CN106279397A - 一种神经生长因子的提取方法 - Google Patents
一种神经生长因子的提取方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106279397A CN106279397A CN201510313567.9A CN201510313567A CN106279397A CN 106279397 A CN106279397 A CN 106279397A CN 201510313567 A CN201510313567 A CN 201510313567A CN 106279397 A CN106279397 A CN 106279397A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- supernatant
- chromatography
- extracting method
- buffer
- liquid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 93
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 title claims abstract description 66
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 title claims abstract description 16
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 title claims abstract 4
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims abstract description 54
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 51
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 43
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 35
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 32
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 claims abstract description 28
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 16
- 210000001913 submandibular gland Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 60
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 claims description 48
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 30
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 17
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 17
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 14
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 13
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 12
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 12
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 9
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 claims description 8
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 8
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 claims description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000008213 purified water Substances 0.000 claims description 6
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 5
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 4
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 claims description 4
- 239000000945 filler Substances 0.000 claims description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 3
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 claims description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 2
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 238000002086 displacement chromatography Methods 0.000 claims 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 claims 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 claims 1
- 125000001309 chloro group Chemical group Cl* 0.000 claims 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 claims 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 claims 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000013595 supernatant sample Substances 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 29
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 abstract description 28
- 239000000047 product Substances 0.000 abstract description 18
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 abstract description 14
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 abstract description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 6
- 102100023995 Beta-nerve growth factor Human genes 0.000 description 69
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 47
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 21
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 14
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 13
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 10
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 10
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 9
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 9
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 8
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 8
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 8
- 101710129634 Beta-nerve growth factor Proteins 0.000 description 7
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 7
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 7
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 6
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 5
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 5
- 238000011020 pilot scale process Methods 0.000 description 5
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 210000003594 spinal ganglia Anatomy 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 3
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 3
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 3
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 3
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100404651 Mus musculus Ngf gene Proteins 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000012475 sodium chloride buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 108090000087 Carboxypeptidase B Proteins 0.000 description 1
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101001076784 Mus musculus Kallikrein 1-related peptidase b22 Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 238000011149 butyl sepharose 4FF chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000003837 chick embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000000385 dialysis solution Substances 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001437 electrospray ionisation time-of-flight quadrupole detection Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012527 feed solution Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 238000013365 molecular weight analysis method Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 150000003016 phosphoric acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000012207 quantitative assay Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- -1 salt ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 150000003385 sodium Chemical class 0.000 description 1
- BYKRNSHANADUFY-UHFFFAOYSA-M sodium octanoate Chemical compound [Na+].CCCCCCCC([O-])=O BYKRNSHANADUFY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/48—Nerve growth factor [NGF]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明提供了一种神经生长因子的提取方法，所述方法包括：将小鼠颌下腺组织匀浆后离心收集匀浆上清液；对所述匀浆上清液进行CM反吸附阳离子交换层析后收集流穿液；对所述流穿液进行酸化离心后收集酸解上清液；对所述酸解上清液进行吸附阳离子交换层析收集目标蛋白峰对应的目的蛋白液；对所述目的蛋白液进行疏水层析，获得疏水层析后的目的蛋白液。本发明的工艺简化了工艺步骤，流程简单，不仅大大缩短了制备所用的时间，同时提高了产品的均一性与活性，并且样品纯度也得到了进一步的提高，为NGF的分离纯化提供了新的途径。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体的涉及一种神经生长因子的提取方法。
背景技术
鼠神经生长因子(mouse nerve growth factor，mNGF)是最早发现的NGF，也是研究最为透彻的NGF。完整的mNGF由α、β、γ三种亚基以α2β2γ2的形式组成。其中，两个β亚基是mNGF的生物活性中心，具有mNGF的全部生物学功能；α和γ亚基能够保护β亚基免于小鼠颌下腺中蛋白酶的剪切作用以及抑制β亚基与NGF受体的结合。两个β亚基以非共价键形成二聚体，即β-NGF。
建立β-NGF的分离纯化工艺是其应用开发的基础。1960年Cohen首先提出并建立了小鼠颌下腺中β-NGF的分离纯化方法。随后，多篇文献报道了从鼠颌下腺中分离纯化NGF的改进方法。根据其分离策略的差异，这些方法可以分为两类：一类是先分离得到完整的7S NGF，再解聚7S NGF释放出具有生物活性的β亚基二聚体(β-NGF)，然后进一步分离得到β-NGF；另一类是直接分离具有生物活性的NGF的β亚基二聚体，即2.5S NGF。
目前国内共有四家注射用鼠NGF上市，各公司纯化β-mNGF的方法大多基于两步阳离子(CM sepharose FF)交换层析，方法的主要流程包括：组织破碎---充分透析----CM反吸附层析---充分透析或超滤---酸化解离---CM吸附层析—排阻层析。详细过程可参见任晚琼等发表的文章“冻干鼠神经生长因子中试制备及几点问题的探讨”中介绍的方法，具体为将小鼠颌下腺组织匀浆，离心后得匀浆上清液，将匀浆上清液充分透析后，进行反吸附离子交换层析，收集流穿液；流穿液再次透析或超滤后进行酸化解离、离心，得酸解上清液；酸解上清液在进行吸附离子交换层析，收集目标蛋白峰，目的蛋白液经排阻层析得NGF提取液。
但是该工艺中包含两步透析，透析步骤耗时且操作繁琐。每步透析耗时长达20多个小时，透析体积较大时还易出现渗漏和破裂。另外由于小鼠颌下腺中富含β-NGF内肽酶和类羧肽酶B蛋白酶，这两种酶会剪切β-NGF氨基端或羧基端的氨基酸，所以透析步骤的时间越长，NGF被剪切的几率越大，易造成NGF两端部分氨基酸的缺失比例增加，影响产品的均一性与活性，同时多种剪切形式的存在不利于产品的质量控制。
因此有必要提供一种快速、简便的神经生长因子提取方法，以获得均一性高、活性强、质量好的神经生长因子。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷，提供一种鼠NGF的制备方法。
本发明的发明人在研究过程中很意外的发现，在NGF提取步骤中加入疏水层析过程，可在不使用常规方法中两步透析的前提下达到与常规提取方法相近甚至更好的提取效果，可以大大节省提取所需时间，同时产品的均一性与活性也得以提高。
基于以上发现本发明提供了一种神经生长因子的提取方法，所述方法包括：将小鼠颌下腺组织匀浆后离心收集匀浆上清液；对所述匀浆上清液进行CM反吸附阳离子交换层析后收集流穿液；对所述流穿液进行酸化离心后收集酸解上清液；对所述酸解上清液进行吸附阳离子交换层析收集目标蛋白峰对应的目的蛋白液；对所述目的蛋白液进行疏水层析，获得疏水层析后的目的蛋白液。
可选的，所述疏水层析中使用的疏水柱的平衡液为含盐浓度为0.5-3.0mol/L的pH值为6.0-9.0的缓冲液。
可选的，所述疏水层析中使用的疏水柱的平衡液是将选自氯化钠、硫酸铵和硫酸钠中的一种盐溶解于磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液获得的，在平衡液中溶解的盐的终浓度为0.5-3.0mol/L、pH值为6.0-9.0。
可选的，当所述盐为氯化钠时，氯化钠的终浓度为0.5-3.0mol/L；当所述盐为硫酸铵时，硫酸铵的终浓度为0.5-2.0mol/L；当所述盐为硫酸钠时，硫酸钠的终浓度为0.5-2.0mol/L。
可选的，所述磷酸盐缓冲液的pH值为6.0-8.0，所述Tris-HCl缓冲液的pH值为7.1-9.0。
可选的，所述疏水层析中的疏水柱介质为Butyl-S-FF、Phenyl FF、Phenyl HP、Butyl FF、OctylFFButyl HP、Phenyl HS FF或FractogelEMD Phenyl(S)。
可选的，疏水层析过程中上样流速为5-300cm/hr，优选为80-200cm/hr。
可选的，疏水层析过程的柱温为2～8℃。
可选的所述方法还包括进行排阻层析步骤。
可选的，所述匀浆上清液的pH值为6.0-7.0。
可选的，匀浆上清液的获得方法包括以下步骤：
将小鼠颌下腺与纯化水混合后充分匀浆，离心收集上清液，用pH6.0～7.0的浓度为0.5mol/L的磷酸盐缓冲液调节上清液的pH后获得匀浆上清液。
可选的，CM反吸附阳离子交换层析过程中使用的平衡液为浓度0.01-0.1mol/L、pH6.0-7.0的磷酸盐缓冲液；上样流速为5-700cm/h。
可选的，所述酸化离心包括以下步骤：向流穿液中加入酸性缓冲液调节pH值至3.5-4.5，再加入NaCl，使体系中NaCl的终浓度为0.1-0.5mol/L，静置离心获得酸解上清液。
可选的，流穿液中加入的酸性缓冲液是pH为3.5-4.5的乙酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液。
可选的，所述吸附阳离子交换层析的步骤包括：
用吸附阳离子交换层析平衡液对填料进行平衡，将酸解上清液上样后，首先用阳离子交换层析平衡液洗脱，吸附的蛋白质用pH8.5～9.5、浓度0.01～0.10mol/L的Tris-HC1洗杂缓冲液洗杂，再用pH8.5～9.5的0.01～0.10mol/L Tris-HC1-0.2～0.8mol/L NaCl洗脱缓冲液进行梯度洗脱；其中，所述吸附阳离子交换层析平衡液中含有浓度为0.01-0.1mol/L的乙酸盐和0.1-0.5mol/L的NaCl，pH值为3.5-4.5。本发明所提供的方法具有以下优点：
1、从工艺流程上，本发明将下颌腺组织匀浆后直接进行上样，CM反吸附盐离子交换层析后直接酸化，不涉及透析溶液置换或超滤步骤，生产操作时间大大减少，与常规方法相比节省了14～48小时。
2、提取获得的完整型β-NGF比例明显提高，样品均一度大大提高：从等电点判断，从以前的三条代减少为两条带；从质谱结果看，从先前的四个峰减少为两个峰；等电点和质谱分子量分析结果表明本发明的工艺能够有效地抑制羧肽酶对NGF的C端精氨酸的降解作用，也能够有效降低N端AA被剪切形式的比例。
3、疏水层析后获得的目的蛋白液的纯度可达到99％以上甚至100％。
综上，本发明的工艺简化了工艺步骤，流程简单，不仅大大缩短了制备所用的时间，同时提高了产品的均一性与活性，并且样品纯度也得到了进一步的提高，为NGF的分离纯化提供了新的途径。
附图说明
图1为实施例1中HPLC纯度检测结果图；
图2为对比例1中HPLC纯度检测结果图；
图3为实施例1中SDS-PAGE纯度检测结果图；
图4为实施例1中SDS-PAGE分子量检测结果图；
图5为实施例1及对比例中等电聚焦电泳对比图；
图6为实施例1中质谱分子量检测结果图；
图7为对比例1中质谱分子量检测结果图；
图8为等电聚焦电泳结果。
具体实施方式
下面将通过具体实施方式对本发明进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
本发明提供了一种神经生长因子的提取方法，将小鼠颌下腺组织匀浆后离心收集匀浆上清液；对所述匀浆上清液进行CM反吸附阳离子交换层析后收集流穿液；对所述流穿液进行酸化离心后收集酸解上清液；对所述酸解上清液进行吸附阳离子交换层析收集目标蛋白峰对应的目的蛋白液；对所述目的蛋白液进行疏水层析，获得疏水层析后的目的蛋白液。
在本发明的一种实施方式中，所述方法还包括调节所述匀浆上清液的pH值至6.0-7.0后再进行CM反吸附阳离子交换层析。所述匀浆上清液的获得方法包括以下步骤：将小鼠颌下腺与预冷至4℃的纯化水按照1:1-20的质量体积比混合后进行压力均质，将均质后的组分在8000-12000g下离心20-60min收集上清液，用pH 6.0～7.0的浓度为0.5mol/L的磷酸盐溶液对所述匀浆上清液的pH进行调节。其中，在将小鼠颌下腺与纯化水混合后可以先用组织粉碎机进行初步破碎，然后用高压均质机进行压力均质。
本发明的实施方式中，对于CM反吸附阳离子交换层析的方法没有特别的限制，可以采用本领域常规的方法进行，例如可以使用CM32、CM Sepharose FF或其它等效介质。所述CM反吸附阳离子交换层析过程中使用的平衡液为0.01-0.1mol/L、pH6.0-7.0的磷酸盐缓冲液；上样流速为5-700cm/h。在本发明的一种优选的实施方式中，在用平衡液进行平衡后可以将所述匀浆上清液上CM-32柱(4.5×15cm)，然后用浓度为0.02mol/L，pH6.8的磷酸盐缓冲液以300ml/h的流速洗脱，收集的不吸附的蛋白峰为流穿液。
在本发明中，所述酸化离心可以包括以下步骤：向流穿液中加入酸性缓冲液调节pH值至3.5-4.5，再加入NaCl，使体系中NaCl的终浓度为0.1-0.5mol/L，静置后于8000-16000g离心20-60min获得酸解上清液。优选的，流穿液中加入的酸性缓冲液是pH为3.5-4.5的乙酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液。具体的，为了获得更好的酸化离心效果，可以向流穿液中直接加入pH4.0浓度为0.5mol/L的乙酸盐缓冲液使体系的pH降至4.5以下，再加入NaCl，使体系中NaCl的终浓度为0.4mol/L，静置10min后，于4℃16000g离心40min，收集上清得到酸解上清液。
在本发明的一种实施方式中，吸附阳离子交换层析，可以采用常规方法进行。即将所述酸解上清液上样至充分平衡后的阳离子交换层析柱，上样完成后用平衡液冲洗至基线，用洗杂缓冲液洗脱杂峰至基线，再用洗脱缓冲液进行梯度洗脱，在紫外检测仪上显示数字从基线开始上升时收集，降为基线时停止收集目标蛋白峰。例如，可以采用任晚琼等发表的文章“冻干鼠神经生长因子中试制备及几点问题的探讨”中介绍的方法进行所述吸附阳离子交换层析步骤。
其中，所述吸附阳离子交换层析填料包括但不限于CM SepharoseFF、SP Sepharose HP、Capto MMC和Fractogel EMD SO3-650。
在本发明的一种实施方式中，所述吸附阳离子交换层析可以通过以下步骤进行：用吸附阳离子交换层析平衡液对填料进行平衡，将酸解上清液以70-400cm/hr的流速上样后，首先用阳离子交换层析平衡液洗脱，吸附的蛋白质用pH8.5～9.5、浓度0.01～0.10mol/L的Tris-HC1洗杂缓冲液洗杂，再用pH8.5～9.5的0.01～0.10mol/LTris-HC1-0.2～0.8mol/LNaCl洗脱缓冲液进行梯度洗脱；其中，所述吸附阳离子交换层析平衡液中含有浓度为0.01-0.1mol/L的乙酸盐和0.1-0.5mol/L的NaCl，pH值为3.5-4.5。
在本发明的一种实施方式中，所述疏水层析中使用的疏水柱的平衡液是将选自氯化钠、硫酸铵和硫酸钠中的一种盐溶解于磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液获得的，在疏水柱的平衡液中溶解的盐的终浓度为0.5-3.0mol/L、疏水柱的平衡液的pH值为6.0-9.0。
在本发明的一种实施方式中，将氯化钠溶解于磷酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液获得疏水柱的平衡液，氯化钠的终浓度为0.5-3.0mol/L，优选为1-2mol/L。
在本发明的另一种实施方式中，将硫酸铵溶解于磷酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液获得疏水柱的平衡液，硫酸铵的终浓度为0.5-2.0mol/L，优选为0.8-1.6mol/L
在本发明的又一种实施方式中，将硫酸钠溶解于磷酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液获得疏水柱的平衡液，硫酸钠的终浓度为0.5-2.0mol/L，优选为0.8-1.6mol/L。
其中，所述磷酸盐缓冲液的pH值为6.0-8.0，浓度为0.01-0.1mol/L，所述Tris-HCl缓冲液的pH值为7.1-9.0，浓度为0.01-0.1mol/L。
在疏水层析前，首先将所述目的蛋白液中盐离子的浓度进行调整，调整的方法可以为通过添加相同的固体盐的方式使得所述目的蛋白液中离子的种类和浓度与疏水柱的平衡液中的离子浓度和种类一致。
上样完成后用疏水柱的平衡液冲洗至基线，然后用不含盐的相应缓冲液进行洗脱，在紫外检测仪上显示数字开始上升时开始收集，降为基线时停止收集目标蛋白峰。
其中，所述疏水层析中的疏水柱介质为Butyl-S-FF、Phenyl FF、Phenyl HP、Butyl FF、OctylFF、Butyl HP、Phenyl HS FF或FractogelEMD Phenyl(S)。优选的情况下，所述疏水层析中的疏水柱介质为ButylFF。
在本发明中，疏水层析中上样流速为5-300cm/h，优选为80-200cm/h，柱温为2～8℃。
优选的，本发明所提供的方法还包括在疏水层析后进行排阻层析获得NGF提取液。
排阻层析可采用常规方法，排阻层析时选用的平衡液可以为常见的排阻层析缓冲液，优选为0.01～0.1mol/L的磷酸盐(含0.1～0.2mol/L氯化钠，pH6.5～7.0)缓冲液，在紫外检测仪上显示数字从基线开始上升时收集目标蛋白峰，降为基线时停止收集目标蛋白峰。
排阻层析介质可采用Superdex 75 prep grade层析、G25层析等其它等效介质。如采用任晚琼等发表的文章“冻干鼠神经生长因子中试制备及几点问题的探讨”中介绍的方法，Sephadex G-75柱层析柱2.6×110cm，用0.05mol/L，pH4.0乙酸盐洗脱，流速78ml/h，收集洗脱峰主峰，即为纯化路线B所得2.5SNGF。
优选的，获得的NGF提取液用0.1μm膜进行预过滤后，还需要用除病毒膜过滤除病毒，收集滤过液，经检验合格后即为产品NGF提取液。
本文中所述的层析都在常规层析装置中进行，最常见的层析柱圆柱形或近似于圆柱形的中空管，使用时一般使其直立。可根据具体生产规模选择选用层析柱的高度及直径。层析柱中填充的介质根据需要来选择。
本发明所提供的方法还可以包括一些提取制备药物的常规步骤，如病毒灭活、除病毒过滤等步骤。
所述的病毒灭活方法可以使用本领域常规的病毒灭活方法进行，例如可以使用低pH值病毒灭活法、S/D病毒灭活法和辛酸钠病毒灭活法。本发明对于进行病毒灭活的时机没有特别的限制，可以在本发明所述方法的任何阶段进行。
所述除病毒过滤步骤可使用本领域常规过滤方法，多使用滤膜过滤，一般在提取步骤完成后最后进行过滤。
本发明所提供的方法通过在NGF制备步骤中加入疏水层析步骤的方式获得节省时间、提高产品的均一性与活性的有益效果，为了使得整个提取方法形成一个高效的整体、更好的实现本发明的发明目的，发明人对匀浆上清液的收集方法、CM反吸附阳离子交换层析方法、酸化离心方法、吸附阳离子交换层析步骤均进行了如上所述的大量的调整，使得整个制备体系与疏水层析步骤形成相互配合的整体，能够更好的适用于通过疏水层析步骤提取神经生长因子的技术方案。但是应当理解的是，上述具体实施方案仅为本发明的优选情况而并非唯一情况，本领域技术人员可以合理的预测说明书给出的具体实施方式之外的其他等同替代方式或明显变形方式都是可以实现的。
下面的实施例将对本发明做进一步的说明。
实施例1
1)匀浆：取小鼠颌下腺，加入预冷纯化水充分匀浆，匀浆液经11000×g、1hr、4℃条件离心，4℃离心，收集离心上清液，加适量0.5mol/L磷酸盐溶液(pH 6.5)调节离心上清液pH至6.8±0.2待用。
2)CM反吸附：将步骤1)得到的离心上清液进行CM SepharoseFast Flow阳离子交换层析，CM Sepharose Fast Flow层析柱用0.02mol/L、pH6.8磷酸盐缓冲液充分平衡后上样，上样完成后用平衡液冲洗，收集蛋白流出峰，流速为150cm/h。
3)酸化：在流穿液中加1mol/L乙酸盐缓冲液(pH4.0)迅速降低pH至4.0，然后加NaCl使体系中的NaCl的终浓度达到0.4mol/L，静置约5min后于4℃10000g离心30min，取酸解上清液。
4)CM2柱：CM Sepharose FF层析柱用0.05mol/L乙酸盐缓冲液(pH4.0)充分平衡后上样，上样完成后，用平衡液冲洗至基线，用0.05mol/L Tris-HC1(pH9.0)缓冲液洗脱杂峰至基线，再用0.05mol/LTris-HC1和0.05mol/L Tris-HC1-0.4mol/L NaCl(pH9.0)梯度洗脱，根据紫外吸收情况收集目标峰，在紫外检测仪上显示数字开始上升时开始收集，降为基线时停止收集目标蛋白峰。
5)疏水层析：Butyl Sepharose 4 FF层析柱经0.02mol/L磷酸盐(pH6.8)-1.5mol/L氯化钠缓冲液充分平衡。在步骤4)获得的料液中加入氯化钠固体使料液中氯化钠的终浓度为1.5mol/L，待氯化钠充分溶解后上样，速度为120cm/h，上样完成后用平衡液冲洗至基线，然后用0.02mol/L磷酸盐(pH6.8)洗脱收集目标峰。
6)除病毒：将5)中的疏水层析洗脱峰料液用0.1μm膜过滤后，再用孔径20nm除病毒膜过滤除病毒，收集滤过液，即为NGF提取液。
对比例1
1)匀浆：取颌下腺，加入预冷纯化水充分匀浆，匀浆液经11000×g、1hr、4℃条件离心，收集离心上清液。
2)透析：离心上清液在20mol/L、pH6.8磷酸盐缓冲液中充分透析24hr。
3)CM反吸附层析：CM Sepharose FF层析柱用20mmol/L、pH6.8磷酸盐缓冲液充分平衡后上样。上样完成后用平衡液冲洗，收集蛋白流出峰。
4)透析：蛋白流穿液置0.25mmol/L、pH6.8磷酸盐缓冲液中透析24h，其间置换透析液2次
5)酸化：透析后液加1mol/L乙酸盐缓冲液(pH4.0)迅速降低pH至4.0，然后加NaCl使成0.4mol/L，静置约5min后10000g离心30min，取上清。
6)CM2柱：CM Sepharose FF层析柱用50mmol/L乙酸盐缓冲液(pH4.0)充分平衡后上样，上样完成后，用平衡液冲洗至基线，用50mmol/L Tris-HC1(pH9.0)缓冲液洗脱杂峰至基线，再用50mmol/LTris-HC1和50mmol/L Tris-HC1-0.4mol/L NaCl(pH9.0)梯度洗脱，根据紫外吸收情况收集目标峰，在紫外检测仪上显示数字开始上升时开始收集，降为基线时停止收集目标蛋白峰。
7)Superdex 75 prep grade层析柱用pH6.8、0.05mol/L磷酸盐-0.15mol/L氯化钠缓冲液充分平衡后上样，在紫外检测仪上显示数字从基线开始上升时开始收集，降为基线时停止收集目标蛋白峰。
8)目标蛋白液用0.1μm膜预过滤后，再用孔径20nm除病毒膜过滤除病毒，收集滤过液，即为NGF提取液。
测试例1 实施例1与对比例1的NGF提取液的各项指标检测
1、HPLC检测NGF提取液的纯度
将实施例1和对比例1制得的NGF提取液进行HPLC检测，检测方法参照专利ZL200510130348.3，对实施例1及对比例1的NGF提取液的检测结果分别见图1和图2。
从HPLC检测结果图可以得知，实施例1的样品纯度为100％，对比例1的样品纯度为93.29％。
2、SDS-PAGE电泳检测NGF的分子量及纯度
利用SDS-PAGE电泳上样缓冲液，在加或不加入巯基乙醇的情况下，将低分子量Marker及10μg的实施例1得到的mNGF分别上样，进行电泳，电泳条件为200V恒电压，45分钟。用考马斯亮蓝G-25进行染色，检测NGF分子量及纯度，结果见图3、4所示。
由图3、4可知，mNGF分子量约为13kDa，说明所获得的的目的蛋白正确，只有一条带无其他杂带，纯度可达到100％。
3、等电聚焦电泳
根据任晚琼等发表的文章“冻干鼠神经生长因子中试制备及几点问题的探讨”中介绍的方法进行等电聚焦电泳，结果如图5所示，等电聚焦电泳结果分析如表1所示。
表1
由图5和表1的结果可知，1泳道为使用实施例1方法得到的NGF，等电点为9.1、8.9，主要为两条带，全长NGF的含量(等电点为9.1条带)达到了77.8％；4泳道为对比例1方法得到的NGF，等电点为9.1、8.9、8.6，等电点为3条带，均一性只能达到51.5％，并且其中全长NGF(等电点为9.1的条带)的含量只能达到13.5％，说明本发明制备得到的mNGF均一性更高。
4、用LC-MS质谱法进行mNGF的分子量测定及其均一性验证
液相色谱仪使用Agilent 1290 Infinity LC反相层析体系，色谱柱使用Poroshell 300 SB-C8、2.1mm×75mm、5μm，柱温为室温。流动相组成：A:0.1％甲酸/水，B：0.1％甲酸/乙腈。进样量：0.1mg/ml、20μl。用5％B平衡该柱5min，用30分钟从5％B线性洗脱到95％B。质谱仪使用Agilent 6530 ESI-Q-TOF MS。扫描范围：m/z 100～3200。紫外可见光波长为A280nm。
对实施例1及对比例1得到的目的蛋白mNGF测定总离子图谱和紫外光谱，结果分别如图6和图7所示。从图6可看出，其包含两个峰，其中：峰1实测分子量为12357.18，理论分子量为12358.04，对应的单体形式为N端剪切8个AA的NGF。峰2实测分子量为13251.78，理论分子量为13251.01，应对单体形式为全长118AA的NGF。从图7可看出，其包含4个峰，其中：除了与图6对应的N端剪切8个AA的NGF(峰2)和全长118AA的NGF(峰4)，还有另外两种形式的单体。
由上可知，实施例1获得的目的蛋白NGF中完整型NGF的含量远远高于对比例1中完整型NGF的含量，利用本发明所提供的方法提取的NGF在产品均一性和完整性上优于对比例1中的NGF。
5、鸡胚背根神经节法及TF-1细胞法测量mNGF活性
1)鸡胚背根神经节法测量mNGF活性
将NGF样品进行稀释：A液：6ng提取的mNGF样品加1ml无血清DMEM培养液溶解；B液：取A液50μl加无血清DMEM培养液4.95ml；C液：取B液60μl加无血清DMEM培养液2.94ml(总量3ml)使终浓度为(3AU/ml)。A、B液稀释在离心管中，C液在细胞瓶内，将C液作为1号瓶，再3倍梯度稀释为：2号、3号、4号、5号、6号待测液。每个待测液加入1个培养瓶，2ml/瓶。同时以无血清DMEM培养液为空白对照，以购自中检院的标准品为阳性对照(参考品)。加入8日龄的鸡胚背根神经节后置于5％CO2、37℃饱和湿度培养箱中，24小时后观察结果。
以生长最好时每毫升待测样品中NGF的含量作为1个活性单位(AU)。从出现阴性对照结果的稀释度开始往回数第3和第4两个稀释度中取生长最好的作为判定终点计算效价。参考品为购自中检院的标准品，每支装量为1000AU。
NGF比活的计算公式为：
待测样品的比活(AU/mg)＝参考品活性(AU/ml)×[样品预稀释倍数×对应参考品稀释点处的活性(AU/ml)/参考品实测活性(AU/ml)]
使用上述方法同时进行实施例1及对比例1提取得到的目的蛋白的活性测定。结果，实施例1及对比例1的NGF活性均达到了50万AU/mg，结果见表2。
2)TF-1细胞法测量mNGF活性
详细操作方法按照专利公开号为CN103376248A，专利名称为“神经生长因子活性定量测定方法”中实施例1中的方法进行操作，比活性检测结果见表2。
表2
| 批号 | 鸡胚法比活 | TF-1细胞法比活 |
| 实施例1 | 5×105AU/mg | 11.7×105U/mg |
| 对比例1 | 5×105AU/mg | 5.0×105U/mg |
由表2可知，由于背根神经节方法灵敏度较低，所以两个实施例mNGF比活没有差别，但是通过灵敏度高的TF-1细胞法检测比活，能看出实施例1的比活性有很大程度的提高。
6、疏水层析前后目标蛋白峰纯度对比
使用前述HPLC检测疏水层析步骤前后目标蛋白峰纯度，数据统计见下表3，纯度从70％左右提高到100％，疏水层析步骤效果明显。
表3
| 料液 | 纯度 |
| 疏水步骤前收集的目标蛋白峰 | 72.7％ |
| 疏水层析后收集的目标蛋白峰 | 100％ |
7、实施例1和对比例1总体检测结果对比表见下表4
表4
实施例2
按照与实施例1相同的方法制备mNGF，区别在于除疏水层析步骤外，CM反吸附阳离子交换层析、酸化离心、吸附阳离子交换层析和排阻层析步骤均参照任晚琼等发表的文章“冻干鼠神经生长因子中试制备及几点问题的探讨”中介绍的方法中的路线B制备mNGF。
测试例2
测试例2用于说明实施例2的mNGF提取液的各项指标，检测方法同测试例1相同，各检测项目的结果列于表5和表6(表6为均一性检测结果)。
表5
表6
由以上结果可知，使用实施例2方法得到的NGF，等电点为9.1、8.9，主要为两条带，均一性达到了69.4％，说明本发明制备得到的mNGF均一性高且主要为完整性NGF。
实施例3
按照与实施例1相同的方法制备mNGF，区别在于在疏水层析步骤后插入以下步骤：Superdex 75 prep grade层析柱用pH6.8、0.05mol/L磷酸盐-0.15mol/L氯化钠缓冲液充分平衡后上样，在紫外检测仪上显示数字开始上升时开始收集，降为基线时停止收集目标蛋白峰，获得凝胶过滤层析样品。
测试例3
测试例3用于说明实施例3的NGF提取液的各项指标检测。对凝胶过滤层析样品进行检测，与对比例1结果相对比，结果统计如下表7。
表7
| 检测项目 | 实施例3 | 实施例1 | 对比例1 |
| HPLC纯度 | 100.0％ | 100.0％ | 93.00％ |
| 等电点 | 8.9、9.1 | 8.9、9.1 | 8.6、8.9、9.1 |
| 分子量(kD) | 13.0 | 13.0 | 12.1 |
| 残余宿主蛋白(ng/mg) | 80 | 250 | 300 |
| DNA残留(ng/mg) | 8 | 100 | 310 |
由表中数据可知，实施例3的工艺与实施例1相比，产品的残余宿主蛋白及DNA残留显著降低；与对比例1相比，不仅产品的均一性明显提高，残余宿主蛋白及DNA残留也显著降低，专利工艺优势明显，尤其体现了凝胶过滤层析可明显的降低产品中内毒素及DNA残留量。
实施例4-9
按照与实施例1相同的方法制备mNGF，区别在于利用表8中给出的参数进行疏水层析步骤：
表8
(2)实验结果
1、对各疏水实验获得的样品进行纯度、等电点及细胞比活法活性检测，结果见下表9。
表9
| 实施例 | HPLC纯度 | 等电点 | TF-1细胞法活性(万U/mg) |
| 4 | 99.5％ | 9.1，8.9 | 9.9×105 |
| 5 | 100.0％ | 9.1，8.9 | 10.8×105 |
| 6 | 99.6％ | 9.1，8.9 | 9.7×105 |
| 7 | 100.0％ | 9.1，8.9 | 10.0×105 |
| 8 | 100.0％ | 9.1，8.9 | 10.2×105 |
| 9 | 99.7％ | 9.1，8.9 | 9.9×105 |
由表中数据可知，各疏水层析实验的样品纯度都达到了99.0％以上，活性都在9.5×105U/mg以上，等电聚焦分析都只有两条带，产品均一性较旧工艺都有明显提升。等电聚焦电泳结果见图8，其中A图和B图中右侧有三条带的泳道是对比例1中的样品。
2、均一性测试结果
由图8(图8A和图8B)可知，实验1-6分别为该使用实施例4-9中的方法得到的NGF，等电点为9.1、8.9，主要为两条带，全长NGF的含量(等电点为9.1条带)达到了65％以上；对比例1方法得到的NGF，等电点为9.1、8.9、8.6，等电点为3条带，均一性差，并且其中全长NGF(等电点为9.1的条带)的含量只能达到13.5％，说明本发明制备得到的mNGF均一性更高。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (15)
1.一种神经生长因子的提取方法，其特征在于，所述方法包括：将小鼠颌下腺组织匀浆后离心收集匀浆上清液；对所述匀浆上清液进行CM反吸附阳离子交换层析后收集流穿液；对所述流穿液进行酸化离心后收集酸解上清液；对所述酸解上清液进行吸附阳离子交换层析收集目标蛋白峰对应的目的蛋白液；对所述目的蛋白液进行疏水层析，获得疏水层析后的目的蛋白液。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述疏水层析中使用的疏水柱的平衡液为含盐浓度为0.5-3.0mol/L的pH值为6.0-9.0的缓冲液。
3.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述疏水层析中使用的疏水柱的平衡液是将选自氯化钠、硫酸铵和硫酸钠中的一种盐溶解于磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液获得的，在平衡液中溶解的盐的终浓度为0.5-3.0mol/L、pH值为6.0-9.0。
4.根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于，当所述盐为氯化钠时，氯化钠的终浓度为0.5-3.0mol/L；当所述盐为硫酸铵时，硫酸铵的终浓度为0.5-2.0mol/L；当所述盐为硫酸钠时，硫酸钠的终浓度为0.5-2.0mol/L。
5.根据权利要求3或4所述的提取方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的pH值为6.0-8.0，所述Tris-HCl缓冲液的pH值为7.1-9.0。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的提取方法，其特征在于，所述疏水层析中的疏水柱介质为Butyl-S-FF、Phenyl FF、Phenyl HP、Butyl FF、OctylFFButyl HP、Phenyl HS FF或Fractogel EMD Phenyl(S)。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的提取方法，其特征在于，疏水层析过程中上样流速为5～300cm/hr，优选为80～200cm/hr。
8.根据权利要求7所述的提取方法，其特征在于，疏水层析过程的柱温为2～8℃。
9.根据权利要求1-8中任意一项所述的提取方法，其特征在于，所述方法还包括排阻层析步骤。
10.根据权利要求1～9中任意一项所述的提取方法，其特征在于，所述匀浆上清液的pH值为6.0-7.0。
11.根据权利要求10所述的提取方法，其特征在于，匀浆上清液的获得方法包括以下步骤：
将小鼠颌下腺与纯化水混合后充分匀浆，离心收集上清液，用pH6.0～7.0的浓度为0.5mol/L的磷酸盐缓冲液调节上清液的pH后获得匀浆上清液。
12.根据权利要求1-11中任意一项所述的提取方法，其特征在于，CM反吸附阳离子交换层析过程中使用的平衡液为浓度0.01-0.1mol/L、pH6.0-7.0的磷酸盐缓冲液。
13.根据权利要求1-12中任意一项所述的提取方法，其特征在于，所述酸化离心包括以下步骤：向流穿液中加入酸性缓冲液调节pH值至3.5-4.5，再加入NaCl，使体系中NaCl的终浓度为0.1-0.5mol/L，静置离心获得酸解上清液。
14.根据权利要求13所述的提取方法，其特征在于，流穿液中加入的酸性缓冲液是pH为3.5-4.5的乙酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液。
15.根据权利要求1-14中任意一项所述的提取方法，其特征在于，所述吸附阳离子交换层析的步骤包括：
用吸附阳离子交换层析平衡液对填料进行平衡，将酸解上清液上样，首先用阳离子交换层析平衡液洗脱，吸附的蛋白质用pH8.5～9.5、浓度0.01～0.10mol/L的Tris-HC1洗杂缓冲液洗杂，再用pH8.5～9.5的0.01～0.10mol/L Tris-HC1-0.2～0.8mol/L NaCl洗脱缓冲液进行梯度洗脱；其中，所述吸附阳离子交换层析平衡液中含有浓度为0.01-0.1mol/L的乙酸盐和0.1-0.5mol/L的NaCl，pH值为3.5-4.5。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510313567.9A CN106279397A (zh) | 2015-06-09 | 2015-06-09 | 一种神经生长因子的提取方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510313567.9A CN106279397A (zh) | 2015-06-09 | 2015-06-09 | 一种神经生长因子的提取方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106279397A true CN106279397A (zh) | 2017-01-04 |
Family
ID=57658831
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510313567.9A Pending CN106279397A (zh) | 2015-06-09 | 2015-06-09 | 一种神经生长因子的提取方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106279397A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108048477A (zh) * | 2017-12-15 | 2018-05-18 | 南京理工大学 | 基于大肠杆菌表达系统的制备多肽的方法 |
| CN109762056A (zh) * | 2017-11-10 | 2019-05-17 | 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 | 一种神经生长因子的提取方法 |
| CN114252519A (zh) * | 2020-09-23 | 2022-03-29 | 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 | 一种测定神经生长因子纯度的方法 |
| CN117417428A (zh) * | 2023-10-20 | 2024-01-19 | 浙江华津依科生物制药有限责任公司 | 一种鼠表皮生长因子制剂及其制备方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1237184A (zh) * | 1996-11-15 | 1999-12-01 | 基因技术股份有限公司 | 神经营养蛋白的纯化 |
| CN1752102A (zh) * | 2005-09-05 | 2006-03-29 | 武汉海特生物制药股份有限公司 | 用有机溶剂病毒灭活法制备鼠神经生长因子的工艺 |
| CN101613394A (zh) * | 2008-06-27 | 2009-12-30 | 熊玲媛 | 鼠神经生长因子的制备方法和注射用鼠神经生长因子的制备方法 |
-
2015
- 2015-06-09 CN CN201510313567.9A patent/CN106279397A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1237184A (zh) * | 1996-11-15 | 1999-12-01 | 基因技术股份有限公司 | 神经营养蛋白的纯化 |
| CN1752102A (zh) * | 2005-09-05 | 2006-03-29 | 武汉海特生物制药股份有限公司 | 用有机溶剂病毒灭活法制备鼠神经生长因子的工艺 |
| CN101613394A (zh) * | 2008-06-27 | 2009-12-30 | 熊玲媛 | 鼠神经生长因子的制备方法和注射用鼠神经生长因子的制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 愈俊棠: "《抗生素生产设备》", 31 October 1982 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109762056A (zh) * | 2017-11-10 | 2019-05-17 | 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 | 一种神经生长因子的提取方法 |
| CN108048477A (zh) * | 2017-12-15 | 2018-05-18 | 南京理工大学 | 基于大肠杆菌表达系统的制备多肽的方法 |
| CN114252519A (zh) * | 2020-09-23 | 2022-03-29 | 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 | 一种测定神经生长因子纯度的方法 |
| CN114252519B (zh) * | 2020-09-23 | 2023-11-24 | 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 | 一种测定神经生长因子纯度的方法 |
| CN117417428A (zh) * | 2023-10-20 | 2024-01-19 | 浙江华津依科生物制药有限责任公司 | 一种鼠表皮生长因子制剂及其制备方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103059125B (zh) | 重组人促卵泡激素的纯化方法 | |
| CN108524929B (zh) | 一种狂犬病疫苗的生产方法 | |
| CN106279397A (zh) | 一种神经生长因子的提取方法 | |
| CN106146660A (zh) | 分离纯化单克隆抗体的方法 | |
| CA1341182C (en) | Tissue-derived tumor growth inhibitors, methods of preparation and uses thereof | |
| CN113444162B (zh) | 具有抗炎活性的小肽、制备方法及其应用 | |
| CN112210002B (zh) | 重组人血清白蛋白的纯化方法 | |
| CN102702341B (zh) | 基于cho细胞表达系统的重组人神经生长因子纯化方法 | |
| NO328693B1 (no) | Fremgangsmate for rensing av LH fra en prove, rekombinant LH med spesifikk aktivitet, anvendelse av rekombinant LH i fremstilling av medikamenter og farmasoytiske preparater omfattende rekombinante LH. | |
| CN109879930B (zh) | 一种重组蛋白的纯化方法 | |
| CN107540743A (zh) | 一种双层析法制备人纤维蛋白原的方法 | |
| BR112020023485A2 (pt) | Métodos para preparar um precursor de insulina humana recombinante ou análogo da mesma, insulina humana recombinante ou análogo da mesma e análogo de insulina acilado | |
| CN102056940A (zh) | 纯化促红细胞生成素的方法 | |
| CN106110290A (zh) | 一种动物睾丸提取物的制备方法 | |
| CN105017407B (zh) | 一种重组人表皮生长因子的纯化方法 | |
| CN105481976B (zh) | 一种制备人凝血因子viii的离子交换层析用洗涤缓冲液及其用途 | |
| CN107698676B (zh) | 一种高纯度尿促性素的提取制备方法 | |
| CN109762056A (zh) | 一种神经生长因子的提取方法 | |
| US7439337B2 (en) | Three-phase partitioning method for purifying a protein | |
| CN104357430A (zh) | 一种蕲蛇酶的生产方法 | |
| EP3110839B1 (en) | Extraction process to obtain hcg having a high biological activity | |
| CN109608516B (zh) | 蜂王浆主蛋白1、2、3的快速纯化方法 | |
| CN105153294B (zh) | 一种重组胰岛素及胰岛素类似物前体纯化方法 | |
| CN114606283A (zh) | 一种具有良好乳化性能的核桃多肽及其制备方法 | |
| CN105732796A (zh) | 眼镜蛇毒神经生长因子纯化制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20170104 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |