CN106232834B - 样品制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及表征模板多核苷酸的改进方法。所述方法包括使用聚合酶制备修饰的多核苷酸，所述修饰的多核苷酸使得表征所述模板多核苷酸变得更容易。

Description

样品制备方法

技术领域

本发明涉及一种用于表征模板多核苷酸的改进的方法。所述方法包括使用聚合酶制备修饰的多核苷酸，所述修饰的多核苷酸使得模板多核苷酸更容易表征。

背景技术

目前需要一种具有广泛的应用范围的快速且廉价的多核苷酸(如DNA或RNA)测序和鉴定技术。现有的技术是缓慢的且昂贵的，这主要由于它们依赖于扩增技术以产生大量的多核苷酸，且需要大量特定的用于信号检测的荧光化学物质。

跨膜孔(纳米孔)作为用于聚合物和各种小分子的直接的、电生物传感器，具有很大的潜力。特别是，目前作为一种有潜力的DNA测序技术的纳米孔受到了许多关注。

当跨纳米孔施加电势时，当分析物如核苷酸短暂地停留在桶(barrel)中一定时间段时，会产生电流的变化。所述核苷酸的纳米孔检测能产生已知信号和持续时间的电流变化。在链测序方法中，单个多核苷酸链穿过所述孔并能实现对核苷酸的鉴定。链测序可包括使用核苷酸处理蛋白以控制所述多核苷酸穿过所述孔的移动。

发明内容

本发明出人意料地证明了可以对模板多核苷酸进行修饰以制备修饰的多核苷酸，当使用跨膜孔，例如通过链测序，表征所述模板多核苷酸，所述修饰的多核苷酸提供了来自原始模板多核苷酸的不同的信息。使用跨膜孔的修饰的多核苷酸的后来的表征使得更容易地确定模板多核苷酸的特征。

所述改进的方法使用了聚合酶和与模板多核苷酸杂交的自由核苷酸的组杂交。所述聚合酶使用模板多核苷酸作为模板以由自由核苷酸的组形成修饰的多核苷酸。选择所述自由核苷酸的同一性，使得当形成修饰的多核苷酸时，所述聚合酶用不同的核苷酸物质取代所述模板多核苷酸中的一种或多种核苷酸物质。例如，所述聚合酶可用修饰的多核苷酸中的脱氧肌苷单磷酸(dIMP)取代模板多核苷酸中的脱氧鸟苷单磷酸(dGMP)。

使用跨膜孔的多核苷酸表征，例如测序，通常包括分析由k个核苷酸组成的聚合物单元，其中k是正整数(即“k聚体(k-mers)”)。这在国际申请No.PCT/GB2012/052343(公开为WO 2013/041878)中讨论。虽然期望对于不同的k聚体具有清楚区分的电流测量值，但这些测量值中的一些通常是重叠的。尤其是k聚体中具有大数量的聚合物单元，即高值的k，分解由不同的k聚体产生的测量值变得困难，不利于所述多核苷酸信息的获得，例如评估所述多核苷酸的潜在序列(underlying sequence)。

通过用修饰的核苷酸中的不同的核苷酸物质取代所述模板多核苷酸中的一种或多种核苷酸物质，所述修饰的多核苷酸包含不同于所述模板多核苷酸的k聚体。所述修饰的多核苷酸中的不同的k聚体能够产生来自所述模板多核苷酸中的k聚体的不同的电流测量值，使得所述修饰的多核苷酸提供了来自所述模板多核苷酸的不同的信息。来自修饰的多核苷酸的附加信息可使得表征模板多核苷酸更加容易。在某些情况下，修饰的多核苷酸自身可更容易地表征。例如可设计修饰的多核苷酸包含在它们电流测量值之间具有增强的分离或清楚的分离的k-聚体或具有减少噪音的k-聚体。来自修饰的多核苷酸的信息也可与来自模板多核苷酸的信息结合以提高表征的整体精确度。

因此，本发明提供了一种表征模板多核苷酸的方法，包含：

a)在聚合酶使用模板多核苷酸作为模板形成修饰的多核苷酸的条件下，将模板多核苷酸与所述聚合酶和自由核苷酸的组接触，其中当形成修饰的多核苷酸时，所述聚合酶用不同的核苷酸物质取代所述模板多核苷酸中的一种或多种核苷酸物质；

b)将所述修饰的多核苷酸与跨膜孔接触，使得所述修饰的多核苷酸移动穿过所述孔；以及

c)随着所述修饰的多核苷酸相对所述孔移动，获取一个或多个测量值，其中所述测量值代表所述修饰的多核苷酸的一个或多个特征，并由此表征所述模板多核苷酸。如果所述模板多核苷酸是RNA，所述聚合酶优选不形成互补的多核苷酸。

本发明也提供了用于表征模板多核苷酸的试剂盒，包含(a)聚合酶和(b)自由核苷酸的组，所述自由核苷酸的组包含不同于所述模板多核苷酸中的一种或多种核苷酸物质的核苷酸物质，其中所述聚合酶能使用所述模板多核苷酸作为模板由所述自由核苷酸形成修饰的多核苷酸，其中所述聚合酶可用不同的核苷酸物质取代所述模板多核苷酸中的一种或多种所述核苷酸物质。

本发明进一步提供了一种表征同聚多核苷酸的方法，包括：

a)在聚合酶使用同聚多核苷酸作为模板形成修饰的多核苷酸的条件下，将所述同聚多核苷酸与聚合酶和自由核苷酸的组接触，其中所述修饰的多核苷酸不是所述同聚多核苷酸的反向互补序列；

b)将所述修饰的多核苷酸与跨膜孔接触，使得所述修饰的多核苷酸移动穿过所述孔；以及

c)随着修饰的多核苷酸相对所述孔移动，获取一个或多个测量值，其中所述测量值代表修饰的多核苷酸的一个或多个特征，并由此表征所述同聚多核苷酸。

附图说明

图1示出了使用实施例1描述的方法制备的多个DNA样品的PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)图。第1道对应于DNA梯(大量的带(bands)显示在凝胶的左手边(1517，1200，1000，900，800，700，600，517和500bps))。第2道显示了ssDNA对照链(SEQ ID NO：34在其3’末端连接到4个iSpC3间隔区，所述4个iSpC3间隔区在其另一端连接到SEQ ID NO：41)。第3道显示了dsDNA对照(SEQ ID NO：34在其3’末端连接到4个iSpC3间隔区，所述4个iSpC3间隔区在其另一端连接到SEQ ID NO：38的5’末端)。第4道显示了通过提供以下dNTP’s–dATP，dTTP，dGTP和dCTP而制备的dsDNA。第5道显示了通过提供以下dNTP’s-dATP，dCTP，dGTP和5-丙炔基-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸而制备的dsDNA样品。第6道显示了通过提供以下dNTP’s-dATP，dCTP，dTTP和6-硫代-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸而制备的dsDNA样品。第7道显示了通过提供以下dNTP’s-dATP，dCTP，5-丙炔基-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸和6-硫代-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸而制备的dsDNA样品。

图2显示了由C，A，G和5-丙炔基-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸组成的修饰的DNA构建体的对角点图(diagonal dot plot)。所述对角点图显示了修饰的链中每个碱基组合的电流水平随着未修饰的链中其等同物的变化，使得电流-序列关系中的大变化通过对角线的大位移表示。

图3显示了当解旋酶(TrwC Cba(SEQ ID NO：25)控制修饰的DNA构建体(SEQ IDNO：34在其3’末端连接到4个iSpC3间隔区，所述4个iSpC3间隔区在其另一端连接到SEQ IDNO：38的5’末端，所述SEQ ID NO：38的5’末端T被实施例1的步骤1.2中的5-丙炔基-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸取代；还包含系链序列(tether sequence)SEQ ID NO：42，0.5nM)移位穿过纳米孔(MS(B1-G75S/G77S/L88N/Q126R)8 MspA(MspA-B2C)(SEQ ID NO：2具有G75S/G77S/L88N/Q126R突变))时的示例电流轨迹(y轴标签＝电流(pA)，x轴标签＝时间(s))。下部的电流轨迹是上部轨迹的区域放大图。

图4显示了由C，T，G和2’-氟代-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸组成的修饰的DNA构建体的对角点图。所述对角点图显示了修饰的链中每个碱基组合的电流水平随着未修饰的链中其等同物的变化，使得电流-序列关系中的大变化通过对角线的大位移表示。

图5显示了由C，T，G和2-氟代-腺苷-5’三磷酸组成的修饰的DNA构建体的对角点图。所述对角点图显示了修饰的链中每个碱基组合的电流水平随着未修饰的链中其等同物的变化，使得电流-序列关系中的大变化通过对角线的大位移表示。

图6显示了由C，T，A和7-去氮-7-碘代-2’-脱氧-鸟苷-5’三磷酸组成的修饰的DNA构建体的对角点图。所述对角点图显示了修饰的链中每个碱基组合的电流水平随着未修饰的链中其等同物的变化，使得电流-序列关系中的大变化通过对角线的大位移表示。

图7显示了由C，T，A和2’-氟代-2’脱氧鸟苷-5’-三磷酸组成的修饰的DNA构建体的对角点图。所述对角点图显示了修饰的链中每个碱基组合的电流水平随着未修饰的链中其等同物的变化，使得电流-序列关系中的大变化通过对角线的大位移表示。

图8显示了由G，T，A和5-甲酰基-2’脱氧胞苷-5’-三磷酸组成的修饰的DNA构建体的对角点图。所述对角点图显示了修饰的链中每个碱基组合的电流水平随着未修饰的链中其等同物的变化，使得电流-序列关系中的大变化通过对角线的大位移表示。

图9显示了由C，T，7-去氮-7-碘代-2’-脱氧-腺苷-5’-三磷酸和7-去氮-7-碘代-2’-脱氧-鸟苷-5’-三磷酸组成的修饰的DNA构建体的对角点图。所述对角点图显示了修饰的链中每个碱基组合的电流水平随着未修饰的链中其等同物的变化，使得电流-序列关系中的大变化通过对角线的大位移表示。

图10显示了当解旋酶(TrwC Cba(SEQ ID NO：25)控制修饰的DNA构建体(SEQ IDNO：34在其3’末端连接到4个iSpC3间隔区，所述4个iSpC3间隔区在其另一端连接到SEQ IDNO：38的5’末端，所述SEQ ID NO：38的5’末端A和G分别被实施例1的步骤1.2中的7-去氮-7-碘代-2’-脱氧-腺苷-5’-三磷酸和7-去氮-7-碘代-2’-脱氧-鸟苷-5’-三磷酸取代；还包含系链序列SEQ ID NO：42，0.5nM)移位穿过纳米孔(MspA-B2C)的示例电流轨迹(y轴标签＝电流(pA)，x轴标签＝时间(s))。下部的电流轨迹是上部轨迹的区域放大图。

图11显示了由G，5-丙炔基-2'-脱氧胞苷-5'-三磷酸，5-丙炔基-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸和2-氨基嘌呤-2’-脱氧核糖核苷-三磷酸组成的修饰的DNA构建体的对角点图。所述对角点图显示了修饰的链中每个碱基组合的电流水平随着未修饰的链中其等同物的变化，使得电流-序列关系中的大变化通过对角线的大位移表示。

图12显示了当解旋酶(TrwC Cba(SEQ ID NO：25)控制修饰的DNA构建体(SEQ IDNO：34在其3’末端连接到4个iSpC3间隔区，所述4个iSpC3间隔区在其另一端连接到SEQ IDNO：38的5’末端，所述SEQ ID NO：38的5’末端C，T和A分别被实施例1的步骤1.2中的5-丙炔基-2'-脱氧胞苷-5'-三磷酸，5-丙炔基-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸和2-氨基嘌呤-2’-脱氧核糖核苷-三磷酸取代；还包含系链序列SEQ ID NO：42，0.5nM)移位穿过纳米孔(MspA-B2C)的示例电流轨迹(y轴标签＝电流(pA)，x轴标签＝时间(s))。下部的电流轨迹是上部轨迹的区域放大图。

图13显示了由C，T，A和7-去氮-7-碘代-2’-脱氧-鸟苷-5’三磷酸组成的修饰的DNA构建体的对角点图。所述对角点图显示了修饰的链中每个碱基组合的电流水平随着未修饰的链中其等同物的变化，使得电流-序列关系中的大变化通过对角线的大位移表示。

图14显示了当解旋酶(TrwC Cba(SEQ ID NO：25)控制修饰的DNA构建体(SEQ IDNO：34在其3’末端连接到4个iSpC3间隔区，所述4个iSpC3间隔区在其另一端连接到SEQ IDNO：38的5’末端，所述SEQ ID NO：38的5’末端G被实施例1的步骤1.2中的7-去氮-7-碘代-2’-脱氧-鸟苷-5’三磷酸取代；还包含系链序列SEQ ID NO：42，0.5nM)移位穿过纳米孔(MspA MS(B1-G75S/G77S/L88N/D90Q/D91Q/Q126R(MS-QQ)SEQ ID NO：2具有G75S/G77S/L88N/D90Q/D91Q/Q126R的突变)的示例电流轨迹(y轴标签＝电流(pA)，x轴标签＝时间(s))。下部的电流轨迹是上部轨迹的区域放大图。

图15显示了C，T，A和7-去氮-7-碘代-2’-脱氧-鸟苷-5’三磷酸组成的3.6kB修饰的DNA构建体的对角点图。所述对角点图显示了修饰的链中每个碱基组合的电流水平随着未修饰的链中其等同物的变化，使得电流-序列关系中的大变化通过对角线的大位移表示。本图使用了基于5聚体(5mer)的Kmer模型，代替在前的附图所示的基于3聚体(3mer)的Kmer模型。根据在这样的K聚体中的第三位置处的碱基的同一性，对这些点进行了区别表示。

图16显示了当解旋酶(T4 Dda–E94C/A360C(SEQ ID NO：24具有E94C和A360C的突变)控制的修饰的DNA构建体(SEQ ID NO：35在其3’末端连接4个iSpC3间隔区，所述4个iSpC3间隔区在其另一端连接到SEQ NO：36的5’末端；SEQ ID NO：36的3’末端连接到附加的4个iSpC3间隔区，所述附加的4个iSpC3间隔区在其另一端连接到SEQ ID NO：37的5’末端，在合成过程中这些序列中的所有G被7-去氮-7-碘代-2’-脱氧-鸟苷-5’三磷酸取代；还包含系链序列SEQ ID NO：42，0.2nM)移位穿过纳米孔(MspA-B2C)的示例电流轨迹(y轴标签＝电流(pA)，x轴标签＝时间(s))。下部的电流轨迹是上部轨迹的区域放大图。

图17显示了代表在实施例7中使用的引物的卡通图。区域1对应于30个iSpC3间隔区。区域2对应于SEQ ID NO：45。区域3对应于4个iSp18间隔区。区域4对应于SEQ ID NO：36。区域5对应于4个5-硝基吲哚。区域6对应于SEQ ID NO：46。

图18显示了代表λ基因组的DNA序列(19,100bp-19,150bp)比对的区域示意图。在直线1中显示参考序列。当DNA模板使用A)2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸，2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸，2’-脱氧胸腺嘧啶-5’-三磷酸，2’-脱氧胞嘧啶-5’-三磷酸复制时，在直线4中显示共有序列，相应的等位基因频率在直线5中显示。当DNA模板使用B)2’-氟代-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸，2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸，2’-脱氧胸腺嘧啶-5’-三磷酸，2’-脱氧胞嘧啶-5’-三磷酸复制时，所述共有序列在直线2中显示，相应的等位基因频率在直线3中显示。直线6对应于当联合两条链的(由使用A或B碱基的模板聚合得到)数据时。箭头用‘？’显示共有序列是歧义的位置；其具有大于80％的置信度，不可能形成共有。当比较直线3和5时，具有80％或更多置信度不可能形成共有的位置发生在序列的不同的位置。当结合数据(直线6)时，可形成正确的共有序列。为了帮助理解附图，放大用具有‘X？’或‘Y？’的箭头标记的区域中的两处并显示在主图的下面。对于‘X？’，在大约65％的分析的解旋酶控制的DNA移动(由B碱基组成的链)中该位置被称为T，但大约35％的分析的解旋酶控制的DNA移动(由B碱基组成的链)中该位置被称为G。对于‘Y？’，在大约65％的分析的解旋酶控制的DNA移动(由B碱基组成的链)中该位置被称为C，但大约35％的分析的解旋酶控制的DNA移动(由B碱基组成的链)中该位置被称为A。对于每个‘？’位置，等位基因频率被不同的灰度阴影所遮蔽，所述不同的灰度阴影对于被称为该碱基的位置。

图19显示了由A，T，G和5-羧基-2’-脱氧胞苷-5’三磷酸组成的3.6kB修饰的DNA构建体的对角点图。所述对角点图显示了修饰的链中每个碱基组合的电流水平随着未修饰的链中其等同物的变化，使得电流-序列关系中的大变化通过对角线的大位移表示。本图使用了基于5聚体(5mer)的Kmer模型，代替在前的附图所示的基于3聚体(3mer)的Kmer模型。根据在这样的K聚体中的第三位置处的碱基的同一性，对这些点进行了区别表示对这些点进行了区别表示。

图20显示了由C，T，G和2-氟代-腺苷-5’三磷酸组成的3.6kB修饰的DNA构建体的对角点图。所述对角点图显示了修饰的链中每个碱基组合的电流水平随着未修饰的链中其等同物的变化，使得电流-序列关系中的大变化通过对角线的大位移表示。本图使用了基于5聚体(5mer)的Kmer模型，代替在前的附图所示的基于3聚体(3mer)的Kmer模型。根据在这样的K聚体中的第三位置处的碱基的同一性，对这些点进行了区别表示。

图21显示了代表λ基因组的DNA序列(26,990-27,040bp)比对的区域示意图。在直线1中显示参考序列。当DNA模板使用A)2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸，2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸，2’-脱氧胸腺嘧啶-5’-三磷酸，2’-脱氧胞嘧啶-5’-三磷酸复制时，在直线4中显示共有序列，相应的等位基因频率在直线5中显示。当DNA模板使用B)2’-氟代-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸，2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸，2’-脱氧胸腺嘧啶-5’-三磷酸，2’-脱氧胞嘧啶-5’-三磷酸复制时，所述共有序列在直线2中显示，相应的等位基因频率在直线3中显示。直线6对应于当联合两条链的(由使用A或B碱基的模板聚合得到)数据时。箭头用‘？’显示共有序列是歧义的位置，其具有大于80％的置信度，不可能形成共有。当比较直线3和5时，具有80％或更多置信度不可能形成共有的位置发生在序列的不同的位置。当结合数据(直线6)时，可形成正确的共有序列。为了帮助理解附图，放大用具有‘X？’或‘Y？’的箭头标记的区域中的两处并显示在主图的下面。对于‘X？’，在大约65％的分析的解旋酶控制的DNA移动(由B碱基组成的链)中该位置被称为T，但大约35％的分析的解旋酶控制的DNA移动(由B碱基组成的链)中该位置被称为G。对于‘Y？’，在大约65％的分析的解旋酶控制的DNA移动(由B碱基组成的链)中该位置被称为A，但大约35％的分析的解旋酶控制的DNA移动(由B碱基组成的链)中该位置被称为C。对于每个‘？’位置，等位基因频率被不同的灰度阴影所遮蔽，所述不同的灰度阴影对于被称为该碱基的位置。

序列表的描述

SEQ ID NO：1显示了密码子优化的多核苷酸序列，其编码MS-B1突变体MspA单体。该突变体缺少信号序列，并包含下列突变：D90N，D91N，D93N，D118R，D134R和E139K。

SEQ ID NO：2显示了MspA单体的MS-B1突变体的成熟形式的氨基酸序列。该突变体缺少信号序列，并包含下列突变：D90N，D91N，D93N，D118R，D134R和E139K。

SEQ ID NO：3显示了编码α-溶血素-E111N/K147N(α-HL-NN；Stoddart等人PNAS，2009；106(19)：7702-7707)的一个单体的多核苷酸序列。

SEQ ID NO：4显示了α-HL-NN的一个单体的氨基酸序列。

SEQ ID NOs：5至7显示了MspB，C和D的氨基酸序列。

SEQ ID NO：8显示了编码Phi29 DNA聚合酶的多核苷酸序列。

SEQ ID NO：9显示了Phi29 DNA聚合酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：10显示了来自大肠杆菌(E.coli.)的sbcB基因的密码子优化的多核苷酸序列。它编码来自大肠杆菌的核酸外切酶I酶(EcoExo I)。

SEQ ID NO：11显示了来自大肠杆菌的核酸外切酶I酶(EcoExo I)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：12显示了来自大肠杆菌的xthA基因的密码子优化的多核苷酸序列。它编码来自大肠杆菌的核酸外切酶III酶。

SEQ ID NO：13显示了来自大肠杆菌的核酸外切酶III酶的氨基酸序列。这种酶执行双链DNA(dsDNA)的一条链的3’–5’方向的5’单磷酸核苷的分配消化。在一条链上的酶的启动需要大约4个核苷酸的5’突出部分。

SEQ ID NO：14显示了来自嗜热栖热菌(T.thermophilus)的recJ基因的密码子优化的多核苷酸序列。它编码来自嗜热栖热菌的RecJ酶(TthRecJ-cd)。

SEQ ID NO：15显示了嗜热栖热菌的RecJ酶(TthRecJ-cd)的氨基酸序列。这种酶执行ssDNA的5’单磷酸核苷在5’–3’方向的前进消化。在一条链上的酶的启动需要至少4个核苷酸。

SEQ ID NO：16显示了来自噬菌体λ核酸外切酶(redX)基因的密码子优化的多核苷酸序列。它编码噬菌体λ核酸外切酶。

SEQ ID NO：17显示了噬菌体λ核酸外切酶的氨基酸序列。所述序列是装配成三聚体的三个完全相同的亚基中的一个。所述酶执行dsDNA的一条链的核苷酸在5’-3’方向的高度地前进消化(http：//www.neb.com/nebecomm/products/productM0262.asp)。在一条链上的酶的启动优选地需要具有5’磷酸的大约4个核苷酸的5’突出部分。

SEQ ID NO：18显示了Hel308 Mbu的氨基酸序列。

SEQ ID NO：19显示了Hel308 Csy的氨基酸序列。

SEQ ID NO：20显示了Hel308 Tga的氨基酸序列。

SEQ ID NO：21显示了Hel308 Mhu的氨基酸序列。

SEQ ID NO：22显示了TraI Eco的氨基酸序列。

SEQ ID NO：23显示了XPD Mbu的氨基酸序列。

SEQ ID NO：24显示了Dda 1993的氨基酸序列。

SEQ ID NO：25显示了Trwc Cba的氨基酸序列。

SEQ ID NO：26显示了对于克列诺片段(Klenow片段)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：27显示了实施例1中使用的λDNA的600bp片段的多核苷酸序列。这种序列显示了dsDNA的正义序列(sense sequence)。

SEQ ID NO：28显示了实施例1中使用的引物的多核苷酸序列。

SEQ ID NO：29显示了实施例1中使用的引物的多核苷酸序列。

SEQ ID NO：30显示了实施例1中使用的多核苷酸序列。SEQ ID NO：30在其5末端连接到28个iSpC3间隔区，所述28个iSpC3间隔区在其另一端连接到两个胸腺嘧啶。SEQ IDNO：30在其3’末端连接到4个iSpC3间隔区，所述4个iSpC3间隔区在其另一端连接到SEQ IDNO：31。SEQID NO：30在另一条多核苷酸序列中连接到4个iSpC3间隔区，所述4个iSpC3间隔区在其另一端连接到SEQ ID NO：33。

SEQ ID NO：31显示了实施例1和6中使用的多核苷酸序列。在实施例1中SEQ IDNO：31在其3’末端连接到4个iSpC3间隔区，所述4个iSpC3间隔区在其另一端连接到SEQ IDNO：30。

SEQ ID NO：32显示了实施例1中使用的引物的多核苷酸序列。所述序列的5’末端包含磷酸基团。

SEQ ID NO：33显示了在实施例1中使用的多核苷酸序列。SEQ ID NO：33在其5’末端连接到4个iSpC3间隔区，所述4个iSpC3间隔区在其另一端连接到SEQ ID NO：30。

SEQ ID NO：34显示了实施例2-5中使用的多核苷酸序列。SEQ ID NO：34在其3’末端连接到4个iSpC3间隔区，所述4个iSpC3间隔区在其另一端连接到SEQ ID NO：38的5’末端。

SEQ ID NO：35显示了实施例6中使用的多核苷酸序列。

SEQ ID NO：36显示了实施例6和7中使用的多核苷酸序列。

SEQ ID NO：37显示了实施例6中使用的多核苷酸序列。

SEQ ID NO：38显示了实施例2-5中使用的多核苷酸序列。SEQ ID NO：38连接到4个iSpC3间隔区，所述4个iSpC3间隔区在其另一端连接到SEQ ID NO：35的3’末端。

SEQ ID NO：39显示了在实施例2中使用的多核苷酸序列。SEQ ID NO：39在其3’末端连接到4个iSpC3间隔区，所述4个iSpC3间隔区在其另一端连接到SEQ ID NO：40的5’末端。

SEQ ID NO：40显示了在实施例2中使用的多核苷酸序列。SEQ ID NO：40在其5’末端连接到4个尿嘧啶碱基和4个iSpC3间隔区，所述4个尿嘧啶碱基和4个iSpC3间隔区在其另一端连接到SEQ ID NO：39的3’末端。

SEQ ID NO：41显示了在实施例1中使用的多核苷酸序列。

SEQ ID NO：42显示了在实施例1-8中使用的多核苷酸序列。连接到SEQ ID NO：42的3’末端的是6个iSp18间隔区，所述6个iSp18间隔区在其另一端连接到两个胸腺嘧啶和一个3’胆固醇TEG。

SEQ ID NO：43显示了在实施例7中使用的多核苷酸序列。所述序列的5’末端包含磷酸基团。SEQ ID NO：44显示了在实施例7中使用的多核苷酸序列。所述序列的5’末端包含磷酸基团。

SEQ ID NO：45显示了在实施例6和7中使用的多核苷酸序列。

SEQ ID NO：46显示了在实施例6和7中使用的多核苷酸序列。

SEQ ID NO：47显示了在实施例6中使用的多核苷酸序列。

SEQ ID NO：48显示了在实施例6中使用的多核苷酸序列。

SEQ ID NO：49显示了在实施例6中使用的多核苷酸序列。

具体实施方式

应理解，公开的产品和方法的不同应用可以根据本领域的具体需求而调整。可以理解本文中使用的术语仅是为了描述本发明的具体实施方式的目的，而不意为对本发明的限制。

另外，除非本文另有明确规定，否则本说明书和随附的权利要求中所使用的单数形式的“一”、“一个”和“所述”包括复数指代。因此，例如，涉及“多核苷酸”时包括“多个多核苷酸”,涉及“聚合酶”时包括两个或多个所述聚合酶，涉及“跨膜孔”时包括两个或多个所述孔，等。

本文所引用的所有公开物、专利和专利申请，无论在前文或在后文，均以引用的方式全文引入。

本发明的方法

本发明提供了表征例如测序模板多核苷酸的方法。根据本发明，所述模板多核苷酸是最终被表征或被测序的多核苷酸。这更详细地描述如下。

使用链测序对多核苷酸进行测序的重要组成是对由k个核苷酸组成的聚合物单元(即“k-聚体”)的识别，其中k是正整数。在过去，为了实现对k-聚体的识别，将多核苷酸穿过跨膜孔，例如溶血素的突变体。这提供了显示为序列依赖的电流特征。结果也显示大量的核苷酸(即高值的k)对观测到的电流有贡献，使得观测到的电流和多核苷酸序列之间的直接关系是挑战性的。进一步，已观测到当多核苷酸移动穿过孔时，一些电流状态显示出高度变化。结果还表明一些突变的孔比其他的孔表现出更大的变化。

由突变的MspA单体产生的孔可以显示增加的电流范围，这使得识别不同的k-聚体更加容易，和/或减少的电流状态的变化，其增加了信噪比。进一步，当多核苷酸移动穿过由MspA突变体构建的孔时对电流有贡献的核苷酸数量(即k值)减少了。这使得确定随着多核苷酸移动穿过孔时观测到的电流和多核苷酸序列之间的直接关系更容易。使用这样的孔产生的信号可能仍然相当复杂的，因此测序特定多核苷酸仍具有挑战。

所述方法包括修饰的多核苷酸的形成。所述修饰的多核苷酸包括一个或多个修饰的k聚体，所述修饰的k聚体提供来自模板多核苷酸中的k聚体的不同的电流测量值。所述一个或多个修饰的k聚体优选与来自模板多核苷酸中的k聚体和/或修饰的多核苷酸中的其他k聚体具有增强的分离或清楚的分离。所述一个或多个修饰的k聚体优选比模板多核苷酸中的k聚体和/或模板多核苷酸中的其他k聚体具有减少的(或降低的)噪音。在一些实施例中，修饰的多核苷酸包含一个或多个更容易表征的k聚体(例如由于增强的或清楚的分离或减少的噪音)，但仍有一个或多个k聚体较难表征(例如由于减少的或缺失的分离或升高的噪音)。

修饰的多核苷酸提供了来自模板多核苷酸的不同信息，特别是使用链测序时。所述修饰的多核苷酸优选比模板多核苷酸更容易表征，特别是使用链测序时。表征修饰的多核苷酸以更容易地表征模板多核苷酸。虽然不是本发明方法的一部分，模板多核苷酸自身可以通过将该模板多核苷酸与跨膜孔接触，使得所述模板多核苷酸移动穿过孔并且随着所述模板多核苷酸相对所述孔移动获取一个或多个测量值来进行表征，其中所述测量值代表模板多核苷酸的一个或多个特征。关于所述模板多核苷酸自身特征的信息之后可以用于与根据本发明的来自修饰的多核苷酸的不同的信息结合以更容易地表征所述模板多核苷酸。

本发明的所述方法尤其对于链测序有优势，因为修饰的多核苷酸提供了与提供的信号不同的信号，如果该模板多核苷酸自身测序了的话。这些不同的信息可以用来使得模板多核苷酸的测序更容易，特别是如果模板多核苷酸自身已经进行了链测序。

本发明的所述方法也具有其他优势。例如，在修饰的多核苷酸中的一种或多种不同的核苷酸物质可以被设计以促进一个或多个化学基团添加到修饰的多核苷酸上。

模板多核苷酸

本发明的所述方法包括用于表征的模板多核苷酸的修饰。根据本发明，所述模板多核苷酸是最终被表征或被测序的多核苷酸。它也被叫做目标多核苷酸或感兴趣的多核苷酸。

多核苷酸，例如核酸，是包括两个或多个核苷酸的大分子。所述多核苷酸或核酸可以包含任何核苷酸的任意组合。所述核苷酸可以是天然存在的或人工合成的。在模板多核苷酸中的一个或多个核苷酸可以被氧化或被甲基化。在模板多核苷酸中的一个或多个核苷酸可被损坏。例如，所述多核苷酸可包含嘧啶二聚体。此类二聚体通常与紫外线导致的损坏相关，且是皮肤黑素瘤的首要原因。在模板多核苷酸中的一个或多个核苷酸可被修饰，例如用标记物或标签。合适的标记物如下所述。所述模板多核苷酸可包含一个或多个间隔区。

核苷酸通常含有核碱基、糖和至少一个磷酸基团。所述碱基基通常为杂环的。碱基包括但不限于：嘌呤和嘧啶，更具体地，腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)和胞嘧啶(C)。糖通常为戊糖。核苷酸糖包括但不限于，核糖和脱氧核糖。所述核苷酸通常是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。所述核苷酸通常含有单磷酸，二磷酸或三磷酸。所述核苷酸可包含多于3个的磷酸，例如4个或5个磷酸。磷酸可被连接在核苷酸的5’或3’侧。核苷酸包括但不限于，单磷酸腺苷(AMP)，单磷酸鸟苷(GMP)，单磷酸胸苷(TMP)，单磷酸尿苷(UMP)，单磷酸5-甲基胞苷，单磷酸5-羟甲基胞苷，单磷酸胞苷(CMP)，单磷酸环腺苷(cAMP)，单磷酸环鸟苷(cGMP)，单磷酸脱氧腺苷(dAMP)，单磷酸脱氧鸟苷(dGMP)，单磷酸脱氧胸苷(dTMP)，单磷酸脱氧尿苷(dUMP)，单磷酸脱氧胞苷(dCMP)和单磷酸脱氧甲基胞苷。所述核苷酸优选选自AMP，TMP，GMP，CMP，UMP，dAMP，dTMP，dGMP，dCMP和dUMP。

核苷酸可以是脱碱基的(即缺少碱基)。核苷酸也可缺少碱基和糖(即是C3间隔区)。

所述模板多核苷酸中的核苷酸可以以任何方式彼此连接。如在核酸中一样，所述核苷酸通常通过它们的糖和磷酸基团连接。如嘧啶二聚体中一样，所述核苷酸可通过它们的碱基连接。

所述模板多核苷酸可以是单链或双链的。至少所述多核苷酸的一部分优选为双链的。

所述模板多核苷酸可以是核酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。所述模板多核苷酸可包含杂交到一条DNA链的一条RNA链。所述多核苷酸可以是本领域已知的任何合成核酸，例如肽核酸(PNA)，甘油核酸(GNA)，苏糖核酸(TNA)，锁核酸(LNA)，桥连核酸(BNA)或其它具有核苷酸侧链的合成聚合物。

所述模板多核苷酸优选为DNA，并且DNA中的核苷酸物质优选包含单磷酸脱氧腺苷(dAMP)，单磷酸脱氧鸟苷(dGMP)，单磷酸脱氧胸苷(dTMP)，单磷酸脱氧胞苷(dCMP)和单磷酸脱氧甲基胞苷。

替代地，所述模板多核苷酸优选为RNA，并且RNA中的核苷酸物质优选包括单磷酸腺苷(AMP)，单磷酸鸟苷(GMP)，单磷酸尿苷(UMP)，单磷酸胞苷(CMP)和单磷酸5-甲基胞苷。

所述模板多核苷酸可以是任何长度。例如，所述模板多核苷酸可以是至少10、至少50、至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、至少400或至少500个核苷酸对的长度。所述模板多核苷酸可以是1000或更多个核苷酸对，5000或更多个核苷酸对长度或100000或更多核苷酸对长度。

所述模板多核苷酸通常存在于任何合适样本中。本发明通常在已知含有或怀疑含有模板多核苷酸的样品中实施。替代地，可对样品实施本发明，以确认在样品中的存在是已知的或期望的一个或多个模板多核苷酸的同一性。

所述样品可以是生物样品。本发明可以针对从任何生物体或微生物中获得或提取的样品在体外实施。所述生物体或微生物通常是古细菌的(archaeal)，原核的或真核的，并且通常属于以下五界中的一个：植物界，动物界，真菌，原核生物和原生生物。本发明针对从任何病毒中获得或提取的样品在体外实施。所述样品优选是液体样品。样品通常包括患者的体液。所述样品可以是尿液，淋巴液，唾液，粘液或羊水，但优选血液，血浆或血清。通常，所述样品来源于人，但替代地可以是来自其他哺乳动物，如自商业上养殖的动物如马，牛，绵羊，鱼，鸡或猪，或者替代地可以是宠物如猫或狗。或者，所述样品可以来源于植物，例如从商业作物获得的样品，如谷类，豆类，水果或蔬菜，例如小麦，大麦，燕麦，芸苔，玉米，大豆，水稻，大黄，香蕉，苹果，番茄，土豆，葡萄，烟草，菜豆，小扁豆，甘蔗，可可，棉花。

所述样品可以是非生物样品。所述非生物样品优选为流体样品。非生物样品的实例包括手术液，水如饮用水、海水或河水，以及用于实验室试验的试剂。

所述样品通常是在本发明中使用前处理，例如通过离心，或通过膜过滤掉不需要的分子或细胞，例如红细胞。所述样品可在采集后立即测量。样品也可通常在测定前被存储，优选低于-70℃存储。

聚合酶

所述模板多核苷酸与聚合酶接触。所述聚合酶可以是以下讨论的关于多核苷酸结合蛋白质的任意。所述聚合酶优选为Klenow或9o North。

在聚合酶使用所述模板多核苷酸作为模板形成修饰的多核苷酸的条件下，使所述模板多核苷酸与聚合酶接触。这种条件在本领域中是已知的。例如，通常在商购的聚合酶缓冲液中如来自New Engl和

的缓冲液中，使所述多核苷酸通常与聚合酶接触。对于Klenow，温度优选20到37℃，或对于9 o North，温度优选60到75℃。通常使用引物或3'发夹作为聚合酶延伸的成核点。

自由核苷酸的组和替代核苷酸物质

所述模板多核苷酸与自由核苷酸的组接触。基于所述模板多核苷酸，所述聚合酶使用自由核苷酸形成修饰的多核苷酸。组中的自由核苷酸的特性决定修饰的多核苷酸的组成。

以下给出的不同的核苷酸物质的许多实例涉及它们的单磷酸形式。这是因为包含在多核苷酸(例如修饰的多核苷酸)中的核苷酸通常是它们的单磷酸形式。当与所述聚合酶接触时，在组中的自由核苷酸可以是它们的二磷酸形式或三磷酸形式或可以包含多于3个磷酸，例如4个或5个磷酸。因此，以下讨论的任何核苷酸当在组里它们的自由形式下可以具有多于1个的磷酸。在实施例中的不同的核苷酸物质参考它们的自由核苷酸组中的形式，即三磷酸描述如下。

组中的每个自由核苷酸都能够杂交或结合到模板多核苷酸中的一种或多种核苷酸物质。组中的每个自由核苷酸通常都能够特定地杂交或结合(即互补)到所述模板多核苷酸中的一种或多种核苷酸物质。如果核苷酸与模板核苷酸中的该核苷酸的杂交或结合比与模板核苷酸中的其他核苷酸的杂交或结合更强，那么所述核苷酸特定地杂交或特定地结合(即互补)到所述模板多核苷酸中的所述核苷酸。这允许使用聚合酶利用互补性(即碱基配对)使用模板多核苷酸形成修饰的多核苷酸。通常，每个自由核苷酸特定地杂交或特定地结合(即互补)到模板多核苷酸中的一个核苷酸。在一些实施例中，本发明中使用的不同的核苷酸物质能够与模板多核苷酸中多于一种的核苷酸物质进行特定地杂交或特定地结合(即互补)。这些实施例中有用的通用核苷酸更详细地描述如下。

每个不同的核苷酸物质都能够与模板多核苷酸中与它要取代的核苷酸物质是互补的核苷酸物质进行特定地杂交或特定地结合(即互补)。例如，对于DNA模板，用于取代dAMP的不同的核苷酸物质能够特定地杂交或特定地结合(即互补)到dTMP。用于本方法的每个不同的核苷酸物质通常较弱地杂交或结合到模板多核苷酸中的那些不能互补到它取代的核苷酸物质的核苷酸物质。例如，对于DNA模板，用于取代dAMP的不同的核苷酸物质通常能够更强的杂交或结合到dTMP相比于其杂交或结合到dAMP，dGMP或dCMP。技术人员可以设计合适的自由核苷酸组。在一些实施例中，相同的不同的核苷酸物质用来取代模板多核苷酸中的不同的核苷酸物质。在这样的实施例中，不同的核苷酸物质能够特定地杂交或特定地结合(即互补)到模板多核苷酸中的两个或多个核苷酸物质。这意味着不同的核苷酸物质更强地结合到模板多核苷酸中的两个或多个它取代的核苷酸物质相比于模板多核苷酸中的其他核苷酸。这些实施例中有用的通用核苷酸更详细地描述如下。

每个自由核苷酸都能够被聚合酶处理，并且插入到修饰的多核苷酸中。

自由核苷酸的特性(identities)是这样的，从而当形成修饰的多核苷酸时，聚合酶用不同的核苷酸物质取代模板多核苷酸中的一种或多种核苷酸物质。例如，聚合酶可以使用修饰的多核苷酸中的脱氧肌苷单磷酸(dIMP)或修饰版本的dAMP取代模板多核苷酸中的所有dGMP。能够被取代的模板多核苷酸中的一种或多种核苷酸物质通常不会出现在修饰的多核苷酸中。

本发明的所述方法示图如下。

模板…ATGCATGCA…

修饰的…XACGXACGX…

在以上示图中，两条链都是DNA。模板多核苷酸在上部显示。修饰的核苷酸在底部显示。聚合酶利用修饰的多核苷酸中的不同的核苷酸物质X取代核苷酸物质T(即dTMP)。所述不同的核苷酸物质可以是任何以下讨论的核苷酸物质。为了这样做，模板多核苷酸与聚合酶和A，X，G和C的组接触。聚合酶能够处理X并将X插入在修饰的多核苷酸中T应该出现的位置，即在模板多核苷酸中出现的位置A(所述核苷酸与T互补)处。

组中一种或多种自由核苷酸是不同于被取代的一种或多种核苷物质的核苷酸。这些用来取代一种或多种核苷酸物质的自由核苷酸将更详细讨论如下。组中其余的核苷酸通常是出现在所述模板多核苷酸中的核苷酸。这些核苷酸可以是任何以上讨论的核苷酸。

模板多核苷酸中的任意数量的核苷酸物质可以用不同的核苷酸物质取代。例如，当形成修饰的多核苷酸时，聚合酶可以利用不同的核苷酸取代模板多核苷酸中的2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个或更多的核苷酸物质。野生型DNA例如人类DNA，由于大量天然核苷酸修饰存在，可以包含多于4个的核苷酸物质(即多于dAMP，dTMP，dGMP和dCMP)。当形成修饰的多核苷酸时，聚合酶可以用不同的核苷酸取代模板多核苷酸中的所有核苷酸物质。例如，聚合酶可以用核苷酸自身的修饰版本，例如每个包含卤素原子的修饰版本，取代dAMP，dTMP，dGMP和dCMP。这对于模板DNA可以通过将DNA与聚合酶和包含经修饰版本的dAMP，dTMP，dGMP和dCMP的自由核苷酸的组接触来实现。

在一些优选实施例中，聚合酶用不同的核苷酸取代模板多核苷酸中的两个或多个核苷酸物质的每一个。换句话，用不同的核苷酸取代每个核苷酸物质。例如，聚合酶可以用修饰版本的dAMP取代dAMP，并且用修饰版本的dTMP取代dTMP。这对于模板DNA可以让DNA与聚合酶的和包含经修饰版本的dAMP，经修饰版本的dTMP，dGMP和dCMP的自由核苷酸的组接触来实现。替代地，聚合酶可以用修饰版本的dAMP取代dAMP，并用脱氧肌苷单磷酸(dIMP)取代dGMP。这对于模板DNA可以让DNA与聚合酶和包含经修饰版本的dAMP，dIMP，dGMP和dCMP自由核苷酸的组接触来实现。

在其他优选实施例中，聚合酶用相同的核苷酸取代模板多核苷酸中的两个或多个核苷酸物质的每一个。例如，聚合酶可以用dPMP(2'-脱氧-P-核苷单磷酸)取代dCMP和dTMP。这对于模板DNA可以让DNA与聚合酶和自由dPMP，dGMP和dCMP的组接触来实现。

从以上讨论清楚的是修饰的多核苷酸不同于模板多核苷酸的反向互补序列。

如果模板多核苷酸是DNA，聚合酶可以用脱氧甲基胞苷单磷酸取代脱氧胞苷单磷酸(dCMP)。如果模板多核苷酸是DNA，聚合酶优选不仅用脱氧胞苷单磷酸(dCMP)取代脱氧甲基胞苷单磷酸。

如果模板多核苷酸是RNA，聚合酶优选用甲基胞苷单磷酸取代胞苷单磷酸(CMP)。

不同的核苷酸物质

一种或多种不同的核苷酸物质通常被选择以提供感兴趣的修饰的多核苷酸信息。例如，T的k聚体(即中心核苷酸是以胸腺嘧啶为碱基的k聚体，例如TTA，GTC，GTG和CTA)通常具有最低的电流状态。当修饰的多核苷酸移动穿过孔时，修饰版本的T核苷酸可以被引入到修饰的多核苷酸中以进一步降低电流状态，从而增加整个可见电流范围。

G的k聚体(即中心核苷酸是以鸟嘌呤为碱基的k聚体，例如TGA，GGC，TGT和CGA)有被k聚体中的其他核苷酸强烈影响的倾向，因此修饰在修饰的多核苷酸中的G核苷酸可以帮助它们具有更多的独立电流位置。

用同一不同的核苷酸物质取代两个核苷酸物质可以更容易地表征因为之后只需确定修饰的多核苷酸中的3-核苷酸k聚体的位置。然而，这种修饰会减少由修饰的多核苷酸提供的信息，因此也通常需要表征模板多核苷酸自身(例如使用链测序)获得全部的关于模板多核苷酸的信息。

利用脱碱基核苷酸取代一种或多种核苷酸物质导致特征电流峰。这允许清楚显示模板多核苷酸中的一种或多种核苷酸物质的位置。

利用修饰的多核苷酸中的基于甲基-C(meC)的核苷酸取代模板多核苷酸中的所有基于胞嘧啶(C)核苷酸允许建立GTAmeC模型，由该模型可以确定包含k聚体的meC特征。这种特征之后可以用来在模板多核苷酸中的区分这些k聚体与正常的C的k聚体。

如果模板多核苷酸是DNA，修饰的多核苷酸中的不同的核苷酸物质优选包含不同于腺嘌呤，鸟嘌呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶或甲基胞嘧啶的碱基和/或包含不同于脱氧腺苷，脱氧鸟苷，胸苷，脱氧胞苷或脱氧甲基胞苷的核苷。如果模板多核苷酸是RNA，修饰的多核苷酸中的不同的核苷酸物质优选包含不同于腺嘌呤，鸟嘌呤，尿嘧啶，胞嘧啶或甲基胞嘧啶的碱基和/或包含不同于腺苷，鸟苷，尿苷，胞苷或甲基胞苷的核苷。不同的碱基和/或核苷能够与模板多核苷酸的一种或多种核苷酸互补。商业可获得的核苷包括，但不限于，2，6-二氨基嘌呤-2'-脱氧核糖核苷，2-氨基嘌呤2'-脱氧核糖核苷，2，6-二氨基嘌呤-核糖核苷，2-氨基嘌呤-核糖核苷，伪尿苷，嘌呤霉素，2，6-二氨基嘌呤-2'-O-甲基核糖核苷，2-氨基嘌呤-2'-O-甲基核糖核苷和阿糖胞苷。不同的核苷酸物质可以包含任何这些核苷。

不同的核苷酸物质可以是通用核苷酸。通用核苷酸是可以与模板多核苷酸中的所有核苷酸一定程度地杂交或结合的核苷酸。通用核苷酸优选为可以一定程度地杂交或结合到包含核苷腺苷(A)，胸腺嘧啶(T)，尿嘧啶(U)，鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)的核苷酸。通用核苷酸可更强地杂交或结合到一些核苷酸，与其他核苷酸相比。例如，包含核苷2’-脱氧肌苷的通用核苷酸(I)，会显示I-C>I-A>I-G大约＝I-T的优选配对顺序。如果通用核苷酸在组中取代了的核苷酸物质，那么聚合酶会利用通用核苷酸取代该核苷酸物质。例如，如果聚合酶接触自由dAMP，dTMP，dCMP和通用核苷酸的组，聚合酶会利用通用核苷酸取代dGMP。

通用核苷酸优选包含以下碱基中的一个：次黄嘌呤、4-硝基吲哚、5-硝基吲哚、6-硝基吲哚、甲酰基吲哚、3-硝基吡咯、硝基咪唑、4-硝基吡唑、4-硝基苯并咪唑、5-硝基吲唑、4-氨基苯并咪唑或苯基(C 6-芳族环)。通用核苷酸更优选包括下列核苷中的一个：2'-脱氧肌苷，肌苷、7-去氮-2'-脱氧肌苷、7-去氮-肌苷、2-氮杂-脱氧肌苷、2-氮杂-肌苷、2-O'-甲基肌苷、4-硝基吲哚2'-脱氧核糖核苷、4-硝基吲哚核糖核苷、5-硝基吲哚-2'-脱氧核糖核苷、5-硝基吲哚核糖核苷、6-硝基吲哚-2'-脱氧核糖核苷、6-硝基吲哚核糖核苷、3-硝基吡咯2'-脱氧核糖核苷、3-硝基吡咯核糖核苷、次黄嘌呤的无环糖类似物、硝基咪唑2'-脱氧核糖核苷、硝基咪唑核糖核苷、4-硝基吡唑2'-脱氧核糖核苷、4-硝基吡唑核糖核苷、4-硝基苯并咪唑2'-脱氧核糖核苷、4-硝基苯并咪唑核糖核苷、5-硝基吲唑2'-脱氧核糖核苷、5-硝基吲唑核糖核苷、4-氨基苯并咪唑2'-脱氧核糖核苷、4-氨基苯并咪唑核糖核苷、苯基C-核糖核苷、苯基C-2'-脱氧核糖基核苷、2'-脱氧水粉蕈素、2'-脱氧异鸟苷、K-2'-脱氧核糖、P-2'脱氧核糖和吡咯烷。通用核苷酸更优选包含2'-脱氧肌苷。通用核苷酸更优选为IMP或dIMP。通用核苷酸最优选dPMP(2'-脱氧-P-核苷单磷酸)或dKMP(N6-甲氧基-2,6-二氨基嘌呤单磷酸)。

不同的核苷酸物质优选包含其取代的核苷酸物质中不存在的化学原子或基团。所述化学基团优选是丙炔基，硫基，氧基，甲基，羟甲基，甲酰基，羧基，羰基，苄基，炔丙基或炔丙胺基。所述化学基团或原子可以是或可以包含荧光分子，生物素，地高辛，DNP(二硝基酚)，对光不稳定基团，炔烃，DBCO，叠氮化合物，自由氨基基团，氧化还原染料，汞原子或硒原子。

商业可获得的包含不存在于自天然核苷的化学基团的核苷包括，但不限于，6-硫代-2'-脱氧鸟苷，7-去氮-2'-脱氧腺苷，7-去氮-2'-脱氧鸟苷，7-去氮-2'-脱氧黄嘌呤核苷，7-去氮-8-氮杂-2'-脱氧腺苷，8-5'(5'S)-环-2'-脱氧腺苷，8-氨基-2'-脱氧腺苷，8-氨基-2'-脱氧鸟苷，8-氘-2'-脱氧鸟苷，8-氧-2'-脱氧腺苷，8-氧-2'-脱氧鸟苷，亚乙烯基-2'-脱氧腺苷，N6-甲基-2'-脱氧腺苷，O6-甲基-2'-脱氧鸟苷，O6-苯基-2'脱氧肌苷，2'-脱氧伪尿苷，2-硫代胸苷，4-硫代-2'-脱氧尿苷，4-硫代胸苷，5'氨基胸苷，5-(1-芘基乙炔基)-2'-脱氧尿苷，5-(C2-EDTA)-2'-脱氧尿苷，5-(羧基)乙烯基-2'-脱氧尿苷，5，6-二氢-2'-脱氧尿苷，5，6-二氢胸苷，5-溴代-2'-脱氧胞苷，5-溴代-2'-脱氧尿苷，5-羧基-2'-脱氧胞苷，5-氟代-2'-脱氧尿苷，5-甲酰-2'-脱氧胞苷，5-羟基-2'-脱氧胞苷，5-羟基-2'-脱氧尿苷，5-羟基甲基-2'-脱氧胞苷，5-羟基甲基-2'-脱氧尿苷，5-碘代-2'-脱氧胞苷，5-碘代-2'-脱氧尿苷，5-甲基-2'-脱氧胞苷，5-甲基-2'-脱氧异胞苷，5-丙炔基-2'-脱氧胞苷，5-丙炔基-2'-脱氧尿苷，6-O-(TMP)-5-F-2'-脱氧尿苷，C4-(1，2，4-三唑-1-基)-2'-脱氧尿苷，C8-炔烃-胸苷，dT-二茂铁，N4-乙基-2'-脱氧胞苷，O4-甲基胸苷，吡咯并-2'-脱氧胞苷，乙二醇胸苷，4-硫代尿苷，5-甲基胞苷，5-甲基尿苷，吡咯胞苷，3-去氮-5-氮杂-2'-O-甲基胞苷，5-氟代-2'-O-甲基尿苷，5-氟代-4-O-TMP-2'-O-甲基尿苷，5-甲基-2'-O-甲基胞苷，5-甲基-2'-O-甲基胸苷，2'，3'-二脱氧腺苷，2'，3'-二脱氧胞苷，2'，3'-二脱氧鸟苷，2'，3'-二脱氧胸苷，3'-脱氧腺苷，3'-脱氧胞苷，3'-脱氧鸟苷，3'-脱氧胸苷和5'-O-甲基胸苷。不同的核苷酸物质可以包含任何这些核苷。所述不同的核苷酸物质优选为表2中这些核苷中的一个。所述不同的核苷酸物质最优选为2’-氟代-2’-脱氧腺苷或5-羧基-2'-脱氧胞苷。

替代地，所述不同的核苷酸物质优选缺少其要取代的核苷酸物质中存在的化学基团或原子。

所述不同的核苷酸物质，与一种或多种被取代的核苷酸相比，优选具有改变了的电负性。具有改变了的电负性的不同的核苷酸物质优选包含卤素原子。所述卤素原子可以被连接到所述不同的核苷酸物质上的任何位置，例如碱基和/或糖。所述卤素原子优选是氟(F)，氯(Cl)，溴(Br)或碘(I)。所述卤素原子最优选为F或I。

商业可获得的包含卤素的核苷包括，但不限于，8-溴代-2'-脱氧腺苷，8-溴代-2'-脱氧鸟苷，5-溴代尿苷，5-碘代尿苷，5-溴代尿苷，5-碘代尿苷，5'-碘代胸苷和5-溴代-2'-O-甲基尿苷。不同的核苷酸物质可以包含任何这些核苷。

实施例中提到的任何核苷酸都可以被用于本发明的方法中。

模板RNA

如果所述模板多核苷酸是RNA，聚合酶优选不形成互补多核苷酸，例如互补DNA。本发明不涉及国际申请No.PCT/GB2014/053121中公开的表征目标RNA的任何表征方法。

碱基的选择性去除

所述方法的步骤a)优选进一步包含选择性地去除修饰的多核苷酸中的一种或多种不同的核苷酸物质的碱基。这导致修饰的多核苷酸中的脱碱基核苷酸。脱碱基核苷酸是缺少碱基的核苷酸。所述脱碱基核苷酸通常包含糖和至少一个磷酸基团。所述糖通常是戊糖，例如核糖和脱氧核糖。所述脱碱基核苷酸通常是脱碱基核糖核苷酸或脱碱基脱氧核糖核苷酸。所述脱碱基核苷酸通常包含单磷酸，二磷酸或三磷酸。磷酸可以连接到脱碱基核苷酸的5’或3’侧。

所述碱基可以使用本领域任何已知方法选择性地去除。例如，某DNA修复蛋白质，例如人工烷基腺嘌呤DNA糖苷酶(hAAG)，能够从核苷酸选择性地去除3-甲基腺嘌呤，7-甲基鸟嘌呤，1,N6-亚乙烯基腺嘌呤和次黄嘌呤。当然，可以使用尿嘧啶DNA糖苷酶选择性地去除dUMP。

一种或多种不同的核苷酸的选择性修饰

所述方法的步骤a)优选进一步包含选择性地修饰在修饰的多核苷酸中的一种或多种不同的核苷酸物质。进一步的修饰可以用来产生具有不同电流测量值的k聚体。进一步的修饰也可以用于标记修饰的多核苷酸或将其连接到另一个分子或表面。

可以用以上讨论的任何化学基团或原子选择性地修饰一种或多种不同的核苷酸物质。例如，dPMP可以被选择性地修饰以包含卤素原子。

通过糖基化或聚乙二醇化可以选择性地修饰一种或多种不同的核苷酸物质。

单链的模板多核苷酸

模板多核苷酸可以是单链的。引物可以退火到模板多核苷酸并用作成核位点，通过聚合酶形成修饰的多核苷酸。一旦修饰的多核苷酸形成，可以使用发夹适配器连接所述模板和修饰的多核苷酸。例如，发夹适配器可以连接到两个杂交多核苷酸。

如果所述模板多核苷酸是单链，所述方法优选进一步包含在步骤a)之前将发夹适配器连接到模板多核苷酸的一个末端，使得在步骤a)中将连接的发夹适配器用作引物，通过聚合酶形成修饰的多核苷酸，从而通过发夹适配器连接修饰的多核苷酸和模板多核苷酸。

可以使用本领域已知的方法设计合适的发夹适配器。发夹环可以是任何长度。所述发夹环在长度上通常是50个或更少碱基，例如40个或更少碱基，30个或更少碱基，20个或更少碱基或10个或更少碱基。所述发夹环在长度上优选为大约为1至50，来自2至40或来自6至30个碱基。如果环与适配器的不同的选择能力有关，更长长度的，例如15至50个碱基的发夹环，是优选的。相似地，如果所述环与以下讨论的选择性结合没有关联，更短长度的例如1至5个碱基的发夹环，是优选的。

发夹适配器可以连接到模板多核苷酸的任一末端，即5’或3’末端。所述发夹适配器可以使用任何本领域已知的方法连接到模板多核苷酸。所述发夹适配器可以使用连接酶，例如T4 DNA连接酶，大肠杆菌DNA连接酶，Taq DNA连接酶，Tma DNA连接酶和9°N DNA连接酶，进行连接。

发夹适配器优选包含可选择性结合部分。这允许模板多核苷酸和修饰的多核苷酸被纯化或分离。可选择性结合部分是根据其结合性质被挑选的部分。因此，可选择性结合部分优选是特定地结合到表面的部分。如果可选择性结合部分比本发明使用的任何其他部分更大程度地连接到表面，则可选择性结合部分特定地结合到该表面。在优选实施例中，所述部分结合到本发明使用的其他部分没有结合到的表面。

合适的选择性结合部分是本领域已知的。优选的选择性结合部分包括，但不限于，生物素，核酸序列，抗体，抗体片段，例如Fab和ScSv，抗原，核酸结合蛋白质，聚组氨酸尾和GST标签。最优选的选择性结合部分是生物素和可选择性核酸序列。生物素特定地结合到用抗生物素蛋白包覆的表面。可选择性核酸序列特定地结合到(即杂交)用同源序列包覆的表面。替代地，可选择性核酸序列特定地结合到用核酸结合蛋白质包覆的表面。

发夹适配器和/或可选择性结合部分可以包含能被切开，割进，劈开或水解的区域。可以设计这样的区域以允许修饰的多核苷酸和模板多核苷酸(其可以通过发夹适配器被连接到一起)从其结合的表面被去除，之后进行纯化或分离。所述区域也可以被设计以允许修饰的多核苷酸从模板多核苷酸分离。合适的区域是本领域已知的。合适的区域包括，但不限于，RNA区域，包含脱硫生物素和链霉亲和素的区域，二硫键和光可断裂(photocleavable)区域。

如果模板多核苷酸是单链的，所述方法优选进一步包含在步骤a)之前将第一发夹适配器连接到模板多核苷酸的一个末端，使得在步骤a)中将连接的第一发夹适配器用作引物，通过聚合酶形成修饰的多核苷酸，这样修饰的多核苷酸和模板多核苷酸通过所述第一发夹适配器进行连接，在步骤(a)之后但在步骤(b)之前，第二发夹适配器连接到模板多核苷酸或修饰的多核苷酸的没有连接所述第一发夹适配器的末端，在聚合酶使用模板多核苷酸和修饰的多核苷酸作为模板形成新的多核苷酸条件下，让获得的构建体与聚合酶和自由核苷酸的组接触以制备双链构建体，其中两条链通过第二发夹适配器连接。在此实施例中所述自由核苷酸的组可以是以上讨论的任何核苷酸，包括模板多核苷酸中的核苷酸，DNA或RNA核苷酸或所述不同的核苷酸物质。所述双链构建体之后可以根据本发明被表征。在单链模板多核苷酸中的信息不仅是形成的修饰的多核苷酸的两倍，而且是形成的新多核苷酸的又两倍。

双链模板多核苷酸

模板多核苷酸可以是双链的。没有连接双链的发夹适配器可以连接到双链模板多核苷酸一个末端，即连接到双链模板多核苷酸的一条链的一个末端。所述发夹适配器之后可以用作成核位点用于引物延伸。

如果模板多核苷酸是双链的，所述方法优选进一步包含在步骤(a)之前将第一发夹适配器连接到模板多核苷酸的一个末端，并且将所述模板多核苷酸的双链分离以形成单链的模板多核苷酸构建体。根据本发明，所述单链的模板多核苷酸构建体之后可以被用模板以形成修饰的多核苷酸。

合适的发夹可以按照以上描述设计。发夹环可以是以上描述的任何长度。所述第一发夹适配器可以连接到模板多核苷酸任一末端，即5’或3’末端，并且所述第二发夹适配器连接到另一个末端。所述发夹适配器可以如上所述连接到模板多核苷酸。

所述模板多核苷酸的双链可以使用本领域已知的任何方法分离。例如，它们可以通过多核苷酸结合蛋白质分离或使用有助于去杂交(dehybridsation)的条件(有助于去杂交的条件的实例包括，但不限于，高温，高pH和能破坏氢键或碱基对的试剂的条件，例如甲酰胺或尿素)分离。聚合酶优选在分离模板多核苷酸的双链的同时使用链作为模板以形成修饰的多核苷酸。

所述方法优选进一步包含在步骤a)之前，将第二发夹适配器连接到单链模板多核苷酸构建体的一个末端，使得在步骤(a)中将连接的发夹适配器作为引物用来通过聚合酶形成修饰的多核苷酸，并通过第二发夹适配器连接修饰的多核苷酸和单链多核苷酸构建体。

所述第二发夹可以是以上讨论的任何发夹。

所述第二发夹适配器进一步包含所述发夹可以被切开，割进，劈开或水解的区域，并且所述方法进一步包含在步骤(c)之前将所述第二发夹适配器切开以打开圆形的多核苷酸构建体并制备双链多核苷酸。合适的区域讨论如上。

所述第一或第二发夹适配器优选包含以上讨论的可选择性结合部分。

前导序列

在步骤b)之前，所述方法优选包含在修饰的多核苷酸连接前导序列，所述前导序列优先旋入孔。所述前导序列有助于本发明的方法。所述前导序列被设计为优先地旋入跨膜孔，并因此有助于目标多核苷酸穿过孔的移动。所述前导序列通常包含聚合物。所述聚合物优选带负电荷。所述聚合物优选为多核苷酸，例如DNA或RNA，修饰的多核苷酸(例如脱碱基DNA)，PNA，LNA，BNA，聚乙二醇(PEG)或多肽。所述前导序列优选包含多核苷酸和更选包含单链多核苷酸。所述前导序列可以包含以上讨论的任何多核苷酸。所述单链前导序列最优选包含单链DNA，例如聚dT部分。所述前导序列优选包含一个或多个间隔区。

通常前导序列可以是任何长度，但长度上通常是10个至150个核苷酸，例如长度上为20个至150个核苷酸。所述前导的长度通常取决于用于本方法的跨膜孔。

表征

步骤b)包含将修饰的多核苷酸与跨膜孔接触，因此修饰的多核苷酸移动穿过所述孔。修饰的多核苷酸和模板多核苷酸可以与跨膜孔接触，使得它们都移动穿过所述孔。

本方法的步骤b)和c)优选在跨所述孔施加电势的情况下实施。所施加的电势可以是电压电势。替代地，所施加的电势可以是化学电势。这样的实例是在跨两亲层使用盐梯度。盐梯度在Holden et al.,J Am Chem Soc.2007 Jul 11；129(27)：8650-5中公开。在一些情况下，随着多核苷酸相对于孔移动，穿过所述孔的电流被用于确定修饰的多核苷酸的序列。这是链测序。如果修饰的多核苷酸被测序，模板多核苷酸的序列之后可以被重构。

修饰的多核苷酸和/或模板多核苷酸的全部或仅部分可以使用本方法表征，例如测序。模板多核苷酸的长度讨论如上。修饰的多核苷酸大体上是同样的长度。

跨膜孔是一定程度跨越膜的结构。它允许通过施加的电势驱动水合离子使其跨膜流动或在膜内流动。跨膜孔通常跨越整个膜以使得水合离子可以从膜的一侧流动到所述膜的另一侧。然而，跨膜孔不是必须跨越膜。其可以在一端封闭。例如，孔可以是膜中的孔道、间隙、通道、沟槽或狭缝，水合离子可以沿着其流动或流入。

本发明可使用任何跨膜孔。该孔可以是生物的或人造的。合适的孔包括但不限于，蛋白质孔，多核苷酸孔和固态孔。

根据本发明可使用任何膜。合适的膜是现有技术中已知的。该膜优选为两性分子层。两性分子层是一种由具有至少一个亲水性部分和至少一个亲脂性或疏水性部分的两性分子诸如磷脂质形成的层。两性分子可以是合成的或天然存在的。两性分子可以是单层或双层。非天然存在的两亲物质和形成单分子层的两亲物质是本领域已知的，并且包括嵌段共聚物(Gonzalez-Perez et al.,Langmuir,2009,25，10447-10450)。嵌段共聚物是其中两个或多个单体亚单元聚合在一起而形成单一聚合物链的聚合物材料。嵌段共聚物具有的性质通常由每个单体亚单元贡献。然而，嵌段共聚物可具有从各亚单元形成的聚合物不具备的独特的性质。嵌段共聚物可以被改造，使得该单体亚单元之一是疏水性的(即亲脂性)，而其它亚单元在水介质中是亲水性的。在这种情况下，该嵌段共聚物可具有两亲特性，并且可以形成模仿生物膜的结构。嵌段共聚物可以是二嵌段共聚物(由两个单体亚单元组成)，但也可以由两个以上的单体亚单元构成，以形成相当于两亲物质的更复杂的结构。所述共聚物可以为三嵌段，四嵌段或五嵌段共聚物。

两性分子层通常为平面脂质双分子层或支撑双层。

两性分子层通常是脂质双分子层。脂质双分子层为细胞膜的模型，且作为一系列实验研究的优秀的平台。例如，脂质双分子层可通过单通道记录器用于膜蛋白的体外研究。或者，脂质双分子层可作为生物传感器来检测一系列物质的存在。脂质双分子层可以为任何脂质双分子层。合适的脂质双分子层包括但不限于，平面脂质双分子层，支撑双层或脂质体。脂质双分子层优选为平面脂质双分子层。合适的脂质双分子层在国际申请No.PCT/GB08/000563(公布号为WO 2008/102121)，国际申请No.PCT/GB08/004127(公布号为WO2009/077734)和国际申请No.PCT/GB2006/001057(公布号为WO 2006/100484)中公开。

用于形成脂质双分子层的方法是本领域已知的。在实施例中公开了合适的方法。脂质双分子层通常由Montal和Mueller的方法形成(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,1972；69：3561-3566)，其中的脂质单分子层在穿过孔的任一侧负载在水溶液/空气界面上，所述孔垂直于所述界面。

Montal和Mueller的方法非常受欢迎，因为其成本经济并是一种相对迅速的形成具有良好质量的适合蛋白质孔嵌入的脂质双分子层的方法。形成脂质双分子层的其它常规方法包括尖浸渍(tip dipping)，涂覆双分子层(painting bilayers)和膜片钳。

在优选的实施例中，形成脂质双分子层如国际申请No.PCT/GB08/004127(公开为WO 2009/077734)中所描述。

在另一个优选的实施方案中，膜是固态层。固态层不是生物来源的。换句话说，固态层不是由生物环境获得或分离出的，所述生物环境例如生物体或细胞，或生物学上可获得结构的合成制造形式。固态层可以由有机材料和无机材料形成，包括但不限于，微电子材料，绝缘材料，例如Si₃N₄，Al₂O₃和SiO，有机和无机聚合物如聚酰胺，塑料如特氟隆

或柔性体如双组分加成固化硅橡胶，以及玻璃。固态层可由单原子层例如石墨烯，或只有几个原子厚度的层形成。合适的石墨层在国际申请No.PCT/US2008/010637(公开为WO 2009/035647)中公开。

实施该方法通常利用(i)包含孔的人工两性分子层；(ii)分离的，天然存在的包含孔的脂质双分子层，或(iii)含有孔嵌入其中的细胞。该方法通常使用人工两性分子层，如人工脂质双分子层实施。除了孔，该分子层可包含其他跨膜和/或膜内蛋白以及其他分子。合适的设备和条件在下面讨论。本发明的方法通常在体外实施。所述多核苷酸可以连接到膜上。这可以使用任何已知的方法来完成。如果膜是两性分子层，如脂质双分子层(如在上面详细讨论的)，所述多核苷酸优选通过在所述膜中存在的多肽或通过在所述膜中存在的疏水锚被连接到该膜上。疏水锚优选脂质，脂肪酸，甾醇，碳纳米管或氨基酸。

所述修饰的多核苷酸和/或模板多核苷酸可以直接连接到膜上。所述多核苷酸优选通过接器连接到膜上。优选的接器包括但不限于，聚合物，如多核苷酸，聚乙二醇(PEG)和多肽。如果所述多核苷酸直接连接到所述膜，由于该膜和所述孔之间的距离，导致表征不能进行到所述多核苷酸的末端，则将丢失一些数据。如果使用接器，则多核苷酸能够被表征完全。如果使用接器时，可将接器连接到所述多核苷酸的任何位置。接器优选连接到所述多核苷酸的尾部聚合物处。

该连接可以是稳定的或暂时的。对于某些应用，该连接的暂时性的性质是是优选的。如果稳定的连接分子直接地连接到多核苷酸的5'末端或3'末端，则由于该双层和孔之间的距离，表征不能进行到多核苷酸的末端，则将会导致数据的丢失。如果连接是暂时性的，那么当连接的末端随机变成没有该双层时，则多核苷酸能被表征完全。与膜形成稳定的或暂时性的连接的化学基团将在下文进行更详细的讨论。所述多核苷酸可以例如使用胆固醇或脂酰基链的脂质双分子层，暂时性的连接到两性分子层。可以使用任何具有6至30个碳原子长度的脂酰基链，例如棕榈酸。

连接合适的方法在国际申请No.PCT/GB12/05119 1(公布为WO 2012/164270)和英国申请No.1406155.0中公开。

用于基因组DNA的区段扩增的常用技术是使用聚合酶链反应(PCR)。此处，使用两个合成的寡核苷酸引物，可以产生相同DNA区段的许多拷贝，其中对于每个拷贝，在双链中的每条链的5'将是合成的多核苷酸。通过使用具有反应性基团如胆固醇，硫醇，生物素或脂质的反义引物，扩增的目标DNA的每个拷贝将包含用于连接的反应性基团。

跨膜孔优选跨膜蛋白孔。跨膜蛋白孔是多肽或允许水合离子例如分析物从膜的一侧流动到膜的另一侧的一系列多肽。在本发明中，跨膜蛋白孔能够形成允许通过施加的电势驱动的水合离子流从所述膜的一侧流动到另一侧的孔。跨膜蛋白孔优选允许分析物如核苷酸从膜如脂质双分子层的一侧流动到膜的另一侧。跨膜蛋白孔允许多核苷酸，如DNA或RNA，被移动穿过孔。

跨膜蛋白孔可以为单体或寡聚物。所述孔优选由数个重复亚基，如由6个，7个，8个或9个亚基构成。所述孔优选为六聚体，七聚体，八聚体或九聚体的孔。

跨膜蛋白孔通常包括离子可以流经的桶状体或通道。孔的亚基通常围绕中心轴线并向跨膜β桶状体或通道或跨膜α螺旋束或通道提供链(strands)。

跨膜蛋白孔的桶状体或通道通常包括促进与分析物相互作用的氨基酸，所述分析物如核苷酸，多核苷酸或核酸。这些氨基酸优选位于所述桶状体或通道的缢痕附近。跨膜蛋白孔通常包括一个或多个带正电荷的氨基酸，例如精氨酸，赖氨酸或组氨酸，或芳香族氨基酸如酪氨酸或色氨酸。这些氨基酸通常促进孔与核苷酸，多核苷酸或核酸之间的相互作用。

根据本法明使用的跨膜蛋白孔可以衍生自β-桶状孔或α-螺旋束孔。β-桶状孔包括由β-链形成的桶状体或通道。合适的β-桶状孔包括但不限于，β-毒素例如溶血素(α-溶血素-NN的一个单体或亚基的序列示于SEQ ID NO：4)，炭疽毒素和杀白细胞素，以及细菌的外膜蛋白/孔蛋白例如耻垢分枝杆菌(耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis))孔蛋白(MSP)，例如MspA，MspB，MspC或MspD，外膜孔蛋白F(OmpF)，外膜孔蛋白G(OmpG)，外膜磷脂酶A和奈瑟氏菌(奈瑟氏菌属(Neisseria))自转运脂蛋白(NalP)。α-螺旋束孔包括由α-螺旋形成的桶状物或通道。合适的α-螺旋束孔包括但不限于，内膜蛋白和α外膜蛋白，例如WZA和ClyA毒素。跨膜孔可衍生自Msp或衍生自α-溶血素(α-HL)。

跨膜蛋白孔优选衍生自Msp，优选衍生自MspA。该孔为低聚的且通常包含衍生自Msp的7个，8个，9个或10个单体。孔可以是衍生自含相同单体的MsP的同源寡聚孔。或者，孔可以是衍生自含至少一个不同于其他的单体的Msp的异源寡聚孔。优选地，孔衍生自MspA或其同源物或并系同源物(paralog)。

衍生自Msp的单体通常包含如SEQ ID NO：2或其变体的序列。SEQ ID NO：2为MspA单体的MS-(B1)8突变体。其包括以下突变：D90N，D91N，D93N，D118R，D134R和E139K。SEQ IDNO：2的变体是具有从SEQ ID NO：2变化而来的氨基酸序列且保留了其形成孔的能力的多肽。可以使用本领域已知的任何方法测定变体形成孔的能力。例如，变体可以连同其他合适的亚基被插入到两性分子层，且可以确定其寡聚化形成孔的能力。将亚基插入膜例如两亲膜的方法是本领域已知的。例如，亚基可以以纯化的形式悬浮在含有脂质双分子层的溶液中，从而使其扩散到脂质双分子层并通过结合到脂质双分子层而插入，并组装成功能状态。或者，可以使用如M.A.Holden,H.Bayley.J.Am.Chem.Soc.2005,127,6502-6503和国际申请No.PCT/GB2006/001057(公布号为WO 2006/100484)中所描述的“拾取和放置”方法将亚基直接插入膜。

对于整个长度的SEQ ID NO：2的氨基酸序列，基于氨基酸同一性，变体优选与该序列具有至少50％的序列同源性。更优选地，基于氨基酸同一性，变体与整个序列的SEQ IDNO：2的氨基酸序列具有至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，更优选至少95％，97％或99％的同源性。在100或更多，例如125，150，175或200或更多的连续氨基酸长度上，具有至少为80％，例如至少85％，90％或95％的氨基酸同一性(严格同源性)。

本领域的标准方法可用于确定同源性。例如，UWGCG软件包提供BESTFIT程序，该程序可以用来计算同源性，例如在其默认设置使用(Devereux et al(1984)Nucleic AcidsResearch 12,p387-395)。PILEUP和BLAST算法可以用来计算同源性或比对序列(例如鉴定等价残基或相应的序列(通常在它们的默认设置))，如Altschul S.F.(1993)J Mol Evol36:290-300；Altschul,S.F et al(1990)J Mol Biol 215:403-10中所描述的。公众可通过国家生物技术信息中心获得用于进行BLAST分析的软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。

SEQ ID NO：2是MspA单体的MS-(B1)8突变体。变体与MspA比较，可包括MspB，MspC或MspD单体中的任何突变。MspB，MspC和MspD的成熟形式在SEQ ID NO：5至SEQ ID NO：7中示出。特别地，变体可以包括存在于MspB中的下列取代:A138P。变体可以包括存在于MspC中的下列取代中的一个或多个:A96G,N102E和A138P。所述变体可包含存在于MspD中的下列突变中的一个或多个:G1缺失，L2V，E5Q，L8V，D13G，W21A，D22E，K47T，I49H，I68V，D91G，A96Q，N102D，S103T，V104I，S136K和G141A。所述变体可以包括来自Msp B，Msp C和Msp D的突变体和取代物中的一个或多个的组合。变体优选包含突变L88N。SEQ ID NO：2的变体具有突变L88N还具有MS-B1的所有突变，并被称为MS-(B2)8。在本发明中使用的孔优选MS-(B2)8。SEQID NO：2的变体具有突变G75S/G77S/L88N/Q126R还具有MS-B1的所有突变，并被称为MS-B2C。在本发明使用的孔优选MS-(B2)8或MS-(B2C)8。

除了以上讨论的，可对SEQ ID NO：2的氨基酸序列进行氨基酸取代，例如高达1，2，3，4，5，10，20或30个氨基酸的取代。保守取代用相似化学结构，相似化学性质或相似侧链体积的其他氨基酸替代氨基酸。引入的氨基酸可以与它们要替代的氨基酸具有相似的极性，亲水性，疏水性，碱性，酸性，中性或带电性。或者，所述保守取代可在预先存在的芳香族或脂肪族氨基酸的位置引入其他芳香族或脂肪族氨基酸。保守氨基酸的改变是本领域公知的，并且可以根据20种主要氨基酸的特性进行选择。SEQ ID NO：2的氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基可另外从上述多肽中缺失。可缺失高达1，2，3，4，5，10，20或30个或更多个氨基酸残基。

变体可包括SEQ ID NO：2的片段。这些片段保持孔形成活性。片段可以至少为50，100，150或200个氨基酸长度。这类片段可用于产生孔。片段优选包含SEQ ID NO：2的孔形成域。片段必须包含SEQ ID NO：2的残基88、90、91、105、118和134之一。通常，片段包括SEQ IDNO：2的所有残基88、90、91、105、118和134。

一个或多个氨基酸可以替代地或额外地添加到上述多肽中。可在SEQ ID NO：2或多肽变体或其片段的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端提供延伸。所述延伸可以很短，例如，1到10个氨基酸长度。或者，延伸可以更长，例如长达50或100个氨基酸。载体蛋白可以根据本发明被融合到氨基酸序列。其他融合蛋白在下文中更详细地讨论。

如上所讨论的，变体具有从SEQ ID NO：2的氨基酸序列变化而来的氨基酸序列且保留其形成孔能力的多肽。变体通常包含负责孔形成的SEQ ID NO：2的区域。包含β-桶状体的Msp的孔形成能力由每个亚基中的β-折叠(β-sheets)提供。SEQ ID NO：2的变体通常包含SEQ ID NO：2中形成β-折叠的的区域。可对SEQ ID NO：2中形成β-折叠的区域进行一个或多个修饰，只要得到的变体保留了其形成孔的能力。SEQ ID NO：2的变体优选地包括一个或多个修饰，如在α-螺旋和/或环状区域内取代，添加或缺失。

衍生自Msp的单体可以被修饰以辅助它们的鉴定或纯化，例如通过加入组氨酸残基(组氨酸标签)，天冬氨酸残基(天冬氨酸标签)，链亲和素标签或Flag标签，或通过加入信号序列以促进它们从细胞中分泌，该细胞中的多肽不天然地含有该信号序列。引入遗传标签的替换方式是通过化学反应将标签连到孔上天然的或人工位点。这方面的例子是将凝胶迁移试剂与人工连接在孔外的半胱氨酸进行反应。这已被证明是用于分离溶血素异源寡聚物的方法(Chem Biol.1997Jul；4(7):497-505)。

衍生自Msp的单体可以用可显示标记物进行标记。所述显示标记物可为任何使孔可被检测的合适的标记。合适的标记物如下所述。

衍生自Msp的单体也可以使用D-氨基酸生产。例如，衍生自Msp的单体可包含L-氨基酸和D-氨基酸的混合物。这是本领域中用于生产这类蛋白质或肽常规的。

衍生自Msp的单体含有一个或多个特异性修饰以促进核苷酸区别。衍生自Msp的单体也可以含有其它非特异性修饰，只要它们不干扰孔的形成。一些非特异性侧链修饰是本领域已知的，并可以对衍生自Msp的单体的侧链进行修饰。该修饰包括，例如，通过与醛反应然后用NaBH₄还原进行氨基酸的还原性烷基化，用甲基乙酰亚胺酯(methylacetimidate)进行脒基化，或用乙酸酐进行酰化。

衍生自Msp的单体可以使用本领域中已知的标准方法来制备。衍生自Msp的单体可以通过合成或重组方式制成。例如，所述孔可通过体外翻译和转录(IVTT)合成。制造孔的合适的方法在国际申请Nos.PCT/GB09/001690(公布号为WO 2010/004273)，PCT/GB09/001679(公布号为WO 2010/004265)或PCT/GB10/000133(公布号为WO 2010/086603)中描述。讨论了将孔插入膜的方法。

在一些实施例中，跨膜蛋白孔是化学修饰的。孔可以任何方式在任何位点进行化学修饰。所述跨膜蛋白孔优选通过下述进行化学修饰：将分子连接到一个或多个半胱氨酸(半胱氨酸键合)，将分子连接到一个或多个赖氨酸，将分子连接到一个或多个非天然氨基酸，表位的酶修饰或末端的修饰。适用于进行这些修饰的方法是本领域已知的。本文所描述的任何蛋白质，诸如跨膜蛋白孔可以通过人工合成或重组手段制备。例如，所述孔可通过体外翻译和转录(IVTT)合成。该孔的氨基酸序列可以被修饰为包括非天然存在的氨基酸或被修饰以提高蛋白质的稳定性。当通过合成手段制备蛋白质时，可以在制备过程将所述氨基酸引入。孔也可在成或重组生产之后被改变。

所述孔还可以使用D-氨基酸生产。例如，孔或构建体可包含L-氨基酸和D-氨基酸的混合物。这是本领域中用于生产这类蛋白质或肽常规的。

本发明的方法包括测量所述修饰的多核苷酸或模板多核苷酸的一个或多个特征。该方法可以包括测量2个，3个，4个，5个或更多个所述多核苷酸的特征。所述一个或多个特征，优选选自(i)所述多核苷酸的长度，(ii)所述多核苷酸的同一性，(iii)所述多核苷酸的序列，(iv)所述多核苷酸的二级结构；以及(v)多核苷酸是否是经修饰的。(i)至(v)的任何组合可以根据本发明进行测量。

对于(i)，所述多核苷酸的长度例如可以通过确定所述多核苷酸和所述孔之间的相互作用次数，或所述多核苷酸与所述孔之间的相互作用的持续时间来测定。

对于(ii)，所述多核苷酸的同一性可以通过多种方式测定。多核苷酸的同一性可以联合多核苷酸的序列的测定，或不联合所述多核苷酸的序列的测定进行测定。前者是直接的；对所述多核苷酸进行测序，并由此进行鉴定。后者可以以几种方式来完成。例如，可以测定多核苷酸中特定模序的存在(而无需测定该多核苷酸的其余序列)。或者，所述方法中测定的特定的电和/或光信号的测量值可鉴定来自特定来源的多核苷酸。

对于(iii)，多核苷酸的序列可以如前所述确定。合适的测序方法，特别是那些使用电测量值的测序方法，描述于Stoddart D et al.,Proc Natl Acad Sci,12；106(19):7702-7,Lieberman KR et al,J Am Chem Soc.2010；132(50):17961-72,和国际申请WO2000/28312中。

对于(iv)，所述二级结构可以以多种方式测量。例如，如果该方法包含电测量，二级结构可以利用穿过孔的停留时间的改变或电流变化进行测量。这使得单链和双链多核苷酸的区域能够被区别。

对于(v)，可以测定任何存在或不存在修饰。该方法优选包括确定所述多核苷酸是否用一个或多个蛋白质或一个或多个标记物、标签或间隔区通过甲基化、氧化、损伤进行了修饰。特异性修饰将导致与孔的特异性相互作用，其可以使用下面描述的方法来测定。例如，可以基于孔与每个核苷酸的相互作用过程中穿过孔的电流，区别胞嘧啶与甲基胞嘧啶。

可进行各种不同类型的测量。这包括但不限于：电测量和光测量。可行的电测量包括：电流测量，阻抗测量，测量隧道(Ivanov AP等人,Nano Lett.2011 Jan 12；11(1):279-85)，以及FET测量(国际申请WO 2005/124888)。光测量可以与电测量结合使用(Soni GV等人,Rev Sci Instrum.2010 Jan；81(1):014301)。所述测量可以是跨膜电流测量例如流经所述孔的离子电流的测量。

电测量可如Stoddart D等人,Proc Natl Acad Sci,12；106(19):7702-7,Lieberman KR等人,J Am Chem Soc.2010；132(50):17961-72,和国际申请WO-2000/28312所描述的使用标准单声道记录设备进行。或者，电测量可以使用多通道系统进行，例如如在国际申请WO-2009/077734和国际申请WO-2011/067559中所描述的。

所述方法可以使用任何适于研究膜/孔系统(其中孔嵌入膜中)的设备进行实施。该方法可以使用适合于感测跨膜孔的设备实施。例如，所述设备包括一个室，所述室包括水溶液和将该室分割为两部分的屏障(barrier)。所述屏障通常具有缝隙，其中在缝隙中形成包括孔的膜。或者该屏障形成其中存在孔的膜。

该方法可以使用在国际申请No.PCT/GB08/000562(WO 2008/102120)中描述的设备实施。

该方法可以包括随着多核苷酸相对于所述孔移动，测量通过所述孔的电流。因此该装置也可以包括能够跨膜和孔施加电势并测量电流信号的电路。该方法可以使用膜片钳或电压钳实施。所述方法优选包含使用电压钳。

本发明的方法可包括随着所述多核苷酸相对于所述孔移动来测量流过所述孔的电流。用于测量通过跨膜蛋白孔的离子电流的合适的条件是本领域已知的，并且在实施例中公开。该方法通过跨膜和孔施加的电压进行实施。使用的电压通常为+2V到-2V，通常-400mV到400mV。所使用的电压优选在具有以下下限和上限的范围内，所述下限的选自在-400mV，-300mV，-200mV，-150mV，-100mV，-50mV，-20mV和0mV的范围内，所述上限独立地选自+10mV，+20mV，+50mV，+100mV，+150mV，+200mV，+300mV，+400mV。所用的电压更优选在100mV到240mV的范围内并最优选在120mV到220mV的范围内。可通过对孔施加提高的电势来提高对不同核苷酸的分辨力。

该方法通常在任何载荷子，如金属盐，例如碱金属盐，卤盐，例如氯盐，如碱金属氯盐的存在下实施。载荷子可包括离子型液体或有机盐，例如四甲基氯化铵，三甲基氯化铵，氯化苯甲基铵，或1-乙基-3-甲基咪唑鎓氯化物。在上面讨论的示例性设备中，所述盐存在于所述室中的水溶液中。通常使用氯化钾(KCl),氯化钠(氯化钠)或氯化铯(CsCl)或亚铁氰化钾和铁氰化钾的混合物。优选氯化钾，氯化钠和亚铁氰化钾和铁氰化钾的混合物。盐浓度可为饱和的。盐浓度可以是3M或更低，通常为0.1M至2.5M，0.3M至1.9M，0.5M至1.8M，0.7M至1.7M，0.9M至1.6M或1M至1.4M。优选盐浓度为150mM到1M。所述方法优选使用至少为0.3M，例如至少为0.4M，至少为0.5M，至少为0.6M，至少为0.8M，至少为1.0M，至少为1.5M，至少为2.0M，至少为2.5M，或者至少为3.0M的盐浓度进行实施。高盐浓度提供了高信噪比，并使得在正常电流波动的背景下，代表核苷酸存在的电流能被识别。

该方法通常在缓冲剂存在下实施。在上面讨论的示例性设备中，缓冲剂在所述室中以水溶液存在。本发明的方法可使用任何缓冲剂。通常地，缓冲剂是磷酸盐缓冲液。其他合适的缓冲剂为HEPES和Tris-HCl缓冲剂。该方法通常在pH值为4.0至12.0，4.5至10.0，5.0至9.0，5.5至8.8，6.0至8.7，7.0至8.8，或7.5至8.5下实施。所使用的pH优选约为7.5。

该方法可在0℃至100℃，15℃至95℃，16℃至90℃，17℃至85℃，18℃至80℃，19℃至70℃，或20℃至60℃下实施。该方法通常在室温下进行。该方法可选地在支持酶功能的温度下，例如约37℃实施。

步骤b)优选进一步包括将修饰的多核苷酸与多核苷酸结合蛋白接触，使得所述蛋白质控制修饰的多核苷酸穿过孔的移动。更优选地，所述方法包括(a)让修饰的多核苷酸和跨膜孔及多核苷酸结合蛋白接触，使得所述多核苷酸移动穿过所述孔，所述蛋白质控制所述多核苷酸穿过孔的移动，和(b)随着所述多核苷酸相对于所述孔移动，测量流过所述孔的电流，其中电流表示所述多核苷酸的一个或多个特征，从而表征修饰的多核苷酸。

在一些情况下，模板多核苷酸和修饰的多核苷酸都移动穿过孔，例如当它们彼此连接时。步骤b)优选进一步包括将修饰的多核苷酸和模板多核苷酸与多核苷酸结合蛋白接触，使得所述蛋白质控制两种多核苷酸穿过孔的移动。更优选地，所述方法包括(a)将修饰的多核苷酸和模板多核苷酸与跨膜孔和多核苷酸结合蛋白接触，使得两种多核苷酸移动穿过所述孔并且所述蛋白质控制所述多核苷酸穿过孔的移动，和(b)随着所述多核苷酸相对于所述孔移动，测量流过所述孔的电流，其中电流表示所述多核苷酸的一个或多个特征，并由此表征所述模板多核苷酸。

所述多核苷酸结合蛋白可以是任何能够结合到所述多核苷酸并控制它穿过孔的移动的蛋白质。蛋白质是否结合到多核苷酸在本领域中是简单的。所述蛋白质通常与所述多核苷酸相互作用并且修饰所述多核苷酸的至少一个特征。所述蛋白质可通过将多核苷酸裂解来形成单个核苷酸或更短链的核苷酸，例如两核苷酸或三核苷酸，来修饰所述多核苷酸。所述部分可以通过定向多核苷酸或将多核苷酸移动到特定位置，即控制它的移动，来修饰多核苷酸。

所述多核苷酸结合蛋白优选为多核苷酸处理酶。多核苷酸处理酶能够与多核苷酸相互作用并修饰多核苷酸的至少一个特性的多肽。所述酶可以通过裂解多核苷酸以形成单个核苷酸或较短链的核苷酸，如二核苷酸或三核苷酸，来修饰多核苷酸。所述酶可以通过定向多核苷酸或将多核苷酸移动到特定的位置而修饰该多核苷酸。只要多核苷酸处理酶能够结合多核苷酸并控制其相对于孔的移动，所述多核苷酸处理酶并不需要显示酶活性。例如，所述酶可被修饰以去除其酶活性或者可在防止其作为酶发挥作用的条件下使用。这样的条件将在下文更详细的讨论。

所述一个或多个多核苷酸处理酶优选衍生自溶核酶。使用在构建体中的所述多核苷酸处理酶更优选衍生自酶分类(EC)组3.1.11、3.1.13、3.1.14、3.1.15、3.1.16、3.1.21、3.1.22、3.1.25、3.1.26、3.1.27、3.1.30和3.1.31中的任何成员。所述酶可以是在国际申请No.PCT/GB10/000133(公开为WO2010/086603)中公开的任何酶。

优选的酶是聚合酶、核酸外切酶、解旋酶和拓扑异构酶如旋转酶。合适的酶包括但不限于，来自大肠杆菌的核酸外切酶I(SEQ ID NO：11)，来自大肠杆菌的核酸外切酶III酶(SEQ ID NO：13)、来自嗜热栖热菌的RecJ(SEQ ID NO：15)和噬菌体λ核酸外切酶(SEQ IDNO：17)、TatD核酸外切酶及其变体。包含SEQ ID NO：15中示出的序列的三个亚基或其变体相互作用以形成三聚体核酸外切酶。所述酶优选为Phi29 DNA聚合酶(SEQ ID NO：9)或其变体。所述拓扑异构酶优选为部分分类(EC)组5.99.1.2和5.99.1.3中的任何成员。

所述酶最优选衍生自解旋酶，例如Hel308 Mbu(SEQ ID NO：18)，Hel308 Csy(SEQID NO：19)，Hel308 Mhu(SEQ ID NO：20)，TraI Eco(SEQ ID NO：21)，XPD Mbu(SEQ ID NO：22)或其变体。本发明可以使用任何解旋酶。所述解旋酶可以是或衍生自Hel308解旋酶，RecD解旋酶，例如TraI解旋酶或TrwC解旋酶，XPD解旋酶或Dda解旋酶。所述解旋酶可以是国际申请No.PCT/GB2012/052579(公布号为WO 2013/057495)；PCT/GB2012/053274(公布号为WO 2013/098562)；PCT/GB2012/053273(公布号为WO2013098561)；PCT/GB2013/051925；PCT/GB2013/051924，PCT/GB2013/051928和PCT/GB2014/052736中公开的任何解旋酶，修饰的解旋酶或解旋酶构建体。

所述解旋酶优选包含如SEQ ID NO：25(Trwc Cba)所示的序列或其变体，所述序列如SEQ ID NO：18(Hel308 Mbu)所示的序列或其变体或所述序列如SEQ ID NO：24(Dda)所示的序列或其变体。变体可以以下针对跨膜孔讨论的任意方式不同于天然序列。SEQ ID NO：8的优选变体包含E94C/A360C和(ΔM1)G1G2(即M1缺失并并添加G1和G2)。

根据本发明任何数量的解旋酶可移动穿过一个或多个间隔区。例如，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多个解旋酶可移动穿过一个或多个间隔区。在一些实施例中，不同数量的解旋酶可移动穿过各间隔区。例如，如果使用两个分离的间隔区停滞两个解旋酶，一个解旋酶(第一解旋酶)可移动穿过第一间隔区，但两个解旋酶(第一和第二解旋酶)可移动穿过第二间隔区。

本发明的方法优选包括移动两个或多个，例如三个或更多或四个或更多，停滞的解旋酶穿过一个或多个间隔区。所述两个或多个解旋酶通常是相同的解旋酶。所述两个或多个解旋酶可以是不同的解旋酶。

所述两个或多个解旋酶可以是以上提到的解旋酶的任意联合。所述两个或多个解旋酶可以是两个或多个Dda解旋酶。所述两个或多个解旋酶可以是一个或多个Dda解旋酶和一个或多个TrwC解旋酶。所述两个或多个解旋酶可以是相同解旋酶的不同变体。

所述两个或多个解旋酶优选彼此连接。所述两个或多个解旋酶更优选彼此共价地连接。所述解旋酶可以任何顺序和使用任何方法连接。本发明中使用的优选的解旋酶构建体在国际申请Nos.PCT/GB2013/051925；PCT/GB2013/051924；PCT/GB2013/051928和PCT/GB2014/052736中进行了描述。

SEQ ID NOs：9，11，13，15，17，18，19，20，21，22，23，24或25的变体是具有以下氨基酸序列的酶，所述氨基酸由SEQ ID NO：9，11，13，15，17，18，19，20，21，22，23，24或25的氨基酸序列变化而来并保持多核苷酸结合能力的酶。这可以使用本领域已知的任何方法测定。例如，所述变体可与多核苷酸接触，并且它与多核苷酸结合的能力和沿着所述多核苷酸移动的能力可以被测定。所述变体可包括促进多核苷酸结合和/或提高它在高盐浓度和/或室温下活性的能力的修饰。

基于氨基酸同一性，对于SEQ ID NO：9，11，13，15，17，18，19，20，21，22，23，24或25的氨基酸序列的整个长度，变体优选与该序列具有至少50％的同一性。更优选，基于氨基酸同一性，对于SEQ ID NO：9，11，13，15，17，18，19，20，21，22，23，24或25的氨基酸序列的整个长度，变体多肽与该序列具有至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％和更优选至少95％，97％或99％的同一性。在200或更多，例如230，250，270，280，300，400，500，600，700，800，900或1000或更多的连续氨基酸长度上，可以具有至少80％，例如至少85％，90％或95％的氨基酸同一性(严格同源性)。同源性如上所述进行确定。所述变体可以按上述针对SEQ ID NO：2和4所描述的多种方式中的任意一种不同于野生型序列。酶可以共价地连接到孔。可以使用任何方法将酶共价连接到孔。

在链测序中，在顺着或逆着施加的电势下，多核苷酸移位穿过孔。逐渐的或进行性作用于双链多核苷酸的核酸外切酶可用在孔的顺侧在施加的电势下使剩余的单链穿过所述孔或在相反的电势下在反侧使剩余的单链穿过所述孔。同样地，也可以相似方式使用能解开双链DNA的解旋酶。也可以使用聚合酶。对于测序应用也可能需要在逆着施加的电势下进行链移位，但在反电势或无电势下DNA必须首先被酶“捕获”。然后，在结合链后，随着电势翻转，链将从顺侧到反侧穿过所述孔，并被电流保持为伸长的构造。单链DNA核酸外切酶或单链DNA依赖聚合酶可用作分子马达，以受控的逐步的方式逆着施加的电势，从反侧到顺侧，将最近移位的单链穿过所述孔拉回。

表征修饰的或模板多核苷酸的方法优选包括将多核苷酸与孔和衍生自解旋酶的多核苷酸结合蛋白接触。所述方法可使用任何解旋酶。所述解旋酶相对于孔可以两种模式工作。首先，所述方法优选通过在顺着施加的电势形成的场中使用解旋酶使其移动多核苷酸穿过所述孔来实施。在这种模式中，所述多核苷酸的5’末端首先被捕获在所述孔中，并且所述解旋酶移动所述多核苷酸进入所述孔，使得其顺着场穿过所述孔直到最终移位至双分子层的反侧。或者，所述方法优选通过解旋酶逆着施加的电势形成的场中移动所述多核苷酸穿过所述孔来进行实施。在这种模式中所述多核苷酸的3’末端首先被捕获在所述孔中，并且所述解旋酶移动所述多核苷酸穿过所述孔，使得其在逆着施加的场中被拉出所述孔直到最终被拉回至双分子层的顺侧。

所述多核苷酸可以任何顺序与多核苷酸结合蛋白和孔接触。优选地，当多核苷酸与多核苷酸结合蛋白例如解旋酶及所述孔接触时，所述多核苷酸首先与蛋白质形成复合体。当施加电压穿过孔时，所述多核苷酸/蛋白质复合体之后与所述孔形成复合体并控制所述多核苷酸穿过孔的移动。

通常在自由核苷酸或自由核苷酸类似物和有利于多核苷酸结合蛋白发挥功能的酶辅因子的存在下实施本方法的步骤b)和c)。所述自由核苷酸可以是任何以上讨论的单个核苷酸的一种或多种。所述自由核苷酸包括，但不限于，单磷酸腺苷(AMP)，二磷酸腺苷(ADP)，三磷酸腺苷(ATP)，单磷酸鸟苷(GMP)，二磷酸鸟苷(GDP)，三磷酸鸟苷(GTP)，单磷酸胸苷(TMP)，二磷酸胸苷(TDP)，三磷酸胸苷(TTP)，单磷酸尿苷(UMP)，二磷酸尿苷(UDP)，三磷酸尿苷(UTP)，单磷酸胞苷(CMP)，二磷酸胞苷(CDP)，三磷酸胞苷(CTP)，单磷酸环腺苷(cAMP)，单磷酸环鸟苷(cGMP)，单磷酸脱氧腺苷(dAMP)，二磷酸脱氧腺苷(dADP)，三磷酸脱氧腺苷(dATP)，单磷酸脱氧鸟苷(dGMP)，二磷酸脱氧鸟苷(dGDP)，三磷酸脱氧鸟苷(dGTP)，单磷酸脱氧胸苷(dTMP)，二磷酸脱氧胸苷(dTDP)，三磷酸脱氧胸苷(dTTP)，单磷酸脱氧尿苷(dUMP)，二磷酸脱氧尿苷(dUDP)，三磷酸脱氧尿苷(dUTP)，单磷酸脱氧胞苷(dCMP)，二磷酸脱氧胞苷(dCDP)和三磷酸脱氧胞苷(dCTP)。所述自由核苷酸优选选自AMP，TMP，GMP，CMP，UMP，dAMP，dTMP，dGMP或dCMP。所述自由核苷酸优选腺苷三磷酸(ATP)。所述酶辅因子是使构建体发挥功能的因子。所述酶辅因子优选是二价金属离子。所述二价金属离子优选是Mg²⁺，Mn²⁺，Ca²⁺或Co²⁺。所述酶辅因子最优选是Mg²⁺。

解旋酶和分子制动器(molecular brake)

在优选实施例中，所述方法包括：

(i)给所述多核苷酸/每个多核苷酸提供一个或多个解旋酶和一个或多个连接到所述多核苷酸/每个多核苷酸的分子制动器；

(b)将所述多核苷酸/每个多核苷酸与跨膜孔接触并跨所述孔施加电势，使得一个或多个解旋酶和一个或多个分子制动器结合在一起并共同控制所述多核苷酸/每个多核苷酸的至少一条链移动穿过所述孔；

(c)随着所述多核苷酸/每个多核苷酸相对于所述孔移动，获取一个或多个测量值，其中所述测量值代表所述多核苷酸的一个或多个特征，并由此表征修饰的多核苷酸或模板多核苷酸。

这种类型的方法在国际申请No.PCT/GB2014/052737中详细讨论了。

试剂盒

本发明还提供了用于表征模板多核苷酸的试剂盒。所述试剂盒包括(a)聚合酶和(b)包含核苷酸物质的自由核苷酸的组，所述核苷酸物质不同于模板多核苷酸中的一种或多种核苷酸物质。聚合酶能够使用模板多核苷酸作为模板，由所述自由核苷酸形成修饰的多核苷酸。所述聚合酶能够用不同的核苷酸物质取代模板多核苷酸中的一种或多种所述核苷酸物质。

所述试剂盒优选进一步包括发夹环和/或能够优先地旋入跨膜孔的前导序列。所述试剂盒优选进一步包括跨膜孔。所述试剂盒优选进一步包括多核苷酸结合蛋白。

关于本发明方法的以上讨论的任何实施方式同样适用于所述试剂盒。所述试剂盒可进一步包括膜的组件，例如两性分子层或脂质双分子层的组件。

本发明的试剂盒可以另外包括能使上面描述的任何实施方式实施一种或多种其他试剂或仪器。所述试剂或仪器包括以下的一种或多种：合适的缓冲剂(水溶液),用于从受体获得样本的工具(诸如导管或含有针的仪器)，用于扩增和/或表达多核苷酸的工具,如上所定义的膜或者电压钳或膜片钳装置。存在于所述试剂盒中的试剂可以是干态的，液体样本使所述试剂重悬。所述试剂盒还可选地包括使该试剂盒能在本发明方法中使用或关于该方法可以用于哪些有机体的说明书。

同聚多核苷酸方法

本发明还提供了表征同聚多核苷酸的方法。同聚多核苷酸是只由一种核苷酸物质组成的多核苷酸。所述同聚多核苷酸可包含以上讨论的任何核苷酸物质。同聚多核苷酸包括，但不限于，聚(A)，聚(dA)，聚(U)，聚(dU)，聚(C)，聚(dC)，聚(G)，聚(dG)，聚(T)和聚(dT)。同聚多核苷酸很难使用孔表征，例如链测序，因为随着同聚多核苷酸穿过孔，单一核苷酸物质的存在导致恒定的电流信号。如以下所述本发明的方法避免了这种问题。

所述同聚多核苷酸可以是任何长度。所述同聚多核苷酸在长度上可以是2个至100个核苷酸，例如从5个至50个或从10个至40个核苷酸长度。所述同聚多核苷酸可形成更长的模板多核苷酸的部分。

将所述同聚多核苷酸与自由核苷酸的组接触。聚合酶使用所述自由核苷酸来形成基于所述同聚多核苷酸的修饰的多核苷酸。组中的自由核苷酸的特性决定了修饰的多核苷酸的组成。

组中的每个自由核苷酸能够杂交或结合到所述同聚多核苷酸中的核苷酸物质。组中的每个自由核苷酸通常能够特定地杂交或特定地结合到(即互补)模板多核苷酸中的核苷酸物质。这允许聚合酶利用互补性(即碱基配对)使用同聚多核苷酸来形成修饰的多核苷酸。

能够通过所述聚合酶处理每个自由核苷酸并将其插入到修饰的多核苷酸中。

修饰的多核苷酸不是所述同聚多核苷酸的相反互补序列。当形成修饰的多核苷酸时，所述聚合酶随机地用不同的核苷酸物质取代与同聚多核苷酸中的核苷酸物质互补的某核苷酸物质。例如，所述聚合酶可以用修饰的多核苷酸中的修饰版本的dTMP取代某dTMP，当使用聚(dAMP)同聚多核苷酸作为模板时。

随机取代某核苷酸物质导致修饰的多核苷酸提供了变化电流信号，当所述修饰的多核苷酸移动穿过孔时。这使得同聚多核苷酸更容易被表征。

不同的核苷酸物质优选是被取代的核苷酸物质的修饰版本。它可以以任何以上讨论的方式被修饰。

本发明的方法描述如下。

同聚 …AAAAAAAAA…

修饰的 …XTTXXTTTX…

在以上描述中，两条链都基于DNA。同聚多核苷酸显示在上部，是聚(dAMP)。修饰的核苷酸显示在下部。聚合酶用修饰的多核苷酸中的不同的核苷酸物质X随机地取代某核苷酸物质T(即dTMP)。所述不同的核苷酸物质X可以是任何以上讨论的核苷酸物质。X优选是修饰版本的T。它可以以任何以上讨论的方式被修饰。为了做到这样，所述模板多核苷酸与聚合酶和T和X的组接触。所述聚合酶能够处理X并随机地将X插入至T应该出现在修饰的多核苷酸的位置。

任何数量的某核苷酸物质可以用不同的核苷酸物质取代。例如，聚合酶可以用不同的核苷酸物质取代至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％或至少80％的核苷酸物质。所述聚合酶通常不会用不同的核苷酸物质取代所有的核苷酸物质。用不同的核苷酸物质取代的某核苷酸物质的数量通常取决于不同的核苷酸物质杂交或结合到同聚核苷酸的强度，以及被取代的核苷酸物质，和/或不同的核苷酸物质与被取代的核苷酸物质在自由核苷酸组中的比例。

在一些优选实施例，当形成修饰的多核苷酸时，聚合酶利用第一不同的核苷酸物质随机取代与同聚多核苷酸中的核苷酸物质互补的某核苷酸物质，并利用第二不同的核苷酸物质随机取代与同聚多核苷酸中的核苷酸物质互补的其他核苷酸物质。换句话说，不同的核苷酸物质被有区别的核苷酸取代。例如，所述聚合酶可利用修饰版本的dTMP，例如缺乏天然化学基团的dTMP，取代某dTMP，并利用不同的修饰版本的dTMP，例如用卤素原子修饰的dTMP，取代某dTMP。对于模板DNA，可以将DNA与聚合酶和包含dTMP，经修饰版本的dTMP和不同修饰版本的dTMP的自由核苷酸的组接触来实现。某些核苷酸物质可能不被取代。

这个实施例描述如下。

同聚 …AAAAAAAAA…

修饰的 …XTXYXTYTX…

在以上描述中，两条链都基于DNA。同聚多核苷酸显示在上部，是聚(dAMP)。修饰的核苷酸显示在下部。聚合酶用修饰的多核苷酸中的两个不同的核苷酸物质X和Y随机地取代核苷酸物质T(即dTMP)中的一些。所述不同的核苷酸物质X和Y可以是任何以上讨论的核苷酸物质。X和Y优选是不同修饰版本的T。它们可以以任何以上讨论的方式被修饰。为了这么做，将所述模板多核苷酸与聚合酶和T，X和Y的组接触。所述聚合酶能够处理X和Y并将它们随机地插入至T应该出现在修饰的多核苷酸中的位置。修饰的多核苷酸中的T，X和Y的相对数量通常取决于T，X和Y杂交或结合到同聚多核苷酸的相对强度和/或自由核苷酸组中T，X和Y的比例。

或者，模板多核苷酸中的所有的核苷酸物质都可以用第一不同核苷酸物质或第二核苷酸物质来取代。这个实施方式使用如上所述相同的方式描述如下。

同聚 …AAAAAAAAA…

修饰的 …XYXYXYYXX…

为了这么做，将所述模板多核苷酸与聚合酶和X和Y的组接触。修饰的多核苷酸中的X和Y的相对数量通常取决于X和Y杂交或结合到同聚多核苷酸的相对强度和/或自由核苷酸组中X和Y的比例。

使用同聚多核苷酸作为模板形成的修饰的多核苷酸然后与跨膜孔接触，使得修饰的多核苷酸移动穿过所述孔。随着修饰的多核苷酸相对于所述孔移动，获取一个或多个测量值，其中所述测量值代表修饰的多核苷酸的一个或多个特征，由此表征所述同聚多核苷酸。以上讨论的任何实施方式的都适用这些步骤。

以下实施例举例说明本发明。

实施例

实施例1

本实施例描述了使用Klenow(SEQ ID NO：26)和dNTPs(当至少一个dNTPs是来自dAMP，dGMP，dTMP和dCMP的不同的核苷酸物质时)，如何从5’前导区和系链位点(tethersite)和3’发夹填充ssDNA来形成600bp DNA链。

材料与方法

1.1 ssDNA样品的制备

使用以下方法制备在步骤1.2中需要的λDNA样品的600bp ssDNA片段(SEQ ID NO：33其在5’末端连接到4个iSpC3间隔区，所述4个iSpC3间隔区在其另一端连接到SEQ ID NO：30)。通过使用LongAmp^TM Taq DNA聚合酶(NEB，目录号No：M0323S)利用以下引物SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29扩增λ的600bp片段(SEQ ID NO：27显示dsDNA的义序列)。按如下进行循环反应；94℃进行30秒，(94℃进行15秒，57℃进行30秒，65℃进行1分钟)₃₀，65℃进行5分钟。所述600bp片段在5％TBE PAGE凝胶上跑胶，以及纯化PAGE，在无核酸酶的水中洗脱。

之后使用第一回的产物作模板，LongAmp^TM Taq DNA聚合酶(NEB，目录号No：M0323S)和以下引物(引物1＝SEQ ID NO：30在其5末端连接到28个iSpC3间隔区，所述28个iSpC3间隔区在其另一端连接到2个胸腺嘧啶，并且所述引物1在其3’末端连接到4个iSpC3间隔区，所述4个iSpC3间隔区在其另一端连接到SEQ ID NO：31以及引物2＝SEQ ID NO：32)实施第二回的PCR。

PCR之后产物通过λ核酸外切酶(NEB，目录号No.M0262S)在37℃消化1小时。消化之后产物在5％TBE PAGE凝胶上跑胶，并从凝胶纯化该ssDNA(SEQ ID NO:33其在5’末端连接到4个iSpC3间隔区，所述4个iSpC3间隔区在其另一端连接到SEQ ID NO：30)，在无核酸酶的水中洗脱。

1.2修饰的DNA样品的制备

修饰的ssDNA样品通过以下表1概括的和其下段落介绍的方法制备。表中的实施例利用6-硫代-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸取代dGTP，然而，任何dNTP可使用以下方法被取代为获得不同的核苷酸物质。

表1

以上反应混合物在37℃孵育60分钟。15μL的样品，添加到RecJ_f(购买自NewEngland Biolabs^TM)并在37℃孵育1小时，然后在140V下在5％TBE PAGE上跑胶55分钟。PAGE凝胶的实施例显示在图1中。第5道显示了修饰的DNA的凝胶，其中在表1预先描述的样品制备过程修饰的DNA中dTTP已经被5-丙炔基-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸取代。第6道显示了修饰的DNA的凝胶，其中在表1预先描述的样品制备过程修饰的DNA中dGTP已经被6-硫代-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸取代。第7道显示了修饰的DNA的凝胶，其中在表1预先描述的样品制备过程修饰的DNA中dTTP和dGTP已经被5-丙炔基-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸和6-硫代-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸分别取代。由修饰的600bp片段产生的条带(band)在与600bp对照(第3道)跑在同一位置，表明样品制备已成功。

反应混合物之后使用SPRI珠(150μL)纯化并在无核酸酶水(40μL)中洗脱。样品使用分光光度计定量并将浓度调整到100nM。所述DNA样品(SEQ ID NO：34显示了非修饰的序列，所述SEQ ID NO：34在其3’末端连接到4个iSpC3间隔区，所述4个iSpC3间隔区在其另一端连接到SEQ ID NO：38的5’末端，其中在此实施例中所有的G被6-硫代-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸取代)(100nM)之后与系链(tether)(SEQ ID NO：42,100nM)和5x退火缓冲液和无核酸酶水中孵育，并在55℃加热2分钟，并以每分钟2℃冷却到18℃。

实施例2

本实施例描述了Trwc Cba(SEQ ID NO：25)酶如何控制修饰的多核苷酸穿过单个MspA纳米孔(MS(B1-G75S/G77S/L88N/Q126R)8 MspA(MspA–B2C)(SEQ ID NO：2具有G75S/G77S/L88N/Q126R突变)的移动。

材料和方法

在建立实验之前，修饰的DNA构建体(SEQ ID NO：34在其3’末端连接到4个iSpC3间隔区，所述4个iSpC3间隔区在其另一端连接到SEQ ID NO：38的5’末端，所述SEQ ID NO：38的5’末端C，T，A或G中的至少一个被实施例1的步骤1.2中的不同的核苷酸三磷酸物质取代；还包含系链序列SEQ ID NO：42，终浓度0.5nM)和TrwC Cba(1μM)在23℃缓冲液(50mM CAPS/NaOH,pH 10.0+100mM NaCl)中一起预先孵育至少1小时。

在缓冲液(625mM KCl,100mM羟乙基哌嗪乙磺酸,75mM亚铁氰化钾(II),25mM铁氰化钾(III),pH 8)中，由插入嵌段共聚物中的单个MspA纳米孔(MspA–B2C)在15℃获取电测量值(通过将实验系统设置在冷却板上)。在实现单个孔插入到嵌段共聚物中后，然后将缓冲液(1mL，625mM KCl，100mM羟乙基哌嗪乙磺酸，75mM亚铁氰化钾(II)，25mM铁氰化钾(III)，pH 8)流经所述系统以去除任何过量的MspA纳米孔(MspA–B2C)。将MgCl₂(10mM终浓度)和dTTP(5mM终浓度)用缓冲液(625mM KCl，100mM羟乙基哌嗪乙磺酸，75mM亚铁氰化钾(II)，25mM铁氰化钾(III)，pH 8)混合到一起，然后添加到修饰的DNA构建体(0.5nM终浓度)，TrwC Cba(1μM终浓度)缓冲液(50mM CAPS/NaOH，pH 10.0+100mM NaCl)中预混合。然后将预混合物添加到单个纳米孔实验系统中。然后在电势翻转过程(120mV，每20分钟电势翻转到-100mV保持2秒，然后0mV保持2秒)之后进行实验2小时，并监控解旋酶控制的DNA移动。

结果与讨论

观察解旋酶控制的DNA移动用于修饰的DNA构建体检测(标记的构建体Z在下表2中，其对应于SEQ ID NO：34，所述SEQ ID NO：34在其3’末端连接到4个iSpC3间隔区，所述4个iSpC3间隔区在其另一端连接到SEQ ID NO：38的5’末端，所述SEQ ID NO：38的5’末端C，T，A或G中的至少一个被实施例1的步骤1.2中的不同的核苷酸三磷酸物质取代；还包含系链序列SEQ ID NO：42)。一列其他被测试的修饰的多核苷酸在这一实施例的末尾提供(例如第2至4条使用的缓冲液是600mM KCl，25mM磷酸钾，75mM亚铁氰化钾(II)，25mM铁氰化钾，pH8.0和使用的电势翻转协议是120mV，每10分钟电势翻转到-100mV保持2秒，然后0mV保持2秒)。下面的表2强调了多个被研究的实施例。

表2

图2和4-8中所示的对角点图显示了修饰的链中每个碱基组合的电流水平随着未修饰的链中其等同物的变化，因此使得电流-序列关系中的大变化通过对角线的大位移表示。图3显示了表2中实验序号1的解旋酶控制的DNA移动的实施例。

当获得来自修饰的模板的数据时，所述链映射到已知序列并用来训练(train)新的碱基识别模型(base-calling模型),其中每个“kmer”或碱基组合具有特征电流水平。这些kmer电流水平绘制在纵轴上，它们未修饰的等同物绘制在横轴上。点的形状表示组合中的中心碱基。以这种方式描绘测得的电流信号和一组特定修饰的序列之间的关系。表现非常不同的电流序列关系的修饰的模板显示出远离对角的点，而具有小的变化的修饰的模板显示出靠近对角线的点。取决于使用的具体修饰，观察到的变化或者是由于kmers的具体设置，或者是由于更一般伸展。

从标准模型显示出大的或明显的变化的修饰是特别感兴趣的，因为这些修饰用于与标准结合以提供关于序列的更多信息。从示例的图2和4-8可以清楚看出不同的核苷酸物质引入到制备的修饰的多核苷酸中明显改变了标准模型。

以下不同的核苷酸物质也在以上描述的相同的实验系统中进行了测试，5-羧基-2'-脱氧胞苷-5'-三磷酸，5-丙炔基-2'-脱氧胞苷-5'-三磷酸，5-氟代-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸，2-硫代胸苷-5'-三磷酸，5-溴代-2'-脱氧胞苷-5'-三磷酸，5-碘代-2'-脱氧胞苷-5'-三磷酸，5-三氟代甲基-2’脱氧-尿苷-5’-三磷酸，5-碘代-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸，5-溴代-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸，7-去氮-7-溴代-2’-脱氧-腺苷-5’-三磷酸，7-去氮-7-碘代-2’-脱氧-腺苷-5’-三磷酸，7-去氮-7-碘代-2’-脱氧-鸟苷-5’-三磷酸，6-硫代-2'-脱氧鸟苷-5'-三磷酸，α-硫代磷酸-脱氧胸苷-5’-三磷酸，α-硫代磷酸-脱氧腺苷-5’-三磷酸，5-氟代-2-脱氧胞苷-5’-三磷酸，2’-氟代-2’-脱氧-尿苷-5’-三磷酸，2'-氟代-2-脱氧尿苷-5’-三磷酸，2’-氟代-2’-脱氧-胞苷-5’-三磷酸。

以下不同的核苷酸物质也在与以上描述相似的实验中测试，但使用了200bp长度的链(SEQ ID NO：39在其3’末端连接到4个iSpC3间隔区，所述4个iSpC3间隔区在其另一端连接到SEQ ID NO：40的5’末端，所述SEQ ID NO：40的5’末端C，T，A或G中的至少一个被实施例1的步骤1.2中的不同的核苷酸三磷酸物质取代；还包含系链序列SEQ ID NO：42)–肌苷(2’脱氧肌苷-5’-三磷酸)，7-去氮-2'-脱氧鸟苷-5'-三磷酸，脱碱基(取代任意的G或T)，糖基化羟甲基化脱氧胞苷取代的hmC后聚合酶插入，2'-脱氧-P-核苷-5'-三磷酸(dP)，zebularine(2’脱氧ebularine-5’-三磷酸)，5-羟基甲基-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸，N⁴-甲基-2'-脱氧胞苷-5'-三磷酸，5-甲基-2'-脱氧胞苷-5'-三磷酸，7-去氮-2'-脱氧腺苷-5'-三磷酸，2-氨基-2'-脱氧腺苷-5'-三磷酸，N⁶-甲基-2'-脱氧腺苷-5'-三磷酸，2-氨基嘌呤-2'-脱氧核糖核苷-三磷酸，2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸，链的骨架变为LNA，N6-苄基-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸，连接到Cy5的5-氨基-炔丙基-2’-脱氧尿苷5’-三磷酸，5-丙炔基-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸，5-羟基甲基-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸，6-氮杂-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸，6-硫代-2'-脱氧鸟苷-5'-三磷酸，5-甲酰基-2’-脱氧胞苷-5’-三磷酸，5-羧基-2'-脱氧胞苷-5'-三磷酸和2-硫代-2'-脱氧胞苷-5'-三磷酸。

实施例3

本实施例描述了Trwc Cba(SEQ ID NO：25)酶如何控制修饰的多核苷酸移动穿过单个MspA纳米孔(MspA–B2C)。在模板多核苷酸中的核苷酸物质(A和G)被修饰的多核苷酸中的不同的核苷酸物质(7-去氮-7-碘代-2’-脱氧-腺苷-5’-三磷酸和7-去氮-7-碘代-2’-脱氧-鸟苷-5’-三磷酸)取代。

材料和方法

使用如上述实施例2描述的相同的方法制备实验的预混合物，除了修饰的DNA构建体(SEQ ID NO：34在其3’末端连接到4个iSpC3间隔区，所述4个iSpC3间隔区在其另一端连接到SEQ ID NO：38的5’末端，所述SEQ ID NO：38的5’末端A和G被实施例1的步骤1.2中的7-去氮-7-碘代-2’-脱氧-腺苷-5’-三磷酸和7-去氮-7-碘代-2’-脱氧-鸟苷-5’-三磷酸分别取代；还包含系链序列SEQ ID NO：42，终浓度0.5nM)是使用不同的核苷酸三磷酸物质(C,T,7-去氮-7-碘代-2’-脱氧-腺苷-5’-三磷酸和7-去氮-7-碘代-2’-脱氧-鸟苷-5’-三磷酸)制备的。

获得电测量值，并且使用如上实施例2描述的相同方法监控解旋酶控制的DNA移动，除了使用的实验缓冲液是(600mM KCl，25mM磷酸钾，75mM亚铁氰化钾，25mM铁氰化钾，pH8.0)，并且施加的电势翻转过程稍微不同(120mV，每10分钟电势翻转到-100mV保持2秒，然后0mV保持2秒)。

结果与讨论

观察到解旋酶控制的DNA移动用于修饰的DNA构建体检测(SEQ ID NO：34在3’末端连接到4个iSpC3间隔区，所述4个iSpC3间隔区在其另一端连接到SEQ ID NO：38的5’末端，所述SEQ ID NO：38的5’末端A和G被实施例1的步骤1.2中的7-去氮-7-碘代-2’-脱氧-腺苷-5’-三磷酸和7-去氮-7-碘代-2’-脱氧-鸟苷-5’-三磷酸分别取代；还包含系链序列SEQ IDNO：42)。在本实施例的末尾提供一列其他被研究的修饰的多核苷酸。

图9中所示的对角点图显示了修饰的链中每个碱基组合的电流水平随着未修饰的链中其等同物的变化，因此使得电流-序列关系中的大变化通过对角线的大位移表示。图10显示了解旋酶控制的修饰的链(SEQ ID NO：34在3’末端连接到4个iSpC3间隔区，所述4个iSpC3间隔区在其另一端连接到SEQ ID NO：38的5’末端，所述SEQ ID NO：38的5’末端A和G被实施例1的步骤1.2中的7-去氮-7-碘代-2’-脱氧-腺苷-5’-三磷酸和7-去氮-7-碘代-2’-脱氧-鸟苷-5’-三磷酸分别取代；还包含系链序列SEQ ID NO：42)的DNA移动的实例。

在本实施例中测试的修饰(7-去氮-7-碘代-2’-脱氧-腺苷-5’-三磷酸和7-去氮-7-碘代-2’-脱氧-鸟苷-5’-三磷酸)证明了当多于一个核苷酸物质被不同的核苷酸物质取代时，观察到与标准模型(如图9所示)的不同的变化。

以下不同的核苷酸物质组合也在以上描述的相同的实验系统中进行了测试-(5-丙炔基-2'-脱氧胞苷-5'-三磷酸和5-丙炔基-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸)，(5-丙炔基-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸和5-羧基-2'-脱氧胞苷-5'-三磷酸)，(5-丙炔基-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸和7-去氮-2'-脱氧鸟苷-5'-三磷酸)，(5-丙炔基-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸和5-甲酰基-2’-脱氧胞苷-5’-三磷酸)，(5-丙炔基-2'-脱氧胞苷-5'-三磷酸和2-氨基-2'-脱氧腺苷-5'-三磷酸)，(2’-氟代-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸和5-三氟代甲基-2’脱氧-尿苷-5’-三磷酸)，(5-丙炔基-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸和2’-氟代-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸)，(2’-氟代-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸和7-去氮-7-碘代-2-脱氧鸟苷-5’-三磷酸)，(5-碘代-2'-脱氧胞苷-5'-三磷酸和7-去氮-7-碘代-2-脱氧鸟苷-5’-三磷酸)，(5-氟代-2-脱氧胞苷-5’-三磷酸和7-去氮-7-碘代-2-脱氧鸟苷-5’-三磷酸)，(5-氟代-2-脱氧胞苷-5’-三磷酸和5-碘代-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸)，(5-氟代-2-脱氧胞苷-5’-三磷酸和5-丙炔基-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸)，(2-氟代-腺苷-5’-三磷酸和5-碘代-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸)，(2’-氟代-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸和5-碘代-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸)，(2-氟代-腺苷-5’-三磷酸和5-丙炔基-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸)，(5-丙炔基-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸和7-去氮-7-碘代-2-脱氧鸟苷)，(5-碘代-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸和7-去氮-7-碘代-2-脱氧鸟苷-5’-三磷酸)，(5-溴代-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸和7-去氮-7-碘代-2-脱氧鸟苷-5’-三磷酸)，(2-氟代-腺苷-5’-三磷酸和5-溴代-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸)，(2’-氟代-2’脱氧鸟苷-5’-三磷酸和5-溴代-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸)，(2’-氟代-2’脱氧鸟苷-5’-三磷酸和5-碘代-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸)，(2’-氟代-2’脱氧鸟苷-5’-三磷酸和2-氟代-腺苷-5’-三磷酸)，(2’-氟代-2’脱氧鸟苷-5’-三磷酸和5-溴代-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸)和(2’-氟代-2’脱氧鸟苷-5’-三磷酸和5-碘代-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸)。

实施例4

本实施例描述了Trwc Cba(SEQ ID NO：25)酶如何控制修饰的多核苷酸移动穿过单个MspA纳米孔(MspA–B2C)。在模板多核苷酸中的核苷酸物质(C，T和A)被不同的核苷酸物质(5-丙炔基-2'-脱氧胞苷-5'-三磷酸，5-丙炔基-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸和2-氨基嘌呤-2’-脱氧核糖核苷-三磷酸)取代。

材料和方法

使用如上描述的实施例2的相同方法制备实验的预混合物，除了修饰的DNA构建体(SEQ ID NO：34在其3’末端连接到4个iSpC3间隔区，所述4个iSpC3间隔区在其另一端连接到SEQ ID NO：38的5’末端，所述SEQ ID NO：38的5’末端C，T和A分别被实施例1的步骤1.2中的5-丙炔基-2'-脱氧胞苷-5'-三磷酸，5-丙炔基-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸和2-氨基嘌呤-2’-脱氧核糖核苷-三磷酸分别取代；还包含系链序列SEQ ID NO：42，终浓度0.5nM)是使用不同的核苷酸物质(7-去氮-7-碘代-2’-脱氧-腺苷-5’-三磷酸和7-去氮-7-碘代-2’-脱氧-鸟苷-5’-三磷酸)制备。

获得电测量值，并且使用如上实施例2描述的相同方法监控解旋酶控制的DNA移动，除了使用的实验缓冲液是(600mM KCl，25mM磷酸钾，75mM亚铁氰化钾，25mM铁氰化钾，pH8.0)并且施加的电势翻转过程稍微不同(120mV，每10分钟电势翻转到-100mV保持2秒，然后0mV保持2秒)。

结果与讨论

观察到解旋酶控制的DNA移动用于修饰的DNA构建体检测(SEQ ID NO：34在3’末端连接到4个iSpC3间隔区，所述4个iSpC3间隔区在其另一端连接到SEQ ID NO：38的5’末端，所述SEQ ID NO：38的5’末端C，T和A被实施例1的步骤1.2中的5-丙炔基-2'-脱氧胞苷-5'-三磷酸，5-丙炔基-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸和2-氨基嘌呤-2’-脱氧核糖核苷-三磷酸分别取代；还包含系链序列SEQ ID NO：42)。本实施例的末尾提供一列其他被研究的修饰的多核苷酸。

图11中所示的对角点图显示了修饰的链中每个碱基组合的电流水平随着未修饰的链中其等同物的变化，使得电流-序列关系中的大变化通过对角线的大位移表示。图12显示了解旋酶控制的修饰的链(SEQ ID NO：34在3’末端连接到4个iSpC3间隔区，所述4个iSpC3间隔区在其另一端连接到SEQ ID NO：38的5’末端，所述SEQ ID NO：38的5’末端A和G被实施例1的步骤1.2中的5-丙炔基-2'-脱氧胞苷-5'-三磷酸，5-丙炔基-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸和2-氨基嘌呤-2’-脱氧核糖核苷-三磷酸分别取代；还包含系链序列SEQ ID NO：42)的DNA移动的实例。

在本实施例中测试的修饰(5-丙炔基-2'-脱氧胞苷-5'-三磷酸，5-丙炔基-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸和2-氨基嘌呤-2’-脱氧核糖核苷-三磷酸)证明了当多于一个核苷酸物质被不同的核苷酸物质取代时，观察到与标准模型(如图11清楚所示)的不同的变化。

以下不同的核苷酸物质组合也在以上描述的相同的实验系统中进行了测试–(2’-氟代-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸，5-碘代-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸和7-去氮-7-碘代-2-脱氧鸟苷-5’-三磷酸)，(2-氟代-腺苷-5’-三磷酸，5-丙炔基-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸和7-去氮-7-碘代-2-脱氧鸟苷-5’-三磷酸)和(2’-氟代-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸，5-丙炔基-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸和7-去氮-7-碘代-2-脱氧鸟苷-5’-三磷酸)。

实施例5

本实施例描述了Trwc Cba(SEQ ID NO：25)酶如何控制修饰的多核苷酸移动穿过单个MspA纳米孔MspA MS(B1-G75S/G77S/L88N/D90Q/D91Q/Q126R)(MS-QQ)(SEQ ID NO：2具有G75S/G77S/L88N/D90Q/D91Q/Q126R的突变)。在模板多核苷酸中的核苷酸物质(G)被修饰的多核苷酸中的不同的核苷酸三磷酸物质(7-去氮-7-碘代-2’-脱氧-鸟苷-5’三磷酸)取代。

材料和方法

使用如上述实施例2描述的相同的方法制备实验的预混合物，除了修饰的DNA构建体(SEQ ID NO：34在其3’末端连接到4个iSpC3间隔区，所述4个iSpC3间隔区在其另一端连接到SEQ ID NO：38的5’末端，所述SEQ ID NO：38的5’末端G被实施例1的步骤1.2中的7-去氮-7-碘代-2’-脱氧-鸟苷-5’三磷酸取代；还包含系链序列SEQ ID NO：42)是使用不同的核苷酸物质(7-去氮-7-碘代-2’-脱氧-鸟苷-5’三磷酸)制备的并在降低的浓度(0.25nM终浓度)下使用。

获得电测量值，并且使用如上实施例2描述的相同方法监控解旋酶控制的DNA移动。

结果与讨论

观察到解旋酶控制的DNA移动用于修饰的DNA构建体检测(SEQ ID NO：34在3’末端连接到4个iSpC3间隔区，所述4个iSpC3间隔区在其另一端连接到SEQ ID NO：38的5’末端，所述SEQ ID NO：38的5’末端G被实施例1的步骤1.2中的7-去氮-7-碘代-2’-脱氧-鸟苷-5’三磷酸取代；还包含系链序列SEQ ID NO：42)。

图13中所示的对角点图显示了修饰的链中每个碱基组合的电流水平随着未修饰的链中其等同物的变化，使得电流-序列关系中的大变化通过对角线的大位移表示。图14显示了解旋酶控制的修饰的链(SEQ ID NO：34在3’末端连接到4个iSpC3间隔区，所述4个iSpC3间隔区在其另一端连接到SEQ ID NO：38的5’末端，所述SEQ ID NO：38的5’末端G被实施例1的步骤1.2中的7-去氮-7-碘代-2’-脱氧-鸟苷-5’三磷酸取代；还包含系链序列SEQID NO：42)的DNA移动的实例。本实施例阐述了当使用不同的突变体纳米孔(MS-QQ)时，与标准模型相比时，观测不同的变化是可能的。

实施例6

本实施例描述了T4 Dda–E94C/A360C(SEQ ID NO：24具有E94C/A360C突变)酶如何控制修饰的多核苷酸的3.6kB链穿过单个MspA纳米孔(MspA-B2C)的移动。在模板多核苷酸X(下面描述)中的核苷酸物质(G)被修饰的多核苷酸中的不同的核苷酸物质(7-去氮-7-碘代-2’-脱氧-鸟苷-5’三磷酸)取代。当不同的核苷酸物质1)5-羧基-2’-脱氧胞苷-5’三磷酸和dATP/dGTP/dTTP一起使用或2)2-氟代-腺苷-5’三磷酸和dCTP/dGTP/dTTP一起使用时，本实施例也可以重复。

材料和方法

使用以下方法制备5mer模型生成需要的原始模板的修饰碱基拷贝和互补序列，λDNA样品的～3,600bp dsDNA片段(模板链＝30个iSpC3间隔区连接到SEQ ID NO：45的5’末端，所述SEQ ID NO：45在其3’末端连接到4个iSp18间隔区，所述4个iSp18间隔区在其另一端连接到SEQ ID NO：36的5’末端，所述SEQ ID NO：36在其3’末端连接到4个5-硝基吲哚，所述4个5-硝基吲哚在其另一端连接到SEQ ID NO：37的5’末端，并且所述补体链＝30个iSpC3间隔区连接到SEQ ID NO：45的5’末端，所述SEQ ID NO：45在其3’末端连接到4个iSp18间隔区，所述4个iSp18间隔区在其另一端连接到SEQ ID NO：36的5’末端，所述SEQ ID NO：36在其3’末端连接到4个5-硝基吲哚，所述4个5-硝基吲哚在其另一端连接到SEQ ID NO：47的5’末端)。

通过使用LongAmp^TM Taq DNA聚合酶(NEB，目录号No：M0323S)利用以下引物(SEQID NO：48和SEQ ID NO：49)扩增λ的3447bp片段(SEQ ID NO：35显示了dsDNA的义序列)。反应按以下循环；94℃进行30秒，(94℃进行15秒，57℃进行30秒，65℃进行3分钟)30，65℃进行10分钟。所述3.6kb片段在0.8％TAE琼脂糖凝胶上跑胶并进行凝胶纯化，在无核酸酶水中洗脱。

然后使用第一回的产物作为模板(多核苷酸X)实施第二回PCR。每个反应包含以下(括号中给出了10ul反应中的终浓度)；ThermoPol缓冲液(1x)，3.6kb模板(多核苷酸X，5ngul^-1)，引物1(200nM，30个iSpC3间隔区在其一个末端连接到SEQ ID NO：45的5’末端，所述SEQ ID NO：45在其3’末端连接到4个iSp18间隔区，所述4个iSp18间隔区在其另一端连接到SEQ ID NO：36的5’末端，所述SEQ ID NO：36在其3’末端连接到4个5-硝基吲哚，所述4个5-硝基吲哚在其另一端连接到SEQ ID NO：31的5’末端)和引物2(200nM，30个iSpC3间隔区在其一个末端连接到SEQ ID NO：45的5’末端，所述SEQ ID NO：45在其3’末端连接到4个iSp18间隔区，所述4个iSp18间隔区在其另一端连接到SEQ ID NO：36的5’末端，所述SEQ ID NO：36在其3’末端连接到4个5-硝基吲哚，所述4个5-硝基吲哚在其另一端连接到SEQ ID NO：46的5’末端)，0.2mM的修饰碱基三磷酸(7-去氮-7-碘代-2’-脱氧-鸟苷-5’三磷酸或5-羧基-2’-脱氧胞苷-5’三磷酸或2-氟代-腺苷-5’三磷酸，取决于实验)，0.2mM的其余dNTP/s和1U的聚合酶(通常是9°N除非当使用Taq时使用dUTP)。然后通过吹打很好地混合混合物，并且试管转移到PCR模块并进行PCR循环；95℃进行2分钟，56℃进行20秒，72℃进行30秒。所述样品然后进行0.7x SPRI纯化，在200ul 70％EtOH中清洗两次并在5ul nH₂O.5x结合缓冲液+EDTA(1.5ul，1x＝25mM磷酸钾缓冲液pH 7.5，150mM KCl和1mM EDTA)中洗脱，并且在样品中添加DNA系链(tether)(1ul的500nM，SEQ ID NO：42在其3’末端连接到6个iSp18间隔区，所述6个iSp18间隔区在其另一端连接到2个T和3’胆固醇TEG)，并在室温下孵育15分钟。添加T4 Dda–E94C/A360C(SEQ ID NO：24具有E94C/A360C突变，0.6ul)，所述混合物在室温下孵育10分钟。然后添加TMAD(1μL，0.8mM)，所述样品在室温下再孵育10分钟。最后，添加具有MgCl2(1mM)和rATP(2mM)的500mM KCl pH 8.0，25mM磷酸钾缓冲液(300ul)。

在缓冲液(600mM KCl，25mM磷酸钾缓冲液，75mM亚铁氰化钾(II)，25mM铁氰化钾(III)，pH 8)中，由插入嵌段共聚物中的单个MspA纳米孔(MspA–B2C)在20℃获得电测量值(通过将实验系统设置在冷却板上)。在实现单个孔插入到嵌段共聚物中后，然后将缓冲液(3mL，960mM KCl，3mM亚铁氰化钾(II)，1mM铁氰化钾(III)，25mM磷酸钾pH 8)流经所述系统以去除任何过量的MspA纳米孔(MspA–B2C)。然后将上文描述的预混合物添加到所述单个纳米孔实验系统。在电势翻转过程(120mV，每60分钟电势翻转到-100mV保持2秒，然后0mV保持2秒)之后进行实验2小时，并监测解旋酶控制的DNA移动，本实验中G被修饰的碱基7-去氮-7-碘代-2’-脱氧-鸟苷-5’三磷酸取代。本实验中不同的核苷酸物质1)5-羧基-2’-脱氧胞苷-5’三磷酸和dATP/dGTP/dTTP一起使用或2)2-氟代-腺苷-5’三磷酸和dCTP/dGTP/dTTP一起使用在140mV运行6小时并再次监控解旋酶控制的DNA移动。

结果与讨论

观察到解旋酶控制的DNA移动用于3.6kB的修饰的DNA构建体检测。

图15中所示的对角点图显示了修饰的链中每个碱基组合的电流水平随着未修饰的链中其等同物的变化，使得电流-序列关系中的大变化通过对角线的大位移表示。图15显示了与预先描述相似的图，其中新链中的kmer位置随着其旧链中等同物变化。然而，本次k＝5代替k＝3；因为5mer组合可能比3mer组合更多，在图上显示更多的点。5mer模型给出更高的精确度适合在每条链事件中发现的电流水平，但只能在较长的链中构建，该较长的链具有足够碱基使得大多数组合在序列中至少出现一次。图16显示了解旋酶控制修饰的链的DNA移动的实例。本实施例阐述了当使用3.6kB修饰的链时，与标准模型相比时，观测不同的变化是可能的。

也观察了对于3.6kB修饰的DNA解旋酶控制的DNA移动，该3.6kB修饰的DNA使用1)5-羧基-2’-脱氧胞苷-5’三磷酸和dATP/dGTP/dTTP一起使用的核苷酸组合或2)2-氟代-腺苷-5’三磷酸和dCTP/dGTP/dTTP一起使用的核苷酸组合来制备。

图19和20示出了用于碱基组合1和2的对角点图(再次，这些图具有k＝5Kmer)。这些实施例表明当使用3.6kB修饰的链时，与标准模型相比时，观测不同的变化是可能的，(所述3.6kB修饰的链是使用1)5-羧基-2’-脱氧胞苷-5’三磷酸和dATP/dGTP/dTTP一起使用的碱基组合或2)2-氟代-腺苷-5’三磷酸和dCTP/dGTP/dTTP一起使用的碱基组合来制备的)。

实施例7

本实施例描述了T4 Dda–E94C/A360C(SEQ ID NO：24具有E94C/A360C的突变)酶如何控制修饰的多核苷酸移动穿过单个MspA纳米孔。在随机片段化的模板多核苷酸λ基因组的DNA中的核苷酸物质(A)被修饰的多核苷酸中的不同的核苷酸物质(2’-氟代-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸)取代。

材料和方法

使用Covaris g-管以6,000rpm进行1分钟使得λ基因组的DNA dam^-(1ug，NEB)随机片段化。然后分别使用NEB的NEBNext末端修复和NEBNext dA-尾试剂盒(根据制造商的说明)使回收的DNA被末端修复(end-repaired)和dA-尾(dA-tailed)，每一次使用SPRI珠(Agencourt AMPure)纯化。然后用1x Blunt/TA Master Mix(NEB)将回收的DNA连接到适配器(400nM，SEQ ID NO：43和44)，在室温下进行15分钟，然后使用SPRI珠(AgencourtAMPure)纯化。对于适配器连接的DNA(1ug)，添加ThermoPol缓冲液以制备100ul的1x，以及200nM的每个dNTP(2’-氟代-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸，2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸，2’-脱氧胸腺嘧啶-5’-三磷酸，2’-脱氧胞嘧啶-5’-三磷酸)，200nM引物(看图17的引物构建体和合适的序列的卡通图像)和10个单位的9°N DNA聚合酶(NEB)。然后反应加热到95℃进行2.5分钟，55℃进行20秒和72℃进行30分钟。扩增的DNA然后使用SPRI珠(Agencourt AMPure)纯化。

DNA系链(50nM，SEQ ID NO：42)在室温下在25mM磷酸钾(pH 8)，151mM KCl中退火15分钟。然后添加T4 Dda–E94C/A360C(200nM，SEQ ID NO：24具有E94C/A360C的突变)，然后反应物在室温下放置5分钟。然后添加TMAD(100mM，N,N,N′,N′-四甲基偶氮二甲酰胺，SigmaAldrich-D3648)，并且实验的预混合物在室温下进一步放置5分钟。

所述实验的预混合物然后用于纳米孔实验。在缓冲液(600mM KCl，25mM磷酸钾缓冲液，75mM亚铁氰化钾(II)，25mM铁氰化钾(III)，pH 8)中，由插入嵌段共聚物中的单个MspA纳米孔在20-45℃获得电测量值。在实现单个孔插入到嵌段共聚物中后，然后将缓冲液(3mL，960mM KCl，3mM亚铁氰化钾(II)，1mM铁氰化钾(III)，25mM磷酸钾pH 8)流经所述系统以去除任何过量的MspA纳米孔。将MgCl₂(1mM终浓度)和ATP(2mM终浓度，Sigma Aldrich-A6559-25UMO)用缓冲液(500mM KCl，25mM磷酸钾pH 8)混合在一起，然后添加到修饰的DNA构建体实验的预混合物。然后将150ul的所述预混合物添加到纳米孔实验系统中。实验在140mV下进行6个小时，并监控解旋酶控制的DNA移动。

解旋酶控制的DNA移动是单独基于碱基的，然后所有的移动的读数被用于产生一个共有(consensus)。通过使用标准基因组大小比对软件首先将移动读数对齐到参考序列来创造共有(consensus)。在每个对齐位置形成淳朴的最大频率的共有(naive maximumfrequency consensus)。表示相对于所述参考序列的删除或插入的数据在共有中保留。然后将所述共有序列自身与参考序列对齐。移动读取跨对齐位置的等位基因频率，以及共有序列用可视化软件IGV检查。

结果与讨论

观察解旋酶控制的DNA移动用于修饰的随机λDNA构建体检测，其中在合成期间，序列中全部的A被2’-氟代-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸取代。

如图18和21所示的图的比对显示了λ基因组的DNA序列比对区域中的放大图。每张图显示了对于由A)2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸，2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸，2’-脱氧胸腺嘧啶-5’-三磷酸，2’-脱氧胞嘧啶-5’-三磷酸(对于所有的图，共有＝直线4和等位基因频率＝直线5)或B)2’-氟代-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸，2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸，2’-脱氧胸腺嘧啶-5’-三磷酸，2’-脱氧胞嘧啶-5’-三磷酸(对于所有的图，共有＝直线2和等位基因频率＝直线3)制备的DNA，使用λ基因组的序列作为参考(所有图的直线1)，沿着共有的比对。对于每个模板可以看见对于在具体位点或位置的具体碱基在共有序列中的任何歧异(在所有图中用箭头和‘？’标记)。本实施例阐述了对于由(A)或(B)碱基制备的DNA模板，当与参考比较时，对于两种比对，在共有序列中的具体碱基位点或位置的歧义会在该DNA模板的序列不同位置发生。当结合两组数据时(直线6显示没有箭头‘？’)，有可能增加解决共有序列中的歧异的可能性。由于具有来自两个实验的数据的A或B碱基的组合没有结合起来，因此不能形成共有的序列中的特定位点和位置具有大于80％置信度将保留不被解决。当结合两组数据时，也有可能增加解决共有序列中的删除和插入位点歧异的可能性。

Claims (28)

1.一种表征模板多核苷酸的方法，包括：

a)在聚合酶使用所述模板多核苷酸作为模板形成修饰的多核苷酸的条件下，将所述模板多核苷酸与所述聚合酶和自由核苷酸的组接触，其中当形成所述修饰的多核苷酸时，所述聚合酶用不同的核苷酸物质取代所述模板多核苷酸中的一种或多种核苷酸物质使得所述修饰的多核苷酸与所述模板多核苷酸的反向互补序列不同；

b)将所述修饰的多核苷酸与多核苷酸结合蛋白和跨膜孔接触，使得所述多核苷酸结合蛋白控制所述修饰的多核苷酸穿过所述孔的移动；和

c)随着所述修饰的多核苷酸相对于所述孔移动，获取由不同于模板多核苷酸中聚合物单元的多于一个的聚合物单元提供的一个或多个电流测量值，其中所述测量值代表所述修饰的多核苷酸的一个或多个特征，并由此表征所述模板多核苷酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其中如果所述模板多核苷酸是RNA，所述聚合酶不形成互补的多核苷酸。

3.根据权利要求1所述的方法，其中当形成所述修饰的多核苷酸时，所述聚合酶用不同的核苷酸物质取代所述模板多核苷酸中的两种或多种所述核苷酸物质。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述聚合酶用不同的核苷酸物质取代所述模板多核苷酸中的所述两种或多种核苷酸物质中的每一个。

5.根据权利要求3所述的方法，其中所述聚合酶用相同的核苷酸物质取代所述模板多核苷酸中的所述两种或多种核苷酸物质中的每一个。

6.根据权利要求1所述的方法，其中：

(a)所述模板多核苷酸是DNA，并且所述模板多核苷酸中的所述核苷酸物质包括脱氧腺苷单磷酸(dAMP)，脱氧鸟苷单磷酸(dGMP)，脱氧胸苷单磷酸(dTMP)，脱氧胞苷单磷酸(dCMP)和脱氧甲基胞苷单磷酸；或

(b)所述模板多核苷酸是RNA，并且所述模板多核苷酸中的所述核苷酸物质包括腺苷单磷酸(AMP)，鸟苷单磷酸(GMP)，尿苷单磷酸(UMP)，胞苷单磷酸(CMP)和5-甲基胞苷单磷酸。

7.根据权利要求1所述的方法，其中：

(a)所述模板多核苷酸是DNA，并且所述修饰的多核苷酸中的不同的核苷酸物质包含不同于腺嘌呤，鸟嘌呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶或甲基胞嘧啶的碱基和/或包含不同于脱氧腺苷，脱氧鸟苷，胸苷，脱氧胞苷或脱氧甲基胞苷的核苷；或

(b)所述模板多核苷酸是RNA，并且所述修饰的多核苷酸中的不同的核苷酸物质包含不同于腺嘌呤，鸟嘌呤，尿嘧啶，胞嘧啶或甲基胞嘧啶的碱基和/或包含不同于腺苷，鸟苷，尿苷，胞苷或甲基胞苷的核苷。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述不同的核苷酸物质包含次黄嘌呤，4-硝基吲哚，5-硝基吲哚，6-硝基吲哚，甲酰基吲哚，3-硝基吡咯，硝基咪唑，4-硝基吡唑，4-硝基苯咪唑，5-硝基吲哚，4-氨基苯并咪唑或苯基(C6-芳族环)。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述不同的核苷酸物质包含2'-脱氧肌苷，肌苷，7-去氮-2’-脱氧肌苷，7-去氮-肌苷，2-氮杂-脱氧肌苷，2-氮杂-肌苷，2-O’-甲基肌苷，4-硝基吲哚2'-脱氧核糖核苷，4-硝基吲哚核糖核苷，5-硝基吲哚2'-脱氧核糖核苷，5-硝基吲哚核糖核苷，6-硝基吲哚2'-脱氧核糖核苷，6-硝基吲哚核糖核苷，3-硝基吡咯2'-脱氧核糖核苷，3-硝基吡咯核糖核苷，次黄嘌呤的无环糖类似物，硝基咪唑2'-脱氧核糖核苷，硝基咪唑核糖核苷，4-硝基吡唑2'-脱氧核糖核苷，4-硝基吡唑核糖核苷，4-硝基苯并咪唑2'-脱氧核糖核苷，4-硝基苯并咪唑核糖核苷，5-硝基吲哚2'-脱氧核糖核苷，5-硝基吲哚核糖核苷，4-氨基苯并咪唑2'-脱氧核糖核苷，4-氨基苯并咪唑核糖核苷，苯基C-核糖核苷，苯基C-2’-脱氧核糖基核苷，2'-脱氧水粉蕈素，2'-脱氧异鸟苷，K-2'-脱氧核糖，P-2'-脱氧核糖和吡咯烷。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚合酶用不同的核苷酸物质取代所述一种或多种核苷酸物质，所述不同的核苷酸物质包含不在所述一种或多种核苷酸物质中的化学基团或原子。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述化学基团是丙炔基基团，含硫的基团，含氧的基团，甲基基团，羟基甲基基团，甲酰基基团，羧基基团，羰基基团，苄基基团，炔丙基基团或炔丙胺基团。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚合酶用不同的核苷酸物质取代所述一种或多种核苷酸物质，所述不同的核苷酸物质缺乏存在于所述一种或多种核苷酸物质中的化学基团或原子。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚合酶用具有改变电负性的不同的核苷酸物质取代所述一种或多种核苷酸物质。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述具有改变电负性的不同的核苷酸物质包含卤素原子。

15.根据权利要求6所述的方法，其中：

(a)所述模板多核苷酸是DNA，并且所述聚合酶用脱氧甲基胞苷单磷酸取代脱氧胞苷单磷酸(dCMP)；或

(b)所述模板多核苷酸是RNA，并且所述聚合酶用甲基胞苷单磷酸取代胞苷单磷酸(CMP)。

16.根据权利要求1所述的方法，其中步骤a)进一步包含在所述修饰的多核苷酸中选择性地去除来自所述一种或多种不同的核苷酸物质的碱基。

17.根据权利要求1所述的方法，其中所述模板多核苷酸是单链的。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述方法进一步包含在步骤a)之前，将发夹适配器连接到所述模板多核苷酸的一个末端，从而在步骤a)中，该连接的发夹适配器用作引物，以通过所述聚合酶形成所述修饰的多核苷酸，并使得所述修饰的多核苷酸和模板多核苷酸通过所述发夹适配器连接。

19.根据权利要求1所述的方法，其中所述模板多核苷酸是双链的。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述方法进一步包含在步骤a)之前，将第一发夹适配器连接到所述模板多核苷酸的一个末端并分离所述模板多核苷酸的两条链以形成单链的模板多核苷酸构建体。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述方法进一步包含在步骤a)之前，将第二发夹适配器连接到所述单链的模板多核苷酸构建体的一个末端，从而在步骤a)中，该连接的发夹适配器用作引物，以通过所述聚合酶形成所述修饰的多核苷酸，并使得所述修饰的多核苷酸和所述单链的模板多核苷酸构建体通过所述第二发夹适配器连接。

22.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤b)之前，所述方法包含将所述修饰的多核苷酸与优先旋入所述孔的前导序列接触。

23.根据权利要求1所述的方法，其中所述一个或多个特征选自(i)所述模板多核苷酸的长度，(ii)所述模板多核苷酸的同一性，(iii)所述模板多核苷酸的序列，(iv)所述模板多核苷酸的二级结构，(v)所述模板多核苷酸是否是修饰的。

24.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸结合蛋白质衍生自解旋酶。

25.一种表征同聚多核苷酸的方法，包括：

a)在聚合酶使用所述同聚多核苷酸作为模板形成修饰的多核苷酸的条件下，将所述同聚多核苷酸与聚合酶和自由核苷酸的组接触，其中所述修饰的多核苷酸不是所述同聚多核苷酸的反向互补序列，其中所述聚合酶在形成所述修饰的多核苷酸时(i)用不同的核苷酸物质中的核苷酸随机取代与同聚多核苷酸中的核苷酸物质互补的核苷酸物质中的一些核苷酸，其中不同的核苷酸物质包含4-硝基吲哚，5-硝基吲哚，6-硝基吲哚，甲酰基吲哚，3-硝基吡咯，硝基咪唑，4-硝基吡唑，4-硝基苯并咪唑，5-硝基吲唑，4-氨基苯并咪唑或苯基(C6-芳环)，或(ii)用第一不同的核苷酸物质中的核苷酸随机取代与同聚多核苷酸中的核苷酸物质互补的核苷酸物质中的一些核苷酸，并用第二不同的核苷酸物质中的核苷酸随机取代与同聚多核苷酸中的核苷酸物质互补的核苷酸物质中的其他核苷酸；

b)将所述修饰的多核苷酸与跨膜孔接触，使得所述修饰的多核苷酸移动穿过所述孔；以及

c)随着所述修饰的多核苷酸相对所述孔移动，获取由不同于模板多核苷酸中的多于一个的聚合物单元提供的一个或多个测量值，其中所述测量值代表所述修饰的多核苷酸的一个或多个特征，并由此表征所述同聚多核苷酸。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述不同的核苷酸物质是其要取代的核苷酸物质的修饰的版本。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述不同的核苷酸物质如权利要求10所述进行修饰。

28.根据权利要求25所述的方法，其中所述同聚多核苷酸形成更长的模板多核苷酸的一部分。

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