CN106434439A

CN106434439A - 一株产酶溶杆菌1‑t‑1‑4及其应用

Info

Publication number: CN106434439A
Application number: CN201610837534.9A
Authority: CN
Inventors: 魏兰芳; 姬广海; 付丽娜; 张小芳; 杨俊�
Original assignee: Yunnan Agricultural University
Current assignee: Yunnan Agricultural University
Priority date: 2016-09-21
Filing date: 2016-09-21
Publication date: 2017-02-22

Abstract

本发明具体涉及一株产酶溶杆菌1‑T‑1‑4及其应用。该产酶溶杆菌1‑T‑1‑4可制成水剂或可湿性粉剂，作用于三七或魔芋上，用于防治三七根腐病和魔芋软腐病等病害。

Description

一株产酶溶杆菌1-T-1-4及其应用

技术领域

本发明涉及生防菌剂技术领域，具体涉及一株产酶溶杆菌1-T-1-4及其应用。

背景技术

三七[Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen]属五加科人参属植物，是我国特有的名贵中药材，具有散瘀止血，消肿定痛、降脂和保护肝脏等功效。2014年云南省三七种植面积超过60万亩，其经济价值相当于2000万亩玉米的产值，目前农业产值及全国以三七为原料的三七总产值超过700亿元，因此三七是云南中药产业最重要的支柱品种，但是三七生产存在严重的连作障碍问题，由于连年大面积单一化种植，加之三七为多年生宿根草本植物，性喜温暖阴凉，连作障碍问题尤为突出。多年来，人们对连作障碍的研究主要集中于病原菌引起的根腐病方面。引起根腐病的主要病原是包括腐皮镰孢(Fusarium solani)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、细极链格孢(Alternariatenuis)和人参链格孢(Alternaria panax)等。常年因连作障碍造成的损失达10％-40％，严重时损失可达70％以上，甚至绝收。

目前生产上主要采用化学农药和新地轮作的方式减轻连作障碍的危害。化学农药灌根防治不但成本高，防效低，而且导致土壤污染和农药残留，严重影响三七的品质。新地轮作在一定程度上能降低根腐病的危害，但轮作期限一般在20年以上，加之常年轮作，目前三七主产区已经无地可轮。因此，如何克服三七连作障碍的问题，减少三七农药残留的、缩短土地资源再生周期，对三七栽培的可持续发展具有重要意义。

魔芋(Amorphophallus konjac)，天南星科魔芋属多年生草本植物，富含葡甘露聚糖，是自然界仅有的几种含天然葡甘露聚糖的植物之一，20世纪80年代以来，随着魔芋食用、药用和工业用途的不断开发以及农业产业结构调整，魔芋已成为我国中西部地区农村发展特色经济、农民脱贫致富和出口创汇的主要支柱产业之一。魔芋软腐病是胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种(Erwinia carotovora subsp.carotovora，Ecc)引起的、对魔芋种植业造成毁灭性打击的细菌性病害，该病在我国大部分魔芋产地均有发生，其中云南、贵州、湖南、湖北、四川等省发生严重。魔芋植株感染软腐病后叶片或球茎变软，发黑腐烂，并有恶臭味，从病部流出带菌汁液又侵染新的植株，使之发病，严重时引起成片倒苗，造成的损失一般在30％-50％，严重者可达80％甚至绝收，严重影响芋农种植魔芋的积极性，防碍了西南地区地方经济的快速发展。

目前，防治上述病害主要采用农业栽培措施，抗病品种及化学防治措施，其中化学农药防治使用最为广泛和频繁，但是由于长期使用化学农药导致“3R”现象(残留，有害生物再娼厥，病原物的抗药性)的发生且化学农药可能具有“三致”作用(致崎，致癌，致突变)，虽然土壤中含有的农药并不会直接危害人类的身体健康，但却可以被农作物吸收，而人类通过摄取这些农作就会或多或少的受到农药的危害。随着科学技术的发展和人民生活水平的提高，农药残留等农产品品质问题和农产品的产量问题已经成为当今我国农业发展的两大主要问题，特别是农药残留的问题已经引起了几乎全体国民的忧患意识。

生物农药具有多种优势，其来源广泛、不易产生耐药性、对人畜安全且具有良好的环境兼容性、开发利用途径多、种类繁多、研发的选择余地大等特点，且具有低毒、低残留、不易产生抗药性、高效等优点，为农业可持续发展提供了非常重要的研究方向并已成为全球农业生产发展的新趋势。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种生防细菌——产酶溶杆菌1-T-1-4，该菌株已于2016年3月21日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记入册，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号：CGMCC NO:12229。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种生防菌剂，其中有效活性成分为产酶溶杆菌1-T-1-4，其分泌的代谢产物包括蛋白酶、几丁质酶、葡聚糖酶、醋酶、隣脂酶五种抗菌相关物质，所述的生防菌剂作用于三七或魔芋上，用于防治三七根腐病和魔芋软腐病等病害。

进一步的，本发明所述的生防菌剂，它是水剂、可湿性粉剂中的其中一种。

进一步的，本发明所述的生防菌剂，使用方法为喷雾、灌根、浸种中的其中一种。

进一步的，所述的产酶溶杆菌1-T-1-4水剂，其制备方法包括如下步骤：

(1)菌种培养

a.试管种培养：将NA培养基121℃灭菌30min后倒入试管中1/3处，做成斜面，接种产酶溶杆菌1-T-1-4菌株，26℃培养24-48h；

所述NA培养基的配方为：葡萄糖10g，蛋白胨5g，牛肉浸膏3g，酵母浸膏1g，琼脂粉17g，用蒸馏水补足到1000mL；

b.菌种摇床扩大培养：将斜面种子接种茄瓶斜面NA培养基上，26℃下培养24-48h，获得茄瓶种子；

(2)发酵

a.种子悬浮液的制备：用灭菌水洗下茄瓶斜面上的菌苔，得到种子悬浮液；

b.接种：将种子悬浮液通过接种口，利用压差接入发酵罐培养基；

所述发酵罐培养基的配方及处理方法为：蛋白胨5％，葡萄糖7％，酵母膏1％，硫酸镁1.5％，磷酸氢二钾1.5％，甘油10％，用蒸馏水补足到1000mL，灭菌前pH 8.0；

c.液体发酵：发酵罐培养基在接种后，培养36-48小时。

进一步的，所述步骤(2)中在接种时，发酵罐的罐温为25-32℃，罐压为0.5kg/cm²，罐内搅拌速度为200r/min。

进一步的，所述步骤(2)中在接种升压过程中，罐压不超过1.5kg/cm²。

本发明所述的产酶溶杆菌1-T-1-4菌株，具有以下形态和生理生化特征：

产酶溶杆菌1-T-1-4细胞呈棒状，不具鞭毛，菌落边缘轮廓清晰，呈啮齿状，具有滑移能力，该菌培养初期为淡黄色，培养后期产生黄色色素。

产酶溶杆菌1-T-1-4菌株具有以下生理生化特征：革兰氏染色阴性，氧化酶和过氧化氢酶阳性，硝酸盐不还原，明胶液化、淀粉和吐温80不水解，吲哚和精氨酸双水解酶和脲酶阴性。能利用用葡萄糖产酸，可水解酪蛋白；常规和Biolog生理生化特征：能利用D-麦芽糖、D-海藻糖、N-乙酰-D-葡萄糖胺、N-乙酰-D-半乳糖胺、D-甘露糖、D-果糖、D-半乳糖、醋竹桃霉素、利福霉素SV、明胶、E-氨基乙酰-L-脯氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、林肯霉素、四唑紫、四唑兰、L-苹果酸、吐温40、β-羟基-D，L丁酸、乙酰乙酸、乙酸；不能利用糊精、蔗糖、α-D-乳糖、β-甲酰-D-葡糖苷、蜜三糖、N-乙酰神经氨酸、D-丝氨酸、D-山梨酸、D-甘露醇、D-阿拉伯醇、肌醇、L-半乳糖醛酸内酯、奎宁酸、糖质酸、万古霉素、P-羟基-苯乙酸、丙酮酸甲酯、D-苹果酸、γ-氨基-丁酸等。

本发明的有益效果为：

本发明提供了一种高效、无毒、安全无残留、使用简便的防治三七根腐病和魔芋软腐病等病害的生防菌剂，其有效活性成分为产酶溶杆菌1-T-1-4菌株，通过产生胞外水解酶，如蛋白酶、几丁质酶、葡聚糖酶、醋酶、磷脂酶等来降解不同病原菌的细胞壁组分，从而实现高效的防治效果。经云南昆明市郊、昆明市寻甸县、景洪市普文镇和楚雄自治州等地的温室和田间小区进行得防效实验表明，该生物制剂防效显著、稳定，可以有效地控制三七根腐病和魔芋软腐病，对三七根腐病的相对防治效果达到45.0-55.0％；对魔芋细菌性软腐病的相对防治效果达到48.0-55.0％。

本发明提供的生防菌剂综合性状较好，对三七和魔芋等作物有很好的促生作用，此外，还对一些辣椒疫霉病、水稻细菌性条斑病、番茄青枯病和油菜菌核病等都有较好的抑菌效果。该生防菌剂无毒，使用安全无残留，有助于减少化学药剂在农产品中的使用量和残留量，降低生产成本，实用性强，适用于工业化生产。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes)1-T-1-4水剂的制备

(1)菌种培养

a.试管种培养(以下均为重量百分比)

将NA培养基(蛋白胨5g，蔗糖10g，酵母粉1g，牛肉浸膏3g，琼脂17-20g)放入试管中，用蒸馏水补足到1000mL，灭菌，做成斜面，接种产酶溶杆菌1-T-1-4菌株，26℃培养24h。

b.菌种摇床扩大培养

将斜面种子接种茄瓶斜面NA培养基(培养基配方与上述步骤a相同)上，26℃下培养48h，获得茄瓶种子。

(2)发酵

具体发酵生产过程如下：

b.接种：将种子悬浮液通过接种口，利用压差接入发酵罐(发酵罐的培养基配方为：蛋白胨5％，葡萄糖7％，酵母膏1％，硫酸镁1.5％，磷酸氢二钾1.5％，甘油10％，灭菌前pH 8.0；发酵罐的罐温为25-32℃，罐压为0.5kg/cm²，罐内搅拌速度为200r/min)，注意避免污染；升压时罐压不能超过1.5kg/cm²；

c.液体发酵：

发酵罐在接种后，培养36小时，至菌数不再增加，立即放罐，经平板计数测定含菌量，含菌量达180亿CFU/mL；

本制剂可通过浸种、喷雾、灌根等方式施用于作物播种时或病害始发期；方法如下：作物播种前，采用生物制剂与种芋浸(拌)种后，晾干施入土壤中，或在病害始发期将本制剂通过灌根施用。对三七根腐病和魔芋软腐病病害发生严重地区可在作物生长过程中追施1至2次。

实施例2：

产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes)1-T-1-4可湿性粉剂的制备

(1)制备液体生防菌剂：同实施例1，得发酵液；

(2)添加填充剂：将发酵液压入贮罐，根据以下计算公式加入硅藻土(轻质碳酸钙)作为填充剂，搅拌30min；

填充剂的加入量(公斤)＝[发酵液菌数(亿/毫升)X放罐体积(升)X收率]/成品菌数—发酵液中的残存物(公斤)。然后经、板框压滤、打浆、干燥、粉碎、制成可湿性粉剂，供大田用。

(3)板框过滤：用2kg/cm²的压力，将物料由贮罐压入板框，通过7号滤布过滤，压力随时调节，使滤液中的含菌量不超过0.2亿/毫升，得滤饼和滤液；

(4)打浆：将滤饼卸入打浆罐中，按加入碳酸钙量的8％加入浓乳100号，或按3％加入SDS，再加入辅助剂(CPL)以及适量的滤液均匀搅拌30min；

(5)干燥：将浆液置于60℃以下的烘干房内通风干燥至含水量为5％-8％，得半成品；

(6)粉碎：将半成品进行粉碎，粉碎时出料温度≤60℃；

(7)成品质量指标测定：含菌量、含水量、悬浮率、细度的测定均参照国家企业标准(Q/KWL02-2003)进行，含菌量18亿/克，其余各项指标均符合标准。

实施例3：

产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes)1-T-1-4对三七根腐病的药效试验

药效试验所用供试试剂和培养基如下：

KB培养基(蛋白胨20g，磷酸氢二钾1.5g，七水硫酸镁1.5g，甘油10mL，蒸馏水1000mL；pH7.0)；

PDA培养基(马铃薯200g，琼脂15g，葡萄糖15g，水1000mL)；

NA培养基(蛋白胨5g，牛肉浸膏3g，酵母浸膏1g，蔗糖10g，琼脂17g，水1000mL，pH7.0)；

乙酸乙酯、丙酮、甲醇、石油醚等，均为分析纯。

1.产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes)1-T-1-4的代谢产物对三七根腐病的离体抑菌试验

1.1供试病原菌

包括腐皮镰孢(Fusarium solani)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、细极链格孢(Alternaria tenuis)和人参链格孢(Alternariapanax)等真菌，以上病原菌由云南农业大学植保学院植物病理实验室提供。

1.2产酶溶杆菌1-T-1-4代谢产物粗提物的制备

在装500mL已灭菌的KB液体培养基的1000mL锥形瓶中接种产酶溶杆菌1-T-1-4，在26℃条件下培养5天终止发酵。将发酵液离心10min(10000rpm/min)收集上清液，于上清液中加入等体积乙酸乙酯萃取3次。旋转蒸发浓缩，再用乙酸乙酯(或者丙酮、甲醇)洗下蒸馏瓶中的粗提物，获得代谢产物粗提物。

1.3产酶溶杆菌1-T-1-4代谢产物粗提物对病原菌的离体抑菌力测定

采用管碟法，用丙酮将乙酸乙酯提取物稀释至5000μg/mL。各浓度重复3次，测量抑菌圈大小，取平均值。

1.4试验结果与分析

试验结果见表1。

表1不同浓度粗提物对不同病原真菌生长抑制效果测定(菌落平均直径)

注：菌落平均直径为接种后第5天观察结果。

由表1可知，代谢产物粗提物对6种真菌都有明显的抑制作用，对尖孢镰刀菌的抑制效果最强，在浓度为2mg/mL时，抑菌圈直径达到2.8cm，在浓度为0.25mg/mL时，抑菌直径仍大于1cm；对腐皮镰孢菌的抑制作用次之，在浓度为2mg/mL时，抑菌圈直径为2.1cm，在浓度为0.25mg/mL时，抑菌直径仍大于0.5cm；对人参链格孢菌的抑制作用中等，在浓度为2mg/mL时，抑菌圈直径为1.8cm，在浓度为0.25mg/mL时，抑菌直径为0.6cm；对立枯丝核菌、三七疫霉和细极链格孢菌的抑制作用较差，在浓度为2mg/mL时，抑菌圈直径为1.5cm，在浓度为0.125mg/mL时，无抑菌作用。

2.产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes)1-T-1-4对三七根腐病的温室盆栽防效试验

2.1供试作物：盆栽三七

2.2防治对象：三七根腐病

2.3实验地点：云南省昆明市云南农业大学植保学院温室

2.4病原菌和生防菌剂的制备

三七根腐病菌悬液的制备：将在PDA培养基上长势较好的新生菌丝切块(2×2mm)，取8-10块移入PDA液体培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉7g，蒸馏水1000mL)中，于26℃160rpm振荡培养3d，使其产生大量孢子。将孢子浓度稀释成为1×108/mL的孢子悬浮液。

生防菌剂的制备：将产酶溶杆菌1-T-1-4接种于装有500mL KB液体培养基三角瓶中，在摇床中(26℃，160rpm)振荡培养3d，用分光光度计在600nm波长下调OD值到0.5，菌悬液浓度相当于1X10⁸CFU/mL。

2.5接种方法：

将种植半年的三七植株苗先进行生防菌的接种，每株于植株根基部灌根生防菌20mL，在生防菌定殖7d后接种病原菌，每株于植株根基部灌根病原菌20mL，24h后再用同样的方式和同样的灌菌量灌入生防菌，以空白培养液作为空白对照。每隔7d再灌入生防菌2-3次，于接种病原菌后40d进行病情调查，记录三七根腐病的发病等级，统计生防菌对三七根腐病防效及病情指数，计算并分析结果。

三七根腐病菌病情分级标准如下：

0级:无病；

1级:根系稍有变色，变色根系占全部根系的10％以下，植株不萎焉；

3级:根系明显变褐，变色根系占全部根系的10.1％-30％，植株开始萎焉；

5级:变色根系占全部根系的30.1％-50％，植株明显萎焉；

7级:变色根系占全部根系的50.1％-80％，植株萎焉；

9级:全株枯死。

病情指数％＝[∑(病级×该级病株数)/总株数×最高病级数值]×100

相对防效＝(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数×100％

2.6试验结果与分析

试验结果见表2。

表2温室生防菌1-T-1-4盆栽测试结果(40d)

由表2可知：施用生防菌1-T-1-4生物制剂对三七根腐病防治效果明显，防治效果达54.71％。与对照及生产中常用的防治该病害的农药多菌灵相比，施用生物制剂1-T-1-4的各个处理的发病率和病情指数都有显著降低，该生物制剂的防效显著，显示了该菌株潜在的应用开发前景。

3.产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes)1-T-1-4对三七根腐病的田间控病试验

3.1供试作物：三七

3.2防治对象：三七根腐病

3.3试验地点：云南省昆明市寻甸县三七试验基地(二年连作土，种植三七半年苗，小区为单行区，面积60平方米，每处理设3个重复，随机排列，共9各小区，四周设保护行，按三七栽培措施规范化管理)

3.4病原菌和生防菌剂的制备

同2.4。

3.5接种方法：

同2.5。

3.6试验结果与分析

试验结果见表3。

表3寻甸三七实验基地对生防菌1-T-1-4测试结果(40d)

由表3可知：施用生防菌1-T-1-4生物制剂对三七根腐病防治效果明显，防治效果达47.32％。与对照及生产中常用的防治该病害的农药多菌灵相比，施用生物制剂1-T-1-4的各个处理的发病率和病情指数都有减轻。

将三次防效试验结合，都说明生物制剂1-T-1-4对三七根腐病都有很好的防治效果，并且此防效试验具有可重复性。以上试验，进一步说明该生物试剂1-T-1-4对三七根腐病具有稳定、较好的防治效果，也具备了生产上大量推广的基本条件。

实施例4：

产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes)1-T-1-4对魔芋软腐病的田间控病试验

试验所用供试试剂和培养基如下：

乙酸乙酯、丙酮、甲醇、石油醚等，均为分析纯。

1.1供试作物：魔芋

1.2防治对象：魔芋软腐病

1.3实验地点：云南省富源县魔芋种植基地(肥力中等，小区为一畦4行区，面积30平方米，每处理设3个重复，随机排列，共9个小区，四周设保护行，按高产、优质栽培措施规范化管理)

1.4病原菌和生防菌剂的制备

魔芋软腐病菌悬液的制备：将魔芋软腐病病菌在NA培养基上活化，然后挑取单菌落接种于KB培养基中，26℃160rpm振荡培养2d，使其产生大量孢子。将孢子浓度稀释成为1×108/mL的孢子悬浮液。

生防菌剂的制备：将产酶溶杆菌1-T-1-4接种于装有500mL KB液体培养基三角瓶中，在摇床中(26℃，160rpm)振荡培养3d，调节菌悬液浓度相当于1X10⁸CFU/mL。

1.5接种方法：

试验设生防菌剂处理、清水对照、农药对照3个处理，施药的方法采用灌根法，每棵魔芋根部浇罐生防菌液200mL，发病初期施第一次药，使生防菌在植株根际定殖，7d后再接入病原菌，24h后再追施2-3次生防菌液，于接种病原菌后30d进行病情调查，记录魔芋软腐病的发病等级并统计生防菌对魔芋软腐病防效及病情指数，计算并分析结果。

魔芋软腐病病情分级标准如下：

根据发病严重程度将魔芋软腐病分为0-4级：

0级：植株生长正常，叶片无非生理性发黄、无水浸状病斑；

1级：叶片(或叶柄)一侧有小型水浸状病斑，病斑面积(或长)占总叶面积(叶柄总长度)的10％以下；或者叶片轻度黄化面积小于 10％；

2级:叶片(或叶柄)的水浸状病斑或者黄化面积占总叶面积10％—40％，茎基部或茎有水浸状病斑，但植株正立。

3级：叶片(或叶柄)的水浸状病斑或者黄化面积占总叶面积40％—90％，茎基部有明显软腐症状或茎一侧叶柄全部软腐，植株歪斜。

4级：叶片(或叶柄)的水浸状病斑或者黄化面积占总叶面积90％以上或全叶枯黄、植株倒伏腐烂。

病情指数＝Σ(各级病株数×相对级数值)×100/(调查总株数×最高级数值)

1.6试验结果与分析

结果见表4。

表4生防菌剂1-T-1-4对魔芋细菌性软腐病的大田防效测定

由表4可知：施用生防菌1-T-1-4生物制剂对魔芋细菌性软腐病病防治效果明显，防治效果达51.0％。与对照及生产中常用的防治该病害的农药噻枯唑相比，施用生物制剂1-T-1-4的各个处理的发病率和病情指数都有减轻。说明生物制剂1-T-1-4对魔芋细菌性软腐病都有很好的防治效果，并且此防效试验具有可重复性，说明该生物试剂1-T-1-4对魔芋细菌性软腐病具有稳定、较好的防治效果，也具备了生产上大量推广的基本条件。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims

1.一株产酶溶杆菌1-T-1-4及其应用，其特征在于，所述产酶溶杆菌1-T-1-4的分泌代谢产物包括蛋白酶、几丁质酶、葡聚糖酶、醋酶、隣脂酶，所述产酶溶杆菌1-T-1-4可用于防治三七根腐病和魔芋软腐病病害。

2.如权利要求1所述的产酶溶杆菌1-T-1-4，其特征在于，可制成水剂或可湿性粉剂中的其中一种进行使用。

3.如权利要求1所述的产酶溶杆菌1-T-1-4，其特征在于，使用方法为喷雾、灌根、浸种中的其中一种。

4.一种如权利要求2所述的产酶溶杆菌1-T-1-4水剂，其特征在于，其制备方法包括如下步骤：

(1)菌种培养

(2)发酵

c.液体发酵：发酵罐培养基在接种后，培养36-48小时。

5.如权利要求3所述的产酶溶杆菌1-T-1-4水剂，其特征在于，所述步骤(2)中在接种时，发酵罐的罐温为25-32℃，罐压为0.5kg/cm²，罐内搅拌速度为200r/min。

6.如权利要求3所述的产酶溶杆菌1-T-1-4水剂，其特征在于，所述步骤(2)中在接种升压过程中，罐压不超过1.5kg/cm²。