CN106377527A - 开链吡啶羧酸衍生物H2dedpa在抗菌领域的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药物化学领域，公开了开链吡啶羧酸衍生物H2dedpa在抗菌领域的应用。该化合物具有如下结构，其可以恢复产金属β‑内酰胺酶肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗生素的敏感性。体外抗菌实验结果证明，其最高可以将碳青霉烯类耐药的大肠埃希菌（产NDM‑4型金属β‑内酰胺酶）对美罗培南的MIC值降低约40960倍。体外红细胞毒性实验也证明了此化合物具有很小的红细胞毒性，因此，该化合物可以作为新型金属β‑内酰胺酶抑制剂的候选药物。
Description
技术领域
本发明属于药物化学技术领域，涉及具有潜在应用价值的开链吡啶羧酸衍生物H2dedpa作为新型金属β-内酰胺酶抑制剂在抗菌领域的应用。
背景技术
抗生素的出现为临床上治疗感染性疾病带来了福音，但是对着越来越多的抗生素类药物被开发和运用于临床后，抗生素对于临床感染性疾病的治疗带来了疲软，临床上开始出现各种耐药性菌株，越来越多的抗生素对于治疗失去了最初的效力，全球耐药性情况已不容藐视。2009年，英国卡迪夫大学的Walsh课题组报道了一类新型的β-内酰胺酶—金属β-内酰胺酶，病例显示该患者在2007年12月，在印度新德里接受抗身素治疗后，其尿液的培养物分离出一种对于碳青霉烯耐药的肺炎克雷伯菌，所以这种酶又被成为新德里β-内酰胺酶(Antimicrobial agents and chemotherapy 2009,53,5046.)。自其报道一年后已经有将近20个国家相继报道发现携带blaNDM-1，全球趋势严重(The Lancet InfectiousDiseases 2010,10,597.)。
按照β-内酰胺酶分子结构中氨基酸序列同源性的差异，Ambler分类法将β-内酰胺酶分为A、B、C和D四类，其中由于其末端氨基残留不同又将其分为丝氨酸类β-内酰胺酶和金属β-内酰胺酶。其中A、C和D属于丝氨酸类β-内酰胺酶，B类属于金属β—内酰胺酶。目前已上市的β-内酰胺酶抑制剂有克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦。其与头孢类抗菌药物联用可以提高抗菌药物的活性。但是其都属于丝氨酸类β-内酰胺酶抑制剂，而有关金属β-内酰胺酶抑制剂目前没有上市药物报道。
2014年，Gerard D.Wright等人报道了从真菌中得到的一种天然的化合物AMA，它可以快速、有效的抑制含有NDM-1型金属β-内酰胺酶的活性，与美罗培南联合用药的情况下可使产NDM-1酶菌株对美罗培南恢复敏感(Nature 2014,510,503.)。2015年，SabihaY.Essack等人报道了两种锌离子螯合剂NOTA和DOTA，此两种螯合剂可以携带金属β-内酰胺酶的菌株恢复对碳青霉烯类抗生素的敏感性(Journal of Antimicrobial Chemotherapy2015,70,1594.)。2015年，西北大学杨科武课题组报道了一系列巯基乙酸硫酯氨基酸衍生物，其对于金属β‐内酰胺酶L1的IC50最小可以达到18nM，但是其体外活性实验证明其恢复美罗培南敏感性效果并不理想(Acs Medicinal Chemistry Letters 2015,6,660.)。
H2dedpa是2008年西班牙Teresa Rodríguez-Blas课题组首次发明的开链吡啶羧酸类配体，用于二价锌离子，二价铬离子和二价铅离子的配位(Dalton transactions2008,5754.)。2010年美国Chris Orvig课题组把这个化合物用于和放射性元素Ga68配位，用于正电子发射断层摄影(PET)成像剂(Journal of the American Chemical Society2010,132,15726.)。其具有如下结构：
发明内容
本发明的目的在于提供H2dedpa作为新型金属β-内酰胺酶抑制剂在抗菌领域的应用。
为实现本发明目的，技术方案如下：本发明对化合物H2dedpa体外红细胞溶血性进行了实验；对化合物H2dedpa体外Hela(海拉癌细胞株)细胞毒性进行了实验；对化合物H2dedpa体外对于大肠埃希菌14-55的杀菌动力学进行了实验；并进行了H2dedpa和NOTA在体外与美罗培南(MEM)、Zn2+联用对比。结果发现H2dedpa作为非环螯合、氮杂环类衍生物，可以使产金属β-内酰胺酶菌株恢复对碳青霉烯类抗生素敏感性。可以作为新型金属β-内酰胺酶抑制剂在抗菌领域应用。
本发明优点及创新点在于：发现了化合物H2dedpa的新用途，将用于化合物配体及正电子发射断层摄影(PET)成像剂的H2dedpa作为新型金属β-内酰胺酶抑制剂在抗菌领域得到应用，并且发现化合物H2dedpa与美罗培南联用具有很好的杀菌效果，而且发现化合物H2dedpa和金属β-内酰胺酶中的锌离子结合导致该酶失活，具有可逆性。该应用将有利于开发新型金属β-内酰胺酶抑制剂。
附图说明
图1为化合物H2dedpa体外红细胞溶血性的实验结果，由图可知，化合物H2dedpa在1000μg/mL时红细胞溶血率小于1％，对红细胞没有明显的损伤，由此可以证明其对于哺乳动物的红细胞损伤很小。
图2为化合物H2dedpa在体外对于Hela细胞毒性的实验结果，由图可知，化合物H2dedpa在1000μg/mL时对Hela细胞的抑制率在48.71％，由此可以初步证明，在体外实验过程中，化合物H2dedpa具有较小的细胞毒性。
图3为化合物H2dedpa在体外对于Hela细胞毒性的活死细胞荧光实验结果，图中，a–c阴性对照(不加药组)，d–f化合物H2dedpa(128μg/mL)，g–i化合物H2dedpa(64μg/mL)，j–l阳性对照组0.1％Triton X-100。图中比例尺为100nm。由图可以显著的观察到，化合物H2dedpa于128μg/mL作用于Hela细胞后，对于细胞维持正常形态的生长几乎没有影响。
图4为化合物H2dedpa在体外对于大肠埃希菌14-55的杀菌动力学结果对比图，图中，a为化合物H2dedpa，b为对照化合物NOTA，c为浊度实验，c图中，1为空白对照，2为化合物H2dedpa(0.125μg/mL)，3为化合物H2dedpa(0.25μg/mL)。由图a、b可知，当化合物H2dedpa在4×MIC和8×MIC两个浓度作用24h后，对于对数生长初期的细菌有很好的杀菌活性。与阳性对照NOTA的活性相对较优。从c图中，24h后的外观可以清楚地看到，化合物H2dedpa作用后的菌液浊度很低，而空白对照组浊度明显大。
图5为化合物H2dedpa和NOTA在体外与美罗培南(MEM)、Zn2+联用后的结果柱状图，由图可知，化合物H2dedpa与美罗培南联用16-18h之后几乎可以达到100％的抑制率，但是与锌离子联合使用后药物失效，说明化合物H2dedpa和金属β-内酰胺酶中的锌离子结合导致该酶失活，具有可逆性。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围。
应用例1 化合物H2dedpa体外抗菌联合用药活性测试：
实验方法 微量肉汤稀释法：
(1)抗菌药物贮存液制备：制备抗菌药物贮备液的浓度为5120μg/mL，溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。所需抗菌药物溶液量或粉剂量可公式进行计算。配制好的抗菌药物贮存液应贮存于-20℃以下环境，保存期不超过6个月。
(2)待测菌的制备：用接种环挑取过夜培养的MH(A)培养皿上的单菌落于MH(B)培养基中，校准为0.5麦氏比浊标准，约含菌数1×108CFU/mL，然后稀释100倍，即得到约含菌数1.0×106CFU/mL的菌液，备用。
(3)分别将抗菌药物(美罗培南MEM)贮备液母液(5120μg/mL)稀释160倍，得到浓度为32μg/mL的抗菌药物溶液。取无菌的96孔板，第一孔加入200μL的抗菌药物，第二至十孔分别加入100μL的MH肉汤培养基，从第一孔吸取100μL加入第二孔，混匀，再吸取100μL至第三孔，依次类推，第十孔吸取100μL弃去。此时各孔药物浓度依次为：16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125μg/mL，第十二孔加入200μL MH(B)培养基(阴性对照)。
(4)然后将稀释好的菌液分装于EP管中，计算需要固定待测化合物的浓度(64μg/mL或32μg/mL)，将其加入菌液中，使待测化合物的终浓度为64或32μg/mL。自稀释好美罗培南的96孔板的第1孔至第10孔分别加入菌液和待测化合物的混合溶液。将加完药的96孔板放置37℃培养箱进行培养，16-18h观察菌液生长情况，根据美国临床与实验室标准协会(CLSI)的判定标准，肉眼观测完全不长菌的那一孔为抗菌药物的MIC。同时用标准株做质控。
实验结果见表1，表2。
表1：本发明化合物H2dedpa和NOTA对含有NDM的菌株的MIC(μg/mL)及其与美罗培南(MEM)联合用药的MIC结果
aNOTA为1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid(1,4,7-三氮杂环壬烷-N,N',N”-三乙酸)，NDM为New Delhi-Metallo(新德里金属酶)。
由表1可见，本发明化合物H2dedpa能使所有携带NDM-1和NDM-4酶的菌株恢复对碳青霉烯类美罗培南的敏感性。针对产NDM-4酶的大肠埃希菌14-55，而本发明化合物H2dedpa可以将MEM活性提高40960倍。
表2：本发明化合物H2dedpa和NOTA对产IMP酶菌株的MIC(μg/mL)及其与美罗培南(MEM)联合用药的结果
IMP为IMP型金属beta内酰胺酶。
由表2可见，对临床分离的产IMP酶的10株肠杆菌科细菌，化合物H2dedpa均可以提高产IMP酶耐药株对美罗培南的敏感性。其中针对产IMP酶大肠埃希菌Ec-15-101，化合物NOTA可以将MEM的活性提高32倍，而化合物H2dedpa可以将美罗培南的活性提高64倍。
应用例2 化合物H2dedpa体外NDM-1酶的抑制率和IC50测试：
反应在96孔板中进行，终体积为200μL。每个底物浓度平行设置3个副孔，分别设置不含美罗培南和不含NDM-1酶的实验对照组。
(1)反应体系中各物质的终浓度分别为：NDM-1 3.5U，美罗培南125mM,10mM HEPES(PH＝7.5),待测药物浓度为10mg/mL。
其中酶NDM-1每孔98μL与抑制剂用DMSO梯度稀释，使浓度从10mg/mL二倍稀释到0.15625mg/mL，每孔2μL加入相应孔中，使化合物终浓度为100μg/mL到1.5625μg/mL，用DMSO作为阴性对照组，每组四个平行。在30℃条件下孵育15min，再加入美罗培南100μL捶打均匀启动反应。
(2)将96孔板置入酶标仪中于，测定其相应孔中于300nm处的吸光值；每隔60s测定一次，连续测定60个循环。分别计算各抑制浓度下的酶抑制率，用Graphpad Prism5分析各抑制剂的IC50。
运用上述模型监测待测样品酶活性的抑制率，其中阴性对照组为不含抑制剂，可以反应体系中酶的最大活力。空白对照组为不含抑制剂也不含酶，所测得的结果为体系本底值。因此待测样品抑制率的计算公式如下：
IR(％)＝(1-VS/VN)×100％
VS代表待测样品孔的酶反应速率
VN代表阴性对照孔的平均每反应速率
实验结果见表3。
表3化合物H2dedpa对于NDM-1酶的IC50和抑制率
| 化合物 | IC50(μg/mL) | IC50(μM) | 抑制率a(％) |
| H2dedpa | 0.15 | 0.45 | 92％ |
| EDTA | 0.803 | 2.84 | 85％ |
a化合物浓度为10μg/mL
由表3可知，化合物H2dedpa对于NDM-1的抑制活性都明显优于EDTA，化合物H2dedpa的IC50达到0.45μM。在浓度为10μg/mL时其抑制率达到92％。高于阳性对照EDTA。
应用例3 化合物H2dedpa体外红细胞溶血性实验
(1)实验材料：10mLEP管，96孔板，新鲜脱脂羊血。
(2)PBS缓冲液：500mL规格，氯化钠4g，氯化钾100mg，二水合磷酸二氢钠1.49g，无水磷酸二氢钾100mg，去离子水定容至490mL，调节PH7.2-7.4之间，灭菌，用10mL灭过菌的超纯水溶解900mg葡萄糖后加入溶液中。
(3)5％红细胞悬浮液的制备：新鲜的脱纤维羊血冷冻于冰箱里，配置好的PBS缓冲液放置于37℃水浴锅中，即用即配制：
取两支10mL EP管置于试管架，将37℃1×PBS取出水浴锅和冷藏的新鲜羊血一起喷酒精，放入超净台。用移液枪分别吸取5700μL的1×PBS加入两支EP管中，再分别吸取300微升羊血，缓慢加入到PBS溶液中，盖盖子，上下缓慢颠倒混匀，放入离心机1500转离心10min，取出EP管，小心吸取上清，移除上清。再重新分别加入5～7mL PBS溶液，上下缓慢颠倒混匀，放入离心1500转离10min。如此反复操作，直至离心后上清液不再浑浊。最后一次离心过后，撇去上清液，红细胞沉积物留置待用。
取几支10mL EP管，放置试管架上，于每支EP管中加入5700μL的1×PBS(37℃)，然后依次加入300μL的红细胞沉积物。上下缓慢颠倒混匀，如此，便配置好5％的红细胞悬液。
(4)样品溶液的配置：用少量的DMSO溶解(DMSO终浓度不能大于0.5％)，并且用相同体积的DMSO做阴性对照。溶解后的DMSO用PBS稀释(例如，第一孔浓度为1000μg/mL，那么第一孔加入的50μL中药物的含量就是2mg，配置成2mg/50μL的溶液)，此时这支EP管内的药物为初始药物。然后平行取九支1.5mL EP管置于试管架中，分别加入200μL的PBS(编号2号、3号、4号……10号)。所有药物都如此平行操作。最后，由初始药物EP管中吸取200μL的药品溶液加入2号EP管中，反复吹洗后吸取200μL到3号EP管中，反复吹洗……重复操作，直到10号EP管。如此稀释好药物。
(5)铺板：取96孔板，写好实验编号，药品代码，日期。将移液枪调至150μL，将配置好的5％红细胞悬液上下轻缓颠倒混匀，依次吸取铺入96孔板中(6×10)。然后将配置好的药物对应加入96孔板中，一个药物三个复孔。加完后放置37℃恒温箱内孵育1h。
(6)后处理：将96孔板从恒温箱内取出，置于-4℃离心机内离心(3500rpm，5min)。离心完毕，每块板对应都取一块新的96孔板。标注和离心后的板子对照。然后对应地吸取100μL上清液(孔孔对应)。吸取完毕后，与酶标仪中测取OD值，分析数据，得到HC50。
实验结果见附图1。
应用例4 化合物H2dedpa体外细胞毒性测试
实验材料：DMEM培养基，细胞计数板，96孔板，CCK-8，酶标仪。
(1)培养基的配置：取无菌分装瓶，FBS和DMEM培养基1:10的比例配置，于4℃冰箱内储存待用。
(2)铺板：将培养中状态良好的Hela细胞自培养箱中取出，于生物安全柜中操作。倒掉上清培养基，用2mL PBS洗细胞一次，除去残留的培养基。取1mL胰蛋白酶沿壁打入培养皿中，于37℃培养箱，体积百分比0.5％CO2中孵育1-2min。取出消化后的培养皿，加入1mL培养基终止消化。将终止消化后的细胞混悬液转移至10mL EP管中，800rpm 3min离心。取出EP管，缓缓倒掉上清，加入2—4mL培养基，反复吹打50次。从中取10μL细胞混悬液打入细胞计数板中，于20×显微镜下计数。计算好需要细胞的数目，配置为5000个/孔的细胞混悬液。每孔100μL依次加入96孔板中，于恒温培养箱中孵育24h。
(3)加药：将待测药物在4ml EP管中梯度稀释好后，取出已贴壁生长的96孔板，弃掉上清，将稀释好的待测药物每个浓度三个副孔，每孔200μL加入板中，操作完成后将96孔板放入恒温培养箱中。24h后，细胞计数试剂cck-8每孔7μL依次加入板中，放入恒温培养箱中培养4h后于酶标仪中，450nm波长处读取OD值，计算抑制率，回归其IC50。
实验结果见附图2。
应用例5 化合物H2dedpa体外活死细胞双染测试
(1)实验材料：DMEM培养基，细胞计数板，96孔板，CCK-8，钙黄绿素-AM，碘化丙啶(PI),PBS缓冲液，荧光显微镜。
(2)培养基的配置：取无菌分装瓶，FBS和DMEM培养基1:10的比例配置，于4℃冰箱内储存待用。
(3)荧光染料的配置：将分装好的钙黄绿素-AM和碘化丙啶(PI)用PBS稀释，即用即稀释。
(4)铺板：将培养中状态良好的Hela细胞自培养箱中取出，于生物安全柜中操作。倒掉上清培养基，用2mL PBS洗细胞一次，除去残留的培养基。取1mL胰蛋白酶沿壁打入培养皿中，于37℃培养箱，体积百分比0.5％CO2中孵育1-2min。取出消化后的培养皿，加入1mL培养基终止消化。将终止消化后的细胞混悬液转移至10mL EP管中，800rpm 3min离心。取出EP管，缓缓倒掉上清，加入2—4mL培养基，反复吹打50次。从中取10μL细胞混悬液打入细胞计数板中，于20×显微镜下计数。计算好需要细胞的数目，配置为30000个/孔的细胞混悬液。每孔1mL依次加入12孔板中，于恒温培养箱中孵育24h。
(5)加药与染色：将待测药物在4mL EP管中梯度稀释好后，取出已贴壁生长的12孔板，弃掉上清，将稀释好的待测药物每孔700μL加入板中，操作完成后将12孔板放入恒温培养箱中。24h后，取出，分别收集每个孔的上清，做好标记，3500rpm 5min离心上清，弃掉上清收集死细胞，接着用PBS洗一次，弃掉PBS。将12孔板用PBS每孔各洗一次。用配置好的染料每孔700μL先吹打收集该孔的死细胞，然后将其混合液加入到12孔板的孔中。操作完成后，于恒温培养箱孵育15min。接着，尼康荧光显微镜下拍照。
实验结果见附图3。
应用例6 化合物H2dedpa体外杀菌动力学测试
(1)实验材料：MHB培养基(Muiller-Hinton Broth)，MHA培养基(Muiller-Hinton琼脂)，1.5mL无菌EP管，96孔板，PBS缓冲液。
(2)培养基的配置：用超纯水溶解一定量的MHA和MHB粉末，121℃高温灭菌20min后，取出备用。MHA培养基待其冷却至40℃左右将其倒入一次性无菌培养皿，待至室温凝结成固体培养基。
(3)步骤：取两支10mLEP管分别加入3mL的MHB培养基，用接种环分别挑取培养皿中的单克隆菌株(NDM-4菌株14-55和IMP菌株Ec-101)，于恒温摇床中，37℃250rpm过夜生长。第二天，将两支管中的菌液分别都按1:10000倍进行稀释，分别稀释14管，每管3mL的菌液，分为两批，分别于37℃250rpm生长2h和5h。待到达生长时间，取出菌液，加入设定浓度的抗菌药物，此时，分别从每个样品管里面取出100μL的样品液，于低温离心机内10000g离心，弃掉上清，用1×PBS稀释。取无菌96孔板，每孔180μL加入1×PBS。从上述用1×PBS稀释好的菌液中取出20μL加入第一孔，然后向后倍比稀释。从稀释好的孔中取出10μL的样品液滴到MHA固体培养基上，做好标记，此为0h时的菌落计数。往后依照上述方法，依次对1h、2h、3h……24h等进行菌落计数，绘制曲线。结果见附图4。
应用例7 化合物H2dedpa体外锌离子联合用药实验
(1)抗菌药物贮存液制备：制备抗菌药物贮备液的浓度为5120μg/mL，溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。所需抗菌药物溶液量或粉剂量可公式进行计算。配制好的抗菌药物贮存液应贮存于-20℃以下环境，保存期不超过6个月。
(2)待测菌的制备：用接种环挑取过夜培养的MH(A)培养皿上的单菌落于MH(B)培养基中，校准为0.5麦氏比浊标准，约含菌数1×108CFU/mL，然后稀释100倍，即得到约含菌数1.0×106CFU/mL的菌液。
(3)分别将抗菌药物(美罗培南)贮备液母液(5120μg/mL)稀释160倍，得到浓度为32μg/mL的抗菌药物溶液。取无菌的96孔板，第一孔加入200μL的抗菌药物，第二至十孔分别加入100μL的MH肉汤培养基，从第一孔吸取100μL加入第二孔，混匀，再吸取100μL至第三孔，依次类推，第十孔吸取100μL弃去。此时各孔药物浓度依次为：16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125μg/mL，第十二孔加入200mL MH(B)培养基(阴性对照)。
(4)然后将稀释好的菌液分装于EP管中，计算需要固定待测化合物的浓度(64μg/mL或32μg/mL)，将其加入菌液中，使待测化合物的终浓度为64或32μg/mL，然后加入等摩尔量的ZnCl2。自稀释好美罗培南的96孔板的第1孔至第10孔分别加入菌液和待测化合物的混合溶液。将加完药的96孔板放置37℃培养箱进行培养，16-18h观察菌液生长情况，根据美国临床与实验室标准协会(CLSI)的判定标准，肉眼观测完全不长菌的孔为抗菌药物的MIC。同时用标准菌株大肠埃希菌ATCC 25922做质控。结果见附图5。
由上述体外生物活性评价实验可知，化合物H2dedpa具有可以使耐药的美罗培南恢复其敏感的生物活性，最高可以把美罗培南的活性提高40960倍。体外毒性实验证实，红细胞毒性显示化合物H2dedpa即使在浓度为1000μg/mL时对于红细胞依旧没有什么毒性。而对于体外Hela细胞的毒性显示，化合物H2dedpa对于体外细胞毒性也在其治疗量MIC范围之内。杀菌动力学的结果表明化合物H2dedpa对于对数生长初期的细菌具有很好的杀菌活性。NDM-1酶的抑制实验也证明了化合物H2dedpa的确可以抑制NDM-1的活性，并且对NDM-1酶的IC50小于EDTA。锌离子联合用药实验验证了化合物H2dedpa与金属β-内酰胺酶的锌离子结合导致酶失活。一系列的生物活性评价可以初步认定，化合物H2dedpa具有潜在联合成药价值。
Claims (2)
1.开链吡啶羧酸衍生物H2dedpa在抗菌领域的应用，该化合物结构式如下，其特征在于，作为金属β-内酰胺酶抑制剂，将其应用于抗菌药物的制备，与美罗培南联合用药，用于抗菌、杀菌，提高耐药菌株对美罗培南的敏感性，
。
2.如权利要求1所述的开链吡啶羧酸衍生物H2dedpa在抗菌领域的应用，其特征在于，所述耐药菌株为大肠埃希菌，弗氏柠檬酸菌，阴沟肠杆菌，产气荚膜梭状芽胞杆菌，肺炎克雷伯氏菌，奇异变形杆菌。
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