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CN106324234B - 修饰的n-乙酰神经氨酸醛缩酶及其制备方法和应用 - Google Patents

修饰的n-乙酰神经氨酸醛缩酶及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种修饰的N‑乙酰神经氨酸醛缩酶及其制备方法和应用，所述修饰的N‑乙酰神经氨酸醛缩酶的氨基酸侧链经烷基化修饰。其制备方法包括以下步骤：将N‑乙酰神经氨酸醛缩酶与烷基化试剂进行反应，去除其氨基酸侧链的羧基；将去除羧基后的N‑乙酰神经氨酸醛缩酶用盐酸胍进行修饰，即可。所述的修饰的N‑乙酰神经氨酸醛缩酶可用于制备稳定的SA试剂盒。经过修饰后的酶活力更高，在试剂中稳定性更佳，同时不与还原型辅酶互相干扰，使得试剂的灵敏度更佳，可以检测到更微量的唾液酸，在值相对较低的样本检测中，准确度更佳。

Description

修饰的N-乙酰神经氨酸醛缩酶及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及体外诊断领域，具体涉及一种修饰的N-乙酰神经氨酸醛缩酶及其制备方法和应用，特别是涉及一种N-乙酰神经氨酸醛缩酶的修饰方法和含该修饰酶的试剂盒。
背景技术
N-乙酰神经氨酸在N-乙酰神经氨酸醛缩酶催化下生成N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸，是唾液酸检测中重要的酶之一。
唾液酸是细胞膜糖蛋白的重要组成部分，与生物体的许多生物学功能有关，且与细胞恶变、癌转移、浸润、失去接触性抑制、细胞粘附性降低以及肿瘤抗原性密切相关。测定血清唾液酸(SA)浓度，可作为肿瘤诊断辅助性指标和疗效观察指标。
SA明显升高的疾病有：急性白血病、食道癌、贲门癌、胃癌、肠癌、肝癌、肺癌以及卵巢癌等，其中以急性白血病患者为最高。肿瘤患者血清唾液酸增高可能是肿瘤细胞涎糖蛋白合成增加和代谢的改变在血中的反映。
癌症患者SA水平动态变化与病情相关，可以用于早期发现肿瘤的转移和复发。
唾液酸检测的原理：样本中的唾液酸受神经氨酸苷酶的作用，形成N-乙酰神经氨酸，进而在N-乙酰神经氨酸醛缩酶(NANA-醛缩酶)的作用下生成丙酮酸和N-乙酰甘露糖胺。丙酮酸在NADH存在下由乳酸脱氢酶(LDH)作用下生成乳酸和NAD+。测定该NADH的吸光下降的速率可求得样本中唾液酸浓度。
因为N-乙酰神经氨酸醛缩酶侧链还有羧基，羧基具有一定的氧化性，试剂2中含有还原型辅酶，长时间的储存会使还原型辅酶被N-乙酰神经氨酸醛缩酶氧化，导致了试剂的稳定性不佳。
目前，普遍的SA检测试剂盒的稳定性为6个月至10个月。主要原因便在于试剂中N-乙酰神经氨酸醛缩酶和还原型辅酶相互的影响。含使用本发明方法修饰的N-乙酰神经氨酸醛缩酶的试剂盒，稳定性能达到14个月，稳定性大大提高。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种N-乙酰神经氨酸醛缩酶的修饰方法和含该修饰酶的试剂盒。本发明提供一种N-乙酰神经氨酸醛缩酶的修饰方法，同时利用该方法修饰的N-乙酰神经氨酸醛缩酶，发明了一种稳定的唾液酸检测试剂盒。该试剂盒灵敏度好、稳定性佳，测定结果准确可靠。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
第一方面，本发明提供了一种修饰的N-乙酰神经氨酸醛缩酶，其特征在于，所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的氨基酸侧链经烷基化修饰及酶空间结构修饰。
第二方面，本发明提供了一种修饰的N-乙酰神经氨酸醛缩酶的制备方法，包括以下步骤：
A1、将N-乙酰神经氨酸醛缩酶与烷基化试剂进行反应，去除其氨基酸侧链的羧基；
A2、将去除羧基后的N-乙酰神经氨酸醛缩酶用盐酸胍进行修饰，即可。使用盐酸胍对N-乙酰神经氨酸醛缩酶进行修饰，可使酶分子重新折叠，改变其空间结构。
优选地，步骤A1中，所述烷基化试剂包括碳化二亚胺、碘乙酸和碘乙酰胺中的一种或几种混合。
优选地，步骤A1中，所述的反应具体为：使用三乙胺作为溶剂，N-乙酰神经氨酸醛缩酶与烷基化试剂以1:3～5的质量比混合，在室温下搅拌过夜。
优选地，步骤A2中，所述修饰的具体方法为：在所述含去除羧基的N-乙酰神经氨酸醛缩酶的溶液中加入一定质量的盐酸胍，使用冰醋酸调节PH至5.0～6.0下，室温搅拌过夜。
优选地，所述去除羧基后的N-乙酰神经氨酸醛缩酶与盐酸胍的质量比为1:5～10。
第三方面，本发明提供了一种含有修饰的N-乙酰神经氨酸醛缩酶的试剂盒，包括试剂R1和试剂R2；
所述试剂R1包括以下浓度的各组分：
试剂R2包括以下浓度的各组分：
优选地，所述的缓冲液为Good’s缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸-NaOH缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液中的一种或几种；所述R1中缓冲液的PH为5.0-7.0，试剂R2中缓冲液的PH为8.0-10.0。
优选地，所述表面活性剂为吐温20、吐温80、曲拉通-100、十二烷基苯磺酸钠中的一种或几种。
优选地，所述稳定剂为牛血清白蛋白、海藻糖、蔗糖、螯合剂EDTA类中的一种或几种；所述防腐剂为叠氮钠或proclin系列防腐剂。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
(1)N-乙酰神经氨酸醛缩酶氨基酸侧链中含有羧基。羧基含有一定的氧化性，在试剂中会与还原型辅酶相互影响，使还原型辅酶含量降低，导致试剂故稳定性不佳。使用本发明中的修饰剂修饰后，去除了羧基，从而提高了试剂的整体稳定性。
(2)N-乙酰神经氨酸醛缩酶去除羧基后，酶的空间构象发生了改变，受到酶空间构象的影响，N-乙酰神经氨酸醛缩酶的反应速度有所下降。为解决这个问题，我们使用盐酸胍对酶进行处理，盐酸胍能使肽键充分伸展，对酶分子内部的疏水基团进行修饰，使酶重新进行折叠，使得酶空间构象发生改变。进过盐酸胍修饰后的N-乙酰神经氨酸醛缩酶比羧基修饰前活力更高。
(3)通常的N-乙酰神经氨酸醛缩酶的最佳稳定PH值为7.4-8.0，而还原型辅酶稳定的PH条件需达到PH9.0以上。稳定PH的差异导致在正常的条件下，不能使得2个酶都保持最佳稳定条件。而使用本发明方法修饰后的N-乙酰神经氨酸醛缩酶，因酶构象的改变，酶的稳定PH变化为8.8-9.2。这样可以使2个酶都在最佳的稳定条件下共存。
(4)经过修饰后的酶活力更高，在试剂中稳定性更佳，同时不与还原型辅酶互相干扰，使得试剂的灵敏度更佳，可以检测到更微量的唾液酸，在值相对较低的样本检测中，准确度更佳。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明试剂盒的定标曲线；
图2为本发明试剂盒的相关性分析图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例涉及一种修饰的N-乙酰神经氨酸醛缩酶及其制备方法，所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的氨基酸侧链经烷基化修饰。
所述制备方法包括如下步骤：
使用三乙胺作为溶剂，N-乙酰神经氨酸醛缩酶与碳化二亚胺以1:3的质量比混合，在室温下搅拌过夜，去除其氨基酸侧链的羧基；
在上述含去除羧基的N-乙酰神经氨酸醛缩酶的溶液中加入盐酸胍，使用冰醋酸调节PH至5.0～6.0下，室温搅拌过夜。所述去除羧基后的N-乙酰神经氨酸醛缩酶与盐酸胍的质量比为1:5。
实施例2
本实施例提供一种含有实施例1制备的修饰的N-乙酰神经氨酸醛缩酶的检测试剂盒，其组成如下：
试剂R1各组分及浓度为：
试剂R2各组分及浓度为：
本实施例描述的SA检测试剂盒，适用于各种类型的全自动生化仪，以日立7170全自动生化仪为例，其操作如表1。分析方法：速率法，即试剂R1；R2的用量分别为240μl和60μl，样本量8μl；240μl试剂R1加入8μl样本于37℃5min后加入60μlR2，延迟120秒开始读点，读数时间约180秒；检测波长分别主波长340nm，副波长405nm。
采用本试剂及上述测定方法，采用日立7170生化分析仪测得的SA标准品的曲线(如图1所示)，其中X轴表示SA含量(mg/dl)；Y轴表示吸光度。
表1
实施例3：检测试剂的相关性试验
本实施例的目的是检测本发明实施例2制备的试剂和现有试剂的相关性。
使用本法发明试剂(具体配方同实施例2)和对照试剂日本和光纯药公司的SA试剂，对100份人血清(包括正常和异常标本)按各自参数进行测定，对测定值进行相关性分析。测定结果见图2，X，Y轴均为测定值(SA的含量mg/dl)。
由图2的结果看出，两种试剂的相关系数R2＝0.9928，回归方程为y＝1.0265x-0.926。结果表明本试剂与进口试剂测定病人血清相关性良好，具有很好的特异性和准确性。
此外，以上实验本试剂是采用日立公司制造的7170全自动生化仪进行的，但本发明的试剂不限于上述仪器，还适用于其他全自动或半自动生化分析仪。
实施例4灵敏度试验
本实施例的目的是检测本发明试剂盒在测试样本时的灵敏度。
采用实验例2的试剂、对照试剂、标准品。
操作步骤：测定水样本20次，计算试剂最低检测限。
表2显示，含使用本发明方法修饰的N-乙酰神经氨酸醛缩酶的试剂盒，最低检测限可到达0.5mg/dl。含未修饰的N-乙酰神经氨酸醛缩酶的试剂盒的最低检测限为5mg/dl。试剂的灵敏度大幅提高。
表2
实施例5稳定性试验
本实施例的目的是检测试剂的稳定性。
采用实验例1试剂、标准品、质控品。
操作步骤：
1.试剂盒在加热(37℃)条件下保存7天后，取出试剂盒测定各质控3次，结果如表3所示。
2.试剂盒在冷藏(2～8℃)条件下，每2个月取出试剂盒测定质控，结果如表4所示。
表3显示，试剂在加热(37℃)条件下保存7天后，检测的准确度仍然很好。表4显示，试剂盒在冷藏(2～8℃)条件下，保存14个月后，试剂准确度保持良好。从表中结果可以看出本发明试剂稳定性良好，能长时间保存。适合临床要求。
表3样品37℃加热7天后的检测结果
低值质控 高值质控
1 59.51 102.93
2 58.07 102.52
3 59.67 98.90
平均值 59.083 101.450
靶值 59 100
相对偏差 0.14％ 1.45％
表4.样品保存14个月的稳定性
实施例6
本实施例涉及一种修饰的N-乙酰神经氨酸醛缩酶及其制备方法，所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的氨基酸侧链经烷基化修饰。
所述制备方法包括如下步骤：
使用三乙胺作为溶剂，N-乙酰神经氨酸醛缩酶与碘乙酸以1:5的质量比混合，在室温下搅拌过夜，去除其氨基酸侧链的羧基；
在上述含去除羧基的N-乙酰神经氨酸醛缩酶的溶液中加入盐酸胍，使用冰醋酸调节PH至5.0～6.0下，室温搅拌过夜。所述去除羧基后的N-乙酰神经氨酸醛缩酶与盐酸胍的质量比为1:10。
本实施例还提供一种含有上述方法制备的修饰的N-乙酰神经氨酸醛缩酶的检测试剂盒，其组成如下：
试剂R1各组分及浓度为：
试剂R2各组分及浓度为：
本实施例制备的试剂盒的相关性试验结果与实施例3基本相同，与进口试剂测定病人血清相关性良好，具有很好的特异性和准确性。其灵敏度试验结果为最低检测限可达0.5mg/dl。其稳定性试验结果为：加热(37℃)条件下保存7天后，检测的准确度仍然很好；在冷藏(2～8℃)条件下，保存14个月后，试剂准确度保持良好。本实施例制备的试剂盒能长时间保存，适合临床要求。
实施例7
本实施例涉及一种修饰的N-乙酰神经氨酸醛缩酶及其制备方法，所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的氨基酸侧链经烷基化修饰。
所述制备方法包括如下步骤：
使用三乙胺作为溶剂，N-乙酰神经氨酸醛缩酶碘乙酰胺以1:4的质量比混合，在室温下搅拌过夜，去除其氨基酸侧链的羧基；
在上述含去除羧基的N-乙酰神经氨酸醛缩酶的溶液中加入盐酸胍，使用冰醋酸调节PH至5.0～6.0下，室温搅拌过夜。所述去除羧基后的N-乙酰神经氨酸醛缩酶与盐酸胍的质量比为1:7。
本实施例提供一种含有实施例1制备的修饰的N-乙酰神经氨酸醛缩酶的检测试剂盒，其组成如下：
试剂R1各组分及浓度为：
试剂R2各组分及浓度为：
本实施例制备的试剂盒的相关性试验结果与实施例3基本相同，与进口试剂测定病人血清相关性良好，具有很好的特异性和准确性。其灵敏度试验结果为最低检测限可达0.5mg/dl。其稳定性试验结果为：加热(37℃)条件下保存7天后，检测的准确度仍然很好；在冷藏(2～8℃)条件下，保存14个月后，试剂准确度保持良好。本实施例制备的试剂盒能长时间保存，适合临床要求。
本发明具体应用途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式。应当指出，以上实施例仅用于说明本发明，而并不用于限制本发明的保护范围。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种修饰的N-乙酰神经氨酸醛缩酶，其特征在于，所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的氨基酸侧链经烷基化修饰及酶空间结构修饰；
所述的修饰的N-乙酰神经氨酸醛缩酶的制备方法包括以下步骤：
A1、将N-乙酰神经氨酸醛缩酶与烷基化试剂进行反应，去除其氨基酸侧链的羧基；
A2、将去除羧基后的N-乙酰神经氨酸醛缩酶用盐酸胍进行修饰，即可。
2.如权利要求1所述的修饰的N-乙酰神经氨酸醛缩酶，其特征在于，步骤A1中，所述烷基化试剂包括碳化二亚胺、碘乙酸和碘乙酰胺中的一种或几种混合。
3.如权利要求1所述的修饰的N-乙酰神经氨酸醛缩酶，其特征在于，步骤A1中，所述的反应具体为：使用三乙胺作为溶剂，N-乙酰神经氨酸醛缩酶与烷基化试剂以1:3～5的质量比混合，在室温下搅拌过夜。
4.如权利要求1所述的修饰的N-乙酰神经氨酸醛缩酶，其特征在于，步骤A2中，所述修饰的具体方法为：在所述含去除羧基的N-乙酰神经氨酸醛缩酶的溶液中加入盐酸胍，使用冰醋酸调节PH至5.0～6.0下，室温搅拌过夜。
5.如权利要求4所述的修饰的N-乙酰神经氨酸醛缩酶，其特征在于，所述去除羧基后的N-乙酰神经氨酸醛缩酶与盐酸胍的质量比为1:5～10。
6.一种含有如权利要求1所述的修饰的N-乙酰神经氨酸醛缩酶的试剂盒，其特征在于，包括试剂R1和试剂R2；
所述试剂R1包括以下浓度的各组分：
试剂R2包括以下浓度的各组分：
7.如权利要求6所述的含有修饰的N-乙酰神经氨酸醛缩酶的试剂盒，其特征在于，所述的缓冲液为Good’s缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸-NaOH缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液中的一种或几种；所述R1中缓冲液的PH为5.0-7.0，试剂R2中缓冲液的PH为8.0-10.0。
8.如权利要求6所述的含有修饰的N-乙酰神经氨酸醛缩酶的试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂为吐温20、吐温80、曲拉通-100、十二烷基苯磺酸钠中的一种或几种。
9.如权利要求6所述的含有修饰的N-乙酰神经氨酸醛缩酶的试剂盒，其特征在于，所述稳定剂为牛血清白蛋白、海藻糖、蔗糖、螯合剂EDTA类中的一种或几种；所述防腐剂为叠氮钠或proclin系列防腐剂。
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