CN106404474B - 丝状真菌质谱鉴定蛋白提取技术 - Google Patents
丝状真菌质谱鉴定蛋白提取技术 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106404474B CN106404474B CN201510985224.7A CN201510985224A CN106404474B CN 106404474 B CN106404474 B CN 106404474B CN 201510985224 A CN201510985224 A CN 201510985224A CN 106404474 B CN106404474 B CN 106404474B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- minutes
- filamentous fungi
- mass spectrometric
- spectrometric identification
- dry
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000233866 Fungi Species 0.000 title claims abstract description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims abstract description 9
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims abstract description 5
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 5
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 6
- 230000009514 concussion Effects 0.000 claims description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 3
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 2
- 150000004674 formic acids Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 claims 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract description 5
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 abstract description 2
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 241001136487 Eurotium Species 0.000 abstract 1
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 abstract 1
- 241000852049 Scedosporium apiospermum Species 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 abstract 1
- 238000003801 milling Methods 0.000 abstract 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- XBJFCYDKBDVADW-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;formic acid Chemical compound CC#N.OC=O XBJFCYDKBDVADW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 2
- 241001504664 Crossocheilus latius Species 0.000 description 1
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 1
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/286—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q involving mechanical work, e.g. chopping, disintegrating, compacting, homogenising
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及一种丝状真菌质谱鉴定蛋白提取方法，包括用75％乙醇灭活洗脱丝状真菌的菌丝；再用磁珠加上合适比例的甲酸和乙腈结合旋涡震荡充分乳化和碾磨其细胞壁；最后用超声波超声破碎细胞，从而有利于真菌蛋白的完全析出，即可用于质谱的鉴定。通过这样富集提取的蛋白纯度和产量较高，可以使得大多数临床常见丝状真菌如曲霉菌属、暗色真菌、接合菌属、镰刀菌属、尖端赛多孢子菌、双相真菌的质谱鉴定到种的水平。
Description
技术领域
本发明涉及临床标本病原性真菌的蛋白检测，属于医学分子生物学领域。
背景技术
近几年来基质辅助激光解析飞行时间质谱技术(MALDI-TOF-MS)已越来越多的用于临床上病原微生物的鉴定。其在普通细菌的鉴定能力上已完全能够和传统的生化反应鉴定技术和金标准的序列测定技术相媲美。但在少见病原如分支杆菌、诺卡菌、真菌的鉴定方面由于这些病原菌自身的生长结构特点导致其蛋白提取效果不甚理想。因而不能达到满意的鉴定效果。
目前临床上常用的化学提取丝状真菌蛋白的方法只能提取临床上常见丝状真菌的少数菌属，对多数丝状真菌提取效果不甚理想，因此需要开发出一种新的提取方法解决存在的问题。本发明通过大量富集丝状真菌的菌丝，借助乙醇的洗脱沉淀纯化、磁珠的碾磨、超声波的破碎和甲酸乙腈的提取能够得到高纯度的丝状真菌蛋白，将能够使质谱鉴定丝状真菌的技术得到更好的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种临床标本丝状真菌质谱鉴定蛋白提取技术。所涉及的临床标本丝状真菌质谱鉴定蛋白提取技术采用7步法。是在临床常用的化学提取法基础上改进而来。在甲酸乙腈化学提取的基础上加入磁珠研磨和超声破碎步骤，通过反复提取，丝状真菌的蛋白能够充分释放出来，即可用于后续的高质量的质谱鉴定。具体作法为：
（1）液体沙保弱培养基垂直旋转培养临床丝状真菌，直至培养出足够多的丝状真菌，静止10分钟，待其沉淀；
（2）弃上清培养液，收集1.5ml的沉淀转移至eppendorf管中，13000rpm 离心2分钟，弃上清；再用75%的乙醇1ml 13000rpm 离心灭活洗脱3分钟。重复用75%的乙醇1ml洗脱沉淀2次，待沉淀充分干燥；
（3）沉淀中加入等量的0.1mm磁珠，视沉淀多少加入20~100µL的70%甲酸水溶液（要求加入的甲酸水溶液没过沉淀），充分研磨，漩涡震荡混匀作用5分钟；
（4）再加入等体积的乙腈溶液，充分研磨，漩涡震荡混匀作用5分钟；
（5）超声波超声破碎2分钟；
（6）13000rpm离心2分钟，吸取 1 µL 上清液添加到 MALDI靶板上，并在室温下自然晾干；
（7）在上述样品点上覆盖 1 µL HCCA 基质溶液并在室温下自然晾干。即可上机质谱鉴定。
本发明具有快速、灵敏度高、蛋白提取纯度高、产量高的特点，能够使质谱鉴定丝状真菌的能力从属的水平提高到种的水平。
Claims (1)
1.丝状真菌质谱鉴定蛋白提取技术，包括以下步骤：
(1)液体沙保弱培养基垂直旋转培养临床丝状真菌，直至培养出足够多的丝状真菌，静止10分钟，待其沉淀；
(2)弃上清培养液，收集1.5ml的沉淀转移至离心管中，13000转/分钟离心2分钟，弃上清；再用75％的乙醇1ml 13000转/分钟离心灭活洗脱3分钟；重复用75％的乙醇1ml洗脱沉淀2次，待沉淀充分干燥；
(3)沉淀中加入等量的0.1mm磁珠，视沉淀多少加入20～100μL的70％甲酸水溶液，要求加入的甲酸水溶液没过沉淀，充分研磨，漩涡震荡混匀作用5分钟；
(4)再加入等体积的乙腈溶液，充分研磨，漩涡震荡混匀作用5分钟；
(5)超声波超声破碎2分钟；
(6)13000转/分钟离心2分钟，吸取1μL上清液添加到质谱仪靶板上，并在室温下自然晾干；
(7)在步骤(6)晾干的上清液靶点位置上覆盖1μL HCCA基质溶液并在室温下自然晾干，即可上机质谱鉴定。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510985224.7A CN106404474B (zh) | 2015-12-25 | 2015-12-25 | 丝状真菌质谱鉴定蛋白提取技术 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510985224.7A CN106404474B (zh) | 2015-12-25 | 2015-12-25 | 丝状真菌质谱鉴定蛋白提取技术 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106404474A CN106404474A (zh) | 2017-02-15 |
| CN106404474B true CN106404474B (zh) | 2018-03-06 |
Family
ID=58007900
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510985224.7A Active CN106404474B (zh) | 2015-12-25 | 2015-12-25 | 丝状真菌质谱鉴定蛋白提取技术 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106404474B (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE102019126201A1 (de) | 2019-09-27 | 2021-04-01 | Bruker Daltonik Gmbh | Massenspektrometrische Probenvorbereitung für matrix-unterstützte Ionisierung (z.B. MALDI) |
| CN112430257B (zh) * | 2020-10-28 | 2022-08-30 | 融智生物科技（青岛）有限公司 | 用于产聚合物双歧杆菌蛋白提取的提取剂及提取方法与应用 |
| CN113219046B (zh) * | 2021-06-08 | 2023-05-26 | 郑州安图生物工程股份有限公司 | 基于基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱的丝状真菌多维蛋白指纹图谱数据库构建方法 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102766214A (zh) * | 2011-05-05 | 2012-11-07 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 含蛋白标签的sumo融合蛋白及其应用 |
| CN102253111A (zh) * | 2011-06-09 | 2011-11-23 | 曹际娟 | Maldi-tof ms辅助鉴定单增李斯特氏菌的方法 |
| US9074236B2 (en) * | 2012-05-01 | 2015-07-07 | Oxoid Limited | Apparatus and methods for microbial identification by mass spectrometry |
| CN102653558B (zh) * | 2012-05-22 | 2013-08-21 | 中国农业大学 | 一种单链抗体及其在检测黄曲霉毒素中的应用 |
| CN102808223B (zh) * | 2012-08-02 | 2014-12-31 | 北京毅新博创生物科技有限公司 | 结核分枝杆菌的核酸指纹特征图谱库及其用途 |
| CN103713065B (zh) * | 2014-01-06 | 2015-09-16 | 上海市农业科学院 | 一种同时检测多种真菌毒素的方法 |
| CN103743808A (zh) * | 2014-01-17 | 2014-04-23 | 中国药科大学 | 人乳腺癌细胞乙酰化p53蛋白同位素标记定量方法 |
| CN103823008B (zh) * | 2014-03-14 | 2016-03-02 | 北京市疾病预防控制中心 | 构建液相色谱-质谱数据库检测未知毒物的方法 |
| CN104596816B (zh) * | 2015-01-09 | 2017-10-10 | 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 | 一种用于maldi‑tof ms检测的植物线虫前处理方法 |
-
2015
- 2015-12-25 CN CN201510985224.7A patent/CN106404474B/zh active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN106404474A (zh) | 2017-02-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2010272586B2 (en) | Mass spectrometric diagnosis of septicemia | |
| EP3543700B1 (en) | Identification of pathogens in body fluids | |
| CN106404474B (zh) | 丝状真菌质谱鉴定蛋白提取技术 | |
| CN114107289B (zh) | 粪便样本的核酸提取试剂盒、制备方法及提取方法 | |
| CN107964545A (zh) | 一种基于磁珠技术提取真菌/细菌基因组dna的试剂盒及其方法 | |
| CN113926432B (zh) | 一种新型冠状病毒核酸提取试剂盒及核酸提取方法 | |
| CN105132410B (zh) | 一种微生物基因组dna的提取方法 | |
| CN110452903A (zh) | 一种无酶法全核酸提取试剂盒 | |
| CN112251492A (zh) | 一种提取病毒核酸的试剂盒和提取方法 | |
| CN106226530A (zh) | 用于maldi tof细菌及酵母类真菌鉴定的菌体预处理方法 | |
| CN111944802A (zh) | 真菌核酸提取裂解液及提取核酸的试剂盒及方法 | |
| de Lima et al. | Micro-and nano-sized amine-terminated magnetic beads in a ligand fishing assay | |
| CN103421764B (zh) | 一种真菌病毒双链rna快速提取试剂盒及其应用 | |
| JPWO2018061877A1 (ja) | 核酸を抽出する方法及びそれに用いるキット | |
| WO2023115313A1 (zh) | 一种基于CRISPR-Cas系统的核酸富集、分离与纯化的方法 | |
| CN111808721B (zh) | 一种核酸提取芯片及采用其快速提取血液dna的方法 | |
| CN108949749A (zh) | 一种从新鲜真菌菌丝体中快速提取长片段dna的方法 | |
| CN109022424A (zh) | 一种提取竹荪总dna的试剂及应用 | |
| CN104324045A (zh) | 血红铆钉菇多糖在制备抗酪氨酸酶抑制剂中的应用 | |
| CN108676791B (zh) | 一种磁珠法提取dna的试剂盒及提取方法 | |
| CN113308460A (zh) | 一种提取石蜡切片中细菌dna的试剂盒 | |
| CN106349402A (zh) | 一种利用双醛纤维素脱除多糖提取液中蛋白质的方法 | |
| US7871764B1 (en) | Universal nucleic acids sample preparation method for cells, spores and their mixture | |
| CN108192892B (zh) | 一种羟基纳米磁珠法提取rna的试剂盒及提取方法 | |
| CN114752505B (zh) | 一株皇簇菇菌株 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |