CN106396931A - 一种复合固氮微生物菌肥及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种复合固氮微生物菌肥及其制备方法，具体是公开了一种适用PH范围广，好氧与厌氧条件下都具有较强固氮能力的，易保存的复合固氮微生物菌肥，该复合固氮微生物菌肥的原料配比为：弯曲芽孢杆菌发酵液10‑30份，巴氏梭菌发酵液30‑80份，印度拜叶林克氏菌发酵液20‑60份。本发明创造性的将“好氧”、“厌氧”两大固氮菌群融为一体，一类为好氧性的固氮菌‑‑印度拜叶林克氏菌（其低氧下也能固氮，但主要是好氧菌）与弯曲芽孢杆菌；另一类厌氧固氮菌—巴氏梭菌，都具有较强的固氮能力，能在土壤较深层的土壤中进行固氮（10‑30cm），能把空气中的氮转化成植物能吸收的氮，源源不断的提供给植物。

Description

一种复合固氮微生物菌肥及其制备方法

技术领域

本发明属于生物肥料技术领域，涉及一种复合固氮微生物菌肥及其制备方法。

背景技术

固氮菌类肥料是指以土壤或作物根际生活，并固定空气中氮气的微生物菌种，用液体深层发酵而制成的活体制品，能够固定空气中的氮元素作为养料，并能分泌生长素物质，帮助作物生长，在自然界中，每年由微生物所固定的氮素约1亿多吨，对增加土壤肥力起着很大作用。研究结果显示施用固氮菌肥料后能有促进植物生长的趋势，并伴有一定的增产效应，但效果不稳定，主要原因是固氮菌在储运过程中，活菌数下降，施入土壤后，受土壤环境影响，活菌数及活性也会下降，效果得不到保证；

现阶段，主要使用的固氮菌为棕色固氮菌，圆褐固氮菌，光合细菌等非芽孢类的固氮菌，其不容易保存，不易于商品化。而且这些菌种一般在偏酸性环境中生长发育不良。而且大部分为单一菌种，其适应环境的能力有限。

发明内容

本发明提供一种适用PH范围广，好氧与厌氧条件下都具有较强固氮能力的，易保存的复合固氮微生物菌肥，该复合固氮微生物菌肥的原料配比为：弯曲芽孢杆菌发酵液10-30份，巴氏梭菌发酵液30-80份，印度拜叶林克氏菌发酵液20-60份。

本发明的第二目的在于提供一种复合固氮微生物菌肥的制备方法，该方法步骤简单，确保微生物菌肥的肥效突出。

为了达到上述目的，该复合固氮微生物菌肥的制备方法，包括以下步骤：

步骤一，弯曲芽孢杆菌发酵液的制备

取出弯曲芽孢杆菌保藏管，用无氮固体培养基分别划平板进行复苏，30℃培养96小时。在平板下挑取单个菌落接种至装有无氮固体培养基，在30℃培养箱中培养72小时，用3000ml无菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱，接种至装有300L弯曲芽孢杆菌发酵培养基的500L发酵罐中，开搅拌200r/min，前8小时通气量为100L/min，8-24小时后通气量为200L/min ，24小时后通气量为360L/min ，30℃培养40-60小时，检测其芽孢含量超过50亿CFU/ml，即作为弯曲芽孢杆菌发酵液；

其中，所述无氮固体培养基：蔗糖10g，磷酸氢二钾0.2g，硫酸镁0.2g，氯化钠0.2g，硫酸钙0.1g，碳酸钙5g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，pH7.2；

其中，所述弯曲芽孢杆菌发酵培养基：糖蜜40g/L，玉米淀粉10 g/L， 豆粕粉20 g/L，硫酸镁0.4 g/L，硫酸锰0.3g/L，磷酸二氢钾0.3 g/L，碳酸钙10 g/L， pH7.0；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。

步骤二，巴氏梭菌发酵液的制备

取-80℃甘油管保藏的菌种1mL接种于装有9mLRCM培养基的试管中，37℃条件下静态厌氧活化48h。将活化好的菌种按1%(v/v)的接种量转接到灭过菌的100L巴氏梭菌种子培养基中。37℃条件下静态厌氧培养24h~36h，菌含量超过5亿CFU/ml，即可作为巴氏梭菌种子继续接种。将100L巴氏梭菌菌种子接至装有900L已经灭菌的巴氏梭菌发酵培养基的1吨的发酵罐中，抽真空，37℃培养8-10天，待巴氏梭菌产生芽孢，芽孢含量超过50亿CFU/ ml，即可停止培养，即为巴氏梭菌发酵液；

其中，所述的RCM培养基：胰蛋白陈10g/L，牛肉膏10g，酵母膏10g/L，葡萄糖5g/L，氯化钠5g/L，可溶性淀粉1g/L，半胱氨酸盐酸盐0.5克/L，醋酸钠3g/L，pH7.0，121℃灭菌20min；

其中，所述的巴氏梭菌种子培养基：:酵母膏15g/L，牛肉膏5g/L，KH2PO4 2g/L硫酸镁1g/L，半胱氨酸盐酸盐1g/L，NaHCO3 1g/L，CaCO3 1g/L，葡萄糖20g/L， PH7.0，121℃灭菌20min；

其中，所述的巴氏梭菌发酵培养基：大米粉40g/L，酵母膏15g/L，牛肉膏5g/L，KH2PO42g/L硫酸镁1g/L，半胱氨酸盐酸盐1g/L，NaHCO3 1g/L，CaCO3 1g/L，葡萄糖5g/L， PH7.0，121℃灭菌20min。

步骤三，印度拜叶林克氏菌发酵液的制备

取出印度拜叶林克氏菌菌种保藏管，用印度拜叶林克氏菌固体培养基分别划平板进行复苏，30℃培养120小时。在平板下挑取单个菌落接种50毫升印度拜叶林克氏菌液体培养基中，在培养箱中30℃震荡培养96小时。种子采用10%的接种量，接种至5L大三角瓶中，装液量为2L，二级无氮液体种子培养基，30℃震荡培养96-120小时，检测其菌液浓度，活菌含量超过5亿cfu/ml，即可作为印度拜叶林克氏菌液体菌种接种至装有600L印度拜叶林克氏菌发酵培养基的1000L发酵罐中，接种量为10%，开搅拌120r/min，前24小时通气量为200L/min，24小时后通气量为480L/min ，30℃培养40-70小时，检测其菌体含量不低于60亿cfu/ml，即可结束发酵，即得到印度拜叶林克氏菌发酵液；

其中，所述印度拜叶林克氏菌固体培养基：KH2PO4 0.2g，K2HPO4 0.8g，MgSO4·7H2O0.2g，CaSO4·2H2O 0.1g，FeCl3 0.01g，Na2MoO4·2H2O 0.002g，酵母提取物0.5g，甘露醇20.0g，水洗琼脂20 g，蒸馏水1.0L，pH 7.2；

其中，所述印度拜叶林克氏菌液体培养基：KH2PO4 0.2g，K2HPO4 0.8g，MgSO4·7H2O0.2g，CaSO4·2H2O 0.1g，FeCl3 0.01g，Na2MoO4·2H2O 0.002g，酵母提取物0.5g，甘露醇20.0g，蒸馏水1.0L，pH 7.2；

其中，所述二级无氮液体种子培养基：蔗糖20g，苹果酸5.0g, K2HPO4.H2O 0.lg,KH2PO4 .H20 0.4g，MgS04.7H2O 0.2g，NaCI 0.lg，Na2MO04 H20 0.002g，FeCl30.01 g，pH7.0；

其中，所述印度拜叶林克氏菌发酵培养基：葡萄糖5g/L，甘蔗糖蜜40 g/L，氯化铵1 g/L，豆粕粉20 g/L，磷酸氢二钾0.2 g/L，磷酸二氢钾1.0 g/L，硫酸镁0.2 g/L，钼酸钠0.01g/L，氯化铁0.01 g，碳酸钙5g ，pH7.0；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。

步骤四、将步骤一至步骤三中制备的弯曲芽孢杆菌发酵液10-30份，巴氏梭菌发酵液30-80份，印度拜叶林克氏菌发酵液20-60份，混合均匀，用柠檬酸调PH至3.2，即为复合固氮微生物菌肥。

长期以来，根瘤菌和自生固氮菌等虽具有较强的固氮能力，但抗逆性低，不耐贮存，不利于我国生物固氮菌肥的商品化和推广使用。自1958年Hin首次在日本分离得到一株具有高固氮活性的芽抱杆菌后，土壤中新发现的具有固氮作用的芽抱杆菌越来越多。具有固氮作用的芽孢杆菌添加到生物肥料中，可使生物肥料耐酸、耐盐、耐高温和耐高压，为生物固氮肥料的研发、推广和应用将起着重要作用。本发明复合固氮微生物菌肥中的弯曲芽孢杆菌具有较强的固氮作用，并且具有明显的根迹促生作用。

本发明复合固氮微生物菌肥中含有的弯曲芽孢杆菌，可在作物表面、植株内部或土壤中繁殖生长的同时必定向植物根际分泌某些次生代谢产物，能够提高植物对养分的吸收、刺激植株生长和抑制病菌等综合功能。弯曲芽孢杆菌还能够防治植物病害源于其能够产生多种抗菌物质，包括脂肽类、肽类、磷脂类、多烯类、氨基酸类和核酸类等多种化合物，这些抗菌物质能抑制真菌、细菌、病毒和菌原体等的正常生长。

本发明复合固氮微生物菌肥中含有巴氏梭菌，其属厌氧性非共生固氮细菌，也叫丁酸发酵芽孢杆菌。在自然界和土壤中分布很广，数量较多，每克土壤约含巴氏梭菌10-100余万，是土壤中其它固氮菌数量的100-1000倍，所以巴氏梭菌在土壤生物固氮中所起的作用是不可忽视的，向土壤中额外补充已经驯化好的具有高效固氮能力的巴氏梭菌使得固氮效果更加显著是具有重要意义的。

本发明复合固氮微生物菌肥中含有印度拜叶林克氏菌，印度拜叶林克氏菌高度耐酸，生长在PH3-9.5或10之间。在中性和碱性条件下产酸，在很酸的条件下，能产生一种碱性物质，从而提高土壤的PH，好氧菌，具有较强的固氮能力，但在降低氧压的情况下也能生长和固氮，在液体发酵过程中会产生粘稠的半透明的多糖物质，由于有多糖物质的存在，对其保存过程中有明显的保护作用，可以使其延长保质期。

本发明的有益效果与优点：

、本发明中的印度拜叶林克氏菌具有广泛的PH适应性，能在在PH3-9.5或10之间生长，而弯曲芽孢杆菌与巴氏梭菌都能形成芽孢，将复合固氮微生物菌肥的PH调低至3.2，保证了杂菌无法在本发明的固氮微生物菌肥中生长，防止了弯曲芽孢杆菌与巴氏梭菌的芽孢萌发，减少了两种芽孢杆菌在保存过程中的损失，同时，由于多糖物质的存在，也保护了印度拜叶林克氏菌，延长了其保质期。经过检测，常温保存一年，两株芽孢的损失率低于20%，印度拜叶林克氏菌的损失率低于35%。

、本发明创造性的将“好氧”、“厌氧”两大固氮菌群融为一体，一类为好氧性的固氮菌--印度拜叶林克氏菌（其低氧下也能固氮，但主要是好氧菌）与弯曲芽孢杆菌；另一类厌氧固氮菌—巴氏梭菌，都具有较强的固氮能力，能在土壤较深层的土壤中进行固氮（10-30cm），能把空气中的氮转化成植物能吸收的氮，源源不断的提供给植物。微生物菌通过生产、捕食、被捕食和分解的角色分工协作，充分利用自然资源并通过微生物生长、繁殖、死亡等一系列的微生物代谢活动及微生物死亡残体被活菌循环再用，为土壤创造腐殖质，为作物提供各种所需的微量元素，增加土壤内的有机质含量，提升土壤肥力。在这一系列微生物活动中会产生大量的“磷酸聚糖”，帮助分解土壤中因长期过量使用化肥导致固化、钙化的化学物质，促进土壤疏松，使多年沉淀在土壤中的各种矿物元素充分为植物根系吸收利用，恢复土壤肥力，提高产出能力，净化土地、河流、空气。

本发明复合固氮微生物菌肥PH适用范围广，好氧与厌氧条件下都具有较强固氮能力的，且易于保存，保存时间长等特点。

具体实施方式

实施例1

一种复合固氮微生物菌肥，其特征在于，所述的复合固氮微生物菌肥的原料配比为：弯曲芽孢杆菌发酵液20份，巴氏梭菌发酵液50份，印度拜叶林克氏菌发酵液30份。

根据权利要求1所述的一种复合固氮微生物菌肥，其特征在于，其制备方法，包括以下步骤：

步骤一，弯曲芽孢杆菌发酵液的制备

取出弯曲芽孢杆菌保藏管，用无氮固体培养基分别划平板进行复苏，30℃培养96小时。在平板下挑取单个菌落接种至装有无氮固体培养基，在30℃培养箱中培养72小时，用3000ml无菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱，接种至装有300L弯曲芽孢杆菌发酵培养基的500L发酵罐中，开搅拌200r/min，前8小时通气量为100L/min，8-24小时后通气量为200L/min ，24小时后通气量为360L/min ，30℃培养53小时，检测其芽孢含量为58亿CFU/ml，即作为弯曲芽孢杆菌发酵液；

其中，所述无氮固体培养基：蔗糖10g，磷酸氢二钾0.2g，硫酸镁0.2g，氯化钠0.2g，硫酸钙0.1g，碳酸钙5g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，pH7.2；

其中，所述弯曲芽孢杆菌发酵培养基：糖蜜40g/L，玉米淀粉10 g/L， 豆粕粉20 g/L，硫酸镁0.4 g/L，硫酸锰0.3g/L，磷酸二氢钾0.3 g/L，碳酸钙10 g/L， pH7.0；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。

步骤二，巴氏梭菌发酵液的制备

取-80℃甘油管保藏的菌种1mL接种于装有9mLRCM培养基的试管中，37℃条件下静态厌氧活化48h。将活化好的菌种按1%(v/v)的接种量转接到灭过菌的100L巴氏梭菌种子培养基中。37℃条件下静态厌氧培养24h~36h，菌含量超过5亿CFU/ml，即可作为巴氏梭菌种子继续接种。将100L巴氏梭菌菌种子接至装有900L已经灭菌的巴氏梭菌发酵培养基的1吨的发酵罐中，抽真空，37℃培养9天，巴氏梭菌产生芽孢，检测芽孢含量为75亿CFU/ ml，即可停止培养，即为巴氏梭菌发酵液；

其中，所述的RCM培养基：胰蛋白陈10g/L，牛肉膏10g，酵母膏10g/L，葡萄糖5g/L，氯化钠5g/L，可溶性淀粉1g/L，半胱氨酸盐酸盐0.5克/L，醋酸钠3g/L，pH7.0，121℃灭菌20min；

其中，所述的巴氏梭菌种子培养基：:酵母膏15g/L，牛肉膏5g/L，KH2PO4 2g/L硫酸镁1g/L，半胱氨酸盐酸盐1g/L，NaHCO3 1g/L，CaCO3 1g/L，葡萄糖20g/L， PH7.0，121℃灭菌20min；

巴氏梭菌发酵培养基：大米粉40g/L，酵母膏15g/L，牛肉膏5g/L，KH2PO4 2g/L硫酸镁1g/L，半胱氨酸盐酸盐1g/L，NaHCO3 1g/L，CaCO3 1g/L，葡萄糖5g/L， PH7.0，121℃灭菌20min。

步骤三，印度拜叶林克氏菌发酵液的制备

取出印度拜叶林克氏菌菌种保藏管，用印度拜叶林克氏菌固体培养基分别划平板进行复苏，30℃培养120小时。在平板下挑取单个菌落接种50毫升印度拜叶林克氏菌液体培养基中，在培养箱中30℃震荡培养96小时。种子采用10%的接种量，接种至5L大三角瓶中，装液量为2L，二级无氮液体种子培养基，30℃震荡培养96-120小时，检测其菌液浓度，活菌含量超过5亿cfu/ml，即可作为印度拜叶林克氏菌液体菌种接种至装有600L印度拜叶林克氏菌发酵培养基的1000L发酵罐中，接种量为10%，开搅拌120r/min，前24小时通气量为200L/min，24小时后通气量为480L/min ，30℃培养60小时，检测其菌体含量为72亿cfu/ml，即可结束发酵，即得到印度拜叶林克氏菌发酵液；

其中，所述印度拜叶林克氏菌固体培养基：KH2PO4 0.2g，K2HPO4 0.8g，MgSO4·7H2O0.2g，CaSO4·2H2O 0.1g，FeCl3 0.01g，Na2MoO4·2H2O 0.002g，酵母提取物0.5g，甘露醇20.0g，水洗琼脂20 g，蒸馏水1.0L，pH 7.2；

其中，所述印度拜叶林克氏菌液体培养基：KH2PO4 0.2g，K2HPO4 0.8g，MgSO4·7H2O0.2g，CaSO4·2H2O 0.1g，FeCl3 0.01g，Na2MoO4·2H2O 0.002g，酵母提取物0.5g，甘露醇20.0g，蒸馏水1.0L，pH 7.2；

其中，所述二级无氮液体种子培养基：蔗糖20g，苹果酸5.0g, K2HPO4.H2O 0.lg,KH2PO4 .H20 0.4g，MgS04.7H2O 0.2g，NaCI 0.lg，Na2MO04 H20 0.002g，FeCl30.01 g，pH7.0；

其中，所述印度拜叶林克氏菌发酵培养基：葡萄糖5g/L，甘蔗糖蜜40 g/L，氯化铵1 g/L，豆粕粉20 g/L，磷酸氢二钾0.2 g/L，磷酸二氢钾1.0 g/L，硫酸镁0.2 g/L，钼酸钠0.01g/L，氯化铁0.01 g，碳酸钙5g ，pH7.0；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。

步骤四、将步骤一至步骤三中制备的弯曲芽孢杆菌发酵液20份，巴氏梭菌发酵液50份，印度拜叶林克氏菌发酵液30份，混合均匀，用柠檬酸调PH至3.2，即为复合固氮微生物菌肥。

实施例2

实施例1制备的复合固氮微生物菌肥在辣椒上的应用效果（简称菌肥）

1试验时间：2015年5月-8月

2．试验地点：湖南省隆回县滩头镇中桥村

3．试验方法：

试验组：移植时将幼苗用200倍菌肥稀释液沾根30分种，在定植后10天后，用菌肥1000倍稀释液灌根1次总用菌2公斤/亩，总施氮肥为20公斤/亩；对照组用清水沾根与灌根，总施氮肥为40公斤/亩；

4．试验结果：

、对产量的影响与经济效益结果发现，使用复合固氮微生物菌肥的平均单产726 kg/亩，对照组平均662kg/亩，平均每亩增产64kg，增产率为9.67%，亩增产值153.6元（按市场价：鲜椒2.4/公斤）。试验组在少施50%的氮肥的情况下还有明显的增产，是我们没有预计到的；

、对果实的保鲜效果：

辣椒成熟后，将试验组、对照组取出20个成熟度一致的果实置于清水中浸泡，放置于相同的环境中，对照组4天后开始发黑，浸泡6天后果实果肉软化，而试验组浸泡5天后才开始发黑，浸泡8天后果肉软化，表明复合固氮微生物菌肥对果实有保鲜作用，便于长途运输；

、试验过程中，试验组的土壤松软、湿润，稍用力即散；对照组硬朗刺手，用力不散，呈明显的板结状。

实施例3

复合固氮微生物菌肥在黄瓜上的应用效果

1．试验地点：山东省寿光市某种植户

2．试验方法：试验组：移植时将幼苗用200倍菌肥稀释液沾根20分种，在定植后10天后，用菌肥1000倍稀释液灌根1次，总施菌肥量为2公斤，氮肥为15公斤；对照组：用清水沾根与灌根，总施氮肥为30公斤/亩；

3．试验结果：移植后，发现沾根的植株叶片比较新鲜，而且生长势好，没有打蔫的了，使用复合固氮微生物菌肥的植株比对照组提前一个星期期现花。在大部分的都开过花后观察发现，发现试验组的花开的比没喷鲜艳的多，而且花的质量很好，色艳，花大，花看上去就比较“壮”，而且从整个植株的生长来看，生长势明显好于没喷过的，期间用过的黄瓜表现为叶色翠绿、植株整齐且土壤表现为疏松，从口感上黄瓜要清脆、香甜。而末用过的则叶色黄绿、植株参差不齐。 实际测产时，试验组比对照组的增产12.9%，由于常年施用化肥过多，土壤酸化严重，其土壤PH才4.5，这也可能是减少一半的氮肥还有明显增产的一个原因吧。

实施例4

复合固氮微生物菌肥在草莓上试验效果

1．试验地点：湖南省隆回县周旺镇某种植户；

2．试验方法：在定植期，将苗栽好，用复合固氮微生物菌肥500倍稀释液灌根1次，开发结果期，用复合固氮微生物菌肥500倍稀释液灌根1次，总用量为菌肥2公斤；进口氮肥10公斤；对照组：用清水沾根与灌根，进口氮肥为20公斤/亩；

3．试验结果：

结果发现，提前开花结果，果实大而饱满，结果数多，异形果少，口感好，着色鲜亮，草莓（丰香）的单株产量平均为126.9g，较对照（不施菌肥）提高8.95％，而且施用菌肥后草莓果实的可溶性固形物含量达10.14％，较对照相对高12.4％，同时，施用菌肥后，酸含量降低，Vc含量提高，果实的风味和品质得到明显改善，并且耐储存，比不使用菌肥的草莓多储存10天以上。使用复合固氮微生物菌肥的地块比对照区提高产量29%，糖度比对照区提高1-2度。

根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

Claims (2)

1.一种复合固氮微生物菌肥，其特征在于，所述的复合固氮微生物菌肥的原料配比为：弯曲芽孢杆菌发酵液10-30份，巴氏梭菌发酵液30-80份，印度拜叶林克氏菌发酵液20-60份。

2.根据权利要求1所述的一种复合固氮微生物菌肥，其特征在于，其制备方法，包括以下步骤：

步骤一，弯曲芽孢杆菌发酵液的制备

取出弯曲芽孢杆菌保藏管，用无氮固体培养基分别划平板进行复苏，30℃培养96小时，在平板下挑取单个菌落接种至装有无氮固体培养基，在30℃培养箱中培养72小时，用3000ml无菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱，接种至装有300L弯曲芽孢杆菌发酵培养基的500L发酵罐中，开搅拌200r/min，前8小时通气量为100L/min，8-24小时后通气量为200L/min ，24小时后通气量为360L/min ，30℃培养40-60小时，检测其芽孢含量超过50亿CFU/ml，即作为弯曲芽孢杆菌发酵液；

其中，所述无氮固体培养基：蔗糖10g，磷酸氢二钾0.2g，硫酸镁0.2g，氯化钠0.2g，硫酸钙0.1g，碳酸钙5g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，pH7.2；

其中，所述弯曲芽孢杆菌发酵培养基：糖蜜40g/L，玉米淀粉10 g/L， 豆粕粉20 g/L，硫酸镁0.4 g/L，硫酸锰0.3g/L，磷酸二氢钾0.3 g/L，碳酸钙10 g/L， pH7.0；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；

步骤二，巴氏梭菌发酵液的制备

取-80℃甘油管保藏的菌种1mL接种于装有9mLRCM培养基的试管中，37℃条件下静态厌氧活化48h，将活化好的菌种按1%(v/v)的接种量转接到灭过菌的100L巴氏梭菌种子培养基中，37℃条件下静态厌氧培养24h~36h，菌含量超过5亿CFU/ml，即可作为巴氏梭菌种子继续接种，将100L巴氏梭菌菌种子接至装有900L已经灭菌的巴氏梭菌发酵培养基的1吨的发酵罐中，抽真空，37℃培养8-10天，待巴氏梭菌产生芽孢，芽孢含量超过50亿CFU/ ml，即可停止培养，即为巴氏梭菌发酵液；

其中，所述的RCM培养基：胰蛋白陈10g/L，牛肉膏10g，酵母膏10g/L，葡萄糖5g/L，氯化钠5g/L，可溶性淀粉1g/L，半胱氨酸盐酸盐0.5克/L，醋酸钠3g/L，pH7.0，121℃灭菌20min；

其中，所述的巴氏梭菌种子培养基：:酵母膏15g/L，牛肉膏5g/L，KH2PO4 2g/L硫酸镁1g/L，半胱氨酸盐酸盐1g/L，NaHCO3 1g/L，CaCO3 1g/L，葡萄糖20g/L， PH7.0，121℃灭菌20min；

巴氏梭菌发酵培养基：大米粉40g/L，酵母膏15g/L，牛肉膏5g/L，KH2PO4 2g/L硫酸镁1g/L，半胱氨酸盐酸盐1g/L，NaHCO3 1g/L，CaCO3 1g/L，葡萄糖5g/L， PH7.0，121℃灭菌20min；

步骤三，印度拜叶林克氏菌发酵液的制备

取出印度拜叶林克氏菌菌种保藏管，用印度拜叶林克氏菌固体培养基分别划平板进行复苏，30℃培养120小时，在平板下挑取单个菌落接种50毫升印度拜叶林克氏菌液体培养基中，在培养箱中30℃震荡培养96小时，种子采用10%的接种量，接种至5L大三角瓶中，装液量为2L，二级无氮液体种子培养基，30℃震荡培养96-120小时，检测其菌液浓度，活菌含量超过5亿cfu/ml，即可作为印度拜叶林克氏菌液体菌种接种至装有600L印度拜叶林克氏菌发酵培养基的1000L发酵罐中，接种量为10%，开搅拌120r/min，前24小时通气量为200L/min，24小时后通气量为480L/min ，30℃培养40-70小时，检测其菌体含量不低于60亿cfu/ml，即可结束发酵，即得到印度拜叶林克氏菌发酵液；

其中，所述印度拜叶林克氏菌固体培养基：KH2PO4 0.2g，K2HPO4 0.8g，MgSO4·7H2O0.2g，CaSO4·2H2O 0.1g，FeCl3 0.01g，Na2MoO4·2H2O 0.002g，酵母提取物0.5g，甘露醇20.0g，水洗琼脂20 g，蒸馏水1.0L，pH 7.2；

其中，所述印度拜叶林克氏菌液体培养基：KH2PO4 0.2g，K2HPO4 0.8g，MgSO4·7H2O0.2g，CaSO4·2H2O 0.1g，FeCl3 0.01g，Na2MoO4·2H2O 0.002g，酵母提取物0.5g，甘露醇20.0g，蒸馏水1.0L，pH 7.2；

其中，所述二级无氮液体种子培养基：蔗糖20g，苹果酸5.0g,K2HPO4.H2O 0.lg,KH2PO4.H20 0.4g，MgS04.7H2O 0.2g，NaCI 0.lg，Na2MO04 H20 0.002g，FeCl30.01 g，pH 7.0；

其中，所述印度拜叶林克氏菌发酵培养基：葡萄糖5g/L，甘蔗糖蜜40 g/L，氯化铵1 g/L，豆粕粉20 g/L，磷酸氢二钾0.2 g/L，磷酸二氢钾1.0 g/L，硫酸镁0.2 g/L，钼酸钠0.01g/L，氯化铁0.01 g，碳酸钙5g ，pH7.0；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；

步骤四、将步骤一至步骤三中制备的弯曲芽孢杆菌发酵液10-30份，巴氏梭菌发酵液30-80份，印度拜叶林克氏菌发酵液20-60份，混合均匀，用柠檬酸调PH至3.2，即为复合固氮微生物菌肥。