CN106248561A - 适于利用流式细胞仪对多种植物进行倍性鉴定的缓冲液及制备、使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了适于利用流式细胞仪对多种植物进行倍性鉴定的缓冲液及制备、使用方法，由缓冲液母液与吐温‑20、β‑巯基乙醇组成，先将缓冲液母液以双蒸水稀释20倍获得细胞超渗缓冲液，然后在其每100mL中加入0.1‑0.5mL吐温‑20，每100mL中加入0.1‑0.2mL的β‑巯基乙醇；其中，所述缓冲液母液由0.3mol/L柠檬酸三钠与质量浓度为20％的氯化钠组成，溶剂均为双蒸水。然后取植物组织根尖；加入缓冲液，切碎，混匀；混悬液过300‑500目网筛，放置或立即加入染色液，即可上样检测。缓冲液成分较少、配制方法简单、成本低廉、适应多种植物的倍性鉴定。
Description
技术领域
本发明属于植物育种技术领域，涉及一种适于利用流式细胞仪对多种植物进行倍性鉴定的缓冲液及其制备、使用方法。
背景技术
植物倍性鉴定在植物育种及相关基础研究中有广泛应用。近年来，通过倍性操作进行品种改良成为植物育种及其研究的热点之一。倍性操作过程中需对大量材料进行倍性鉴定以及对不同倍性的材料进行分类与筛选。
现有进行倍性鉴定的方法主要有染色体制片法、气孔保卫细胞观察法、细胞核大小观察法、流式细胞仪检测法等，其中最为快速的为流式细胞仪检测法。
在利用流式细胞仪进行植物倍性的检测中，样品制备时，缓冲液的应用是试验成功的关键，常用缓冲液主要由多种具有缓冲能力的盐如EDTA、Tris-HCl、柠檬酸等，调节细胞核渗透压的无机盐NaCl、KCl等，表面活性剂Tween-20、Triton X-100等，以及具抗氧化能力的成分PVP、巯基乙醇、Na2S2O4等组成。现有的缓冲液成分较多，配制较为复杂。缓冲液成分较多造成药品成本增加，对大量材料进行筛选极为不利。部分缓冲液只适于少数一种或几种植物，这对同时开展多种植物的倍性鉴定有所限制。
发明内容
本发明的目的是提供一种适于利用流式细胞仪进行多种植物倍性鉴定的缓冲液，解决了现有技术中存在缓冲液成分较多、配制较为复杂、成本较高、适应范围较窄等问题，缓冲液成分较少、配制方法简单、成本低廉、适应多种植物的倍性鉴定，可大规模应用于多种植物的倍性检测。
本发明的另一目的是提供上述缓冲液的制备方法。
本发明的又一目的是提供上述缓冲液的使用方法。
本发明所采用的技术方案是，一种适于利用流式细胞仪进行多种植物倍性鉴定的缓冲液，由缓冲液母液与吐温-20、β-巯基乙醇组成，先将缓冲液母液以双蒸水稀释20倍获得细胞超渗缓冲液，然后在其每100mL中加入0.1-0.5mL吐温-20，每100mL中加入0.1-0.2mL的β-巯基乙醇；其中，所述缓冲液母液由0.3mol/L柠檬酸三钠与质量浓度为20％的氯化钠组成，溶剂均为双蒸水。
本发明的特征还在于，进一步的，每100mL中加入吐温-20为0.25mL。
进一步的，每100mL中加入β-巯基乙醇0.14mL。
本发明所采用的另一技术方案是，适于利用流式细胞仪进行多种植物倍性鉴定的缓冲液的制备方法，按照以下步骤进行：
步骤1，按每柠檬酸三钠88.2g、氯化钠200g溶于900mL双蒸水比例，称取88.2g的柠檬酸三钠、200g的氯化钠，溶于900mL双蒸水中，用盐酸调节pH至7.0，加入双蒸水定容至1000mL，得到缓冲液母液；可长期常温保存。
步骤2，使用时，将缓冲液母液以双蒸水稀释20倍获得细胞超渗缓冲液，加入吐温-20，每100mL的双蒸水中加入0.1-0.5mL的吐温-20；加入β-巯基乙醇，每100mL的双蒸水中加入0.1-0.2mL的β-巯基乙醇，即制得缓冲液。
本发明所采用的又一技术方案是，适于利用流式细胞仪进行多种植物倍性鉴定的缓冲液的使用方法，按照以下步骤进行：
步骤1，取植物组织根尖、叶片、花瓣少许于塑料平皿中，材料多少视材料而定；
步骤2，加入缓冲液50-200μL，用锋利刀片将材料迅速切碎，再加入1000μL缓冲液，轻微振荡混匀；
步骤3，混悬液过300-500目网筛，放置一段时间或立即加入染色液，即可上样检测。
进一步的，所述步骤3中，染色液为染色剂DAPI、PI配制，其中，DAPI 100ng/mL，PI50μg/mL。
本发明的有益效果：缓冲液基本成分较少，仅含有柠檬酸钠、氯化钠，成本低廉，且配制简易，应用方便；本发明中应用柠檬酸钠为缓冲体系，pH7.0，适于多种植物材料样品的制备；应用1％的氯化钠为细胞核稳定剂，可使细胞核在较长时间内保持完整，样品制备完成后可较长时间放置，这使得大规模制样后再上机测定成为可能；添加吐温-20可提高细胞核的游离效率，从而增加检测样品中细胞核的含量；添加β-巯基乙醇可防止材料中部分成分的氧化，从而降低了褐化等过程对试验结果的影响。本发明中的缓冲液所制备样品稳定性好、适于多种植物的倍性检测，特别适用于大量材料的规模化筛选。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是实施例1中柑橘二倍体流式细胞仪检测图的散点图。
图2是实施例1中柑橘二倍体流式细胞仪检测图的柱形图。
图3是实施例2中烟草四倍体鉴定图。
图4是实施例2中烟草八倍体鉴定图。
图5是实施例3中四倍体、六倍体猕猴桃混合样流式细胞仪检测图谱的散点图。
图6是实施例3中四倍体、六倍体猕猴桃混合样流式细胞仪检测图谱的柱形图。
图7是实施例4中茶叶二倍体流式细胞仪检测图的散点图。
图8是实施例4中茶叶二倍体流式细胞仪检测图的柱形图。
图9是实施例5中二倍体枇杷流式细胞仪检测图。
图10是实施例5中三倍体枇杷流式细胞仪检测图。
图11是实施例6中番茄二倍体流式细胞仪检测图的散点图。
图12是实施例6中番茄二倍体流式细胞仪检测图的柱形图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种适于利用流式细胞仪进行多种植物倍性鉴定的缓冲液，具体按照以下步骤进行配制：
步骤1、缓冲液的配制：
(1)称取柠檬酸三钠88.2g、氯化钠200g，溶于900mL双蒸水中，用盐酸调节pH至7.0，加入双蒸水定容至1000mL，得到缓冲液母液，可长期常温保存。
(2)使用时取将缓冲液母液以双蒸水稀释20倍获得细胞超渗缓冲液，加入吐温-20，使终浓度为0.25％(每100mL的双蒸水中加入0.25mL的吐温-20)，加入β-巯基乙醇使终浓度为20mmol/L(每100mL的双蒸水中加入0.14mL的β-巯基乙醇)制备成工作液，含0.015mol/L柠檬酸三钠、质量浓度10％氯化钠、0.25％吐温-20、20mmol/Lβ-巯基乙醇。
步骤2、缓冲液的使用：
(1)取植物组织(根尖、叶片、花瓣)少许于塑料平皿中，材料多少视材料而定，幼嫩材料可取较少量，较老组织可取较大量；
(2)加入工作液50-200μL(视样品多少进行添加，以便于切碎为宜)，用锋利刀片将材料切碎，加入1000μL缓冲液，轻微振荡混匀；
(3)混悬液过300-500目网筛，放置一段时间或立即加入染色液(工作液中添加染色剂DAPI、PI配制)后即可上样检测。染色剂浓度推荐：DAPI 100ng/mL，PI 50μg/mL。
本发明主要一种适于利用流式细胞仪对多种植物进行倍性鉴定的缓冲液及其配制方法。其在主要成分上与其它缓冲液有一定差异，该缓冲液由NaCl、柠檬酸钠、吐温-20、β-巯基乙醇组成。目前这种缓冲液已经成功应用于柑橘、烟草、猕猴桃、茶叶、枇杷、番茄等植物的基于流式细胞仪的倍性鉴定中。
实施例1，柑橘的倍性鉴定
步骤1、缓冲液的配制：
(1)称取柠檬酸三钠88.2g、氯化钠200g，溶于900mL双蒸水中，用盐酸调节pH至7.0，加入双蒸水定容至1000mL，得到缓冲液母液，可长期常温保存。
(2)使用时取将缓冲液母液以双蒸水稀释20倍获得工作液，含0.015mol/L柠檬酸三钠、质量浓度10％氯化钠。
步骤2、缓冲液的使用：
(1)取幼嫩叶片少许于塑料平皿中；
(2)加入工作液50μL，用锋利刀片将材料切碎，加入1000μL缓冲液，轻微振荡混匀；
(3)混悬液过500目网筛，放置一段时间或立即加入染色液PI 50μg/mL。
(4)上机检测。
结果如图1所示，荧光信号较为集中，通过柱形图(图2)可以较好地识别间期细胞和分裂期细胞。
实施例2，烟草的倍性鉴定
步骤1、缓冲液的配制：
(1)称取柠檬酸三钠88.2g、氯化钠200g，溶于900mL双蒸水中，用盐酸调节pH至7.0，加入双蒸水定容至1000mL，得到缓冲液母液，可长期常温保存。
(2)使用时取将缓冲液母液以双蒸水稀释20倍获得细胞超渗缓冲液，加入吐温-20，使终浓度为0.25％(每100mL的双蒸水中加入0.25mL的吐温-20)，加入β-巯基乙醇使终浓度为20mmol/L(每100mL的双蒸水中加入0.14mL的β-巯基乙醇)制备成工作液，含0.015mol/L柠檬酸三钠、质量浓度10％氯化钠、0.25％吐温-20、20mmol/Lβ-巯基乙醇。
步骤2、缓冲液的使用：
(1)取幼嫩叶片或幼嫩子房少许于塑料平皿中；
(2)加入工作液200μL，用锋利刀片将材料切碎，加入1000μL缓冲液，轻微振荡混匀；
(3)混悬液过500目网筛，放置一段时间或立即加入染色液PI 50μg/mL。
(4)上机检测。可以根据柱形图较为直观地识别出烟草四倍体(图3)和烟草八倍体(图4)。
实施例3，猕猴桃的倍性鉴定
步骤1、缓冲液的配制：
(1)称取柠檬酸三钠88.2g、氯化钠200g，溶于900mL双蒸水中，用盐酸调节pH至7.0，加入双蒸水定容至1000mL，得到缓冲液母液，可长期常温保存。
(2)使用时取将缓冲液母液以双蒸水稀释20倍获得细胞超渗缓冲液，加入吐温-20，使终浓度为0.1％(每100mL的双蒸水中加入0.1mL的吐温-20)，加入β-巯基乙醇，每100mL的双蒸水中加入0.1mL的β-巯基乙醇，制备成工作液。
步骤2、缓冲液的使用：
(1)取幼嫩叶片少许于塑料平皿中；
(2)加入工作液200μL，用锋利刀片将材料切碎，加入1000μL缓冲液，轻微振荡混匀；
(3)混悬液过500目网筛，放置一段时间或立即加入染色液PI 50μg/mL。
(4)上机检测。采用混合样检测，根据散点图和柱形图可以清洗分辨四倍体和六倍体信号(图5、图6)。
实施例4，茶叶的倍性鉴定
步骤1、缓冲液的配制：
(1)称取柠檬酸三钠88.2g、氯化钠200g，溶于900mL双蒸水中，用盐酸调节pH至7.0，加入双蒸水定容至1000mL，得到缓冲液母液，可长期常温保存。
(2)使用时取将缓冲液母液以双蒸水稀释20倍获得工作液，含0.015mol/L柠檬酸三钠、质量浓度10％氯化钠。
步骤2、缓冲液的使用：
(1)取叶片或根少许于塑料平皿中；
(2)加入工作液50μL，用锋利刀片将材料切碎，加入1000μL缓冲液，轻微振荡混匀；
(3)混悬液过500目网筛，放置一段时间或立即加入染色液PI 50μg/mL。
(4)上机检测。如图7-8，可以获得较为清洗的荧光信号，且信号较为集中，获得的柱形图也较好。
实施例5，枇杷的倍性鉴定
步骤1、缓冲液的配制：
(1)称取柠檬酸三钠88.2g、氯化钠200g，溶于900mL双蒸水中，用盐酸调节pH至7.0，加入双蒸水定容至1000mL，得到缓冲液母液，可长期常温保存。
(2)使用时取将缓冲液母液以双蒸水稀释20倍获得细胞超渗缓冲液，加入吐温-20，使终浓度为0.5％(每100mL的双蒸水中加入0.5mL的吐温-20)，加入β-巯基乙醇，每100mL的双蒸水中加入0.2mL的β-巯基乙醇，制备成工作液。
步骤2、缓冲液的使用：
(1)取叶片或根少许于塑料平皿中；
(2)加入工作液50μL，用锋利刀片将材料切碎，加入1000μL缓冲液，轻微振荡混匀；
(3)混悬液过500目网筛，放置一段时间或立即加入染色液PI 50μg/mL。
(4)上机检测。如从图9、10，可以价位清晰分辨二倍体(图9)和三倍体(图10)。
实施例6，番茄的倍性鉴定
步骤1、缓冲液的配制：
(1)称取柠檬酸三钠88.2g、氯化钠200g，溶于900mL双蒸水中，用盐酸调节pH至7.0，加入双蒸水定容至1000mL，得到缓冲液母液，可长期常温保存。
(2)使用时取将缓冲液母液以双蒸水稀释20倍获得工作液，含0.015mol/L柠檬酸三钠、质量浓度10％氯化钠。
步骤2、缓冲液的使用：
(1)取幼嫩叶片少许于塑料平皿中；
(2)加入工作液50μL，用锋利刀片将材料切碎，加入1000μL缓冲液，轻微振荡混匀；
(3)混悬液过500目网筛，放置一段时间或立即加入染色液PI 50μg/mL。
(4)上机检测。结果如图11-12，信号较为集中(图11)，柱形图较好，可以明显分别间期细胞(图12，M1)和分裂期细胞(图12，M2)。
Claims (6)
1.一种适于利用流式细胞仪进行多种植物倍性鉴定的缓冲液，其特征在于，由缓冲液母液与吐温-20、β-巯基乙醇组成，先将缓冲液母液以双蒸水稀释20倍获得细胞超渗缓冲液，然后在其每100mL中加入0.1-0.5mL吐温-20，每100mL中加入0.1-0.2mL的β-巯基乙醇；其中，所述缓冲液母液由0.3mol/L柠檬酸三钠与质量浓度为20％的氯化钠组成，溶剂均为双蒸水。
2.根据权利要求1所述的适于利用流式细胞仪进行多种植物倍性鉴定的缓冲液，其特征在于，每100mL中加入吐温-20为0.25mL。
3.根据权利要求1所述的适于利用流式细胞仪进行多种植物倍性鉴定的缓冲液，其特征在于，每100mL中加入β-巯基乙醇0.14mL。
4.一种如权利要求1所述的适于利用流式细胞仪进行多种植物倍性鉴定的缓冲液的制备方法，其特征在于，按照以下步骤进行：
步骤1，按每柠檬酸三钠88.2g、氯化钠200g溶于900mL双蒸水比例，称取88.2g的柠檬酸三钠、200g的氯化钠，溶于900mL双蒸水中，用盐酸调节pH至7.0，加入双蒸水定容至1000mL，得到缓冲液母液；
步骤2，将缓冲液母液以双蒸水稀释20倍获得细胞超渗缓冲液，加入吐温-20，每100mL的双蒸水中加入0.1-0.5mL的吐温-20；加入β-巯基乙醇，每100mL的双蒸水中加入0.1-0.2mL的β-巯基乙醇，即制得缓冲液。
5.一种如权利要求1所述的适于利用流式细胞仪进行多种植物倍性鉴定的缓冲液的使用方法，其特征在于，按照以下步骤进行：
步骤1，取植物组织根尖、叶片、花瓣少许于塑料平皿中，材料多少视材料而定；
步骤2，加入缓冲液50-200μL，用锋利刀片将材料迅速切碎，再加入1000μL缓冲液，轻微振荡混匀；
步骤3，混悬液过300-500目网筛，放置一段时间或立即加入染色液，即可上样检测。
6.根据权利要求5所述的缓冲液的使用方法，其特征在于，所述步骤3中，染色液为染色剂DAPI、PI配制，其中，DAPI 100ng/mL，PI 50μg/mL。
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