CN106337055B

CN106337055B - 硝酸根运输基因OsNRT1.8在水稻选育中的应用

Info

Publication number: CN106337055B
Application number: CN201610938219.5A
Authority: CN
Inventors: 方中明; 黄玮婷; 吕凯; 王松太
Original assignee: Wuhan Bioengineering Institute
Current assignee: Wuhan Bioengineering Institute
Priority date: 2016-10-25
Filing date: 2016-10-25
Publication date: 2019-06-28
Anticipated expiration: 2036-10-25
Also published as: CN106337055A

Abstract

本发明公开了硝酸根运输基因OsNRT1.8在水稻选育中的应用，属于植物基因工程领域。OsNRT1.8基因编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，cDNA序列如SEQ ID NO.2所示。本发明通过构建水稻OsNRT1.8基因超表达植株、OsNRT1.8基因干扰植株，发现通过提高OsNRT1.8基因表达，可以使正常的水稻分蘖数和每株穗数增加，因此OsNRT1.8基因可用于水稻选育中以提高水稻产量。OsNRT1.8基因在阐述氮素影响植物生长及发育过程方面以及在水稻株型改良方面具有重要的应用价值。

Description

硝酸根运输基因OsNRT1.8在水稻选育中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及硝酸根运输基因OsNRT1.8在水稻选育中的应用。

背景技术

中国水稻种植面积占世界作物总种植面积的20%，但氮肥施用量却占到世界总施用量的37%；1995年中国氮肥生产量和使用量已达世界第一位，但氮肥使用效率较低，氮肥的施用量已较50年前增长20倍，按这种趋势，预计到2050年，将会再翻3倍。氮肥施用过量会导致水体富营养化等生态污染问题[徐国华，范晓荣．水稻硝转运蛋白基因OsNRT1.1a和OsNRT1.1b的功能研究．南京农业大学，2011：4-6]。更多的氮素营养通过反硝化作用、水土流失、自然挥发、微生物利用等途径遭到浪费。

如果将氮素的吸收效率提高1%，就相当于每年节约了十多亿美元的开支。从中国国情分析，扩大种植面积提高总产量的潜力已经很有限，唯一的出路是在有限的土地上生产出更多的稻谷，即提高单位面积产量。在过去的传统耕作中，通过选择氮利用效率更高的作物，来提高氮的利用效率；但与分子水平上的育种相比，这个过程显得缓慢而低效[张洪程，戴其根．水稻氮素利用的基因型差异与生理机理研究．扬州大学，2008：10-13]。要提高氮利用率，必须从氮的分子吸收机制中寻找突破口。硝酸根运输基因家族分为低亲和力硝酸根运输基因与高亲和力硝酸根运输基因两类[周诗毅．糖类和氨基酸对水稻诱导型高亲和力硝酸盐转运系统的影响．华中科技大学，2009：15-16]。通过氮同化作用，将硝态氮和铵态氮吸收并转化为氨基酸，称为氮的第一类吸收。通过对氮的运输使种子营养物质增加，增加饱满度，称为氮的第二类吸收，也就是氮的再利用[Kant S, Bi Y, Steven J, et al.Understanding plant response to nitrogen limitation for the improvement ofcrop nitrogen use efficiency . Journal of Experimental, 2011, 62(4): 1499-1509]。增加氮吸收积累量或氮转运量，都可以增产。因此，在现代化农业建设中，通过分子育种手段来提高水稻对氮肥的利用效率，可以减少氮肥污染，还能增加产量。

NRT1/PTR家族（NRT1/PTR family, NPF）是指能够介导2-3个氨基酸残基的小分子肽及硝酸根等物质进行跨膜运输的蛋白[Rentsch D, Schmidt S, Tegeder M.Transporters for uptake and allocation of organic nitrogen compounds inplants. FEBS Let, 2007, 581: 2281-2289]。NRT1/PTR家族成员参与了种子形成过程中蛋白质的积累和萌发中蛋白降解后小分子多肽形式转运[Martre P, Porter J R,Jamieson P D, et al. Modeling grain nitrogen accumulation and proteincomposition to understand the sink/source regulations of nitrogenremobilization for wheat. Plant Physiol, 2003, 133: 1959-1967]。目前关于NPF家族成员研究的报道很少，本发明涉及的OsNRT1.8基因是水稻NPF基因家族的一个硝酸根运输同源基因。本发明发现OsNRT1.8基因对水稻分蘖有极其重要的作用，可应用于植物株型改良从而使水稻增产。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中存在的问题，提供水稻NPF基因家族成员OsNRT1.8基因在水稻选育中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明以水稻的NPF基因家族成员OsNRT1.8基因为对象，从水稻中花11中克隆了OsNRT1.8的cDNA序列。通过构建OsNRT1.8基因超表达载体，采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，将超表达载体导入正常粳稻品种中花11中，得到OsNRT1.8基因超表达植株，其分蘖数与对照野生型中花11相比显著提高。通过RNAi技术构建OsNRT1.8基因干扰表达载体，将干扰表达载体导入中花11中，得到OsNRT1.8基因表达量下降的干扰植株，干扰植株的分蘖数与中花11相比显著降低；OsNRT1.8突变体纯合植株的分蘖数与中花11相比也显著降低。这些结果表明，通过提高OsNRT1.8基因的表达，可以使正常的水稻分蘖数增加，从而提高穗数和水稻产量。OsNRT1.8基因在阐述氮素影响植物生长及发育过程方面以及在水稻株型改良方面具有重要的应用价值。

基于本发明发现的OsNRT1.8基因的功能，OsNRT1.8基因可用于水稻选育中。所述的水稻选育为提高水稻分蘖数，从而提高穗数和水稻产量。具体可通过提高OsNRT1.8基因的表达使水稻分蘖数和每株穗数增加，达到提高水稻产量的目的。

OsNRT1.8基因也可用于提高其他植物的产量，如通过转基因使OsNRT1.8基因在植物中（超量）表达，来提高植物的分枝数量，进而使植物的产量得到提高。所述的植物是指单子叶植物或双子叶植物；如：小麦、番茄、草坪草或苜蓿等。

所述的OsNRT1.8基因编码的OsNRT1.8蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的OsNRT1.8基因的cDNA序列优选如SEQ ID NO.2所示。

应该理解为，在不影响OsNRT1.8蛋白活性的前提下（即不在蛋白的活性中心），本领域技术人员可对SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸序列。因此，OsNRT1.8蛋白还包括SEQ ID NO.1所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸获得的具有同等活性的蛋白质。此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

本发明的优点和效果：

（1）本发明克隆的OsNRT1.8基因超表达后使水稻分蘖能力增强，说明OsNRT1.8基因对提高水稻产量较明显，因此，通过基因工程技术提高OsNRT1.8基因的表达能够提高植物产量。这不仅有助于通过正常施氮条件下培育高产水稻，还可以通过分子育种进行植物的品种改良。

（2）OsNRT1.8基因的成功克隆，进一步证实了NPF家族在氮吸收过程中的重要作用，对阐明NPF家族的生物学功能有重要的意义，另外对进一步了解植物氮代谢途径，提高氮吸收效率有极大的推动作用。

（3）尽管目前已克隆到了一些提高植物产量的基因，但对植物增产的分子机制仍不清楚。而本发明克隆的OsNRT1.8基因能够提高水稻的产量，对确定植物增产的关键因素有极大的推动作用。

附图说明

图1是对照中花11、OsNRT1.8基因超表达植株3个株系、OsNRT1.8基因干扰植株3个株系及OsNRT1.8基因突变体的整株表型图。

图2是对照中花11、OsNRT1.8基因超表达植株3个株系、OsNRT1.8基因干扰植株3个株系及OsNRT1.8基因突变体分蘖数的统计柱状图，数据采用SPSS软件进行变量分析（ANOVA），使用Duncan’s在0.05水平上进行差异显著性分析，不同组别小写字母（a、b、c）表示差异显著。

图3是对照中花11、OsNRT1.8基因超表达植株3个株系、OsNRT1.8基因干扰植株3个株系及OsNRT1.8基因突变体中OsNRT1.8基因相对表达量的统计柱状图，数据采用SPSS软件进行变量分析（ANOVA），使用Duncan’s在0.05水平上进行差异显著性分析，不同组别小写字母（a、b、c）表示差异显著。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；所用的实验方法均为常规方法，并可按照已描述的重组技术（参见分子克隆，实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约）完成；所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。

实施例1 OsNRT1.8基因超表达植株的构建

提取水稻中花11的RNA，并将其反转录成cDNA，利用引物对：

F1：5'-AGATCTGTCATGGACGCCGGAGACGCCAT-3'（BglII），

R1：5'-CTTAAGGACGTCTCACGAGAGCACGGTCT-3'（Afl II）；

通过PCR扩增OsNRT1.8基因的cDNA后，通过BglII和Afl II酶切后连入pCAMBIA-1301载体（pCAMBIA-1301载体购自Cambia公司），构建出OsNRT1.8基因的超表达载体OsNRT1.8-p1301。采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，将超表达载体导入正常水稻品种中花11中。

将得到的所有转基因小苗移栽于带泥土的筐中，定期浇水，施肥，待小苗长高约10cm时，种于大田中，待苗长大后，提取基因组DNA通过PCR对转基因植株进行检测，检测引物对为：

F2：5'-GATGTTGGCGACCTCGTATT-3'，

R2：5'-TCGTTATGTTTATCGGCACTTT-3'。

若扩增出517bp的片段，则说明转基因植株为阳性植株。阳性植株单株收种并种植，直至T2代鉴定出纯合的转基因植株，即得到OsNRT1.8基因超表达植株。OsNRT1.8基因超表达植株的分蘖数远多于对照中花11植株，差异显著，如图1、2中所示。

取OsNRT1.8基因超表达植株叶片，提取RNA并将其反转录成cDNA，通过实时荧光定量PCR检测OsNRT1.8基因的表达量，结果显示（图3）超表达植株OsNRT1.8基因的表达量与对照中花11相比显著升高。实时荧光定量PCR所用引物对为：

F3：5'-TACGCCGTCGTGGAGGCGTTCA-3'，

R3：5'-TCACGAGAGCACGGTCTTGAGCT-3'。

实施例2 OsNRT1.8基因干扰植株的构建及OsNRT1.8基因突变株的获得

提取水稻中花11的RNA，并将其反转录成cDNA，利用引物对：

F4：5'-GGTACCAGCGCGTCCAACGTCACGAC-3'（KpnI），

R4：5'-GGATCCGCGCTGTCGTCGTCGAACTG-3'（BamH I）；

F5：5'-ACTAGTAGCGCGTCCAACGTCACGAC-3'（SpeI），

R5：5'-GAGCTCGCGCTGTCGTCGTCGAACTG-3'（Sac I）；

各自PCR扩增出OsNRT1.8基因的cDNA片段后，通过上述相应的限制性内切酶酶切后连入pTCK303载体，构建出OsNRT1.8基因的干扰表达载体OsNRT1.8-pTCK303。采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，将干扰表达载体导入正常粳稻品种中花11中。

F2：5'-GATGTTGGCGACCTCGTATT-3'，

R2：5'-TCGTTATGTTTATCGGCACTTT-3'。

若扩增出517bp的片段，则说明转基因植株为阳性植株。阳性植株单株收种并种植，直至T2代鉴定出纯合的转基因植株，即得到OsNRT1.8基因干扰植株。OsNRT1.8基因干扰植株的分蘖数远少于对照中花11植株，差异显著，如图1、2中所示。

在华中农业大学突变体库（http://rmd.ncpgr.cn/）中购买得到OsNRT1.8的突变体纯合植株的种子，将其移栽于带泥土的筐中，定期浇水，施肥，待小苗长高约10cm时，种于大田中，待苗长大后，可得到突变体植株，该突变体植株的分蘖数远少于对照中花11植株，差异显著，如图1、2中所示。

取OsNRT1.8基因干扰植株和突变体植株叶片，提取RNA并将其反转录成cDNA，通过实时荧光定量PCR检测 OsNRT1.8基因的表达量，结果显示（图3）植株OsNRT1.8基因的表达量与对照中花11相比显著降低。实时荧光定量PCR所用引物同实施例1。

上述结果表明，通过提高OsNRT1.8基因的表达，可以增加水稻的分蘖数，进而提高穗数和水稻产量。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉生物工程学院

<120> 硝酸根运输基因OsNRT1.8在水稻选育中的应用

<130> 1

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 574

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 1

Met Asp Ala Gly Asp Ala Met Glu Ser Gly Gln Arg Ala Ala Leu Leu

1 5 10 15

Pro Glu Ser His Gly Pro Lys Thr Glu Asp Asp Ser Leu Gln Val Pro

20 25 30

Leu Leu Lys Asp Lys Lys Arg Gly Gly Ser Lys Ala Pro Ala Ile Val

35 40 45

Leu Gly Phe Glu Cys Leu Glu Ser Thr Ala Phe Asn Gly Ile Ser Thr

50 55 60

Asn Leu Val Val Tyr Leu Glu Thr Val Leu His Gly Ser Asn Leu Ala

65 70 75 80

Ser Ala Ser Asn Val Thr Thr Trp Tyr Gly Thr Ser Tyr Leu Thr Pro

85 90 95

Ile Phe Gly Ala Ile Val Ala Asp Thr Phe Leu Gly Asn Tyr Asn Thr

100 105 110

Ile Leu Ile Ser Leu Ala Val Tyr Leu Leu Gly Met Met Leu Val Thr

115 120 125

Phe Ser Ala Phe Leu Pro Ala Thr Ala Ala Leu Cys Ala Ala Gly Ala

130 135 140

Thr Cys Gly Thr Gly Ala Ala Ala Ala Gln Thr Val Ala Phe Val Gly

145 150 155 160

Leu Tyr Leu Val Ala Val Gly Ser Gly Gly Val Arg Ser Ser Leu Leu

165 170 175

Pro Phe Gly Ala Glu Gln Phe Asp Asp Asp Ser Ala Ala Asp Arg Glu

180 185 190

Arg Lys Ala Ala Phe Phe Ser Trp Phe Tyr Leu Cys Val Asp Phe Gly

195 200 205

Leu Ile Val Ser Gly Val Leu Leu Val Trp Ile Gln Gln Asn Val Ser

210 215 220

Trp Gly Leu Gly Phe Gly Ile Ala Thr Ala Cys Ile Ala Val Ala Phe

225 230 235 240

Ala Ala Phe Val Leu Ala Thr Pro Met Tyr Lys Arg Arg Leu Pro Thr

245 250 255

Gly Thr Pro Leu Lys Ser Leu Ala Gln Val Val Val Ala Ala Phe Arg

260 265 270

Lys Val Gly Met Lys Leu Pro Ala Asp Ala Glu Leu Leu Tyr Glu Val

275 280 285

Ser Asp Lys Val Asp Ser Gln Pro Lys Ile Ala His Thr Ser Glu Phe

290 295 300

Thr Phe Leu Asp Lys Ala Ala Val Val Ser Glu Ser Asp Leu Glu Glu

305 310 315 320

Arg Pro Glu Ala Ala Ser Ser Trp Lys Leu Cys Thr Val Thr Gln Val

325 330 335

Glu Glu Leu Lys Ile Leu Leu Arg Leu Leu Pro Ile Trp Ala Thr Ser

340 345 350

Ile Ile Val Ser Ala Ala Tyr Ser Gln Met Ser Thr Thr Phe Ile Gln

355 360 365

Gln Gly Ser Ala Met Asp Met His Ile Phe Ser Val Pro Val Pro Ala

370 375 380

Ala Ser Leu Ser Ser Phe Gln Val Leu Cys Val Leu Thr Trp Val Ile

385 390 395 400

Leu Tyr Ser Lys Val Ile Val Pro Ala Leu Arg Gly Phe Ser Ser Ser

405 410 415

Gly Ala Ala Gly Glu Pro Ser Gln Leu Gln Arg Met Gly Ala Gly Arg

420 425 430

Leu Leu Met Ala Leu Ala Met Ala Val Ala Ala Leu Val Glu Thr Lys

435 440 445

Arg Leu Asn Ala Ala Ala Ser Gly Glu Ala Ile Asn Ile Ala Trp Gln

450 455 460

Met Pro Gln Tyr Phe Phe Leu Ala Gly Ala Glu Val Phe Cys Tyr Ile

465 470 475 480

Ala Gln Leu Glu Phe Phe Phe Gly Glu Ala Pro Asp Thr Met Lys Ser

485 490 495

Thr Cys Thr Ser Leu Ala Leu Leu Thr Ile Ala Leu Gly Ser Tyr Leu

500 505 510

Ser Ser Leu Ile Tyr Ala Val Val Glu Ala Phe Thr Ala Thr Ala Gly

515 520 525

Gly His Gly Trp Ile Ser Asp Asp Leu Asn Gln Gly His Leu Asp Tyr

530 535 540

Phe Phe Trp Met Leu Ala Ala Met Cys Thr Leu Asn Phe Val Val Tyr

545 550 555 560

Ser Gly Phe Ala Lys Asn Tyr Lys Leu Lys Thr Val Leu Ser

565 570

<210> 2

<211> 1725

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 2

atggacgccg gagacgccat ggagagcgga cagcgcgcgg cgctcctgcc cgagagtcac 60

ggaccaaaga ctgaagatga tagcctgcaa gtgccactcc tcaaggataa gaaacgcggc 120

ggcagcaagg cacctgcaat agttctaggg ttcgaatgcc tggagagcac ggcgttcaat 180

ggcatctcga cgaacctggt ggtgtacctg gagaccgtcc tccatggcag caacctggcc 240

agcgcgtcca acgtcacgac gtggtacggc acgagctacc tcaccccgat cttcggcgcc 300

atcgtcgccg acacgttcct cggcaactac aacaccatcc tcatctccct cgccgtctac 360

ctcctcggga tgatgctggt cacgttctcg gcgttcctgc cggccacggc ggcgctgtgc 420

gcggcgggcg cgacgtgcgg caccggcgcg gccgcggcgc agaccgtcgc gttcgtcggg 480

ctgtacctcg tggctgtcgg gagcggcggg gtgcggtcgt cgctgctgcc gttcggcgcc 540

gagcagttcg acgacgacag cgcggcggat agggagcgca aggcggcctt cttcagctgg 600

ttctacctct gcgtcgactt cggcctgatc gtctccggcg tgctcctcgt ctggatccag 660

cagaacgtca gctggggcct cggcttcggc atcgccaccg cgtgcatcgc ggtcgcgttc 720

gccgcgttcg tgctcgccac gcccatgtac aagcgccggt tgccgacggg cacgccgctc 780

aagagcctcg cccaggtcgt cgtcgccgcc ttcaggaagg tcggcatgaa gctccccgcc 840

gacgccgagc tcctgtacga ggtcagcgac aaggtcgact cccagcccaa gatcgcgcac 900

accagcgagt tcacgtttct tgacaaggcg gccgtcgtct cggagtcgga cctggaggag 960

aggccggagg cggcgagctc gtggaagctc tgcaccgtga cgcaggtgga ggagctcaag 1020

atccttctgc gtctgctccc catctgggcg accagcatca tcgtgtccgc ggcatactcg 1080

cagatgagca ccaccttcat ccagcaaggc agcgccatgg acatgcacat cttctcggtg 1140

ccggtgccgg cggcgtcgtt aagctccttc caggttctct gcgtcctgac atgggtgatc 1200

ctctacagca aggtgatcgt gccggcgctg aggggcttct cctcctccgg agccgccggc 1260

gagccgtcgc agctgcagcg catgggcgcc gggcgcctcc tcatggcgct cgccatggcg 1320

gtggccgcgc tcgtggagac gaagcggctc aacgccgcgg cgagcggcga ggcgatcaac 1380

atcgcgtggc agatgccgca gtacttcttc ctcgccggcg cggaggtgtt ctgctacatc 1440

gcgcagctgg agttcttctt cggcgaggcg ccggacacca tgaagagcac gtgcacgtcg 1500

ctggcgctgc tcaccatcgc gctcgggagc tacctgagct cgctcatcta cgccgtcgtg 1560

gaggcgttca cggcgacggc gggcggccac gggtggatct ccgacgacct caaccagggc 1620

cacctcgact acttcttctg gatgctggcg gccatgtgca cgctcaactt cgtcgtgtac 1680

agcgggttcg ccaagaacta caagctcaag accgtgctct cgtga 1725

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物F1

<400> 3

agatctgtca tggacgccgg agacgccat 29

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物R1

<400> 4

cttaaggacg tctcacgaga gcacggtct 29

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物F2

<400> 5

gatgttggcg acctcgtatt 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物R2

<400> 6

tcgttatgtt tatcggcact tt 22

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物F3

<400> 7

tacgccgtcg tggaggcgtt ca 22

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物R3

<400> 8

tcacgagagc acggtcttga gct 23

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物F4

<400> 9

ggtaccagcg cgtccaacgt cacgac 26

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物R4

<400> 10

ggatccgcgc tgtcgtcgtc gaactg 26

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物F5

<400> 11

actagtagcg cgtccaacgt cacgac 26

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物R5

<400> 12

gagctcgcgc tgtcgtcgtc gaactg 26

Claims

1.OsNRT1.8基因在水稻选育中的应用，其特征在于：所述的水稻选育为提高水稻分蘖数；所述的OsNRT1.8基因编码的OsNRT1.8蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：通过提高OsNRT1.8基因的表达使水稻分蘖数增加。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的OsNRT1.8基因的cDNA序列如SEQIDNO.2所示。