CN106459124B - 表柔红霉素的纯化 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于纯化表柔红霉素、特别是去除诸如在表柔红霉素的生物技术生产中作为副产物形成的杂质表费多霉素的方法。

Description

表柔红霉素的纯化

本发明涉及用于纯化表柔红霉素(epidaunorubicin)，特别是分离表柔红霉素和表费多霉素(epi-feudomycin)的方法，所述表费多霉素在表柔红霉素的生物技术生产中形成为副产物。

表柔红霉素是柔红霉素的4'-差向异构体，它属于糖苷类并且表示蒽环类的抗生素。它主要用作表柔比星的前体，表柔比星在乳腺癌、非霍奇金淋巴瘤、肉瘤、胃癌和其他实体类型的癌症的化疗中用作细胞抑制剂。表柔红霉素可以合成、半合成和生物技术制备。在生物技术生产中，使用各种波赛链霉菌 (Streptomyces peucetius) 菌株。表柔红霉素可以由以下通式（I）表示：

。

在表柔红霉素的微生物合成中，出现的问题是，除了所需产物之外，尤其形成作为副产物的表费多霉素，表费多霉素由于其结构相似性而非常难以与表柔红霉素分离。该副产物的存在对由表柔红霉素在随后的方法步骤中形成的表柔比星的产率和纯度是极其不利的。通常，表柔红霉素从发酵液中的分离和纯化通过液-液提取、层析法和结晶而进行。

然而，由于表费多霉素的存在，这需要复杂的工艺和导致相对高的表柔红霉素的损失。

EP 1 990 405 A1描述了适合于表柔红霉素的生物技术生产的不同微生物菌株。表柔红霉素从发酵液中的分离通过在碱性pH值下用氯仿提取进行。然后将所得的粗制混合物进一步用氯仿作为流动相进行层析纯化。在最后一步中，表柔红霉素通过加入丁醇和调整酸性pH值而结晶。

EP 2 301 943 B1描述了从醇/氯仿的混合物中结晶表柔红霉素盐酸盐，其中在60℃的温度下加入醇。

EP 0 030 295 B1公开了表柔红霉素的合成制备。

WO 2010/028667描述了在吸附树脂的帮助下从发酵液中提取13-DHED、表柔红霉素和表费多霉素。

EP 2 042 608 B1描述了从含有13-DHED、表柔红霉素和费多霉素的发酵液中提取糖苷配基。通过氯仿在微碱性pH值下从水相中提取糖苷。通过饱和NaHCO₃溶液使pH值保持稳定。

从发酵液中纯化表柔红霉素的常规方法需要高的技术和财务花费。表柔红霉素和特别是表费多霉素由于这两种化合物的结构相似性而特别难以分离，从而使得可接受纯度的表柔红霉素仅仅在相当高的产率损失的情况下才能实现。由于表费多霉素的分离困难，该杂质在从表柔红霉素衍生的产物中也会被发现，这对于转化为表柔比星是尤其不利的。另一方面，高纯度和高产率对于后续的从表柔红霉素至表柔比星的转化尤其重要。

因此，需要一种可以有效地将副产物表费多霉素与所希望的产物表柔红霉素分离的方法，且该方法不会由于所述分离和纯化步骤而显著降低表柔红霉素的产率。

因此，本发明的目的在于，提供一种在微生物生产之后可以有效地将表柔红霉素和表费多霉素分离的方法，其中纯化的表柔红霉素的产率比现有技术中已知的常规方法所获得的更高。

该目的通过独立权利要求的主题而实现。从属权利要求描述了优选的实施方案。

本发明的目的是用于纯化表柔红霉素的方法，其包括下列步骤：

a) 提供包含表柔红霉素、表费多霉素和至少一种含卤素的溶剂的混合物；

b) 将该混合物的pH值调整到5.0至7.5的范围；

c) 将步骤b) 的混合物加热到超过25℃；和

d) 纯化所述表柔红霉素，

其特征在于，

基于所述混合物的总体积，在步骤a) 和b) 的混合物中的具有1至5个碳原子的醇的含量不超过5体积%。

不受理论的束缚，可以认为在根据本发明的方法的条件下，表费多霉素被选择性地分解并且所获得的降解产物更容易与所希望的表柔红霉素分离。可以认为，根据本发明的方法也导致了反应混合物的转化并且因此导致表费多霉素的减少。质谱分析表明，糖发生裂解(split off)并且剩余的环被芳构化（aromatized）。进一步认为，这是表费多霉素的特异性分解(disintegration)，因为不能检测到表柔红霉素的降解产物。在这方面，在根据本发明的方法中的分解不同于也可以应用到表柔红霉素的传统的蒽环类酸性水解。

根据本发明的方法开始于作为原料的表柔红霉素，将其在几个步骤中纯化。表柔红霉素的来源和生产方法不受任何限制。例如，可以使用含有一部分表费多霉素的商购的表柔红霉素，这样的表柔红霉素不适于其他应用。

在根据本发明的纯化方法的一个优选的实施方案中，步骤a) 的混合物中的表柔红霉素借助生物技术方法例如合适的微生物而获得。优选地，表柔红霉素与表费多霉素一起存在于发酵液中。合适的微生物包括例如放线菌纲(actinobacteria)的细菌，特别是下列的菌株：链霉菌属物种(Streptomyces sp.)，例如波赛链霉菌、S. coeruloruidus、灰色链霉菌(S. griseus)、链霉菌属C5种(Streptomyces sp. C5)、波赛链霉菌青灰变种(S. peicetius var. caesius)和S. bifurcus。也可以使用修饰的菌株或突变体。

优选地，根据本发明的方法的步骤a) 的混合物中的表柔红霉素和表费多霉素借助从发酵液中的提取而获得。该提取可以包括几个步骤，例如借助合适的聚合树脂的提取并然后液体提取（liquid extraction）。混合物a) 优选从发酵液的液体提取的浓缩物和任选通过添加含卤素的溶剂而获得。

在一个特别优选的实施方案中，步骤a) 中的起始混合物具有碱性的pH值，特别优选范围为8至10.5的pH值。

在混合物a) 中，表柔红霉素在至少一种含卤素的溶剂存在的情况下以溶解的形式存在。在一个优选的实施方案中，所述含卤素的溶剂选自氯化的溶剂，特别是氯仿(CHCl₃)。

基于所述混合物的总体积，在根据本发明的方法的步骤a) 和b) 的混合物中的具有1至5个碳原子的醇的含量为最多5体积%。

已令人惊奇地发现，具有1至5个碳原子的醇的更高含量导致降低的反应速率，而降低的反应速率进而负面地影响表柔红霉素的纯度。

因此，优选这样的本发明的实施方案，其中在步骤a) 和b) 的混合物中的具有1至5个碳原子的醇的含量为最多4体积%，特别优选0.1至4体积%，特别是1.0至3体积%，其总是基于所述混合物的总体积。在本发明范围中的醇含量确保了表柔红霉素保持完全溶解和所述反应在令人满意的时间范围内发生。

还优选这样的本发明的实施方案，其中具有1至5个碳原子的醇选自甲醇、丁醇、丙醇、乙醇、异丙醇、戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2,2-二甲基丙醇和异丁醇。在一个特别优选的实施方案中，具有1至5个碳原子的醇是甲醇。

此外，优选这样的实施方案，其中基于所述混合物的总体积，在步骤a) 的混合物中的水含量为最多1体积%。

另外令人惊奇地发现，如果在步骤a) 的混合物中的表柔红霉素的浓度不多于13g/L，则借助本发明的方法获得的表柔红霉素具有特别高的纯度。

因此，优选这样的实施方案，其中在步骤a) 的混合物中的表柔红霉素的浓度不多于13 g/L，优选6至13 g/L，特别是8至13 g/L。已经发现，如果在步骤a) 的混合物中的表柔红霉素的浓度在该范围中，则可以阻止不希望的副反应和反应的中断。例如，可以减少表柔红霉素沉淀的风险(danger)。表柔红霉素的沉淀会导致不希望的产率损失，因为沉淀的表柔红霉素会被从纯化过程中除去。此外观察到，待分离的杂质表费多霉素与表柔红霉素一起沉淀，因此沉淀不是一个合适的纯化方法。

根据本发明的用于表柔红霉素纯化的方法的步骤b) ，将所述混合物的pH值调整到5.0至7.5的范围。令人惊奇地发现，如果pH值高于本发明的范围，则表柔红霉素分解。如果pH值过于酸性，即调整到低于5的值，则发生不希望的表柔红霉素的部分质子化，这会导致表柔红霉素与费多霉素一起沉淀，从而被从后续的加工流程中除去。

优选地，将所述混合物的pH值借助这样的酸调整到5.0至7.5的范围，所述酸展现出合适的pKa值和在含卤素的溶剂（特别是氯仿）中的好的溶解性。在根据本发明方法的一个优选的实施方案中，将步骤b) 中的混合物的pH值借助一种或多种酸，优选有机酸，和特别优选乙酸来调整。

在本发明方法的另一个优选的实施方案中，基于所述混合物的总体积，酸的量为0.05至0.3体积%，优选0.1至0.25体积%。在添加酸之后，可以观察到反应速率的明显增加。另一方面，如果酸含量基于所述混合物的总体积多于0.3体积%，则会出现溶解性问题，该问题会导致表柔红霉素与表费多霉素从所述溶液中一起沉淀，从而使它们从后续的加工流程中被除去。

在一个特别优选的实施方案中，在添加之前，将用于调整所述混合物中的pH值的酸溶解在具有1至5个碳原子的醇中，优选甲醇。令人惊奇地发现，这会防止有关表柔红霉素的溶解性的问题并且避免表柔红霉素的沉淀。在所述混合物中的具有1至5个碳原子的醇（特别是甲醇）的总含量不应超过基于所述混合物的总体积的5体积%的本发明值。

根据本发明的用于纯化表柔红霉素的方法的步骤c) ，在将pH值调整到本发明的范围之后，将步骤b) 的混合物加热到25℃以上。令人惊奇地发现，如果将所述混合物加热到25℃以上的温度，则可以加快所述纯化。优选地，将所述混合物加热到对应于所述含卤素的溶剂的沸点的温度。50℃以上的温度表现出特别合适，因为在该温度下可以观察到反应速率的显著增加。

因此，优选这样的实施方案，其中将步骤c) 的混合物加热到范围为55至75℃，优选60至65℃的温度。

在一个优选的实施方案中，将本发明方法的混合物在高于25℃的温度，优选高于35℃的温度，特别是60-65℃范围内的温度下搅拌一定的时间周期。该时间周期应当是这样的长度，所述长度可以以有效且及时的方式实施本发明的方法并且同时得到令人满意的表柔红霉素的纯度。

因此，优选这样的本发明方法的实施方案，其中将步骤c) 的混合物搅拌最多48小时的时间周期，优选10至30小时和特别优选15至25小时的时间周期。从程序的角度发现多于48小时的反应时间是不利的，而在少于10小时的反应时间之后发现所述混合物的表费多霉素含量的降低是不充分的。特别优选这样的实施方案，其中将步骤c) 中的混合物搅拌直至表费多霉素的总含量低于1重量%（基于表柔红霉素的总重量），只要不超过48小时的反应时间。在所述混合物中的表费多霉素的量例如可以通过标准化的层析法（如RP-18 HPLC）确定。

如在根据本发明方法的步骤d) 中所描述的，纯化表柔红霉素。该纯化优选当表费多霉素的总含量降至低于1重量%的阈值（基于表柔红霉素的重量，借助分析层析法确定）时实施。进一步优选地，在步骤d) 中的表柔红霉素的纯化借助水剂法提取实施。

在步骤d) 中的表柔红霉素的纯化的过程中，发现如果在步骤d) 中在碱性介质中实施表柔红霉素的水剂法提取则是有利的。因此，在一个优选的实施方案中，在本发明方法的步骤d) 中的表柔红霉素的水剂法提取在8至10，优选8.5至9.5的pH值下实施。该pH值例如可以借助氨调整，其中发现如果所述氨含有大约0.5至1.5重量% NaCl，例如大约1重量%NaCl则是特别有利的，从而阻止了表柔红霉素从有机相部分转移到水相。需要用于调整所需pH值的氨的量可以变化并且取决于添加的酸的量。例如，所需的氨量可以是酸量的2.5倍（以克计）。

高纯度的表柔红霉素对于后续的表柔红霉素向表柔比星的转化是关键的，因为这是增加产率的唯一途径。因此，在根据本发明方法的一个优选的实施方案中，步骤d) 之后为另一个步骤e)，其中步骤e) 是表柔红霉素的层析纯化。层析纯化优选使用硅胶 (SiO₂)作为固定相实施，同时优选使用甲醇和氯仿的混合物作为流动相。这样的优点在于，不必改变溶剂，这进而有助于提高根据本发明的方法的效率。

令人惊奇地发现，相比于使用传统方法纯化的表柔红霉素，使用根据本发明的方法纯化的表柔红霉素在层析柱上的加载量可以增加，而不会导致分离性能的退化。这表明根据本发明的方法的又另一个优点，因为柱上的更高加载量与相同分离性能的组合实现更有效率和更经济的加工周期。令人惊奇地发现，使用根据本发明的方法纯化的表柔红霉素在层析柱上的加载量可以增加到最多7重量%（基于柱基质的干重），而在传统方法中在柱上的最大加载量为大约4重量%。

在根据本发明的方法的另一个优选的实施方案中，步骤e) 的表柔红霉素经受进一步的纯化加工，例如结晶。结晶例如可以以盐酸盐的形式实施。在这方面，已经发现，根据本发明的方法纯化的表柔红霉素的质量在仅一次结晶步骤之后就非常高，从而不需要在现有技术的传统分离加工中通常实施的第二次结晶步骤。

在根据本发明的方法的一个特别优选的实施方案中，所述方法包括下列步骤：

a) 提供包含表柔红霉素、表费多霉素和至少一种含卤素的溶剂（优选氯仿）的混合物，其中费多霉素的含量高于1重量%（基于表柔红霉素和表费多霉素的总重量）；

b) 将该混合物的pH值调整至5.0至7.5的范围；

c) 将步骤b) 的混合物加热至范围为55至75℃，优选60至65℃的温度；

d) 纯化表柔红霉素，优选借助水剂法提取；

e) 层析纯化步骤d) 的表柔红霉素，

其中基于所述混合物的总体积，在步骤a) 和b) 的混合物中的具有1至5个碳原子的醇的含量为0.1至4体积%，优选1.0至3.0体积%，并且基于所述混合物的总体积，在步骤a)的混合物中的水含量为最多1体积%。

在另一个优选的实施方案中，根据本发明的方法包括下列步骤：

a) 提供包含表柔红霉素、表费多霉素和至少一种含卤素的溶剂（优选氯仿）的混合物，其中费多霉素的含量高于1重量%（基于表柔红霉素和表费多霉素的总重量），并且表柔红霉素的浓度范围为6至13 g/L；

b) 将该混合物的pH值调整至5.0至7.5的范围；

c) 将步骤b) 的混合物加热至范围为55至75℃，优选60至65℃的温度；

d) 借助水剂法提取纯化表柔红霉素，其中提取混合物的pH值范围为8至10，优选8.5至9.5；

e) 层析纯化步骤d) 的表柔红霉素，

其中基于所述混合物的总体积，在步骤a) 和b) 的混合物中的具有1至5个碳原子的醇的含量为0.1至4体积%，优选1.0至3.0体积%，并且基于所述混合物的总体积，在步骤a)的混合物中的水含量为最多1体积%。

在一个优选的实施方案中，各个方法步骤a)至e) 不可互换。特别优选地，以给定的顺序进行所述方法。

在下面的实施例中将更具体地解释本发明；然而，它们不应以任何方式限制本发明的概念。

实施例：

实施例1：

在包含氯仿 (CHCl₃)、表柔红霉素和表费多霉素的混合物中的表柔红霉素的浓度借助蒸馏设定为8至12 g/L的含量。相应的起始混合物可以例如通过从发酵液中分离氯仿相而获得。将194 g 乙酸 (0.15体积%) 和2.4 kg 甲醇 (2体积%) 加入到浓缩的溶液(128 L) 中，其中以体积%给出的量相对于所述溶液的总体积，并且因此将pH值调整到5.0至7.5的范围。将获得的溶液加热到60至65℃且在该温度范围下搅拌17小时。然后，将该混合物冷却到25℃ 和杂质表费多霉素的含量（基于表柔红霉素的重量）借助分析型HPLC(RP18-HPLC) 和测量的峰的积分而确定。结果显示在表1中。

实施例 2 用作对比例并且显示了传统的表柔红霉素的纯化的结果，其中没有将混合物加热到60至65℃ 的温度和没有添加乙酸。对于表费多霉素给出的百分比基于表柔红霉素的量。

表1 :

实施例	表费多霉素 (%)
		1	0.6
2 (对比例)	3.3

从表1可以看出，通过使用本发明的方法可以获得更高纯度的表柔红霉素，这反映在较低含量的表费多霉素。

在另一个步骤中，将根据本发明的方法纯化的表柔红霉素借助在8至9的pH值下的水剂法提取和后续的层析纯化而进一步处理。测试在柱上的不同加载量。将在层析纯化的过程中获得的级分合并，并且确定表柔红霉素的纯度和表费多霉素的含量。结果显示在表2中。在柱上的加载量是指表柔红霉素与柱基质的干重的重量比乘以100%。

表2:

实施例	加载量 (%)	纯度 (%)	产率 (%)	表费多霉素的含量 (%)
					3	5.1	91	87	0.3
4	5.8	86	97	0.2
					5	7.2	90	97	0.2

从表2中可以看出，甚至在柱上高加载量的情况下，分离性能不仅保持不变，甚至还会提高。

表3 展示了实验的结果，其中改变用于调整pH值的乙酸的量。从表3中可以看出，当酸的量增加时，表费多霉素的含量减小。使用氯仿作为溶剂。所述混合物各含有1体积%甲醇并且在确定表费多霉素的量之前在60℃下搅拌25小时。在起始混合物中的表费多霉素的量为8.7%。实施例 6 是对比例，其中没有向该混合物中添加乙酸。

表3:

实施例	乙酸 (体积%)	表费多霉素 (%)
			6	0	7.7
7	0.1	3.3
			8	0.2	1.9
9	0.3	1.3
			10	0.5	0.8

如表3中所示，在60℃的温度和25小时的反应时间下，即使向包含氯仿、表柔红霉素、表费多霉素和1体积% 甲醇的混合物添加0.1体积% 的乙酸也会导致杂质表费多霉素的显著减少。因此，可以提高所获得的表柔红霉素的纯度，而不会导致由于纯化方法复杂所致的产率损失。

从上述的实施例可以看出，相比于传统的纯化方法，根据本发明的方法不仅产生了显著更高纯度的表柔红霉素，而且还实现了纯化加工的效率和经济性的提高，这是由于更高的柱加载量与至少相同的分离性能和减少必需的加工步骤（例如可以省略第二次结晶步骤）的组合。

Claims (19)

1.用于纯化表柔红霉素的方法，其包括下列步骤：

a) 提供包含表柔红霉素、表费多霉素和至少一种含卤素的溶剂的混合物；

b) 借助一种或多种酸将所述混合物的pH值调整到5.0至7.5的范围；

c) 将步骤b) 的混合物加热到范围为55至75℃的温度；和

d) 纯化所述表柔红霉素，

其特征在于，

基于所述混合物的总体积，在步骤a) 和b) 的混合物中具有1至5个碳原子的醇的含量为最多5体积%。

2.根据权利要求1的方法，

其特征在于，

基于所述混合物的总体积，在步骤a) 的混合物中的水的含量为最多1体积%。

3.根据权利要求1或2的方法，

其特征在于，

所述具有1至5个碳原子的醇选自甲醇、丁醇、异丙醇、乙醇、丙醇、戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2,2-二甲基丙醇和异丁醇。

4.根据权利要求1或2的方法，

其特征在于，

在步骤a) 中的表柔红霉素的浓度为6至13 g/L。

5.根据权利要求1或2的方法，

其特征在于，

在步骤a) 中的表柔红霉素的浓度为8至13 g/L。

6.根据权利要求1或2的方法，

其特征在于，

所述含卤素的溶剂选自氯化的溶剂。

7.根据权利要求1或2的方法，

其特征在于，

所述含卤素的溶剂是氯仿 (CHCl₃)。

8.根据权利要求1或2的方法，

其特征在于，

在步骤b) 中借助有机酸来调整pH值。

9.根据权利要求1或2的方法，

其特征在于，

在步骤b) 中借助乙酸来调整pH值。

10.根据权利要求1或2的方法，

其特征在于，

基于所述混合物的总体积，所述酸的量为0.1至0.3体积%。

11.根据权利要求1或2的方法，

其特征在于，

基于所述混合物的总体积，所述酸的量为0.15至0.25体积%。

12.根据权利要求1或2的方法，

其特征在于，

在步骤c) 中，将所述混合物加热到范围为60至65℃的温度。

13.根据权利要求1或2的方法，

其特征在于，

在步骤c) 中，将所述混合物搅拌最多48小时的时间。

14.根据权利要求1或2的方法，

其特征在于，

在步骤c) 中，将所述混合物搅拌10至30小时的时间。

15.根据权利要求1或2的方法，

其特征在于，

在步骤c) 中，将所述混合物搅拌15至25小时的时间。

16.根据权利要求1或2的方法，

其特征在于，

在步骤d) 中的表柔红霉素的纯化借助水剂法提取进行。

17.根据权利要求16的方法，

其特征在于，

在步骤d) 中的表柔红霉素的水剂法提取在8至10的pH值下进行。

18.根据权利要求16的方法，

其特征在于，

在步骤d) 中的表柔红霉素的水剂法提取在8.5至9.5的pH值下进行。

19.根据权利要求1或2的方法，

其特征在于，

在步骤d) 之后，加入另一个步骤e) ，其中所述步骤e) 是层析纯化表柔红霉素。