CN106318932A

CN106318932A - 芒果精氨酸脱羧酶基因MiADC的克隆方法

Info

Publication number: CN106318932A
Application number: CN201610693059.2A
Authority: CN
Inventors: 刘荣; 刘清国; 范建新; 龚德勇; 黄海; 吴晓波
Original assignee: GUIZHOU SUBTROPICAL CROP INSTITUTE
Current assignee: GUIZHOU SUBTROPICAL CROP INSTITUTE
Priority date: 2016-08-20
Filing date: 2016-08-20
Publication date: 2017-01-11

Abstract

本发明公开了一种芒果精氨酸脱羧酶基因MiADC的克隆方法，该方法以芒果为试验材料，通过芒果总RNA的抽提、cDNA第一链合成、保守区序列的克隆、3'和5'‑RACE的克隆及拼接、序列分析，获得芒果精氨酸脱羧酶基因MiADC的全长cDNA序列。通过本发明的方法获得的基因序列为芒果在非生物胁迫条件下进行分子育种提供基因资源，进一步为生态农业的发展提供理论支撑。

Description

芒果精氨酸脱羧酶基因MiADC的克隆方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及芒果精氨酸脱羧酶基因MiADC的克隆方法。

背景技术

芒果(Mangifera indica L.)属于漆树科，芒果属，是著名的热带水果，有“热带果王”之称，与香蕉、柑桔、苹果及葡萄并列成为世界五大水果。在生产过程中，培育品种优良、抗病性强、耐贮性好和矮化的芒果品种是研究者的重点指标。

精氨酸是植物体内N/C比最高的氨基酸之一，它可以很少的碳结合很多的氮。L-精氨酸在植物中除作为一种重要的氮素贮藏营养物供再利用外，还是生成多胺(PA)和一氧化氮(NO)等的前体物质，而PA和NO都是植物中重要的信使分子，参与包括生长发育、抗逆性等在内的几乎所有的生理生化过程。精氨酸脱羧酶(ADC)、精氨酸酶(ODC)和一氧化氮合酶(NOS)是L-精氨酸分解代谢的关键酶，精氨酸可经ADC或ODC途径形成PA，也可经NOS途径形成NO，3个酶活性的相对强弱，决定了精氨酸的代谢方向。根系在越冬期间会积累丰富的精氨酸；精氨酸代谢对于植物感知和适应环境变化有重要意义。

因ADC基因在非生物胁迫条件下发挥重要作用，在拟南芥(Waston et al.,1996；Urano et al.,2003)、大豆(Nam et al.,1997)、水稻(Chattopadhyay et al.,1997)、葡萄(Primikirios et al.,1999)等作物中已获得其全长cDNA序列。虽然有较多的研究证实了ADC基因被克隆，但是在芒果中尚未见该基因克隆及序列分析的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种芒果精氨酸脱羧酶基因MiADC的克隆方法，为芒果在非生物胁迫条件下进行分子育种提供基因资源，为生态农业的发展提供理论支撑。

本发明通过以下技术方案实现其目的：

一种芒果精氨酸脱羧酶基因MiADC的克隆方法，包括以下步骤：

1)以芒果为供试材料，称取其叶片研磨后，提取其总RNA，并冷冻保存备用；

2)以步骤1)的总RNA为模板，进行cDNA第一链的合成及3'和5'RACE ready cDNA的准备；

3)以步骤2)中获得的cDNA为模板，进行MiADC基因保守区序列的扩增，并进行克隆测序；

4)以步骤2)中获得的3'/5'RACE ready cDNA为模板，以步骤3)获得的保守区序列设计特异性引物扩增MiADC基因，并进行克隆测序。

其中，步骤1)中采集芒果幼嫩叶片，通过改良CTAB法抽提芒果总RNA。

步骤2)中采用第一链cDNA合成试剂盒(RevertAid First Strand cDNASynthesis Kit)和cDNA末端快速扩增试剂盒(SMARTer RACE cDNA Amplification Kit)。

步骤3)中利用NCBI搜索不同物种中MiADC基因编码的氨基酸序列，进行多序列比对后，在保守区域设计简并引物，引物信息为：

ADC-sense：5'-CACCCTGCCCCACcargarathga-3'

ADC-antisense：5'-GCCGGAGGTGGAGccraartgncc-3'。

5、根据权利要求1所述的芒果精氨酸脱羧酶MiADC基因的克隆及序列分析方法，其特征在于：步骤4)中获得MiADC基因的保守区序列后，采用primer premier 5.0软件设计MiADC基因的特异引物，并通过RACE法进行MiADC基因克隆；

引物信息为：

ADCGsp1-1：5'-GAGCAAAACTGAGAACTAAACATTCGGGACA-3'

ADCGsp1-2：5'-CGTGTGGTGAGGAAACTTGAACAGGCT-3'

ADCGsp2-1：5'-GCCAGCCTGTTCAAGTTTCCTCACCA-3'。

在完成MiADC基因的克隆后，可以采用生物信息学的手段进行序列分析，即采用生物软件进行了MiADC基因序列的分析。

本发明的有益效果：本发明是以芒果为试验材料，通过设计简并引物获得该基因的保守区序列后，再设计特异性引物，利用RACE技术克隆获得芒果精氨酸脱羧酶基因MiADC的全长cDNA序列，为芒果在非生物胁迫条件下进行分子育种提供基因资源，为生态农业的发展提供理论支撑。

具体实施方式

为加深对本发明理解，下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，该实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。在本发明基础上作出的修改或改进，若对本领域技术人员是显而易见的，则属于本发明要求保护的范围。以下内容中如涉及数量或比例，如无特别说明，均表示质量单位或质量比例。

实施例1：

该基因MiADC的克隆方法，采取芒果为试验材料，通过总RNA的抽提、cDNA第一链合成、保守区序列克隆、3'和5'-RACE克隆及序列分析，获得芒果精氨酸脱羧酶基因MiADC的全长cDNA序列。

步骤1、芒果总RNA的抽提：

分别称取芒果幼嫩和成熟叶片0.2g放入研钵中，用液氮将其研磨成粉末后转至2.0mL的离心管中，迅速加入预热的1,000μL2×CTAB于离心管中，65℃水浴6min；立即加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)于离心管中，4℃、11,000rpm离心15min；将上清液转入新的2.0mL的离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)重复抽提1次；将上清液转入新的1.5mL的离心管中，分别加入1/3体积、和等体积的8mol/L LiCl溶液，-80℃冰箱中沉淀；4℃、11,000rpm离心30min，弃上清，用75％乙醇、无水乙醇分别洗涤沉淀1次，吹干，加入30-50μL DEPC水溶解RNA，电泳检测其完整性，并保存于-80℃备用。

步骤2、cDNA第一链合成及3'和5'RACE ready cDNA的准备：

cDNA第一链合成的反应体系：Total RNA3.0μL，Oligo(dT)₁₈Primer 1.0μL，补足DEPC-trade water至12.0μL。65℃温育5min，立刻置冰上冷却30s。在上述PCR管中加入以下反应试剂：变性总RNA12.0μL，5×RT Buffer4.0μL，dNTP Mix 2.0μL，RNase Inhibitor 1.0μL，Revert Aid MM-RTase1.0μL。轻轻吹吸混匀后，短暂离心。反应程序：30℃，10min；42℃，60min；70℃，5min；12℃，保存。注意使用热盖PCR仪。反转录产物置于-20℃冰箱保存备用。

3'和5'RACE ready cDNA的准备：3'和5'RACE ready cDNA是以芒果嫩叶叶片总RNA为模板，按照SMARTer RACE cDNAAmplification Kit说明书进行合成。3'和5'RACEready cDNA产物置于-20℃冰箱保存备用。

步骤3、保守区克隆测序：

利用NCBI搜索不同物种中MiADC基因编码的氨基酸序列，进行多序列比对后，通过CODEHOPs在保守区域设计简并引物。以反转录的cDNA为模板，用ADC-sense和ADC-antisense引物对ADC基因保守区进行PCR扩增。PCR反应体系：2×Taq PCR MasterMix 25.0μL，sense 1.0μL，antisense 1.0μL，cDNA模板1.0μL，补足ddH₂O至50.0μL。PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次；72℃再延伸10min；12℃保存。使用浓度为1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，连接到19-T载体，转化E.Coli DH5α感受态细胞，筛选重组子并进行菌落PCR验证，将阳性克隆送北京诺赛公司测序；目的片段的纯化和胶回收都是按照试剂盒提供的说明书进行操作。

步骤4、3'和5'-RACE克隆：

以保守区序列为基础，采用primer premier 5.0软件设计MiADC基因的特异引物，引物设计的原则：引物长度为23-28bp，GC含量为50-70％，Tm≥65℃。以3'和5'RACE readycDNA为模板，按照SMARTer RACE cDNAAmplification Kit说明书进行扩增。PCR反应体系：2×Tag PCR MasterMix 25.0μL，3'-RACE-Ready cDNA3.0μL，10×UPM 5.0μL，GSP 2.0μL，补足ddH₂O至50.0μL。PCR反应程序：反应程序：94℃30s，72℃3min，循环5次；94℃30s，70℃30s，72℃3min，循环5次；94℃30s，68℃30s，72℃3min，循环30次；12℃，保存。使用浓度为1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，通过胶回收试剂盒回收目的条带，连接到19-T载体，转化E.Coli DH5α感受态细胞，筛选重组子并进行菌落PCR验证，将阳性克隆送北京诺赛公司测序；目的片段的纯化和胶回收都是按照试剂盒提供的说明书进行操作。

步骤5、序列分析：

蛋白质的基本分析：http://web.expasy.org/protparam/

疏水/亲水性分析：http://web.expasy.org/protscale/

信号肽分析：http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/

亚细胞定位：http://wolfpsort.org/

跨膜结构分析：http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html

http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0

保守结构域分析：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

当然，以上只是本发明的具体应用范例，本发明还有其他的实施方式，凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明所要求的保护范围之内。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110> 贵州省亚热带作物研究所

<120> 芒果精氨酸脱羧酶基因MiADC的克隆方法

<130> nm:

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> cDNA

<213> 人工序列

<400> 1

caccc tgccc cacca rgara thga 24

<210> 2

<211> 24

<212> cDNA

<213> 人工序列

<400> 2

gccgg aggtg gagcc raart gncc 24

<210> 3

<211> 31

<212> cDNA

<213> 人工序列

<400> 3

gagca aaact gagaa ctaaa cattc gggac a 31

<210> 4

<211> 27

<212> cDNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgtgt ggtga ggaaa cttga acagg ct 27

<210> 5

<211> 23

<212> cDNA

<213> 人工序列

<400> 5

gccag cctgt tcaag tttcc tcacc at 27

Claims

1.一种芒果精氨酸脱羧酶基因MiADC的克隆方法，其特征在于包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的芒果精氨酸脱羧酶MiADC基因的克隆及序列分析方法，其特征在于：步骤1)中采集芒果幼嫩叶片，通过改良CTAB法抽提芒果总RNA。

3.根据权利要求1所述的芒果精氨酸脱羧酶MiADC基因的克隆方法，其特征在于：步骤2)中采用第一链cDNA合成试剂盒和cDNA末端快速扩增试剂盒。

4.根据权利要求1所述的芒果精氨酸脱羧酶MiADC基因的克隆方法，其特征在于：步骤3)中利用NCBI搜索不同物种中MiADC基因编码的氨基酸序列，进行多序列比对后，在保守区域设计简并引物，引物信息为：

ADC-sense：5'-CACCCTGCCCCACcargarathga-3'

ADC-antisense：5'-GCCGGAGGTGGAGccraartgncc-3'。

5.根据权利要求1所述的芒果精氨酸脱羧酶MiADC基因的克隆方法，其特征在于：步骤4)中获得MiADC基因的保守区序列后，采用primer premier 5.0软件设计MiADC基因的特异引物，并通过RACE法进行MiADC基因克隆；

引物信息为：

ADCGsp1-1：5'-GAGCAAAACTGAGAACTAAACATTCGGGACA-3'

ADCGsp1-2：5'-CGTGTGGTGAGGAAACTTGAACAGGCT-3'

ADCGsp2-1：5'-GCCAGCCTGTTCAAGTTTCCTCACCA-3'。