F: TGTTGAGTGTGGTGGATTGG和Bowl_ORF1_1626_R:AAGGAAGCTGGACCGAGAG。

在实施例部分中更详细地描述的测试是标准的PCR测试。

如果使用上述的引物集合分析细小病毒科内的细小病毒亚科的成员，可以说以下：如果第一引物集合的PCR产物的分析揭示大约140碱基对的PCR产物或如果第二引物集合的PCR产物的分析揭示大约853碱基对的PCR产物，这明确地证实，分析的病毒属于根据本发明的病毒。

仅仅作为一个例子：大约853碱基对的PCR产物是具有853 + 10和853 - 10碱基对之间的长度的PCR产物。大约140碱基对的PCR产物是具有140 + 10和140 - 10碱基对之间的长度的PCR产物。

因而本发明的该实施方案的再一种形式涉及分离的病毒，其为细小病毒科内的细小病毒亚科的一个成员，其特征在于：

a)所述病毒是HBS相关病毒，且

b)所述病毒基因组DNA在PCR反应中与SEQ ID NO: 5和6所示的引物集合反应以产生140±10碱基对的PCR产物，或在PCR反应中与SEQ ID NO: 7和8所示的引物集合反应以产生853±10碱基对的PCR产物。

该实施方案的一种优选形式涉及根据本发明的病毒，其中所述病毒基因组DNA在PCR反应中与SEQ ID NO: 5和6所示的引物集合反应以产生140±10碱基对的PCR产物且在PCR反应中与SEQ ID NO: 7和8所示的引物集合反应以产生853±10碱基对的PCR产物。

该实施方案的一种更优选形式涉及根据本发明的病毒，其中所述病毒具有包含编码衣壳蛋白(CP)的基因和编码非结构蛋白1 (NS1)的基因的病毒基因组，其中所述CP基因的核苷酸序列与SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平或所述NS1基因的核苷酸序列与SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平，且其中所述病毒基因组DNA在PCR反应中与SEQ ID NO: 5和6所示的引物集合反应以产生140±10碱基对的PCR产物且在PCR反应中与SEQ ID NO: 7和8所示的引物集合反应以产生853±10碱基对的PCR产物。

根据本发明的病毒可以呈活的、活减毒的或灭活的形式。

如上面指出的，现在已经表征编码所述病毒的CP和NS1的基因的DNA序列。这些基因的鉴别是非常有用的，因为它们现在可以具体地用作DNA-疫苗的基础，用于制备基于这些蛋白的亚单位疫苗或用于诊断目的，这将在下面广泛地解释。

本发明的另一个实施方案涉及包含编码衣壳蛋白的基因的DNA片段，其特征在于，所述基因与SEQ ID NO: 1所示的CP基因的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平。

该实施方案的一种优选形式涉及这样的DNA片段，其包含与SEQ ID NO: 1所示的CP的核苷酸序列具有至少82%、更优选地84%、86%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或甚至100%（按优先顺序）的同一性水平的基因。

在本发明的再一个实施方案中，涉及包含编码NS1的基因的DNA片段其特征在于，所述基因与SEQ ID NO: 3所示的NS1基因的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平。

该实施方案的一种优选形式涉及这样的DNA片段，其包含与SEQ ID NO: 3所示的NS1的核苷酸序列具有至少82%、更优选地84%、86%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或甚至100%（按优先顺序）的同一性水平的基因。

本发明的另一个实施方案涉及这样的CP，其特征在于，该CP由编码根据本发明的CP的DNA片段编码。

根据本发明的病毒的这样的CP是非常合适的，因为它们适合用在疫苗中，更具体地用在亚单位疫苗中，它们可以用于产生抗体，且它们使得诊断测试成为可能，如下面解释的。

该实施方案的一种优选形式涉及具有SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列的CP。

在本发明的再一个实施方案中，涉及NS1，其特征在于，所述NS1由编码根据本发明的NS1的DNA片段编码。

根据本发明的病毒的这样的NS1是非常合适的，具体地因为它们使得诊断测试成为可能，如下面解释的。

该实施方案的一种优选形式涉及具有SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列的NS1。

本发明的优点之一是，现在首次可能跟踪病毒感染的进程和分析所述新病毒在遭受HBS的猪的不同器官和体液中的存在或不存在。这有助于获得对疾病发展的更多洞察。

已知的是，在单只猪显示HBS的完全临床体征之前数周或甚至数天，没有发现异常。第一征状和动物的死亡之间的平均计时是约2-6小时。在死亡之前不久，动物似乎遭受腹部膨胀，且它们中的一些在垂死之前尖叫。在它们死于疾病之前，将发生临床体征的农场的动物安乐死。

在从其收集HBS-猪的不同墨西哥农场上，HBS-发病率在1-2%之间变化。

从不同的农场收集了共33只安乐死的诊断出HBS的动物，分析了17只在18-27周龄之间的一组(实施例1)和16只在12-26周龄之间的一组(实施例2)。使用上述引物集合的PCR反应揭示，在组1中，发现14份血清(3份血清被错过没有收集)中的5份是病毒阳性的，且发现一个直肠拭子是阳性的。发现共8份完整血液样品是阳性的，且发现15个淋巴结中的12个是阳性的。在组2中，16份血清中的5份是病毒阳性的，且发现一个直肠拭子（swap）是阳性的。

从每个组的一只代表动物(组1的动物2、组2的动物10)，针对病毒的存在来分析器官。发现所有取样的器官（包括淋巴结、肺、脾、肠、肾和肝）以及粪便被测试为病毒阳性的。

本发明的另一个优点是，现在可能用所述新病毒感染健康的猪和检查病毒感染的途径。为了该目的，将来自HBS-动物的器官材料和粪便在组织培养基中匀浆化。将匀浆物冻融一次(-70℃)、离心并在5µm、0.45µm和0.22µm过滤器上过滤以除去剩余的组织材料。

接种物A由一只代表动物的以下材料制成：组2的动物10的粪便、淋巴结、肺、脾和肠。

接种物B由另一只代表动物的以下材料制成：组1的动物2的粪便、淋巴结、肺、肾和肝。在下面的实施例部分(实施例3)中给出了这些实验的全部细节。

在接种时如下将接种物(A或B)作为4 x 2mL肌肉内剂量和20 ml的口服剂量施用给12-14周龄的共4只小公猪和8只小母猪(长白猪（Landrace）/高健康状况/SPF)：组1:5只动物，其中3只动物接受接种物A，2只充当接触警哨（contact sentinel）。组2:4只动物，其中3只动物接受接种物B，1只充当接触警哨。组3:3只动物，它们都接受接种物B。将一只动物(雄性)在接种之前处死并充当阴性对照。在接种之前针对所述新病毒在血清、粪便、鼻拭子和眼拭子中的存在来筛选动物。

在几个时间点采集血液样品、直肠/鼻/眼拭子。在下面的实施例部分中给出了动物实验的全部细节。

发现在全部6只接种的动物中，可以在接种以后7天在血清中以及在直肠、鼻和眼拭子中检测到病毒。在所有3只未接种的动物（警哨）中，可以在其它动物的接种之后14天在血清中检测到病毒。所有警哨动物的直肠/鼻和眼拭子在接种之后第7天是阳性的(实施例3，组1、2)。在接种之后第3天在接种的动物的全部3份血清中，检测到病毒(实施例3，组3)。

因而，尽管确实HBS的发病率据报道是相对低的，考虑到所述病毒的高接触传染性质以及它的高感染速度，可以预见到，在发生HBS的农场中的绝大多数（如果不是全部的话）猪将经历所述病毒的感染。

因此，给在发生HBS的农场中的所有动物接种疫苗是非常明智的，以对抗根据本发明的HBS相关的猪细小病毒的感染。这样的疫苗接种至少根除所述多因素综合征的病毒组分，并且这又会预防所述疾病或至少减小所述疾病的严重程度。

本发明的优点之一还是，由于新猪细小病毒现在已经被分离和与HBS关联，所述病毒和/或所述病毒的保护亚基可以用作用于疫苗接种目的的起始原料。

因而，本发明的另一个实施方案涉及用于与猪中的HBS斗争的疫苗，其中这样的疫苗包含根据本发明的病毒和药学上可接受的载体。

适合用在根据本发明的疫苗中的药学上可接受的载体的例子是无菌水、盐水、水性缓冲液诸如PBS等。另外，根据本发明的疫苗可以包含其它添加剂诸如佐剂、稳定剂、抗氧化剂和其它，如下所述。

斗争在这方面应当在广义上解释：与HBS斗争被视为包含疫苗接种以便预防疾病的体征以及疫苗接种以减少如上所述的疾病的体征。

一旦在尚未遭受所述综合征的被感染的动物中诊断出所述病毒，治疗性疫苗接种当然是同样有效的。鉴于第一临床体征和死亡之间的非常短的时间，诊断出所述综合征以后的治疗性疫苗接种似乎是无效的。

根据本发明的疫苗可以包含减毒的活的或灭活的形式的根据本发明的病毒。

减弱的活病毒疫苗，即包含活减毒形式的根据本发明的病毒的疫苗，具有胜过灭活疫苗的优点，因为它们最佳地模仿天然的感染途径。另外，它们的复制能力允许接种小量病毒；它们的数目将自动地增加，直到它达到免疫系统的触发水平。从此刻开始，免疫系统将被触发并最后消除病毒。

活减毒病毒是与分离自野外的病毒相比具有降低的毒力水平的病毒。具有降低的毒力水平的病毒被视作即使与HBS中涉及的其它因素组合也不会诱发猪的死亡的病毒。

因此，本发明的该实施方案的一种优选形式涉及包含根据本发明的病毒的疫苗，其中所述病毒呈活减毒形式。

减毒病毒可以例如如下得到：在有诱变剂存在下培养根据本发明的病毒，随后选择显示出后代水平的下降和/或复制速度的下降的病毒。许多这样的试剂是本领域已知的。

另一种非常经常使用的方法是连续体外传代。病毒随后适应了用于连续传代的细胞系，使得它们在再次作为疫苗转移至天然宿主时具有减毒的表现。

得到减毒病毒的再一种方式是，在偏离它们的天然生境温度的温度下使它们生长。温度敏感突变体(Ts-突变体)的选择方法是本领域众所周知的。这样的方法包括在有诱变剂存在下培养病毒，随后在次优温度和在最佳温度培养，在细胞层上滴定后代病毒，和视觉选择在最佳温度较慢生长的那些噬斑。这样的小噬斑包含缓慢生长的和因而期望的活减毒病毒。

用于斗争猪细小病毒类型PPV的活减毒疫苗已经具体地由Paul & Mengeling⁽³²⁾、Paul & Mengeling ⁽³³⁾和Fujisaki e& Murakami ⁽³⁴⁾描述。

但是，活减毒病毒的应用的一个可能的缺点可能是，固有地剩余某一水平的毒力。这不是真实的缺点，只要毒力水平是可接受的即可，即只要疫苗至少阻止猪死亡即可。当然，活减毒疫苗的剩余毒力越低，在疫苗接种过程中/以后疫苗接种对重量增加的影响越小。

与它们的活减毒相应物相比，灭活疫苗是固有地安全的，因为其没有残留剩余毒力。尽管事实上它们经常包含与活减毒疫苗相比稍微更高剂量的病毒，但是它们可以例如是已经遭受其它疾病的猪中的疫苗的优选形式。被维持在次优条件（诸如不完全营养物或次优圈舍）下的猪也会受益于灭活疫苗。

因此，该实施方案的另一种优选形式涉及包含根据本发明的病毒的疫苗，其中所述病毒呈灭活形式。

已知的是，完整的灭活细小病毒（它是猪或犬细小病毒）一般而言是疫苗的非常有效且安全的基础。仅仅作为一个例子：MSD AH (Boxmeer, 荷兰)生产商购可得的灭活猪细小病毒类型PPV疫苗: Porcilis Parvo。Hipra (西班牙)也生产商购可得的灭活猪细小病毒类型PPV疫苗: PARVOSUIN^®MR/AD。Zoetis生产灭活犬细小病毒: PARVAC和灭活猪细小病毒类型PPV疫苗: 猪PARVAC。Novartis在美国专利US4193991中提供了灭活细小病毒的方法。

对于根据本发明的新猪细小病毒，同样可以制备这样的灭活的完整病毒疫苗。正如已知的细小病毒疫苗的情况，所述生产基本上包括以下步骤：在易感的猪细胞上培养新细小病毒，收获所述病毒，灭活所述病毒，和将灭活的病毒与药学上可接受的载体混合。

标准的灭活方法是经典的使用甲醛的处理。本领域众所周知用于灭活的其它方法是紫外辐射、γ-辐射、用二元乙烯亚胺、硫柳汞处理等。技术人员知道如何应用这些方法。优选地，用ß-丙内酯、戊二醛、乙烯亚胺或甲醛灭活病毒。不言而喻，在本发明中也包括其它将病毒灭活的方式。

如上面指出的，可以在细胞培养物中在易感的猪细胞或细胞系上培养所述病毒。

因而，本发明的另一个实施方案涉及包含根据本发明的HBS相关的猪细小病毒的细胞培养物。细胞和细胞系的例子是SK6、PK15、原代或永生化的猪肾细胞、原代或永生化的猪肺泡肺巨噬细胞。

实际上现在已经确定了新猪细小病毒的完整病毒基因组，所述新病毒的代表的DNA序列呈现在SEQ ID NO: 10中。这里没有呈现所述基因组的反向末端重复(ITR)。由于细小病毒通过定义属于已知的最小病毒，编码根据本发明的细小病毒的完整ss-DNA可以容易地合成制备。由于该原因，使用病毒DNA作为起始原料可以容易地在体内制备所述细小病毒。其它已知的细小病毒的基因组的反向末端重复(ITR)（诸如具体地由Qiu等人⁽³⁷⁾和Wang等人⁽³⁸⁾描述）可以用于完成SEQ ID NO: 10所示的病毒基因组。ITR仅仅在病毒基因组的复制中起作用，且如此，它们从免疫学观点是无关的。因而，为了生产根据本发明的病毒的目的，ITR是可互换的。

将全长细小病毒DNA克隆进质粒例如Bluescript II SK中，和随后通过用编码新猪细小病毒的表达质粒转染猪细胞来产生完整细小病毒，具体地由Qiu等人⁽³⁷⁾和Wang等人⁽³⁸⁾描述。一种允许的细胞系诸如SK6、PK15、原代或永生化的猪肾细胞、原代或永生化的猪肺泡肺巨噬细胞将是用于该目的的优选细胞系。尽管如此，如果需要的话，还可以使用未允许的细胞系：在腺病毒基因的帮助下，新细小病毒的基因组可以具体地在未允许的细胞中复制，如Guan等人⁽³⁹⁾所述。

尽管完整的灭活细小病毒会为疫苗提供良好的基础，它们的生产可能是昂贵的，具体地取决于使用的宿主细胞的类型、底物和使用的细胞培养基。

在细小病毒的具体情况下，使用完整病毒的一种有吸引力的替代方案是使用细小病毒CP亚基，更优选呈所谓的空衣壳形式的亚基。

这样的空衣壳基本上是病毒样颗粒，但是其不包含细小病毒基因组。结果，细小病毒空衣壳颗粒不必在用于疫苗中之前灭活，且因此它们具有以下另外优点：它们在本质上是安全的。

通过在合适的表达系统中仅仅表达编码衣壳蛋白的ORF2，可以得到空衣壳。如此形成的衣壳蛋白自装配成空病毒颗粒。

细小病毒空衣壳可以容易地大量制备，并且它们是高免疫原性的。

目前用于制备细小病毒空衣壳的绝大多数表达系统是基于杆状病毒的表达系统。

已经描述了用于在基于杆状病毒的表达系统中生产高免疫原性的细小病毒空衣壳的方法：例如，关于猪细小病毒类型PPV，Martinez ⁽¹⁸⁾、Casal ⁽¹⁹⁾、Zhou等人(²⁰⁾和HaoFeng ⁽²¹⁾。关于其它细小病毒，这样的方法已经由例如Saliki ⁽²²⁾和Brown ⁽²³⁾描述。

此外，杆状病毒表达系统和杆状病毒表达载体通常已经广泛地描述在教科书中，诸如由O‘Reilly等人⁽²⁴⁾和Murhammer ⁽²⁵⁾描述。

基于杆状病毒的表达系统也是商购可得的，例如从Invitrogen Corporation,1600 Faraday Avenue, Carlsbad, California 92008, USA。

基于杆状病毒的表达系统的一个替代方案是基于酵母的表达系统。酵母表达系统例如由Gellissen等人⁽²⁹⁾描述。

现成即可使用的表达系统具体地可商购得自Research Corp. Technologies,5210 East Williams Circle, Suite 240, Tucson, AZ 85711-4410 USA。酵母和昆虫细胞表达系统例如还可商购得自Clontech Laboratories, Inc. 4030 Fabian Way, PaloAlto, California 94303-4607, USA。

衣壳蛋白的表达当然在本领域已知的基于哺乳动物细胞的表达系统中也是可能的，但是这些系统最可能与基于杆状病毒的表达系统相比使用起来更昂贵。

因而该实施方案的另一种形式涉及用于与猪中的HBS相关的猪细小病毒斗争的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含免疫原性有效量的根据本发明的衣壳蛋白和药学上可接受的载体。

该实施方案的一种优选形式涉及用于与猪中的HBS相关的猪细小病毒斗争的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含免疫原性有效量的空衣壳形式的根据本发明的衣壳蛋白。

疫苗中空衣壳的量和施用途径是与灭活的完整病毒颗粒的量和施用途径相当的，因为在衣壳的免疫原性和相似性方面，它们与灭活的完整病毒颗粒相当。

通常，1-100µg新细小病毒空衣壳的量作为疫苗剂量是非常合适的。从成本的观点看，优选的量是在1-50µg空衣壳的范围内，更优选地在1-25µg的范围内。

Casal ⁽¹⁹⁾描述了在有常规佐剂存在下低至1-3µg的犬细小病毒和猪细小病毒剂量会给对应宿主赋予针对所述病毒的完全保护。

基于灭活的完整病毒或空衣壳的根据本发明的疫苗优选地包含佐剂。本领域众所周知的常规佐剂是例如弗氏完全和不完全佐剂、维生素E、非离子的嵌段共聚物、胞壁酰基二肽、Quill A^(R)、矿物油例如Bayol^(R)或Markol^(R)、植物油和聚羧乙烯^(R) (一种同聚物)或Diluvac^(R) Forte。所述疫苗也可能包含所谓的“媒介物”。媒介物是所述多肽所附着的化合物，而没有共价地结合它。经常使用的媒介物化合物是例如氢氧化铝、磷酸铝或氧化铝、二氧化硅、白陶土和皂粘土。

Casal ⁽¹⁹⁾在他的细小病毒疫苗中成功地使用了具体的氢氧化铝和Quill A。

一般而言，根据本发明的疫苗可以仅施用一次。但是，特别在灭活疫苗（它是完整病毒疫苗或空衣壳疫苗）的情况下，优选地也施用第一次和可能的第二次强化疫苗接种。第一强化剂经常在第一次疫苗接种以后至少2周施用。强化疫苗接种的一个非常合适的时刻是第一次疫苗接种以后3-16周。第二强化剂（如果必要的话）经常在第一强化剂以后4-50周施用。

灭活的完整病毒疫苗方案和空衣壳疫苗方案的一个替代方案是以猪为它们的宿主动物的活重组非细小病毒载体作为新猪微小病毒衣壳蛋白基因的载体的用途。

在以猪为它们的宿主动物的合适重组非细小病毒载体中，两种载体作为载体是特别合适的：假性狂犬病病毒(PRV)和古典猪瘟病毒(CSFV)。

这样的重组病毒在疫苗中的应用具有以下另外优点：接种疫苗的动物同时变成针对PRV和PPV、或CSFV和PPV接种疫苗。

Chen等人⁽²⁷⁾描述了表达猪细小病毒类型PPV衣壳蛋白的活减毒PRV重组载体的构建和应用。将该PRV重组体以5x10⁵TCID₅₀的量施用给8天龄小猪，且该量的疫苗被证实是安全的，并提供针对PRV和PPV的优良免疫。

活减毒CSFV载体作为活重组载体也是非常合适的。仅仅作为一个例子；已经从其删除N^pro基因的活减毒CSFV已经由Mayer等人⁽²⁸⁾描述。这样的活减毒病毒允许，具体地在N^pro基因的删除位点处，插入编码衣壳蛋白的基因。这样的活重组CSFV载体同样形成新的猪微小病毒衣壳蛋白基因的合适载体。

在于哺乳动物细胞中有功能的任意合适异源启动子的控制下，可以实现衣壳蛋白基因的表达(参见下面)。异源启动子是这样的启动子：其不是负责转录根据本发明的新猪细小病毒的野生型形式中的CP基因的启动子。它可能是负责转录另一种细小病毒的CP或NS1的细小病毒启动子，它不属于根据本发明的细小病毒，或它可以是非细小病毒启动子。

因此，本发明的另一个实施方案涉及包含编码根据本发明的CP的基因的DNA片段，其特征在于，所述基因是在功能性异源启动子的控制下。

Chen等人⁽²⁷⁾使用CMV启动子驱动衣壳蛋白基因的表达，但是在哺乳动物细胞中有功能的其它合适启动子是本领域已知的。在哺乳动物细胞中有功能的启动子是这样的启动子：其能够驱动在哺乳动物细胞中位于所述启动子下游的基因的转录。

在哺乳动物细胞中有功能的合适启动子的例子包括经典启动子诸如(人)巨细胞病毒立即早期启动子(Seed, B. 等人, Nature 329, 840-842, 1987; Fynan, E.F. 等人, PNAS 90, 11478-11482,1993; Ulmer, J.B. 等人, Science 259, 1745-1748,1993)、劳斯氏肉瘤病毒LTR (RSV, Gorman, C.M. 等人, PNAS 79, 6777-6781, 1982;Fynan等人, 出处同上; Ulmer等人, 出处同上)、MPSV LTR (Stacey等人, J. Virology50, 725-732, 1984)、SV40立即早期启动子(Sprague J. 等人, J. Virology 45, 773,1983)、SV-40启动子(Berman, P.W. 等人, Science, 222, 524-527, 1983)、金属硫蛋白启动子(Brinster, R.L. 等人, Nature 296, 39-42, 1982)、热激启动子(Voellmy等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4949-53, 1985)、Ad2的主要晚期启动子和β-肌动蛋白启动子(Tang等人, Nature 356, 152-154, 1992)。调节序列还可以包括终止子和多腺苷酸化序列。可以使用的序列包括众所周知的牛生长激素多腺苷酸化序列、SV40多腺苷酸化序列、人巨细胞病毒(hCMV)终止子和多腺苷酸化序列。

因而该实施方案的另一种形式涉及用于与猪中的HBS相关的猪细小病毒斗争的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含活重组非细小病毒载体和药学上可接受的载体，所述载体包含DNA片段，所述DNA片段包含在功能性启动子控制下编码根据本发明的CP的基因。

不言而喻，活重组非细小病毒载体应当表达免疫原性有效量的衣壳蛋白。

使用灭活的完整病毒疫苗、空衣壳疫苗或活重组非细小病毒载体的疫苗接种的一个替代方案是使用DNA疫苗接种。

这样的DNA疫苗接种是基于DNA片段向宿主动物中的引入，所述DNA片段携带在合适启动子控制下的编码衣壳蛋白的基因。一旦所述DNA被宿主的细胞摄入，编码衣壳蛋白的基因被转录，且转录物在宿主的细胞中翻译成衣壳蛋白。这接近地模仿细小病毒的天然感染过程。

合适的启动子是在哺乳动物细胞中有功能的启动子，如上面举例说明的。

携带在合适启动子控制下的编码衣壳蛋白的基因的DNA片段可以是例如质粒。该质粒可以呈圆形或直链形式。

猪的成功DNA疫苗接种的例子具体地是如在Gerdts等人⁽³⁰⁾, Journal ofGeneral Virology 78: 2139-2146 (1997)中描述的针对奥尔斯基病的成功疫苗接种。他们描述了这样的DNA疫苗：其中使用在人巨细胞病毒的主要立即早期启动子控制下的携带糖蛋白C的DNA片段。疫苗接种以50µg DNA的量以2周间隔进行4次。接种疫苗的动物形成血清抗体，所述血清抗体在免疫印迹中识别各种抗原且表现出中和活性。

Gorres等人⁽³¹⁾给出了猪的成功DNA疫苗接种的另一个例子。他们描述了针对大范围流行的和经典的猪H1N1流感的猪的成功DNA疫苗接种。他们接种DNA疫苗的1次激发疫苗接种和在激发以后3和6周的2次同源强化，所述DNA疫苗包含在功能性启动子控制下的流感H1N1的HA基因。

因此，该实施方案的再一种形式涉及用于与猪中的HBS相关的猪细小病毒斗争的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含DNA片段和药学上可接受的载体，所述DNA片段包含在功能性启动子控制下的编码根据本发明的衣壳蛋白的基因。

不言而喻，包含编码衣壳蛋白的基因的DNA片段应当表达免疫原性有效量的衣壳蛋白。

构成根据本发明的疫苗的“免疫原性有效量”的量取决于期望的作用和靶生物体，所述疫苗基于根据本发明的完整细小病毒、根据本发明的空衣壳、活重组载体或根据本发明的DNA疫苗。本文中使用的术语“免疫原性有效量”是指在猪中诱导免疫应答所必需的细小病毒、空衣壳、活重组载体或DNA疫苗的量，所述免疫应答达到它减轻由野生型HBS相关的猪细小病毒感染造成的病理学作用的程度，所述减轻是相对于未免疫的猪中野生型HBS相关的猪细小病毒感染造成的病理学作用。

确定治疗是否是“免疫学上有效的”完全属于技术人员的能力，例如，通过给接种疫苗的动物施用实验性攻击感染，接下来确定靶动物的疾病临床体征、血清学参数，或通过测量病原体的重新分离，随后将这些发现与在野外感染的猪中观察到的那些发现进行对比。

施用的病毒的量将取决于施用途径、佐剂的存在和施用时机。

将包含根据本发明的病毒的活疫苗的优选量表达为例如组织培养物感染剂量(TCID50)。例如，对于活病毒，可以有利地使用在10-10⁹ TCID50/动物剂量之间的剂量范围，取决于病毒的剩余毒力；优选地使用10²-10⁶ TCID50之间的范围。

可以应用许多施用方式，都是本领域已知的。优选地通过注射(肌肉内或经由腹膜内途径)或口服将根据本发明的疫苗施用给动物。

根据标准疫苗接种实践，可以优化施用方案。在所有情况下，通过真皮内注射(IDAL)的施用是一种优选的施用方式。

如果疫苗包含根据本发明的灭活病毒或空衣壳，也可以将剂量表达为要施用的病毒颗粒的数目。与活病毒颗粒的施用相比，所述剂量经常稍高，因为活病毒颗粒在被免疫系统除去之前在靶动物中复制达到某种程度。对于基于灭活病毒的疫苗，在约10⁴-10⁹个颗粒范围内的病毒颗粒的量经常是合适的，取决于使用的佐剂。

如果疫苗包含亚基，例如根据本发明的CP，也将以微克蛋白来表达剂量。对于基于亚基的疫苗，合适的剂量经常是在5-500微克蛋白之间的范围内，还取决于使用的佐剂。

如果疫苗包含含有编码衣壳蛋白的基因的DNA片段，将以微克DNA来表达剂量。对于基于亚基的疫苗，合适的剂量经常是在5-500微克DNA之间的范围内，具体地取决于使用的表达质粒的效率。在许多情况下，每只动物20-50微克质粒之间的量对于有效的疫苗接种而言是足够的。

根据本发明的疫苗可以呈满足以下条件的任何形式：适合于在养猪场的背景下施用，并且匹配期望的施用途径和预期效应。通过技术人员常用的方式制备根据本发明的疫苗。

为了容易施用疫苗，口服途径是优选的。

对于口服施用，优选地将疫苗与用于口服施用的合适载体混合，所述合适载体即纤维素、食物或可代谢的物质诸如α-纤维素或植物或动物起源的不同油。

在实践中，针对许多病原性病毒或微生物给猪接种疫苗。

因此，由于实践原因和经济原因，非常有吸引力的是，将根据本发明的猪疫苗与例如猪的病原性病毒或微生物的另外免疫原或编码所述病毒或微生物的免疫原的遗传信息组合。

因而，该实施方案的一种优选形式涉及根据本发明的疫苗，其中所述疫苗包含至少一种其它的猪病原性微生物或猪病原性病毒和/或所述猪病原性微生物或猪病原性病毒的至少一种其它的免疫原性组分和/或编码所述其它免疫原性组分的遗传物质。一种免疫原或免疫原性组分是在动物中诱导免疫应答的化合物。它可以是例如完整病毒或细菌、或所述病毒或细菌的蛋白或糖部分。

对猪而言病原性的最常见病原性病毒和微生物是猪痢疾短螺旋体（Brachyspira hyodysenteriae）、非洲猪瘟病毒、尼帕病毒、猪圆环病毒、猪Torque Teno病毒、假性狂犬病病毒、猪流感病毒、猪细小病毒、猪呼吸与生殖综合征病毒(PRRS)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、口蹄疫病毒、传染性胃肠炎病毒、轮状病毒、大肠杆菌（Escherichia coli）、猪丹毒丝菌（Erysipelo rhusiopathiae）、支气管炎博德特氏菌（Bordetella bronchiseptica）、猪霍乱沙门氏菌（Salmonella cholerasuis）、副猪嗜血菌（Haemophilus parasuis）、多杀巴斯德氏菌（Pasteurella multocida）、猪链球菌（Streptococcus suis）、猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae）和胸膜炎肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae）。

因此，本发明的一种更优选形式涉及根据本发明的疫苗，其中猪病原性的病毒或微生物选自猪痢疾短螺旋体、非洲猪瘟病毒、尼帕病毒、猪圆环病毒、猪Torque Teno病毒、假性狂犬病病毒、猪流感病毒、猪细小病毒、猪呼吸与生殖综合征病毒(PRRS)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、口蹄疫病毒、传染性胃肠炎病毒、轮状病毒、大肠杆菌（Escherichia coli）、猪丹毒丝菌（Erysipelo rhusiopathiae）、支气管炎博德特氏菌、猪霍乱沙门氏菌、副猪嗜血菌、多杀巴斯德氏菌、猪链球菌、猪肺炎支原体和胸膜炎肺炎放线杆菌。

还另一个实施方案涉及一种用于制备根据本发明的疫苗的方法，其中所述方法包括，将根据本发明的病毒和/或根据本发明的空衣壳和/或CP和/或编码根据本发明的CP的DNA片段和/或编码根据本发明的CP的活重组非细小病毒载体与药物上可接受的载体混合。

本发明的再另一个实施方案涉及用于疫苗中使用的根据本发明的病毒和/或根据本发明的空衣壳和/或CP和/或编码根据本发明的CP的DNA片段和/或编码根据本发明的CP的活重组非细小病毒载体。

如上所述，出血性肠综合征是一种多因素综合征。它是最终触发HBS的因素的综合（compilation）。这意味着，重要的是，在第一临床体征变得显现之前较长时间知晓HBS相关的猪细小病毒是否存在于某个猪群中。因而，为了有效地保护免于疾病，HBS相关的猪细小病毒的存在的快速且正确检测是重要的。

因此，本发明的另一个目的是，提供适合用于检测HBS相关的猪细小病毒的诊断工具。

这些工具部分地依赖于针对病毒的抗体的可用性。这样的抗体可以例如用在HBS相关的猪细小病毒的诊断测试中。

可以如下快速地和容易地得到针对根据本发明的HBS相关的猪细小病毒的抗体或包含抗体的抗血清：用根据本发明的病毒给例如猪、家禽或例如兔接种疫苗，随后在约4周以后，抽血，离心凝固的血液，并倾析血清。这样的方法是本领域众所周知的。

用于制备针对HBS相关的猪细小病毒产生的抗体的其它方法也是本领域众所周知的，所述抗体可以是多克隆抗体、单特异性抗体或单克隆抗体(或其衍生物)。如果多克隆抗体是期望的，用于生产和加工多克隆血清的技术是数十年来本领域众所周知的，参见例如Mayer和Walter ⁽³⁵⁾。

通过也是本领域长期已知的技术(参见例如Kohler和Milstein ⁽³⁶⁾)，通过免疫近亲交配的小鼠，可以制备可与根据本发明的病毒反应的单克隆抗体。

因而，本发明的另一个实施方案涉及可与根据本发明的病毒反应的抗体或抗血清。

诊断测试试剂盒（其基于检测根据本发明的病毒或该病毒的抗原材料，且因此适合用于检测HBS相关的猪细小病毒感染）可以例如包含标准的ELISA测试。在这样的实验的一个例子中，用针对该病毒的抗体包被ELISA板的孔的壁。与要测试的材料一起温育以后，将可与该病毒反应的标记的抗体加入孔中。如果要测试的材料确实包含根据本发明的新猪细小病毒，该病毒将结合包被至ELISA的孔的抗体。随后加入孔中的可与该病毒反应的标记的抗体又会结合该病毒，然后显色反应揭示该病毒的抗原材料的存在。

因此，本发明的还另一个实施方案涉及用于检测根据本发明的病毒或该病毒的抗原材料的诊断测试试剂盒，其包含可与根据本发明的病毒或可与其抗原材料反应的抗体。应当在广义上解释所述病毒的抗原材料。它可以是例如分解形式的病毒，或包含病毒外膜蛋白的病毒包膜材料。只要所述病毒的材料与针对该病毒产生的抗血清反应，那么所述材料被视作抗原材料。

诊断测试试剂盒（其基于检测血清中可与根据本发明的病毒或该病毒的抗原材料反应的抗体，且因此适合用于检测HBS相关的猪细小病毒感染）也可以例如包含标准的ELISA测试。在这样的测试中，可以例如用根据本发明的病毒或其抗原材料包被ELISA板的孔的壁。与要测试的材料（例如疑似被根据本发明的新猪细小病毒感染的动物的血清）一起温育以后，将可与根据本发明的病毒反应的标记的抗体加入孔中。如果抗-HBS相关的猪细小病毒抗体存在于测试的血清中，这些抗体将结合包被至ELISA的孔的病毒。结果，以后加入的可与该病毒反应的标记的抗体不会结合，且不会发现显色反应。显色反应的缺乏因而揭示可与根据本发明的病毒反应的抗体的存在。

因此，本发明的还另一个实施方案涉及用于检测抗体的诊断测试试剂盒，所述抗体可与根据本发明的病毒反应或可与所述病毒的抗原材料反应，所述病毒的抗原材料包括根据本发明的病毒或其抗原材料。

免疫测定的设计可以变化。例如，所述免疫测定可以基于竞争反应或直接反应。此外，方案可以使用固体支持物，或可以使用细胞材料。抗体-抗原复合物的检测可以包括使用标记的抗体；所述标记可以是，例如，酶、荧光分子、化学发光分子、放射性分子或染料分子。

除了上述的ELISA以外，用于检测可与样品中的根据本发明的病毒反应的抗体的合适方法包括免疫荧光测试(IFT)和蛋白质印迹分析。

用于诊断根据本发明的病毒的存在或不存在的一种可选的、但是快速的和容易的诊断测试是如上所述的PCR测试，其包含可与HBS相关的猪细小病毒的CP或NS1基因的特定区域反应的PCR引物集合。在该背景下，特定是指例如HBS相关的猪细小病毒的CP或NS1基因所特有的，即不存在于细小病毒科的其它成员中。

优选地，这样的测试将使用：与所述病毒的衣壳蛋白特异性地反应的引物集合(SEQ ID NO: 5-6)，或可与所述病毒的NS1特异性地反应的引物集合(SEQ ID NO: 7-8)。

不言而喻，可以使用比上述鉴定的引物更多的引物。本发明首次提供了HBS相关的猪细小病毒的CP和NS1基因的独特序列。这允许技术人员无需任何另外努力就会选择其它选择性的引物。通过本发明提供的HBS相关的猪细小病毒基因序列的CP或NS1基因与细小病毒科的其它非-HBS相关的猪细小病毒成员的已知CP或NS1基因的简单计算机分析，技术人员能够为诊断测试开发其它特定的PCR-引物，所述诊断测试用于检测HBS相关的猪细小病毒和/或将HBS相关的猪细小病毒与其它病毒性(猪)病原体区分开。

与HBS相关的猪细小病毒的CP或NS1基因特异性地反应的PCR-引物被理解为这样的引物：其仅与HBS相关的猪细小病毒的CP或NS1基因反应，且不与另一种(猪)病原性病毒或一组(猪)病原性病毒的CP或NS1基因反应。

因而，另一个实施方案涉及用于检测根据本发明的病毒的诊断测试试剂盒，其特征在于，所述测试试剂盒包含可与HBS相关的猪细小病毒的CP或NS1基因的某个区域反应的PCR引物集合。

该实施方案的一种优选形式涉及用于检测根据本发明的病毒的诊断测试试剂盒，其特征在于，所述测试包含在SEQIDNO:5-6中描绘的引物集合或在SEQIDNO:7-8中描绘的引物集合。

实施例

实施例1: 样品集合1的患病动物的分析.

样品集合1的描述

样品集合1:17只动物，16只雄性/1只雌性猪，年龄18-27周。7个农场。2013年7月31日接受。

临床征状：动物突然发生腹部膨胀，其中的一些在死亡之前尖叫。在死亡之前的数周中没有显著的征状。观察到第一征状和死亡之间的计时是2-6小时。征状发作以后，将动物通过电击致死进行安乐死并尸检。

器官征状：小肠异常。出血性征状，薄肠壁，肠中带血流体。除了膨大的、红色外观的、水肿的淋巴结以外，在其它器官中没有异常。参见图3。

将器官在-70℃冷冻。通过在3000 x g离心从凝固的血液制备血清并随后在-70℃贮存。

PCR方案：

使用从病毒序列衍生出的引物(表1)通过PCR筛选分离的DNA。使用具有58℃（对于Bowl_ORF1_774_F/1626R引物集合）和52℃（对于Bowl_Q_ORF2_FW/REV引物集合）的退火温度的标准方法执行PCR。为Q-PCR设计探针(表1)。使用具有50℃的退火温度的标准方法进行Q-PCR。使用Bio-Rad CFX Manager 2.0分析Q-PCR数据。

表1: 引物序列Bowl

引物/探针:	序列(5’-3’):
		Bowl_ORF1_774_F	TGTTGAGTGTGGTGGATTGG
Bowl_ORF1_1626_R	AAGGAAGCTGGACCGAGAG
		Bowl_Q_ORF2_FW	CTACATCTGCGCCTGAC
Bowl_Q_ORF2_REV	GTGGTGAGAAGGCAAGAC
		Bowl_Q_ORF2_PROBE	6FAM-CACGAGCTAGAGCGTGCTAAACAG-BHQ1

PCR分析结果：

PCR分析结果描绘在表2中。总之，发现76%的样品为阳性的。

表2: 集合1的样品的结果分析. (+): 新细小病毒阳性的. (-)新细小病毒阴性的。

实施例2: 样品集合2的患病动物的分析.

样品集合2的描述

16只动物，13只雄性/3只雌性猪，年龄12-26周。7个农场，相对于样品集合1有4个另外的农场(在样品集合1 + 2中总计11个农场)。2013年8月22日接受。

器官征状：小肠异常。出血性征状，薄肠壁，肠中带血流体。除了膨大的、红色外观的、水肿的淋巴结以外，在其它器官中没有异常。参见图3。没有测试所有的淋巴结和血液样品。

PCR方案：

PCR分析结果：

PCR分析结果描绘在表3中。总之，发现25%的样品为阳性的。没有分析血液。仅分析了2个淋巴结。

表3: 集合2的样品的结果分析. (+): 新细小病毒阳性的. (-)新细小病毒阴性的。

实施例3：新细小病毒在猪中的复制

动物材料的制备：

在分析之前将样品集合1和2的冷冻器官材料和粪便在-70℃保存。在冰上进行所有操作。将器官解冻并随后在组织培养基中匀浆化(10%w/v)。将匀浆物冻融一次(-70℃)。随后，将匀浆物离心并在5µm、0.45µm和0.22µm过滤器上过滤以除去残余的组织材料。将过滤的匀浆物在接种之前在-70℃保存。

将接种物(A或B)作为4 x 2mL肌肉内剂量(4个不同器官，左颈、右颈、左腿、右腿)和20 mL的口服剂量(10个粪便匀浆物+ 4 x 2.5 ml不同器官的匀浆物)进行施用。在室温施用接种物。

接种物A：样品集合2的动物10 (参见实施例2)

粪便、淋巴结、肺、脾、肠

接种物B：样品集合1的动物2 (参见实施例1)

粪便、淋巴结、肺、肾、肝。

动物

养殖13只猪(5小公猪/8小母猪/长白猪/高健康状况/SPF/在接种时12-14周龄)，并在荷兰Stevensbeek的MSD农场中饲养，并根据管理指南圈养。如在实施例1中所述，在接种之前针对新细小病毒在血清、粪便、鼻拭子和眼拭子中的存在来筛选动物。将一只雄性动物处死作为对照动物(未被感染)。将其它12只猪分成3个单独组圈养。

治疗

组1:5只动物

3只动物接受接种物A，2只充当接触警哨

组2:4只动物

3只动物接受接种物B，2只充当接触警哨

组3: 3只动物

3只动物接受接种物B。

取样和尸检

组1、2：

在接种后第-3、0、7、14、21、28天的血液样品、直肠/鼻/眼拭子(如果没有被处死)

在接种后第3、10、17、24天的直肠/鼻/眼拭子(如果没有被处死)

组3：

在接种后第-4、0、3、6天的血液样品、直肠/鼻/眼拭子(如果没有被处死)

基于PCR结果，将动物按计划尸检：

组1：

接种：接种后第10天；接种后第25天；接种后第31天

警哨：接种后第18天；接种后第31天

组2：

接种：接种后第14天；接种后第29天(2只动物)

警哨：接种后第22天

组3：

接种：接种后第4天(1只动物)；接种后第7天(2只动物)。

结果

PCR

样品集合2的动物10用于接种物：

所有器官都被测试为新细小病毒阳性的：粪便、淋巴结、肺、脾、肠、肾、肝

样品集合1的动物2用于接种物：

所有器官都被测试为新细小病毒阳性的：粪便、淋巴结、肺、肾、肝。

动物实验

在拭子/血清上的PCR结果：表4A-B-C

采集器官样品用于组织学、用于PCR分析和用于病毒分离。将用于病毒分离的器官在-70℃保存。使用PCR分析肝淋巴结(10%匀浆物)。

组1:所有接种的动物血清在第7天+ (阳性的)

警哨血清在第7天-(阴性的)

拭子：参见表4A。

组2:所有接种的动物血清在第7天+

警哨血清在第7天-

拭子：参见表4B。

组3: 所有接种的动物血清在第4天+

拭子：参见表4C。

PCR结果

。

淋巴结的结果

将在尸检时收集的所有13只动物的肝淋巴结在10%(w/v)培养基中匀浆化。从匀浆物分离DNA，并通过PCR来分析病毒的存在。对照淋巴结是新细小病毒阴性的，所有12只接种的猪或警哨猪是病毒阳性的。

结论：

基于上面呈现的数据，可以得出结论，新细小病毒在猪中复制。传播途径最可能是通过直接接触的口/鼻，但是不可以排除口/粪便传播和空气传播。但是粪便排泄物受到限制。

在多个器官中发现了病毒。

基于实施例1-3中的合并结果，预见到，在动物的子集中，在所有被感染的动物的约1-2%中，新细小病毒感染在所述病毒出现在血液中(病毒血症)的时间附近造成疾病。脱落在粪便中是极小的，但是病毒在感染以后超过30天保持存在于血液中。鼻和眼拭子也在感染以后超过30天仍然是PCR阳性的。

在实施例3所述的受感染的猪中，没有观察到出血性肠综合征，但是这基于以下内容会预见到：所述疾病的低发生率（在一般群体中1-2%）和在实施例3中使用的动物是相对年轻且处于优良状况的事实。除了在商业农场场合中的猪以外，它们不具有患病倾向性的风险因素。

表4A：组1的结果：3只被感染的动物和2只警哨动物，接种物A

根据本发明的新猪细小病毒被称作“BOWL”。

R：直肠拭子

N：鼻拭子

E：眼拭子

S：血清

n/a: 未分析(未取样)

表4B: 组2的结果：3只被感染的动物和1只警哨动物，接种物B

根据本发明的新猪细小病毒被称作“BOWL”。

R：直肠拭子

N：鼻拭子

E：眼拭子

S：血清

n/a: 未分析(未取样)

表4C：组3的结果：3只被感染的动物，接种物B

根据本发明的新猪细小病毒被称作“BOWL”。

R：直肠拭子

N：鼻拭子

E：眼拭子

S：血清

n/a: 未分析(未取样)。

附图说明

图1：指示根据本发明的新猪细小病毒的NS1与其它细小病毒的NS1的亲缘关系的系统树。根据本发明的新猪细小病毒被称作“BOWL”。

图2：指示根据本发明的新猪细小病毒的衣壳蛋白与其它细小病毒的衣壳蛋白的亲缘关系的系统树。根据本发明的新猪细小病毒被称作“BOWL”。

图3：如在样品集合1和2中所见的出血性肠综合征的实施例。

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Claims

1.一种分离的病毒，其为细小病毒科的细小病毒亚科的一个成员，所述病毒特征在于，

a)所述病毒是出血性肠综合征(HBS)相关病毒，且

2.根据权利要求1所述的分离的病毒，其特征在于，所述CP基因的核苷酸序列与SEQ IDNO: 1所示的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平且所述NS1基因的核苷酸序列与SEQ IDNO: 3所示的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平。

3.一种分离的病毒，其为细小病毒科的细小病毒亚科的一个成员，所述病毒特征在于，

a)所述病毒是HBS相关的猪细小病毒，且

b)所述病毒基因组DNA在PCR反应中与SEQ ID NO: 5和6所示的引物集合反应以产生140±10碱基对的PCR产物或在PCR反应中与SEQ ID NO: 7和8所示的引物集合反应以产生853±10碱基对的PCR产物。

4.根据权利要求3所述的分离的病毒，其特征在于，所述病毒基因组DNA在PCR反应中与SEQ ID NO: 5和6所示的引物集合反应以产生140±10碱基对的PCR产物且在PCR反应中与SEQ ID NO: 7和8所示的引物集合反应以产生853±10碱基对的PCR产物。

5.根据权利要求1-4中的任一项所述的分离的病毒，其特征在于，所述CP基因的核苷酸序列与SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平且所述NS1基因的核苷酸序列与SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平，并且所述病毒基因组DNA在PCR反应中与SEQ ID NO: 5和6所示的引物集合反应以产生140±10碱基对的PCR产物且在PCR反应中与SEQ ID NO: 7和8所示的引物集合反应以产生853±10碱基对的PCR产物。

6.一种包含病毒的细胞培养物，其特征在于，所述培养物包含根据权利要求1-5中的任一项所述的病毒。

7.一种包含编码CP的基因的DNA片段，其特征在于，所述基因的核苷酸序列与SEQ IDNO: 1所示的CP基因的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平。

8.一种CP，其特征在于，所述CP由根据权利要求7所述的DNA片段编码。

9.一种包含编码NS1的基因的DNA片段，其特征在于，所述基因的核苷酸序列与SEQ IDNO: 3所示的NS1基因的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平。

10.一种NS1，其特征在于，所述NS1由根据权利要求9所述的DNA片段编码。

11.根据权利要求7所述的DNA片段，其特征在于，所述CP基因是在功能性异源启动子的控制下。

12.一种用于与猪中HBS相关的猪细小病毒斗争的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含免疫原性有效量的根据权利要求1-5中的任一项所述的病毒和药学上可接受的载体。

13.根据权利要求12所述的疫苗，其特征在于，所述病毒呈活减毒形式。

14.根据权利要求12所述的疫苗，其特征在于，所述病毒呈灭活形式。

15.一种用于与猪中HBS相关的猪细小病毒斗争的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含免疫原性有效量的根据权利要求8所述的衣壳蛋白和药学上可接受的载体。

16.一种用于与猪中HBS相关的猪细小病毒斗争的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含含有根据权利要求11所述的DNA片段的活重组非细小病毒载体和药学上可接受的载体。

17.一种用于与猪中HBS相关的猪细小病毒斗争的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含根据权利要求11所述的DNA片段和药学上可接受的载体。

18.根据权利要求12-17中的任一项所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含至少一种其它的猪病原性微生物或猪病原性病毒和/或所述猪病原性微生物或猪病原性病毒的至少一种其它的免疫原性组分和/或编码所述其它免疫原性组分的遗传物质。

19.根据权利要求18所述的疫苗，其特征在于，所述猪病原性病毒或猪病原性微生物选自猪痢疾短螺旋体（Brachyspira hyodysenteriae）、非洲猪瘟病毒、尼帕病毒、猪圆环病毒、猪Torque Teno病毒、假性狂犬病病毒、猪流感病毒、猪细小病毒、猪呼吸与生殖综合征病毒(PRRS)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、口蹄疫病毒、传染性胃肠炎病毒、轮状病毒、大肠杆菌（Escherichia coli）、猪丹毒丝菌（Erysipelo rhusiopathiae）、支气管炎博德特氏菌（Bordetella bronchiseptica）、猪霍乱沙门氏菌（Salmonella cholerasuis）、副猪嗜血菌（Haemophilus parasuis）、多杀巴斯德氏菌（Pasteurella multocida）、猪链球菌（Streptococcus suis）、猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae）和胸膜炎肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae）。

20.根据权利要求12-19中的任一项所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含佐剂。

21.与根据权利要求1-5中的任一项所述的病毒反应的抗体或抗血清。

22.根据权利要求1-5中的任一项所述的病毒和/或根据权利要求8所述的衣壳蛋白和/或根据权利要求11所述的DNA片段和/或在权利要求16中描述的编码CP的活重组非细小病毒载体，其用于在与猪中HBS相关的猪细小病毒斗争的疫苗中使用。

23.一种用于制备根据权利要求12-20中的任一项所述的疫苗的方法，其特征在于，所述方法包括将根据权利要求1-5中的任一项所述的病毒和/或根据权利要求8所述的衣壳蛋白和/或根据权利要求11所述的DNA片段和/或在权利要求16中描述的编码CP的活重组非细小病毒载体与药学上可接受的载体混合。

24.一种诊断测试试剂盒，其用于检测与根据权利要求1-5中的任一项所述的病毒或与其抗原材料反应的抗体，其特征在于，所述测试试剂盒包含根据权利要求1-5中的任一项所述的病毒或其抗原材料。

25.一种诊断测试试剂盒，其用于检测根据权利要求1-5中的任一项所述的病毒或其抗原材料，其特征在于，所述测试试剂盒包含与根据权利要求1-5中的任一项所述的病毒或与其抗原材料反应的抗体。

26.一种诊断测试试剂盒，其用于检测根据权利要求1-5中的任一项所述的病毒，其特征在于，所述测试试剂盒包含与HBS相关的猪细小病毒的衣壳蛋白基因或NS1基因的某个区域特异性地反应的PCR引物集合。