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CN106279437A - 高糖基化人凝血因子viii融合蛋白及其制备方法与用途 - Google Patents

高糖基化人凝血因子viii融合蛋白及其制备方法与用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高糖基化的重组人凝血因子VIII(FVIII)融合蛋白、其制备方法及用途。该融合蛋白从N端到C端依次包含人FVIII、柔性肽接头、至少1个人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端肽刚性单元和延长半衰期部分(优选人IgG Fc变体)。该融合蛋白具有与重组FVIII类似的生物学活性及延长的体内活性半衰期，从而改善药代动力学和药效。

Description

高糖基化人凝血因子VIII融合蛋白及其制备方法与用途
技术领域
本发明涉及融合蛋白领域，更具体地，涉及一种人凝血因子VIII(FVIII)的融合蛋白及其制备方法和用途，特别是治疗多种凝血相关疾病的用途。
背景技术
凝血因子VIII(FVIII)，又称抗血友病因子，在内源性凝血体系中具有十分重要的作用。据FVIII分子遗传学的大量研究结果，表明性染色体X-连锁基因中缺乏FVIII时会导致A型血友病。据统计，血友病A在男性人群中患病率为1/5000，占血友病总数的80％以上。血友病A目前常用的治疗方法为替代治疗，即补充血友病患者所缺乏的凝血因子VIII。
FVIII是多结构的大分子糖蛋白，分为6个结构域：三个A结构域(A1、A2、A3)，一个富碳水化合物且非必需的中央结构域(B-结构域)和两个C结构域(C1、C2)。成熟的蛋白质由大约分子量为280kDa的轻链和重链组成。轻链分子量约为80kDa，结构包括A3，C1和C2，连接方式为A3-C1-C2。重链分子量约90至200kDa，结构包括A1，A2和B，连接方式为A1-A2-B。重链和轻链连接是金属离子依赖性的。在血浆中，重链和轻链的二聚体再以高亲和力结合冯.维勒布兰德因子(von Willebrand,vWF)，保护其免于成熟前降解。血浆中非活化FVIII结合vWF的半衰期约为12小时。FVIII在重链内的氨基酸Arg372和Arg740，及在轻链内的Arg1689处被活化的凝血因子FX(FXa)及凝血酶蛋白水解切割而活化，导致vWF因子释放并产生活化的FVIII二聚体(FVIIIa)，在Ca2+存在下，它在磷脂表面上与活化凝血因子FIX(FIXa)及FX形成紧密复合物，FX接着被FIXa激活，活化的FX被从复合物中解离出来，转而将凝血酶原转化为凝血酶，后者能将纤维蛋白原直接转化成纤维蛋白。作为一种凝血系统的辅助因子，FVIII能使FIXa对FX的活化催化效率增强达几个数量级。
FVIII分子是迄今克隆的最长的基因片段之一，且是应用于临床的分子量最大的蛋白药物。对于分子量大、糖基化程度高的重组蛋白，哺乳动物细胞是最优的表达系统。然而，FVIII在体外重组表达量明显低于与其它性质类似的基因，如FVIII表达水平只有FIX的1％。这可能是机体对FVIII需求的反映，但这对体外重组表达FVIII而言无疑是一大障碍。此外，由于FVIII在血液中半衰期较短，仅为8-12小时，严重血友病A患者进行预防性治疗，必须每周静脉内(i.v.)注射约3次。
为了延长FVIII的体内功能半衰期，现有技术将FVIII与PEG、人血清白蛋白(HSA)、转铁蛋白或IgG Fc等延长半衰期部分连接。例如，目前Novo Nordisk(N8-GP)，Bayer(BAY94-9027)和Baxter(BAX 855)公司均开发了PEG化的长效FVIII产品，并已进入临床研究，但在该蛋白制备工艺中增加了PEG与FVIII化学缀合的额外步骤，降低了最终产率、加大了制备成本。药代动力学研究数据显示，PEG化的FVIII并未获得显著延长的半衰期，如N8-GP在A型血友病患者体内的循环半衰期约18小时(Tiede A等，J Thromb Haemost，2013，11:670-678)。BAY94-9027的临床I期研究显示其在健康人体内半衰期约为18.2小时，较野生型FVIII延长了约1.4倍(Coyle T等，Haemophilia，2012，18(Suppl3):22)。Bax 855的半衰期约18小时(Turecek PL等，Hamostaseologie，2012，32Suppl 1:S29-38)。
由美国Biogen Idec公司开发的单体-二聚体杂合体型重组FVIIIFc融合蛋白(monomer-dimer hybrid FVIII-Fc)：于2014年6月被美国FDA批准上市。临床数据显示，在人体内半衰期延长了仅1.5～1.7倍(Dumont J A等,Blood,2012,119:3024–3030；Powell JS等,Blood,2 012,119:3031–3037)，需每3～5天注射1次。据报道，Biogen公司构建的rFVIIIFc与Fc的双表达载体转染HEK-293细胞，在其表达的产物中并未预期检测出rFVIIIFc同源二聚体形式的融合体，仅表达出单体-二聚体杂合体型rFVIIIFc融合蛋白和Fc二聚体，该公司研究人员推测可能原因是所采用的表达系统因同源二聚体型分子量过大，宿主细胞未能成功分泌分子量约400KDa的rFVIIIFc同源二聚体蛋白，或因rFVIIIFc单体间的空间位阻效应，而未能发生聚合(Peters RT等,J Thromb Haemost,2013,11(1):132-41)，由此可见，同源二聚体型FVIII融合蛋白的表达是相当困难的。
人绒毛膜促性腺激素(hCG)β链的羧基末端肽(以下称其为CTP)也具有延长某些蛋白质体内半衰期的作用，因此一些专利文献公开的融合蛋白中包含的延长半衰期部分可以选择使用免疫球蛋白Fc片段、HSA、CTP或其他能延长半衰期的融合配体。另外，CTP也可以作为接头，主要用于连接同一个蛋白质的不同亚基。例如，中国专利CN103539860A、CN103539861A、CN103539868A和CN103539869A公开的融合蛋白中，CTP作为接头，位于促卵泡激素的beta亚基和alpha亚基之间；专利WO2005058953A2公开的融合蛋白中，CTP作为接头，用于连接糖蛋白激素的beta亚基和alpha亚基。
本发明人没有根据现有技术将CTP作为接头或者作为延长半衰期部分，而是将它与柔性肽接头(例如(GGGGS)n)连接组成新的接头序列，设置于FVIII和延长半衰期部分之间(如，免疫球蛋白Fc片段，但不包括现有技术所提示的CTP)之间，组成新的FVIII融合蛋白，从而进一步延长了半衰期，并且保持了良好的生物学活性和功能。
发明内容
本发明提供一种高糖基化的同源二聚体型凝血因子VIII的Fc融合蛋白，具有延长的体内活性半衰期且与重组FVIII相似的生物学活性。此外，本发明提供了一种高效、稳定表达所述融合蛋白的方法，该方法表达的融合蛋白具有产量高、在制备和存储过程中稳定性好，并且其生物活性和已上市的重组FVIII因子相似的优点。
本发明第一方面，提供一种高糖基化FVIII融合蛋白(以下简称融合蛋白)，所述融合蛋白从N端至C端依次含有人凝血因子VIII(hFVIII)、柔性肽接头(Linker，L)、至少一个人绒毛膜促性腺激素β亚基的羧基末端肽刚性单元(以下简称CTP刚性单元，表示为(CTP)n，较优地，n为1,2,3,4,或5)和延长半衰期部分(如，免疫球蛋白Fc段、白蛋白、转铁蛋白或PEG，优选人IgG Fc变体(表示为vFc))。本发明的一些优选实施例中，所述融合蛋白表示为hFVIII-L-CTPn-vFc。
其中，所述hFVIII为野生型或其突变型；进一步地，所述野生型hFVIII具有如SEQID NO：1所示的氨基酸序列；优选地，所述突变型hFVIII与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列至少85％同源；更优选地，所述突变型hFVIII与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列至少90％同源。最优选地，所述突变型hFVIII与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列至少95％同源。
其中，所述柔性肽接头优选非免疫原性的，并且在hFVIII和Fc之间产生足够的空间距离，使相互之间的位阻效应降至最低。较佳地，使用含有2个或更多个氨基酸残基组成的柔性肽接头，且选自下列几种氨基酸：Gly(G)、Ser(S)、Ala(A)和Thr(T)。
更优选地，所述柔性肽接头包含G和S残基。连接肽的长度对融合蛋白的活性非常重要。对本发明而言，所述肽接头可优选地包含以(GS)a(GGS)b(GGGS)c(GGGGS)d循环单元组合形成的氨基酸序列通式，其中a，b，c和d是大于或等于0的整数，且a+b+c+d≥1。
具体地，本发明的实施例中，所述肽接头可优选地包含如下序列：
(i)L1：GSGGGSGGGGSGGGGS(如SEQ ID NO：2所示)；
(ii)L2：GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(如SEQ ID NO：3所示)；
(iii)L3：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(如SEQ ID NO：4所示)；
(iv)L4：GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(如SEQ ID NO：5所示)；
(v)L5：GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS(如SEQ ID NO：6所示)；
其中，所述CTP刚性单元选自由人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端第113至145位氨基酸所组成的全长序列或其片段，具体地，所述CTP刚性单元包含如SEQ ID NO：7所示氨基酸序列或其截短的序列。首先，这种人体内天然存在的含有多个糖基化位点的CTP多肽是非免疫原性的。其次，含有多个糖基化位点的CTP刚性连接肽相对于柔性连接肽的无规则卷曲，它可以形成稳定的立体构象，促使FVIII和Fc段独立折叠形成正确三维构象而互不影响各自生物活性。另外，CTP糖基侧链的保护作用可以降低连接肽对蛋白酶的敏感性。
优选地，所述CTP刚性单元包含至少2个糖基化位点；例如，本发明的一优选实施例中，所述CTP刚性单元包含2个糖基化位点，示例性地，所述CTP刚性单元包含SEQ ID NO：7N端的10个氨基酸，即SSSS*KAPPPS*；或所述CTP刚性单元包含SEQ ID NO：7C端的14个氨基酸，即S*RLPGPS*DTPILPQ；又如，另一实施例中，所述CTP刚性单元包含3个糖基化位点，示例性地，所述CTP刚性单元包含SEQ ID NO：7N端的16个氨基酸，即SSSS*KAPPPS*LPSPS*R；再如，另一些实施例中，所述CTP刚性单元包含4个糖基化位点，示例性地，所述CTP刚性单元包含28、29、30、31、32或33个氨基酸并开始于人绒毛膜促性腺激素β亚基的第113、114、115、116、117或118位，终止于第145位。具体地，所述CTP刚性单元包含SEQ ID NO：7N端的28个氨基酸，即SSSS*KAPPPS*LPSPS*RLPGPS*DTPILPQ。在本文中，*代表糖基化位点。每种可能性都代表本发明的独立实施方式。
在另一些实施例中，本发明提供的CTP刚性单元与天然CTP氨基酸序列至少70％同源；在另一些实施例中，本发明提供的CTP刚性单元与天然CTP氨基酸序列至少80％同源；在另一些实施例中，本发明提供的CTP刚性单元与天然CTP氨基酸序列至少90％同源；在另一些实施例中，本发明提供的CTP刚性单元与天然CTP氨基酸序列至少95％同源。
本发明具体实施例中所述CTP刚性单元可优选地包含如下序列：
(i)CTP1：PRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(如SEQ ID NO：7所示)；
(ii)CTP2：SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(如SEQ ID NO：8所示)；
(iii)CTP3：SSSSKAPPPS(如SEQ ID NO：9所示)；
(iv)CTP4：SRLPGPSDTPILPQ(如SEQ ID NO：10所示)。
本发明一些实施例中，所述融合蛋白包含1个上述CTP刚性单元。
本发明另一些实施例中，所述融合蛋白包含1个以上的上述CTP刚性单元，优选地，包含2，3，4或5个上述CTP刚性单元，例如，本发明的一实施例中，所述融合蛋白包含2个CTP3刚性单元：SSSSKAPPPSSSSSKAPPPS(CTP3-CTP3，或表示为(CTP3)2)。
其中，延长半衰期部分优选自免疫球蛋白IgG、IgM、IgA Fc片段；更优选自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4及其变体的Fc片段；进一步地，所述人IgG Fc变体包含位于野生型人IgGFc中的至少一种氨基酸修饰，且变体具有降低的效应子功能(ADCC和/或CDC效应)和/或与新生儿受体FcRn的结合亲和力增强。进一步地，人IgG Fc变体可选自下组：
(i)vFcγ1：含有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突变的人IgG1绞链区、CH2和CH3区域(如SEQ ID NO：11所示氨基酸序列)；
(ii)vFcγ2-1：含有Pro331Ser突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域(如SEQ ID NO：12所示氨基酸序列)；
(iii)vFcγ2-2：含有Thr250Gln和Met428Leu突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域(如SEQ ID NO：13所示氨基酸序列)；
(iv)vFcγ2-3：含有Pro331Ser、Thr250Gln和Met428Leu突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域(如SEQ ID NO：14所示氨基酸序列)；
(v)vFcγ4：含有Ser228Pro和Leu235Ala突变的人IgG4绞链区、CH2和CH3区域(如SEQ ID NO：15所示氨基酸序列)。
本发明所提供的IgG Fc变体包含但不限于(i)～(v)中所述5种变体，还可以是IgG同种亚型间两类功能变体突变位点的组合或叠加，如上述(iv)中所述变体即是由(ii)和(iii)中的突变位点相叠加所获得的新的IgG2Fc的组合变体。
本发明所述融合蛋白中的Fc变体(vFc)，它含有人IgG如人IgG1、IgG2和IgG4的绞链区、CH2和CH3区域。这种CH2区域在228、234、235和331位(由EU计数系统确定)含有氨基酸突变。据信这些氨基酸突变能降低Fc的效应子功能。人IgG2不结合FcγR，但显示出极弱的补体活性。具有Pro331Ser突变的Fcγ2变体应比天然Fcγ2的补体活性更低，而且依旧是FcγR非结合子。IgG4Fc在激活补体级联中有缺陷，且它与FcγR的结合亲和力比IgG1低约一个数量级。与天然Fcγ4相比，具有Leu235Ala突变的Fcγ4变体应表现出最小的效应子功能。具有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突变的Fcγ1也表现出比天然Fcγ1降低的效应子功能。这些Fc变体都比天然人IgG Fc更适于制备FVIII融合蛋白。而250和428位(由EU编号体系确定的位置)含有氨基酸突变，使得Fc区与新生儿受体FcRn的结合亲和力增加，从而进一步延长半衰期(Paul R等,J Biol Chem,2004,279:6213–6216)；上述两类功能变体的相互组合或叠加，获得新的组合变体，使其效应子功能降低的同时且延长了其半衰期。本发明所述Fc变体包含却不局限于上述几个位点的突变，也可引入其它位点的替换使得Fc具有降低的效应子功能和/或与FcRn受体的结合力增强，同时还不会致使Fc变体功能/活性降低或引起不良的构象变化，常见的突变位点可以参见Shields RL等,J Biol Chem,2001,276(9):6591-604。
本发明的一优选实施例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示；
根据本发明的另一个方面，提供一种编码上述融合蛋白的DNA。
本发明的一优选实施例中，所述融合蛋白的DNA序列如SEQ ID NO：17所示。
根据本发明的再一个方面，提供一种载体，该载体包含上述DNA。
根据本发明的再一个方面，提供一种宿主细胞，该宿主细胞包含上述载体，或者转染了上述的载体。
在本发明的具体实施方式中，宿主细胞是CHO的衍生细胞株DG44。
根据本发明的第五方面，提供一种药物组合物。该药物组合物包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂，以及有效量的上述融合蛋白。
根据本发明的另一方面提供了一种从哺乳动物细胞系如CHO衍生的细胞系制备或生产所述融合蛋白的方法，包括以下步骤：
(a)将编码所述融合蛋白的DNA引入CHO细胞，生成CHO衍生的细胞系；
(b)筛选步骤(a)中在其生长培养基中每24小时期间内，表达超过1IU/106个细胞的高产量细胞株；
(c)培养步骤(b)筛选到的细胞株，表达融合蛋白；
(d)收获步骤(c)得到的发酵液，并分离纯化融合蛋白。
进一步地，所述步骤(a)中CHO衍生细胞系为DG44。
进一步地，所述步骤(c)中，细胞培养可选用分批、灌流或流加培养方法。
进一步地，所述步骤(d)中采用四步层析法对融合蛋白进行纯化，分别为亲和层析、疏水层析、阴离子交换层析和分子筛层析。本发明结合实施例5进一步给出其优选条件。
本发明优选实施例中，采用上述方法制备得到的融合蛋白的活性>6000IU/mg。
根据本发明的第六方面，提供所述融合蛋白在制备用于预防或治疗因FVIII缺乏或功能缺陷导致的出血性疾病或事件的药物中的应用。
进一步地，所述疾病包括甲型(或称A型)血友病。在甲型血友病患者的自发出血事件、手术预防、围手术期处理或手术治疗中，本发明所述融合蛋白起到控制或预防出血发生的作用。
本发明人发现，本发明所公开和/或所记载的融合蛋白及其制备方法的优点可以概括如下：
1、本发明构建的FVIII融合蛋白，其Fc段是非裂解性的，即通过对Fc片段的补体、受体结合域进行突变，调节Fc与相应受体的结合亲和力，降低或消除ADCC和CDC效应，而只保留Fc段延长活性蛋白体内半衰期的作用，却不产生细胞毒性。Biogen公司开发的FVIII融合蛋白，其Fc段是天然来源的，可以预测由Fc介导的不良效应子功能必将会增加患者的治疗风险。
2、本发明采用CHO细胞表达融合蛋白且表达产物中仅含有同源二聚体型FVIII Fc融合蛋白，其纯化步骤简单、高效。而Biogen公司为了表达单体-二聚体杂合体(Monomeric)FVIII融合蛋白，构建了一种表达rFVIIIFc与Fc的双表达载体，转染HEK-293细胞(美国专利，公开号：US20130274194A1)。其所表达的融合蛋白发酵液中预期应含有三种形式的产物，分别是FVIII-Fc:FVIII-Fc同源二聚体型(Dimeric)融合蛋白、FVIII-Fc:Fc单体-二聚体杂合体(Monomeric)融合蛋白以及Fc:Fc二聚体。在融合蛋白表达过程中，因宿主细胞需同时表达FVIII-Fc和Fc两种单链分子，再分别两两聚合形成上述三种产物，因而使最终目的产物的表达效率大大减弱；同时，在纯化过程中，还必须去除另外两种形式的杂质，这使其纯化过程也更为复杂，生产效率降低、其生产成本也大大增加。因此，本发明的制备方法相对于Biogen公司开发的Monomeric rFVIIIFc融合蛋白具有一定的技术优势和价格优势，其表达、纯化工艺都更简单、高效，生产成本也更低。
3、HemA小鼠按30IU/kg、90IU/kg和270IU/kg剂量给予本发明FVIII融合蛋白FP-B，中、高剂量组能有效地控制HemA小鼠急性出血状况，且FP-B各剂量组小鼠的存活率较重组FVIII(Xyntha，辉瑞)给药组均有所提高，反映出融合蛋白FP-B比Xyntha具有更持久的药效作用。同时，FP-B高剂量和低剂量组无论在出血时间和出血量等结果均表现出剂量相关性。
4、较重组FVIII，本发明所述融合蛋白可以预期具有降低的免疫原性，降低患者体内中和抗体的产生。
5、本发明制备的融合蛋白保持了较高的生物学活性，纯化的各批次融合蛋白活性大约在6000-10000IU/mg范围，换算为摩尔比活性约2340-3900IU/nM(每个融合蛋白含有2个FVIII，相当于1170-1950IU/nM FVIII)；还有一些批次，纯化融合蛋白的活性甚至超过12000IU/mg(换算为摩尔比活性约4680IU/nM，相当于2340IU/nM FVIII)。因而，本发明制备的融合蛋白与Biogen公司所开发的单体-二聚体杂合体rFVIIIFc融合蛋白(活性为1660-1770IU/nM)(J.McCue等,Biologicals,2015,43:213-219)以及已上市的重组FVIIIReFacto(活性为1521-2287IU/nM)(美国专利，公开号：US20130274194A1)的活性相当甚至更高，说明本发明提供的融合蛋白，其C端融合的Fc对FVIII的活性几乎没有影响。
6、本发明提供的融合蛋白包含具有多个糖基侧链的刚性CTP多肽，相对于(GGGGS)n这类柔性连接肽的无规则卷曲，它可以形成稳定的立体构象，这种“阻隔”作用促使FVIII和Fc段独立折叠形成正确的三维构象而互不影响各自的生物活性。CTP含有糖基，带负电、高度唾液酸化的CTP能够抵抗肾脏对其清除作用，进一步延长融合蛋白的半衰期；再一方面，CTP糖基侧链的保护作用可以降低连接肽对蛋白酶的敏感性，使融合蛋白不易在连接区被降解。
7、本发明所述融合蛋白无论在发酵、纯化过程以及储存过程中均具有良好的稳定性。
8、本发明提供的所述融合蛋白的制备方法，产量较高，在300ml摇瓶中培养14天，累积产量至少可达到150mg/L，可进行工艺放大，实现大规模工业化生产。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。
发明详述：
hCG-β羧基末端肽(CTP)
CTP是一段来自人绒毛膜促性腺激素(hCG)的β-亚基羧基末端的短肽。四种与生殖相关的多肽类激素促卵泡激素(FSH)、黄体生成素(LH)、促甲状腺素(TSH)和绒毛膜促性腺激素(hCG)含有相同的α-亚基和各自特异的β-亚基。与其它三种激素相比，hCG体内半衰期明显延长，这主要来源于其β-亚基上特有的羧基末端肽(CTP)(Fares FA等,Proc NatlAcad Sci USA,1992,89(10):4304-4308)。天然的CTP含有37个氨基酸残基，它具有4个O-糖基化位点，终端是唾液酸残基。带负电、高度唾液酸化的CTP能够抵抗肾脏对其的清除作用，从而延长蛋白在体内的半衰期(Fares F A等,Proc Natl Acad Sci USA,1992,89(10):4304-4308)。然而，本发明人创造性地将至少一个CTP多肽与适当长度的柔性连接肽连接，共同作为连接肽，用于连接FVIII与延长半衰期部分(如，免疫球蛋白Fc片段)。
本发明人发现，通过在FVIII与Fc变体间增加CTP肽，相当于增加了一段刚性连接肽。这一方面保证了N-端融合的FVIII不会影响Fc变体与FcRn的结合位点，从而影响半衰期；另外Fc的Protein A结合位点对于制备工艺中纯化步骤很重要，连接CTP保证N-端融合的FVIII也不会“罩住”它与protein A的结合位点，因而可选择更便宜和更适用的填料纯化融合蛋白，降低纯化成本。另一方面，CTP的添加也使得约25kDa大小的Fc片段不会干扰N-端融合的FVIII的正确折叠，造成其生物学活性/功能的下降或丧失。具有多个糖基侧链的刚性CTP多肽，相对于(GGGGS)n这类柔性连接肽的无规则卷曲，它可以形成稳定的立体构象，这种“阻隔”作用促使FVIII和Fc段独立折叠形成正确的三维构象而互不影响各自的生物活性。再一方面，CTP糖基侧链的保护作用可以降低连接肽对蛋白酶的敏感性，使融合蛋白不易在连接区被降解。
IgG Fc变体
非裂解性Fc变体
Fc元件来源于免疫球蛋白IgG的恒定区Fc片段，它在消灭病原体的免疫防御中起重要作用。Fc介导的IgG的效应子功能发挥通过两种机制：(1)与细胞表面Fc受体(FcγRs)结合，由吞噬作用或裂解作用或杀伤细胞通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)途径消化病原体，或(2)与第一补体成分C1的C1q结合，引发补体依赖性细胞毒性(CDC)途径，从而裂解病原体。在四种人IgG亚型中，IgG1和IgG3能有效结合FcγRs，IgG4与FcγRs的结合亲和力较低，而IgG2与FcγRs的结合低得难以测定，所以人IgG2几乎没有ADCC效应。此外，人IgG1和IgG3还能有效结合C1q而激活补体级联反应。人IgG2与C1q结合相对弱，而IgG4不与C1q结合(Jefferis R等,Immunol Rev,1998,163:59-76)，所以人IgG2CDC效应也较弱。显然，没有一种天然IgG亚型是非常适合构建FVIII-Fc融合蛋白的。为了得到不具效应子功能的非裂解性Fc，最有效方法是对Fc片段上补体、受体结合域突变改造，调节Fc与相关受体的结合亲和力，降低或消除ADCC和CDC效应，只保留功能蛋白的生物学活性和Fc段长效体内半衰期，而不产生细胞毒性。更多的非裂解性Fc变体所包含突变位点可以参见Shields RL等,J BiolChem,2001,276(9):6591-604或中国发明专利CN 201280031137.2。
与新生儿受体(FcRn)结合亲和力增强的Fc变体
IgG的血浆半衰期取决于它与FcRn的结合，一般在pH 6.0时结合，在pH 7.4(血浆pH)时解离。通过对两者结合位点的研究，改造IgG上与FcRn结合的位点，使之在pH 6.0时结合能力增加。已经证明对于结合FcRn重要的人Fcγ结构域的一些残基的突变可增加血清半衰期。已报道T250、M252、S254、T256、V308、E380、M428和N434中的突变可增加或降低FcRn结合亲和力(Roopenian等,Nat.Rview Immunology7:715-725,2007)。韩国专利号KR 10-1027427公开了具有增加的FcRn结合亲和力的曲妥珠单抗(赫赛汀，Genentech)变体，并且这些变体包含选自257C、257M、257L、257N、257Y、279Q、279Y、308F和308Y的一个或更多个氨基酸修饰。韩国专利公开号KR 2010-0099179提供了贝伐单抗(阿瓦斯汀，Genentech)变体并且这些变体通过包含在N434S、M252Y/M428L、M252Y/N434S和M428L/N434S的氨基酸修饰显示增加的体内半衰期。此外，Hinton等也发现T250Q和M428L2个突变体分别使与FcRn的结合增加3和7倍。同时突变2个位点，则结合增加28倍。在恒河猴体内，M428L或T250QM/428L突变体显示血浆半衰期增加2倍(Paul R.Hinton等,J Immunol,2006,176:346-356)。更多的与新生儿受体(FcRn)结合亲和力增强的Fc变体所包含突变位点可以参见中国发明专利CN201280066663.2。此外，有研究对五种人源化抗体的Fc段进行T250Q/M428L突变不仅改善了Fc与FcRn的相互作用，且在随后的体内药代动力学试验中，发现以皮下注射给药，Fc突变抗体与野生型抗体相比药代动力学参数有所改善，如体内暴露量增加、清除率降低、皮下生物利用度提高(Datta-Mannan A等.MAbs.Taylor&Francis,2012,4(2):267-273.)。
融合蛋白及其制备方法
本发明融合蛋白基因是密码子优化过的由人工合成方法制备。根据本发明所述的核苷酸序列，本领域技术人员可方便的用各种已知方法制得本发明的编码核酸。这些方法不限于人工合成或传统亚克隆等，具体方法可参见J.萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》。作为本发明的一种实施方式，通过分段合成核苷酸序列再进行亚克隆的方法来构建本发明的编码核酸序列。
本发明还提供了一种哺乳动物细胞的表达载体，包含编码本发明的融合蛋白序列以及与之操作性相连的表达调控序列。所述的“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。
哺乳动物细胞表达载体可采用市售的例如但不限于：pcDNA3、pIRES、pDR、pBK、pSPORT等可用于真核细胞系统表达的载体。本领域技术人员还可以根据宿主细胞来选择合适的表达载体。
根据已知空载表达载体的酶切图谱，本领域技术人员可按照常规方法通过限制性酶剪切与拼接，将本发明的融合蛋白的编码序列插入合适的限制性位点，制得本发明的重组表达载体。
本发明还提供了表达本发明融合蛋白的宿主细胞，其中含有本发明的融合蛋白的编码序列。所述的宿主细胞优选的是真核细胞，例如但不限于CHO细胞，COS细胞，293细胞，RSF细胞等。作为本发明的优选方式，所述的细胞是CHO细胞，其可较佳地表达本发明的融合蛋白，可获得活性良好，稳定性良好的融合蛋白。
本发明还提供一种用重组DNA技术制备本发明融合蛋白的方法，其步骤包括：
1)提供编码融合蛋白的核酸序列；
2)将1)的核酸序列插入到合适的表达载体，获得重组表达载体；
3)将2)的重组表达载体导入合适的宿主细胞；
4)在适合表达的条件下培养转染宿主细胞；
5)收集上清液，并纯化融合蛋白产物。
将所述编码序列导入宿主细胞可采用本领域的多种已知技术，例如但不限于：磷酸钙沉淀，脂质体转染，电穿孔，微注射，病毒感染法，碱金属离子法。
有关宿主细胞的培养和表达可参见Olander RM等，Dev Biol Stand 1996，86:338。可通过离心去除悬浮液中的细胞和残渣，收集上清液。
可将上述制备获得的融合蛋白纯化为基本均一的性质，例如在SDS-PAGE电泳上呈单一或特定条带。首先将表达上清浓缩,浓缩液可采用凝胶层析的方法进一步加以纯化，或采用离子交换层析的方法纯化。例如阴离子交换层析或阳离子交换层析。凝胶基质可为琼脂糖、葡聚糖、聚酰胺等常用于蛋白纯化的介质。Q-或SP-基团是较为理想的离子交换基团。最后，还可用羟基磷灰石吸附层析，金属螯合层析，疏水相互作用层析和反相高效液相色谱等方法对上述纯化产物进一步精制纯化。上述所有纯化步骤可利用不同的组合，最终使蛋白纯度达到基本均一。还可利用含有所述融合蛋白的特异性抗体、受体或配体的亲和层析柱对表达的融合蛋白进行纯化。根据所使用的亲和柱的特性，可利用常规的方法，如高盐缓冲液、改变pH等方法洗脱结合在亲和柱上的融合性多肽。
药物组合物
本发明还提供了一种药物组合物，它含有有效剂量(较佳约2～10μg/kg)的本发明的融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将有效量的本发明融合蛋白配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种辅形剂和稀释剂。
药学上可接受的载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。
本发明所述的融合蛋白的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的融合蛋白的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者体重、患者免疫状况、给药途径等。
附图说明
图1、根据本发明实施例的在pcDNA3表达载体内SpeI-EcoRI(酶切位点以标注)片段的FP-B的核苷酸序列及推导的氨基酸序列。人FVIII由信号肽(1-19，以下划线标注)和成熟FVIII蛋白(20-1457)构成。成熟的融合蛋白含有hFVIII(20-1457)、柔性肽接头(1458-1484，以下划线____标注)、CTP刚性单元(1485-1512，以下划线标注)和vFcγ2-3变体(1513-1735)。
图2、纯化后FP-B蛋白的SEC-HPLC峰谱图。
图3、纯化后FP-B蛋白的SDS-PAGE电泳图。
图4：断尾后每只小鼠出血量(μl)。注：*p<0.05，**p<0.01。
图5：断尾后每只小鼠出血时间(s)。注：*p<0.05，**p<0.01。
具体实施方式
实施例1.构建编码FVIII融合蛋白的表达质粒
编码FVIII前导肽、成熟蛋白、柔性肽接头、CTP刚性单元和人IgG vFc变体的基因序列都是人工优化过的CHO细胞偏爱密码子，经人工合成获得。所合成融合蛋白全长DNA片段的5’和3’端各有一个限制性酶内切位点，分别为SpeI和BamHI，全长DNA片段插入至pUC57转移载体相应酶切位点间，并由DNA测序验证序列。
然后再将上述获得的融合蛋白全长基因片段从中间载体转移到以pcDNA3.1为模板并改造的表达质粒PTY1A1的相应酶切位点间，得到融合蛋白高表达质粒。PTY1A1质粒包含但不限于以下重要表达元器件：1)人巨细胞病毒早期启动子和哺乳动物细胞外源高表达所需增强子；2)双重筛选标记物，在细菌中具有卡那霉素抗性，在哺乳动物细胞中具有G418抗性；3)鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)基因表达框，当宿主细胞为DHFR基因缺陷型时，氨甲蝶呤(MTX)能共扩增融合基因和DHFR基因(参见美国专利US 4,399,216)。再将融合蛋白表达质粒转染入哺乳动物宿主细胞系，为了获得稳定高水平的表达，优选的宿主细胞系是DHFR酶缺陷型CHO-细胞(参见美国专利US 4,818,679)。转染两天后，将培养基换成含0.6mg/mLG418的筛选培养基，细胞以一定浓度(5000-10000个活细胞/孔)种植在96孔培养板里，培养10-14天直至大的离散细胞克隆出现。用ELISA分析方法，筛选对选择用药具有抗性的转染子。通过极限稀释96孔培养板，亚克隆产生高水平融合蛋白的孔。
如下表所示，本发明构建了一系列hFVIII融合蛋白，它含有不同长度的肽接头(Linker)、不同组成的CTP刚性单元以及几种不同亚型的IgG Fc变体(vFc)元件组成。为了验证含有至少1个，并且不同长度的CTP刚性单元均能显著提高融合蛋白的活性，我们构建了融合蛋白FP-A、FP-B、FP-C、FP-D和FP-E；其中，FP-B的氨基酸及编码核苷酸如图1所示。为了验证CTP刚性单元对融合蛋白活性的重要性，我们还同时构建了不含CTP刚性单元的Fc融合蛋白FP-G和FP-H，表达质粒构建方法同上。此外，我们还构建了CTP位于Fc C端的FP-F，以验证CTP刚性单元位置的重要性。详见表1。各组成元件的氨基酸序列见序列表。
表1、各种FVIII融合蛋白组成
实施例2.瞬时表达各融合蛋白和活性测定
将实施例1得到的8种表达质粒，在30ml的摇瓶里使用DNAFect LT试剂TM(ATGCell公司)转染3×107CHO-K1细胞，经转染的细胞在含有1000ng/ml维生素K1的无血清生长培养基中生长5天，测定上清液中的融合蛋白浓度，并用实施例6或7中描述的方法测定其活性。ELISA结果显示8种质粒在该条件下的瞬时表达量相似，但是它们凝血活性却显示出较大差别。
其中，我们将FP-A的摩尔比活性定义为100％。FP-G细胞培养上清液中的融合蛋白多以无活性形式的聚合体形式分泌；而FP-F和FP-H质粒表达的融合蛋白活性较低，分别约为FP-A的20.5％和15.2％，同样大部分以聚合体形式表达；另外，融合蛋白FP-F、FP-G和FP-H的稳定性较差，易发生降解。据报道FVIII 2303-2332区域的脂质结合区(Lipid bindingregion)对其功能至关重要，该区域极微小的构象变化即会引起蛋白的聚合，导致活性的丧失(Gilbert GE等,Biochemistry,1993,32(37):9577-9585)。因而我们推测培养上清中的FVIII融合蛋白FP-F、FP-G和FP-H因脂质结合区构象受C端Fc配体的影响发生改变，引起了蛋白的聚集，使活性大大降低。而含有CTP的FP-B、FP-C、FP-D和FP-E的活性分别为FP-A的113.4％、96.0％、87.4％和93.7％。
从FP-B和FP-F、FP-H的活性差异可知仅靠延长肽接头并不能有效改善融合蛋白的活性，也无法解决融合蛋白易发生聚合及降解的问题。而CTP的加入使得融合蛋白FP-B的活性显著增加。我们推测原因，过长的柔性肽接头，给了FVIII更高的灵活度，使其能相对Fc自由转动，这可能使FVIII的立体结构更加靠近Fc区，而在二者之间加入CTP刚性单元，一方面相当增加了一端刚性肽接头，使彼此远离，更重要的是CTP刚性单元含多个糖基侧链，相对于柔性肽接头的无规则卷曲形态，CTP刚性单元可以形成固定的空间构象，能够有效的分开融合蛋白的不同功能区，这更有利于两部分独立折叠形成正确的三维构象，保持了较高的活性。我们通过FP-B和FP-F的活性比较验证了这种推测的正确性，即CTP刚性单元置于Fc C端的FP-F的活性不足CTP刚性单元置于Fc N端的FP-B的20％。以上结果证实CTP刚性单元对融合蛋白的活性极为关键，并且CTP刚性单元置于Fc的N端能有效提高融合蛋白的活性。
实施例3.筛选高表达融合蛋白的稳定转染细胞系
将上述FP-A、FP-B、FP-C、FP-D和FP-E的表达质粒转染入哺乳动物宿主细胞系，以表达FVIII融合蛋白。为了维持稳定的高水平表达，优选的宿主细胞是DHFR缺陷型的CHO细胞(美国专利NO.4818679)。一种优选转染方法是电穿孔，也可以使用其它方法，包括磷酸钙共沉降、脂质体转染和微注射等。电穿孔方法应用设置为300V电压和1050μFd电容的GenePulser Electroporator(Bio-Rad Laboratories公司)，往放置在比色杯内的2～3×107个细胞中加入50μg PvuI线性化的表达质粒，电穿孔后的细胞转移至含30ml生长培养基的摇瓶中。转染两天后，将培养基换成含0.6mg/mL G418的生长培养基，细胞以一定浓度种植在96孔培养板里，培养10-12天直至大的离散细胞克隆出现。用抗人IgG Fc的ELISA分析方法，筛选对选择用药具有抗性的转染子，也可用抗FVIII的ELISA分析方法进行融合蛋白表达的定量测定，然后通过极限稀释法亚克隆产生高水平表达融合蛋白的孔。
为了实现融合蛋白较高水平的表达，宜用受MTX药物抑制的DHFR基因进行共扩增。在含有递增浓度MTX的生长培养基中，用DHFR基因共扩增转染的融合蛋白基因。极限稀释DHFR表达阳性的亚克隆，逐步加压并筛选出能在高达6μM MTX培养基中生长的转染子，测定其分泌率，筛选出高表达外源蛋白的细胞系。将分泌率超过约1(较佳地约3)IU/106(即百万)个细胞/24小时的细胞系使用无血清培养基的进行适应性悬浮培养，然后再用条件培养基纯化融合蛋白。
以下实施例中以FP-B为例，具体描述上述实施例筛选的几种融合蛋白发酵、纯化步骤及方法，FP-A、FP-C、FP-D和FP-E方法相同，实施例中不再赘述。
实施例4.生产融合蛋白
将实施例3优选得到的高产量细胞株首先在培养皿中进行无血清驯化培养，然后转移到摇瓶中进行悬浮驯化培养。待细胞适应这些培养条件后，然后在300ml摇瓶中进行补料流加培养或通过每天更换培养基的办法模拟灌流培养。由实施例3筛选得到的生产融合蛋白FP-B的CHO衍生的细胞株在300ml体积的摇瓶中补料流加培养14天，其表达的重组融合蛋白累积产量达到200mg/L，活细胞密度最高可达到15×106个/mL。为了得到更多融合蛋白，也可以选用1000ml摇瓶培养。另一种培养方法，上述CHO衍生的细胞株在100ml体积的摇瓶中每天更换培养基，其表达的重组融合蛋白每天累积产量约为20mg/L，在摇瓶中活细胞密度最高可达到30×106个/mL。以上两种方法生产的重组融合蛋白的测定的生物学活性相当。
实施例5.纯化与定性融合蛋白
本发明主要采用四步层析法对融合蛋白FP-B进行纯化。分别为亲和层析、疏水层析、阴离子交换层析和分子筛层析(本实施例采用的蛋白纯化仪为美国GE公司的AKTA pure25M。本实施例中采用的试剂均购自国药集团化学试剂有限公司，纯度均为分析级)。
第一步，亲和层析：采用博格隆公司的耐碱Protein A Diamond或其它市售的重组protein A亲和层析介质(例如GE的Mabselect、Mabselect Sure、TOSOH的Toyopearl AF-rProteinA-650F、天地人和的rProtein A Bead，赛分科技的MabPurix、Pall的Protein ACeramic HyperD)进行样品捕获、浓缩以及部分污染物的去除。首先使用平衡buffer：20mMHis-HCl,150mM NaCl，5mM CaCl2，0.02％Tween-80,pH6.8-7.2，以50-100cm/h的线性流速平衡层析柱3-5个柱体积(CV)；将经过澄清后的发酵液以50-100cm/h的线性流速上样，载量不高于50000IU/ml；上样完毕后，使用平衡buffer：20mM His-HCl,150mM NaCl,5mM CaCl2,0.02％Tween 80,pH6.8-7.2，以50-100cm/h的线性流速平衡层析柱3-5个柱体积(CV)，冲洗未结合的组份；使用去污buffer 1：20mM His-HCl,2M NaCl,4M urea，5mM CaCl2，0.02％Tween 80，pH6.8-7.2，以50-100cm/h的线性流速冲洗层析柱3-5个柱体积，去除部分污染物；使用平衡buffer：20mM His-HCl，150mM NaCl，5mM CaCl2，0.02％Tween 80，pH6.8-7.2，以50-100cm/h的线性流速平衡层析柱3-5个柱体积(CV)；然后使用去污buffer 2：20mMHis-HCl,5mM EDTA,150mM NaCl，30％乙二醇、5mM CaCl2,0.02％Tween 80,pH6.8-7.2，以50-100cm/h的线性流速冲洗层析柱3-5个柱体积，去除部分污染物；使用平衡buffer：20mMHis-HCl,150mM NaCl,5mM CaCl2,0.02％Tween 80，pH6.8-7.2，以50-100cm/h的线性流速平衡层析柱3-5个柱体积(CV)；之后使用洗脱buffer：20mM His-HCl，5mM CaCl2，0.02％Tween 80，50％乙二醇，pH5.0，以不高于50cm/h的线性流速洗脱目标产物，收集目标峰，用2M Tris,pH9.0中合pH值至中性(7.0-8.0)。
第二步，疏水层析：使用博格隆公司的Butyl HP或其它市售的疏水层析介质(例如GE的Butyl HP、TOSOH的Toyopearl Butyl-650、天地人和的Butyl Beads4FF，赛分科技的Generik MC30-HIC Butyl、Merck的Fractogel EMD Propyl)进行中间纯化，用于降低聚合体含量。第一步亲和洗脱液中仍含有一定比例的聚合体，因为聚合体的形成原因多样，包括结构未改变的聚合和结构发生变化的聚合，它们的生物学活性差别较大，因此对于生物学活性的分析带来较大的干扰。因此，在完成捕获以后，首先去除聚合体。目标蛋白聚合以后，聚合体和单体之间存在性质上的差异，包括电荷特性以及疏水性，我们使用疏水性的差异对二者进行分离。因为纯化最后步骤是分子筛层析，所以经第一步亲和层析捕获的融合蛋白再使用Butyl HP进行第二步纯化，目标是部分去除聚合体，使其含量低于10％。首先，使用平衡buffer：20mM His-HCl,1.5M NaCl,5mM CaCl2,0.02％Tween 80,pH6.8-7.2，以50-100cm/h的线性流速平衡层析柱3-5个柱体积(CV)；亲和捕获的样品使用平衡buffer稀释2倍，用于降低有机溶剂含量，然后等体积加入浓缩buffer：20mM His-HCl,3M NaCl,5mMCaCl2,0.02％Tween 80,pH6.8-7.2，然后上样，载量控制在<20000IU/ml；上样完毕后，使用平衡buffer：20mM His-HCl,1.5M NaCl,5mM CaCl2,0.02％Tween 80,pH6.8-7.2，以50-100cm/h的线性流速冲洗层析柱3-5个柱体积(CV)；之后使用wash buffer：20mM His-HCl,1.5M NaCl,5mM CaCl2,0.02％Tween 80,20％乙二醇，pH6.8-7.2，以50-100cm/h的线性流速冲洗层析柱3-5个柱体积(CV)，去除部分聚合体；最后进行目标蛋白洗脱，使用洗脱buffer：20mM His-HCl,5mM CaCl2,0.02％Tween 80,50％乙二醇,pH6.8-7.2，以不高于60cm/h的线性流速洗脱，对洗脱组分进行分段收集，分别送检SEC-HPLC。将单体百分比大于90％的目标组分合并进行下一步层析。
第三步，阴离子交换层析：使用博格隆公司的Q-HP或其它市售的阴离子交换层析介质(例如GE的Q HP、TOSOH的Toyopearl GigaCap Q-650、天地人和的DEAE Beads 6FF，赛分科技的Generik MC-Q、Merck的Fractogel EMD TMAE、Pall的Q Ceramic HyperD F)进行中间纯化，分离结构变异体、进一步去除HCP、DNA等污染物。首先使用平衡buffer：20mMHis-HCl,200mM NaCl,5mM CaCl2,0.02％Tween 80,pH6.8-7.2，以50-100cm/h的线性流速冲洗层析柱3-5个柱体积(CV)；经第二步疏水层析分离得到的目标蛋白稀释2倍，降低有机物浓度后上样，载量控制在5000-10000IU/ml；上样完毕，使用平衡buffer：20mM His-HCl,200mM NaCl,5mM CaCl2,0.02％Tween 80,pH6.8-7.2，以50-100cm/h的线性流速冲洗层析柱3-5个柱体积(CV)；之后采用线性梯度的盐浓度进行洗脱，洗脱buffer：20mM His-HCl,1MNaCl,5mM CaCl2,0.02％Tween 80,pH6.8-7.2，条件为洗脱buffer从0-100％，用时2小时，线性流速控制在不高于50cm/h，对洗脱组分进行分段收集，分别送样进行蛋白含量、SEC-HPLC、活性和HCP含量检测。经蛋白浓度测定，及蛋白活性测定，计算出蛋白比活力约为10000IU/mg。
第四步，分子筛层析：使用博格隆公司的Chromdex 200prep grade或其它市售的分子筛介质(例如GE的superdex 200)进行分离，目标是降低聚合体含量至<5％，并进一步降低关键污染物的含量。使用平衡buffer：20mM His-HCl,200mM NaCl,5mM CaCl2,0.02％Tween 80,pH6.8-7.2，以20-40cm/h的线性流速冲洗层析柱2个柱体积(CV)；上样量不高于柱体积的3％，以20cm/h的线性流速冲洗，依次收集洗脱组份，SEC检测，合并。
样品的SEC-HPLC纯度结果及SDS-PAGE电泳结果分见图2和图3，其中SEC-HPLC结果显示，纯化后融合蛋白FP-B的主峰纯度达97％以上，SDS-PAGE电泳带型符合预期，非还原电泳包含未加工融合蛋白(390KDa)，电泳时脱落FVIII的一条重链后的片段HC-LC-L-CTP-Fc:LC-L-CTP-Fc(300KDa)，脱落两条重链后的(LC-L-CTP-Fc)2二聚片段(210KDa)和HC(90KDa)；还原后可得清晰的HC-LC-L-CTP-Fc(190kDa)、LC-L-CTP-Fc(105KDa)和HC(90KDa)单链条带。
实施例6.发色底物法间接测定融合蛋白体外活性
FVIII融合蛋白的活性可采用发色底物法测定。本实施例采用ChromogenixCoatest SP FVIII试剂盒(Chromogenix，Ref.K824086)测定，其检测原理如下:当被凝血酶激活后，FVIIIa在磷脂和钙离子存在下，与FIXa结合形成酶复合物，继而可激活因子X转变成其活性形式Xa。激活形成的因子Xa继而可使其特异性发色底物(S-2765)发生裂解，释放发色基团pNA。在405nm下测定所产生pNA的量，即可知与其量直接成正比关系的FXa的活性大小，其中在体系中因子IXa和因子X的含量是一定且过量的，FXa的活性仅与FVIIIa的含量多少直接相关。以本法测定FVIII融合蛋白的比活性约为6000-10000IU/mg。
实施例7.凝血法直接测定融合蛋白的生物学活性
凝固法测定FVIII生物学活性是通过纠正FVIII因子缺失血浆所导致凝固时间延长的能力而获得的。采用德国Siemens公司Coagulation Factor VIII Deficient Plasma(Cat.No.OTXW17)试剂盒检测FVIII活性的方法如下：首先将已知效价的中检院FVIII活性标准品用5％乏FVIII血浆将其稀释至10IU/ml，然后再分别稀释10倍、20倍、40倍和80倍。以全自动血凝分析仪(CA500，SYSMEX公司)测定活化部分凝血活酶时间(APTT)。以FVIII活性标准品溶液效价(IU/ml)的对数对应其相应的凝固时间(s)的对数作线性回归，以FVIII标准品建立标准曲线。然后将待测样本经适度稀释后与乏FVIII基质血浆混合，进行APTT测定。代入标准曲线方程，可计算得出待测样品FVIII的效价，据此可求算出待测样品FVIII的比活性大小，单位为IU/mg。以本法测定FVIII融合蛋白的比活性约为6000-10000IU/mg。
实施例8.融合蛋白对血友病A小鼠急性出血的止血作用
我们以VIII因子基因剔除纯合子HemA小鼠断尾出血模型(tail clip bleedingmodel)评估实施例5中所制备的融合蛋白FP-B在HemA小鼠体内的止血活性。选取8-12周龄雄性HemA小鼠(购自上海南方模式生物责任有限公司)，适应性饲养一周后将小鼠按体重随机分为6组，另设一组HemA小鼠阴性对照组和一组正常C57小鼠的对照组，分别单次尾静脉注射给予不同活性剂量的融合蛋白FP-B或对照药物任捷(Xyntha，辉瑞)，动物分组情况见表2。
表2：融合蛋白对HemA小鼠止血效果实验动物分组情况
给药前，首先以1.0％戊巴比妥钠(Sigma公司)按照0.1ml/10g剂量腹腔注射麻醉小鼠，然后将小鼠置于37℃的加热垫上以保持其体温。将小鼠尾巴浸入37℃的温水中10分钟，使尾静脉扩张，然后按照表2所示剂量进行给药。给药10分钟后，在距小鼠尾末端1.5cm处剪断，迅速将尾端浸入装有约13ml预热生理盐水的离心管中，并开始计时。如果出血在30分钟内停止，记录出血时间和出血量。如果出血时间超过30分钟，则记为30分钟。出血量(ml)＝(采血后离心管重量(g)-采血前离心管重量(g))/1.05。30分钟后，将鼠尾从生盐水管中取出。在24小时内，每隔10min观察记录复出血情况，并记录小鼠存活数量。所有数据以均数±标准误差(x±SEM)表示，各实验组间比较采用t-test检验分析，分析软件采用Graphpad Prism 5.0，p<0.05认为有统计学意义。
从图4和图5中各组动物的出血时间和出血量的统计结果分析，HemA小鼠给予FP-B270IU/kg 10分钟后，其出血时间和出血量与C57对照组接近，促凝血效果明显，说明FP-B可以作为血友病等凝血因子缺乏症发生急性出血情况的有效凝血剂；小鼠给药FP-B 90IU/kg后，在出血时间和出血量上同样与C57对照组接近。分别给予同等活性剂量的FP-B和任捷，HemA小鼠出血量无显著差异，但各个剂量下，FP-B组的出血时间均略少于任捷组，显示FP-B比任捷可能具有一定的药效优势。与FP-B 30IU/kg给药组比较，FP-B 90IU/kg组的出血时间显著缩短(p<0.05)，FP-B 270IU/kg组的出血时间显著缩短(p<0.05)，出血量也显著减少(p<0.05)，说明融合蛋白FP-B对HemA小鼠急性出血的止血作用具有一定的剂量-效应关系(详细结果见表3)。
从术后恢复情况来看，给予相同活性剂量的FP-B和任捷，FP-B各剂量组的小鼠存活率均优于同等活性剂量的任捷组，反映出融合蛋白FP-B比任捷具有更持久的药效作用(见表3)。
表3：各组HemA小鼠断尾试验的出血时间、出血量、复出血次数和存活率统计
注：a，24-48h内又有小鼠死亡，故统计48h死亡率；
b，出血时间超过30min，记做1800秒；
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (17)

1.一种人凝血因子VIII的融合蛋白，所述融合蛋白从N端至C端依次包含人凝血因子VIII、柔性肽接头、至少1个人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端肽刚性单元和延长半衰期部分(如，免疫球蛋白Fc段、白蛋白、转铁蛋白或PEG，优选人IgG Fc变体)。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白是糖基化的，优选是通过在哺乳动物细胞(如，中国仓鼠卵巢细胞)中表达而糖基化的。
3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述人凝血因子VIII包含如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，或者所述人凝血因子VIII的氨基酸序列与如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列有至少90％的同一性。
4.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述柔性肽接头含有2个或多个选自G、S、A和T残基的氨基酸，
优选地，所述柔性肽接头具有以(GS)a(GGS)b(GGGS)c(GGGGS)d循环单元组合形成的氨基酸序列通式，其中a，b，c和d是大于或等于0的整数，且a+b+c+d≥1，更优选地，所述柔性肽接头优选自下组：
(i)GSGGGSGGGGSGGGGS；
(ii)GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；
(iii)GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；
(iv)GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；
(v)GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS。
5.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述人绒毛膜促性腺激素β亚基的羧基末端肽刚性单元包含如SEQ ID NO：7所示氨基酸序列或其截短的序列，其中，所述截短的序列包含至少2个糖基化位点，
优选地，所述人绒毛膜促性腺激素β亚基的羧基末端肽刚性单元包含以下氨基酸序列：
(i)PRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ；
(ii)SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ；
(iii)SSSSKAPPPS；
(iv)SRLPGPSDTPILPQ。
6.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述人绒毛膜促性腺激素β亚基的羧基末端肽刚性单元与权利要求5所述融合蛋白中的CTP氨基酸序列至少具有70％，80％，90％或95％的同一性。
7.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含1、2、3、4或5个人绒毛膜促性腺激素β亚基的羧基末端肽刚性单元。
8.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述人IgG Fc变体具有降低的ADCC效应和/或CDC效应和/或与FcRn受体的结合亲和力增强，
优选地，所述Fc变体选自：
(i)含有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突变的人IgG1绞链区、CH2和CH3区域；
(ii)含有Pro331Ser突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域；
(iii)含有Thr250Gln和Met428Leu突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域；
(iv)含有Pro331Ser、Thr250Gln和Met428Leu突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域；
(v)含有Ser228Pro和Leu235Ala突变的人IgG4绞链区、CH2和CH3区域。
9.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO：16所示。
10.如权利要求1-9中任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的活性>6000IU/mg。
11.编码如权利要求1-10中任一项所述的融合蛋白的DNA，优选所述DNA的序列如SEQID NO：17所示。
12.一种载体，其特征在于，包含如权利要求11所述的DNA。
13.一种宿主细胞，其特征在于，包含如权利要求12所述的载体，或者转染了权利要求12所述的载体。
14.一种药物组合物，其特征在于，包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂，以及有效剂量的如权利要求1-10中任一项所述的融合蛋白。
15.一种如权利要求1-10中任一项所述的融合蛋白的制备方法，所述方法包括：
(a)将权利要求11所述编码融合蛋白的DNA序列引入CHO细胞，生成CHO衍生的细胞系；
(b)筛选步骤(a)中在其生长培养基中每24小时期间内，表达超过1IU/106(百万)个细胞的高产细胞株；
(c)培养步骤(b)筛选到的细胞株，表达融合蛋白；
(d)收获步骤(c)得到的发酵液，并分离纯化融合蛋白。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述步骤(d)中融合蛋白纯化过程包含亲和层析、疏水层析、阴离子交换层析和分子筛层析。
17.一种如权利要求1-10中任一项所述的融合蛋白在制备用于预防或治疗出血性疾病(例如，用于FVIII先天性或获得性缺乏症患者的出血性疾病的预防或治疗、血友病A患者的自发或手术性出血的预防或治疗)的药物中应用。
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