CN1062309C

CN1062309C - 植酸酶及其基因的克隆和表达

Info

Publication number: CN1062309C
Application number: CN97121731A
Authority: CN
Inventors: 姚斌; 范云六; 王建华; 张春义; 李淑敏; 王亚茹; 丁宏标; 史秀云
Original assignee: BIOLOG TECHNOLOGY RESEARCH CEN; Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS; Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 1997-12-16
Filing date: 1997-12-16
Publication date: 2001-02-21
Anticipated expiration: 2017-12-16
Also published as: CN1184156A

Abstract

本发明提供了一种具有高比活性的植酸酶以及表达该植酸酶的黑曲霉菌株CGMCC 0332，并对其编码基因进行了克隆、基因改造，构建了表达载体，并转化受体菌，建立了重组酵母的高密度发酵大量产生植酸酶的方法。重组酵母中植酸酶的表达量可达到500000U/ml发酵液。高效表达植酸酶的重组酵母可用来大规模工业化廉价生产饲料用植酸酶，同时发酵后的菌体还可以做为优良的单细胞饲料蛋白。

Description

植酸酶及其基因的克隆和表达

本发明涉及一种植酸酶及其基因的克隆和表达的方法。本发明也涉及产生这种植酸酶的菌株。

磷是一种所有动物生长都需要的重要矿物质。磷占动物机体矿物质总量的四分之一还多，其中80％的磷以羟磷灰石的形式存在于骨胳中。骨骼不仅作为身体的骨架，而且也是钙、磷和其他矿物质的贮存库，当需要时它们能动员到其它组织中。另外的20％的磷存在于肌肉、血液和其它软骨组织中。它们作为许多有机化合物的组成成分，参与体内几乎每一种生命所需的生理生化反应。由于磷有如此重要的生物学功能，所以在动物日粮中提供充足的磷是非常重要的。否则，组织的生长受到抑制、骨骼变软变脆，长期磷缺乏会导致生长动物的佝偻病和成年动物的骨质疏松症，从而影响动物的生长。

目前在单胃动物如鸡、猪等饲料中是添加无机磷如磷酸氢钙来满足动物对磷的需求。但是在主要以植物性饲料为主的动物日粮中本身就含有丰富的磷，只不过是因为它们主要以动物不能利用的植酸磷的形式存在而已。

植酸磷是谷物、豆类和油料等作物籽实中磷和肌醇的基本贮存形式，含量高达1-5％(Lolas M.Et al.Food Sci.42：1094-1097，1977)。它占植物中总磷的60-80％(Nelson T.S.Poultry Sci.47：862-871，1967)。但是以植酸磷形式存在的磷却因单胃动物体内缺乏能分解植酸的酶而难以被利用(Cromwell G.L.Biotechnology in the Feed Industry，Lyons T.P.ed.Alltech Technical Publication，Nicholasville，KY，133-145)，其利用率仅在0-40％。

植酸磷不能被单胃动物有效利用，从而在饲喂过程中造成了许多问题，第一、造成磷源浪费。一方面饲料中的磷源不能得到有效利用，另一方面为了满足动物对磷的需求，又必须在饲料中额外添加无机磷，提高了饲料成本。在实际生产中，添加无机磷时还常因无机磷中残留有氟、重金属等元素而造成动物中毒。第二、形成高磷粪便而污染环境。饲料中85％左右的植酸磷会被动物直接排出体外，粪便中大量的磷使水和土壤受到严重污染。目前许多欧洲国家如荷兰等已因此问题开始限制畜禽的养殖数量。我国是畜牧生产大国，单胃动物占畜禽总数的比例远高于西方国家，因此，防止磷对环境的污染在我国更具有特殊的意义。第三、植酸磷还是一种抗营养因子，它在动物肠胃道的消化吸收过程中会与多种金属离子Zn²⁺、Ca²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺等以及蛋白质螯合成相应的不溶性复合物，从而降低了动物对这些营养元素的有效利用(Sharma C.B.et al_且Phytochemistry.17：201-204，1978)。

植酸酶(EC.3.1.3.8)是一种能水解植酸的酶类。它能将植酸磷降解为肌醇和磷酸。植酸酶广泛存在于微生物中，如枯草芽孢杆菌(Paver，V.K.J_Bacteriol.151：1102-1108，1982)，假单孢杆菌(Cosgrove D.J_Austral.J.Biol.Sci.23：1207-1220，1970)，乳酸杆菌(Shirai K_Letters Appl.Biol.Sci.19：366-369，1994)，大肠杆菌(Greiner R_Arch Biochem.Biophys.303：107-113，1993)，酵母(Nayini N.R.et al.Lebensm Wiss.Technol.17：24-26，1984)，曲霉(Yamada K.et al.Agric.Biol.Chem.32：1275-1282，1986；Van Gorcom R.F.M.et al_US Patent No.5436156，1995)。其中来源于A.ficuum NRRL3135(A.niger var.awamori)的植酸酶(Van Gorcom R.F.M.et al_US Patent No.5436156，1995)具有较好的耐热性，在酸性条件下有较高的酶活性，被认为是目前最有应用前景的饲用植酸酶。它的最适pH值为2.5和5.5，最适温度为55℃，特异比酶活性为10万单位/毫克酶蛋白。

植酸酶的饲喂效果已在世界范围内得到了确证(Ware J.H.et al_USPatent No.3297548，1967；Nelson T.S.et al_J.Nutrition101：1289-1294，1971；Nelson T.S.et al_Poult Sci.47：1842-1848，1968)。它可使植物性饲料中磷的利用率提高60％，粪便中磷排泄量减少40％，还可降低植酸磷的抗营养作用。因此对提高畜牧业生产效益及降低植酸磷对环境的污染有重要意义。

虽然植酸酶具有良好的饲喂效果，但到目前为止它还没有在饲料工业上得到广泛应用，其根本原因在于，在天然微生物中植酸酶的表达量太低，从而难以大量获得廉价的植酸酶产品，不能满足饲料工业发展的要求(Han Y.W_Animal Feed Sci.Technol_24：345-350，1989)。随着生物技术、基因工程等高新技术的发展，人们意识到通过基因工程的手段，利用生物反应器来高效表达植酸酶基因可望达到大幅度提高植酸酶产量、降低生产成本的目的(Conneely O.M_Biotechnology in the Feed Industry，T.P.Lyons(Ed)，Alltech Technicai Publications.Nicholasville，K Y.57-66，1992)。

几种微生物来源的植酸酶基因已得到了分离，如酵母Saccaromycescerevisiae(Bajwa W_Nucleic Acids Res.12：7721-7739，1984)、Aspergillus niger(MacRae W.D_Gene，71：339-348，1988)、A.terreus和Myceliophthora thermophila(van Loon，Patent NO.EP 0684313A2，1995)、A.niger(ficuum)(van Hartimgsveldt et al_Gene，127：87-94，1993；Ehrlich K.C_Biocem.Biophys.Res.Comm.195：53-57，1993)、A.niger var.awamori(Piddington C.S.Gene，133：55-62，1993)等。

植酸酶基因表达的研究主要集中在来源于A.niger(ficuum)的植酸酶基因phyA和phyB上。如1993年在A.niger ALK02268中表达了源于A.niger var.awamori的植酸酶基因phyA，其表达量比原菌株提高了几倍，约为329U/mL(Piddington C.S_Gene，127：87-94，1993)。同年，将来源于A.ficumm NRRL3135的phy基因导回原菌株，使phyA基因的拷贝数增加到15个以上，从而使植酸酶的表达量提高到7600U/mL(Van HartingsveldtW.et al_Gene，127：87-94，1993：Van Gorcom R.F.M.et al，PantentNo.US 5436156，1995)。Moore E.等在A.oryzae中表达来源于酵母Saccharomyces cerevisiae的植酸酶基因和来源于A.niger 762的phyB基因，其结果也是使表达量分别提高到840U/mL和750U/mL(Moore E.et al_J.Ind.Microbiol，14：396-402，1995)。另外，也曾有人尝试了在Trichoderma中表达植酸酶基因phyA和phyB(Nevalainen H.K.M.et al_Pantent No.Wo 94/03612，1994)以及尝试了用基因工程的方法改造植酸酶基因使其具有更好的耐温性并在黑曲霉中表达(Van Loon A.Patent No.EP0684313A2，1995)。以上的这些表达研究，从总体上看，其表达水平还较低，难以获得大量产品，生产成本过高。

本发明的目的之一是筛选一种可产生高比活性植酸酶的天然菌株。同时，所产生的植酸酶在最适pH值、最适温度等生理生化特性上还具有适合于在饲料中作为添加剂使用所要求的特性。

本发明按常规方法(Cosgrove，D.J.et al.Aust.J.Biol.Sci.23：339-343，1970)从土壤中筛选分泌植酸酶的黑曲霉天然菌株，进一步对所产植酸酶进行生理生化性质研究(Vallah A.H.J.Prep.Biochem_18：459-471，1988)。本发明筛选出了具有高活性并且适于在饲料中使用的植酸酶产生菌株A.niger 963。

经检测，该菌株所产生的植酸酶PHYA2的比活为1000万单位/毫克酶蛋白，而目前报道的植酸酶PHYA的比活为10万单位/毫克(Van Gorcom R.F.M.et al_Patent No.US 5436156，1995)。适合于在饲料中使用的植酸酶应具备的最基本特性之一是，在酸性条件下必需有较高的酶活性，因为植酸酶的主要作用场所是在单胃动物酸性的胃中(pH1.5-3.5)。本发明的植酸酶有两个最适的pH值，分别为1.6-2.0之间和5.5-5.9之间，最佳点在约1.8和5.7，而且在pH1.6至5.9的整个范围内能维持较高的酶活性，这样就更有利于它在动物胃中起作用，因而具备了在饲料中使用的优良特性。另外，与已报道的并已在生产上有所应用的黑曲霉植酸酶PHYA(Van Gorcom R.F.M.et al_Patent No.US 5436156，1995)相比，它们第一酶活峰分别为pH5.7和5.5，相差不大，但PHYA2的另一最适pH为1.8，而PHYA为2.5，同时它在pH1.8的酶活性为在pH5.7时的77％，在pH1.8至5.7的范围内的最低酶活性(在pH3.0)也有近40％左右的剩余酶活性，而PHYA分别为50％和25％(在pH3.0)。从这些数据来看，PHYA2比PHYA具有更适合于在饲料中使用的特性。

表1. A.niger 963与A.niger var.awamori(A.ficuum NRRL3135)(Van Gorcom R.F.M.et al_Patent No.US 5436156，1995)所产的植酸酶的异同点酶特性 A.niger 963 A.niger var.awamori(本发明) (A.ficuum NRRL3135)酶比活性 1000万单位/毫克蛋白 10万单位/毫克蛋白蛋白质分子量 85kD 85/100kD最适pH值 1.8，5.7 2.5，5.5最适温度(℃) 55 50/58潜在糖基化位点 9 10氨基酸序列同源性 91.6％基因序列同源性 91.8％

本发明筛选出的黑曲酶菌株(Aspergillus niger)已于1997年11月24日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市中关村北一条13号，邮编：100080)进行了保藏。保藏号为CGMCC 0332。

本发明的目的之二是分离克隆此高比活的植酸酶编码基因。

从A.niger 963中提取基因组DNA，通过PCR方法(Maniatis T_et al.Molecular cloning.New York：Cold Spring harbor laboratory，1982)克隆出植酸酶基因phyA2，然后克隆到大肠杆菌的质粒克隆载体如pPUC18、pPGEM等上，并进一步对此基因进行全序列分析。DNA全序列分析结果表明，phyA2结构基因全长1506个核苷酸，其中+46～+147的102个核苷酸序列是一典型的真菌内含子序列，其上有真菌内含子的特征保守序列：Donor序列-GTATGC、Lariat序列-GCTGAC及Acceptor序列-CAG。PhyA2基因编码467个氨基酸，N端的19个氨基酸为信号肽，信号肽的切割位点在+19位的Gly之后。来源于黑曲霉的植酸酶是一糖基化蛋白，在phyA2编码的氨基酸序列上，发现了9个潜在的N-糖基化位点(Asn-X-Ser/Thr，X为任意氨基酸)。从氨基酸推断出的理论分子量约为52KD。从氨基酸序列上还找到了植酸酶的活性位点序列(Active-site sequence)：CQVTFAQVLSRHGARYPTDSKGK，它位于氨基酸序列的+52～+74。RHGERYPS是微生物来源的植酸酶活性位点中最保守的序列，在PHYA2上相应的序列为RHGARYPT。PhyA2基因中G+C含量达到54.7％，密码子第三位碱基的G+C含量更高达68.8％，在密码子第三位碱基上高频使用G和C碱基是曲霉中高表达蛋白编码序列所具有的特征之一。phyA2与已报道的来源于Aspergillus niger(ficuum)var.awamori的植酸酶基因phyA(Van Gorcom R.F.M.et al_Patent No.US 5436156，1995)相比较，在DNA序列上有123个核苷酸的差异，同源性为91.8％。编码的氨基酸序列上有39个氨基酸不同，同源性为91.6％。在phyA编码的PHYA蛋白上有10个潜在的糖基化位点，而在PHYA2上有9个，其中8个与PHYA上的位置相同。

phyA2结构基因的DNA序列和推导出的氨基酸序列如图5所示。

本发明的目的之三是提供一种针对各表达系统的不同特点，对植酸酶基因加以改造以使它能在特定的表达系统中高效表达的改造体。

基因的改造可利用已知的PCR技术、定点突变技术、基因设计后化学合成等技术来实现。在本发明的一个优选实施方案中，我们除了将植酸酶基因phyA2原有的信号肽序列和内含子除掉，另外还在分子水平上对基因的密码子进行了改造。具体是把第85位、146位、159位和466位的Arg密码子CGG和CGA这两种在酵母中极少使用的密码子(Sharp，P.M.et al.Neucleic)点突变成酵母高频使用的密码子AGA。改造后的DNA序列如图8所示。

类似思路也同样可用来改造植酸酶基因使它在别的表达系统中各项表达，如借助杆状病毒的昆虫表达系统、霉菌表达系统、植物表达系统等。

在本发明的一个实方案中，将改造后的植酸酶基因插入到带有α-因子信号肽序列的酵母表达载体上(购自Invitrogen)，经转化酵母细胞后，稳定整合到酵母染色体上，此重组酵母经发酵培养后，表达的植酸酶蛋白在信号肽的引导下分泌到培养基中。

经测定，植酸酶表达量达到500000U/mL，其表达水平是原始菌株A.niger963的3000倍，比phyA2基因没有改造的提高了37倍，也比国际最新的专利(Van Gorcom R.F.M.et al_Patent No.US 5436156，1995)所报道的表达水平高80％。

本发明的目的之四是提供一种含有改造后的植酸酶基因的重组表达系统。

选择高效表达系统-P.pastoris作为表达phyA2的生物反应器。通过体内重组使含有phyA2的酵母表达载体整合到酵母的基因组上，筛选出阳性重组子，并在分子水平上进行验证(Southern blotting、Northernblotting及SDS-PAGE等)。

其它的真核表达系统如杆状病毒的昆虫表达系统、霉菌表达系统、植物表达系统等也适应与此植酸酶基因的高效表达。

本发明优选的毕赤酵母(P.pastoris)表达系统与Van Gorcom R.F.M.等的专利(Patent No.US 5436156，1995)所采用的宿主菌霉菌相比，毕赤酵母具有很多方面的优势。第一，霉菌的生长繁殖周期比毕赤酵母长很多；第二，霉菌的营养生长是通过菌丝体尖端的伸长生长实现的，这种生长特性尤其适合固体培养，而并不适合现代发酵工艺所常用的液态发酵，一般而言固体发酵工效低，周期长，成本高，由此使获得大量发酵产品的成本比之液态发酵要增加很多。相比之下，毕赤酵母是通过裂殖而增加营养体的，这种繁殖特性十分适合液态发酵；第三，霉菌营养体在生长发育期间需要提供足够的较复杂的碳氮有机养分，这也会增加发酵成本，毕赤酵母营养体的生长发育主要利用廉价的简单养分如甲醇、葡萄糖和氨水等，获得同等量的营养体毕赤酵母比霉菌消耗的养分要便宜得多。酵母的高细胞密度、低成本发酵方法已经建立(Siegel R.S_Biotechnol.Bioeng，34：403-404，1989)，发酵培养基中所使用的碳源、氮源、盐、微量元素和生物素等都很便宜；第四，霉菌特有的霉味会降低牲畜的适口性，而毕赤酵母发酵产生的一种酱香味具有良好的诱食作用；第五，毕赤酵母含有多种大量的促进生长的有机化合物，如低聚糖、核苷酸、各种氨基酸、短肽等，这些优势都是霉菌比不上的或所不具有的；第六，在真核生物表达系统中，酵母，包括毕赤酵母在内无疑是研究得最为详透的，在进行分子生物学操作时，酵母比霉菌更为容易、方便和有效。到目前为止，我们还未见到有利用酵母表达、生产植酸酶的报道，但酵母作为一种良好的真核表达系统已成功地高效表达出许多具有生物活性的外源基因产物。第七、毕赤酵母本身具有很好的安全性，曾作为单细胞蛋白广泛应用，酵母培养基中不含有毒物质和致热源，所以重组酵母表达的植酸酶就可以不用分离纯化而能直接以酵母培养物的形式添加到饲料中，可降低植酸酶的生产成本；第八、表达的植酸酶在信号肽的引导下会分泌到培养基中，这使植酸酶直接暴露出来而无需破碎酵母菌体，也为把包含植酸酶的酵母培养物直接作为饲料添加剂提供了可能；以上这些优势都是利用黑曲霉做为植酸酶表达受体(Van Gorcom R.F.M.et al_Patent No.US 5436156，1995)所不具备的，它为利用重组酵母工业化大规模、低成本发酵生产植酸酶奠定了基础。

本发明的目的之五是提供重组的植酸酶基因工程菌株的高密度发酵、植酸酶蛋白大量产生的方法，为植酸酶工业化发酵生产奠定基础。

本发明参照Introvigen公司提供的发酵方法，使用葡萄糖作为菌体培养阶段、碳源饲喂阶段和碳源-甲醇混合饲喂阶段的唯一碳源。具体方法为：

a．将菌株接种培养，然后按5-10％再接种于包含3-5％葡萄糖发酵培养基10Xbasal salts中；

b．通气搅拌培养，在整个培养过程中氧饱和度不低于20％；

c．18小时后，按照17-19ml/hr/L，优选18.15ml/hr/L，的流量流动加入23-25％，优选25％，的葡萄糖溶液继续培养3小时以上，优选4小时；

d．按照4-6ml/hr/L，优选5ml/hr/L，的流量流动加入23-27％，优选25％，葡萄糖∶甲醇混合溶液(3-5∶1-2)，优选(4∶1)，继续培养3小时以上，优选5小时；

e．加入诱导剂甲醇，使甲醇的终浓度维持在0.1-0.5％，优选0.3％，继续培养3小时以上，优选培养108-132小时。

与已有的以曲霉为生产菌株的发酵方法(Van Gorcom R.F.M.et al_Patent No.US 5436156，1995)相比，在发酵原料、发酵时间及最终的发酵产物植酸酶的量上均有所不同(表2)，在发酵原料的成本上，本发明全为较廉价的工业原料，而曲霉发酵时还需有甘露-葡聚糖、酵母提取物、水解酪蛋白等天然有机提取物，因而本项目的原料成本将比曲霉发酵低得多；发酵时间本项目为108-132小时，曲霉发酵为140-200个小时，在发酵过程中的能源消耗上本发明也有优势。而发酵的植酸酶产量(指单位体积发酵液中植酸酶产量)本项目要高出约一倍左右。再加上本发明生产的植酸酶无需纯化而可以直接以酵母培养物的形势做为添加剂，因而总的来说，本发明要比国外用基因工程曲霉来生产植酸酶(Van Gorcom R.F.M.et al_USPatent No.5436156，1995)更有优势。表2．本发明发酵生产植酸酶与国外专利中发酵生产植酸酶的比较本发明国外曲霉发酵(Patent No.US 5436156，1995)发酵培养基碳源甘油或葡萄糖100g/L 甘露-葡聚糖70g/L甲醇15％酵母提取物12.5g/L氮源氨水5％水解酪蛋白25g/L无机盐磷酸2％硫酸钾2.0g／L硫酸钙0.93g/L 硫酸镁0.5g/L硫酸钾18.2g/L 硫酸亚铁0.5g/L硫酸镁14.9g/L 磷酸二氢钾2g/L发酵时间(小时) 108-132 140以上植酸酶产率(U/mL) 50万 28万

本领域普通技术人员可以对本发明的酶进行各种改造，如用各种化学修饰基团进行修饰，如糖基化、磷酸化、N端氨基化、蛋白内切割等；也可为改善其表达后的转运而添加信号肽及在植酸酶蛋白前或后加上融合肽等，而不改变本发明酶的基本功能，如酶活性、底物特异性等。这些通称为本发明酶的功能衍生物，均包括在本发明的范围内。

附图说明

图1 Aspergillus niger 963在含植酸钙的筛选平板AS上形成的透明消解圈

图2 Aspergillus niger 963产生的植酸酶PHYA2的pH适性

图3 Aspergillus niger 963产生的植酸酶PHYA2的温度适性

图4植酸酶基因phyA2的克隆

图5 phyA2结构基因DNA序列及推导出的氨基酸序列

小写英文字母表示内含子序列，内含子序列中下划线的序列依次表示内含子donor、lariat及acceptor序列；垂直箭头表示信号肽切割位点；在氨基酸N下划线的表示潜在的糖基化位点；氨基酸序列下划线指出植酸酶活性位点序列。

图6 phyA2中信号肽编码序列的和内含子序列的去除过程

图7 phyA2点突变进行密码子优化的过程

图8改造后的phyA2的DNA序列

图9重组酵母表达载体pPIC9A的物理图谱

图10重组酵母的Sourthern blotting分析

1．受体酵母P.pastoris GSll5

2，3，4.分别为酵母重组子P.pastoris

pPIC9A-6，7.9(EcoRI酶切)

5，6，7.分别为酵母重组子P.pastoris

pPIC9A-6，7.9(BamH I酶切)

图11重组酵母的Northern blotting分析

1．受体酵母P.pastoris GSll5

2，3.分别为酵母重组子P.pastoris

pPIC9B-12、pPIC9A-7

图12重组酵母的SDS-PAGE分析

1．受体酵母P.pastoris GSll5

2，3.分别为酵母重组子P.pastoris pPIC9A-7，9

4，5.分别为酵母重组子P.pastoris pPIC9A-7，9，表达的植酸酶蛋白经脱糖基化处理

6．蛋白分子量Marker

图13重组酵母P.pastoris pPIC9A-7表达的植酸酶的pH适性

图14重组酵母P.pastoris pPIC9A-7表达的植酸酶的温度适性

图15在摇床水平上重组酵母植酸酶表达量与诱导培养时间的关系

●P.pastoris pPIC9A-7；▲P.pastoris pPIC9A-9

图16重组酵母在不同高细胞密度发酵方法中表达产物植酸酶的积累与诱导时间的关系

■以甘油为碳源、甘油饲喂○以甘油为碳源、甘油-甲醇混合饲喂●以葡萄糖为碳源、葡萄糖-甲醇混合饲喂

四、实施例

1．菌株与载体大肠杆菌菌株E.coli DH_5a、质粒pUC18等购自Promega公司，酵母菌株Pichia pastoris GS115(His^-Mut⁺)、质粒pPIC9由加拿大Alberta大学D.Luo博士惠赠。

2．酶与试剂盒限制性内切酶、连接酶、Taq酶、Mung bean酶为Boehringer公司产品。T₇DNA sequence kit购于Pharmacia公司。In vitromutagenesis systems Kit、随机引物标记Kit和PCR Kit均购于Promega公司。

3．生化试剂 DNA合成试剂为Milipore公司产品。引物合成用ABI公司Cyclone DNA合成仪。IPTG、X-Gal、SDS及植酸钠为Sigma公司产品。TEMED、过硫酸铵、丙烯酰胺及甲叉双丙烯酰胺为Promega公司产品。

4．培养基黑曲霉生长培养基为PDA(20％马铃薯、2％蔗糖、2％琼脂)；黑曲霉产酶筛选培养基为AS(0.1％植酸钙、3％葡萄糖、0.5％NH₄NO₃、0.05％KCl、0.05％MgSO₄.7H₂O、0.03％MnSO₄.4H₂O、0.03％FeSO₄.7H₂O、1.5％琼脂，pH 5.7)；黑曲霉产酶培养基为AP(1.5％葡萄糖、0.3％蛋白胨、0.2％(NH₄)₂SO₄、0.05％MgSO₄.7H₂O、0.05％KCl、0.003％FeSO₄.7H₂O、0.003％MnSO₄.4H₂O，pH5.7)。大肠杆菌培养基为LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)。酵母完全培养基为YPD(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖)；酵母转化培养基为RDB[18.6％山梨醇、2％葡萄糖、1.34％YeastNitrogen Base W/O amino acids(YNB)、0.00004％Biotin、0.005％谷氨酸、0.005％甲硫氨酸、0.005％赖氨酸、0.005％亮氨酸、0.005％异亮氨酸、2％琼脂糖)]；酵母选择培养基为MM(1.34％YNB、0.00004％Biotin、0.5％甲醇、1.5％琼脂糖)和MD(1.34％YNB、0.00004％Biotin、2％葡萄糖、1.5％琼脂糖)；酵母诱导培养基BMGY[1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％YNB、0.00004％Biotin、1％甘油(V/V)]和BMMY(除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份相与BMGY相同)。重组酵母发酵培养基为10×Basal Salts(2.67％磷酸、0.093％硫酸钙、1.82％硫酸钾、1.49％硫酸镁、0.413％氢氧化钾、4％甘油或葡萄糖)；发酵中所用的微量盐溶液PTM1(0.6％硫酸铜、0.008％碘化钠、0.3％硫酸锰、0.02％钼酸钠、0.002％硼酸、0.05％氯化钴、2％氯化锌、6.5％硫酸亚铁、0.025％生物素、0.5％硫酸)。

实施例1产生植酸酶的天然菌株的筛选

土样按常规稀释后涂布于PDA平板上，28℃培养3-5天，待菌落出现后，挑取菌落转接到筛选平板AS上，28℃培养3天。能产生并分泌植酸酶的菌株将会分解筛选平板中的不溶性植酸钙，形成透明消解圈。挑取产生透明消解圈的菌株接种于5mL液体产酶培养基AP中，28℃摇振培养2天，按1％接种量转接到50mL产酶培养基中继续培养3天。滤去菌体，上清液用来进行酶活测定。测定方法为：0.2mL的酶稀释液加入0.8mL 1.25mmol/L的植酸钠，37℃保温30min，加入1mL 10％TCA终止酶活反应，然后加入2mL硫酸亚铁-钼酸铵显色液，700nm测定无机磷含量。对照为先在0.2mL的酶稀释液中加入1mTCA使酶灭活，再加入同体积的底物保温。一个酶活性单位(U)定义为：在一定条件下，每分钟释放出1nmol无机磷所需酶量为一个酶活性单位。由于适合于在饲料中使用的植酸酶必须具备在酸性条件下具有高酶活性这一特性，所以首先在酸性条件下测定菌株分泌的植酸酶酶活性，即植酸钠用pH2.5的HCl-甘氨酸缓冲液配制，使酶促反应在pH2.5的缓冲体系中完成。在此条件下测到的最高酶活性为70U/mL，其产生菌株经鉴定为黑曲霉Aspergillus niger，定名为Aspergillus niger 963。对Aspergillus niger963所产生的植酸酶PHYA2进一步进行pH适性和温度适性的测定。pH适性的测定为底物植酸钠用一系列不同pH值的缓冲液(pH1.4、1.8、2.4、3.0、3.4的HCl-Gly缓冲液；pH4.0、4.4、5.0、5.4、5.6、5.8、6.0的HAc-NaAc缓冲液；pH7.2、8.0、9.0的Tris-HCl缓冲液)配制，37℃下测定酶活性。结果(图2)表明，其最适pH有两个，分别为1.8和5.7。在pH1.8～5.7的范围内，植酸酶均具有较高的酶活性。酶促反应在pH5.5、不同温度下保温所测到的植酸酶phyA2的温度适性(图3)表明，它的最适温度为55℃。在37℃、pH5.7的条件下测到的植酸酶表达量为100U/mL，植酸酶绝对活性(比活性)为1000万单位/毫克蛋白。以上结果表明，植酸酶PHYA2在酸性条件下具有高酶活性，具有适合于在饲料中使用的优良特性。

实施例2克隆植酸酶基因phyA2

菌株A.niger 963总DNA的提取采用中性裂解法，及菌株培养5天后收集菌丝，用液氮冷冻菌丝并研磨成粉状，10mg菌丝中加入10mL SDS-TE缓冲液(4％SDS、10mmol/LTris、0.1mmol/LEDTA，pH8.0)在室温下裂解5min，用等体积的酚、酚-氯仿、氯仿依次抽提，乙醇沉淀。根据已报道的来源于黑曲霉的不同植酸酶基因序列，设计合成PCR引物P1和P2：P1：5’GCGAATTCTTTCTTCTCATAGGC 3’P2：5’CTGAATTCATCAAGGTAGTTCAG 3’这两段引物序列都设计在植酸酶结构基因序列之外，引物上设计的酶切位点均为EcoRI。以Aspergillus niger 963的基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应参数为：94℃变性1min、55℃退火45sec、72℃延伸1min；循环30轮后72℃保温10min。扩增出的约1.5Kb的DNA片断用EcoRI酶切后通过琼脂糖凝胶电泳回收目的片断，与经EcoRI酶切的载体pUC18于15℃连接过夜，转化大肠杆菌E.coliDH_5a，涂板后挑选阳性重组子，得到重组质粒pYY-1(图4)。通过DNA全序列分析，测定了植酸酶基因的完整DNA序列(图5)。phyA2结构基因全长1506个核苷酸，其中+46～+147的102个核苷酸序列是一典型的真菌内含子序列，其上有真菌内含子的特征保守序列：Donor序列-GTATGC、Lariat序列-GCTGAC及Acceptor序列-CAG。PhyA2基因编码467个氨基酸，根据信号肽序列的结构规则推断，N端的19个氨基酸为信号肽，信号肽的切割位点在+19位的Gly之后。来源于黑曲霉的植酸酶是一糖基化蛋白，在phyA2编码的氨基酸序列上，发现了9个潜在的N-糖基化位点(Asn-X-Ser/Thr，X为任意氨基酸)。从氨基酸推断出的理论分子量约为52KD。从氨基酸序列上还找到了植酸酶的活性位点序列(Active-site sequence)：CQVTFAQVLSRHGARYPTDSKGK，它位于氨基酸序列的+52～+74。RHGERYPS是微生物来源的植酸酶活性位点中最保守的序列，在PHYA2上相应的序列为RHGARYPT。

PhyA2基因中G+C含量达到54.7％，密码子第三位碱基的G+C含量更高达68.8％，在密码子第三位碱基上高频使用G和C碱基是曲霉中高表达蛋白编码序列所具有的特征之一。

实施例3植酸酶基因phyA2的改造

为了使phyA2能在酵母中顺利异源表达，我们首先去掉了phyA2中信号肽编码序列和内含子序列，具体方法为，参照信号肽编码序列之后的核苷酸序列合成一个22个碱基的寡聚核苷酸片断P3(5’GCGAATTCATGCTGGCAGTCCC3’)作为PCR引物，另一引物(5’TCGAATTCTAAGCAAAAC 3’)参照phyA2的3’端序列合成。由于内含子序列是包含在信号肽编码序列之中，所以用这对引物通过PCR的方法扩增到的phyA2基因就是除去信号肽编码序列和内含子序列的完整的植酸酶结构基因编码序列。PCR反应的方法同例3。扩增出的DNA片断用引物上设计的EcoRI酶切后插入到载体pUC18的EcoRI位点上，转化大肠杆菌后筛选阳性重组子。这样就将无信号肽编码序列和内含子序列的phyA2基因克隆到了pUC18上，得到重组质粒pYY-2(图6)。

为了使PhyA2能在酵母中高效表达，我们进一步根据酵母密码子的选择偏向对phyA2的密码子进行优化。我们发现在phyA2序列中，编码第85位和446位Arg的密码子为CGG，编码第146位和159位Arg的密码子为CGA，这两种密码子在酵母大量表达的蛋白基因中使用频率为零，为了提高phyA2基因在酵母中的表达水平，我们通过点突变的方法进行了密码子优化，将这两种密码子突变成酵母高频使用的Arg密码子AGA(使用频率为86.6％)。具体方法(图7)为，首先根据需突变的4个位点合成4段相应的突变引物：a1：5’GAGCGAGATATCC 3’；a2：5’ACCAGAGATACG 3’；a3：5’TCATCAGATCCT 3’；a4：5’GTACGAGAGATAG 3’。要突变的位点设计在引物的中间，两侧的序列与基因中需突变位点两侧的序列完全一致。然后按照点突变Kit(In vitromutagenesis systems Kit，Promega)中的说明，用相应的突变引物逐个进行点突变。通过序列分析证实了此基因已得到正确的突变。最后得到的突变质粒定名为pYY-6。

经以上两步改造后的phyA2序列见图8。

实施例4phyA2在酵母表达载体上的构建

用于构建酵母表达载体的质粒是pPIC9(带有α-因子分泌信号)。首先将植酸酶基因插入到上述表达载体的信号肽序列的下游，与信号肽形成正确的阅读框架，然后通过载体与酵母P.pastoris染色体基因组之间的同源重组事件使目的基因稳定整合到酵母染色体上。具体的过程是：将改造后及未经点突变改造的植酸酶基因phyA2用EcoRI分别从质粒pYY-6和pYY-2上酶切下后，电泳回收约1.4Kb的DNA片段，再将其分别插入到载体pPIC9上的EcoRI位点，得到了一个用于酵母转化的表达载体-pPIC9A和pPIC9B(图9)。这样就将带有分泌信号的目的基因克隆到了AOX启动子下游。

实施例5酵母转化及筛选重组酵母株系

质粒pPIC9A和pPIC9B的DNA经电击转化酵母细胞后，通过体内重组，目的基因可以整合到受体酵母基因组中。在外源诱导物甲醇存在的条件下，AOX1启动子可以启动其下游基因的表达，并且信号肽可以指导表达产物进入酵母的分泌途径，经过切割，外源蛋白产物最终分泌至胞外，所产生的植酸酶PHYA2氨基酸序列与天然存在的成熟植酸酶完全相同。外源蛋白经过这样的代谢途径，可以进行翻译后修饰，例如糖基化、形成二硫键等，从而得到具有生物活性的蛋白产物。

首先用2～3倍过量的内切酶BglII分别消化质粒pPIC9A和pPIC9B的DNA(经PEG法纯化)，电泳检测酶切是否完全，使之线性化。用酚抽提，乙醇沉淀，70％乙醇洗两次，冷冻干燥，无菌水溶解，-20℃保存备用。

酵母菌株GS115接种于5mLYPD中30℃培养过夜，取0.5mL接种于500mLYPD中30℃培养使O.D.600=1.3～1.5，1500×g离心5分钟，用500mL冰预冷的无菌水洗涤沉淀，如上离心，以20mL冰预冷的1mol/l山梨醇悬浮沉淀，如上离心，以0.5mL冰预冷的1mol/l山梨醇悬浮沉淀。取40μl酵母细胞液加入线性化DNA1～5μg，转移到冰预冷的无菌电击杯中冰浴5分钟。在国产电击仪LN-101上进行电击转化酵母受体菌hisGS115，电击参数为0.8kv，11.5μF。电击后立即向电击杯中加入0.5mL冰预冷的1mol/l山梨醇，然后将电击杯中的溶液转移到无菌的Eppendorf管中在RDB固体培养基上涂板，每板涂0.1mL，将培养皿倒置30℃培养至转化子出现。转化子可在基本培养基(不含His)生长，由于载体中没有酵母复制子，所以his4基因必须整合进酵母基因组中才能表达。另外，由于转化的酵母细胞中AOX1基因受到破坏，所以它就不能再利用甲醇作为碳源。这样，在以甲醇作为唯一碳源的培养基上转化子就不会生长(或者生长极缓慢)，表现为甲醇利用缺陷型(Mut^-)。

用无菌牙签从转化平板上挑取His⁺重组子，首先接种到MM固体培养基上，在接种到MD固体培养基上，如此挑取His⁺重组子，30℃培养2天。寻找在MD平板上生长正常但在MM平板上有一点生长或完全不生长的克隆子。

为了筛选得到高表达的重组酵母菌株，直接检测诱导培养基中植酸酶的表达情况。将His⁺Mut^-转化子首先在BMGY培养基(以甘油为碳源)中培养，待其生长至饱和状态，移去BMGY，换入诱导培养基BMMY(以甲醇作为诱导物)，在诱导培养36小时后取上清液进行植酸酶酶活性分析。通过表达植酸酶的酶活性测定，从phyA2经突变改造后得到的重组酵母中初步筛选到3株高水平表达植酸酶的重组子，分别定名为P.Pastoris pPIC9A-6，7，9。phyA2未经改造所得到的重组子表达量最高的三株分别定名为P.PastorispPIC9B-4，12，16。

实施例6在分子水平上证实植酸酶基因在酵母中的重组、转录及翻译

重组酵母菌株的甲醇利用缺陷型说明外源基因已经准确整合到酵母基因组中AOX1基因位点，从而破坏了该基因的功能。通过分子检测也证实了这一点。通过酶解的方法破坏酵母的细胞壁，再用SDS破坏细胞膜从而释放出染色体DNA再经过进一步的纯化处理就可以得到较纯的酵母基因组DNA。取5μg重组酵母基因组DNA进行EcoRI和BamHI全酶解，酶解产物进行0.8％的琼脂糖凝胶电泳，将凝胶中的DNA转移到尼龙膜上进行Southrenblotting分析。杂交所用探针为用BamHI从重组质粒pYY-1上切下的长约1.0Kb的植酸酶基因片断。探针酶切后电泳回收，用随机引物标记Kit标记探针。结果(图10)表明，不同的重组子(P.pastoris pPIC9A-6，7，9)DNA用phyA2基因两端的EcoRI酶切后，在1.4kb处有一全长的phyA2基因特异杂交带，这证明phyA2基因已整合到酵母基因组中。用phyA2基因内的BamH1酶切后，外源基因整合到酵母基因组中的不同位点会出现不同的杂交带，结果表明，重组酵母P.pastoris pPIC9A-6，7，9中，植酸酶基因的拷贝数分别为1、2、1个。

破碎酵母细胞提取酵母mRNA，取5μg酵母的mRNA进行甲醛变性凝胶电泳，将凝胶上的mRNA吸印到尼龙膜上进行Northern blotting分析。所用探针与Southren blotting分析使用的探针相同。结果(图11)表明，无论phyA2是否经过改造，重组酵母中的植酸酶基因得到了正常的转录。

取3μL无菌体的诱导培养液进行SDS-PAGE分析(丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺为29∶1)。所用分离胶浓度为8％，浓缩胶浓度为5％。电泳结束后凝胶用考马斯亮兰R250染色30分钟，接着用10％的冰乙酸脱色。结果(图12)表明，表达的植酸酶分子量大小约为85kD，在用EndoH(Endo-β-N-acetylglycosaminidase H)脱糖基处理后，分子量降为64kD左右，这证明植酸酶基因不仅得到了表达、有效分泌，而且表达产物还能进行蛋白翻译后修饰-糖基化，而糖基化修饰也是植酸酶具备正常酶活性所必需的。

实施例7重组酵母表达的植酸酶的性质分析

重组酵母30℃诱导培养36小时后，在37℃、pH5.5的条件下，对含表达产物的培养液进行植酸酶酶活性测定，结果(表2)表明，1)不同的转化子所表达的酶量有所差异，三个重组子P.pastoris pPIC9A-6，7，9分别为13488U/mL、15656U/mL、14656U/mL，比植酸酶基因未经改造的高37倍。这充分证明了我们对植酸酶基因的改造是成功的。

表2.酵母重组子中植酸酶表达量重组子植酸酶活性(U/mL) 整合的拷贝数A.niger 963 100 1Host P.Pastoris - -P.pastoris pPIC9A-6 13488 1P.pastoris pPIC9A-7 15656 2P.pastoris pPIC9A-9 14636 1P.pastoris pPIC9B-4 372 2P.pastoris pPIC9B-12 420 1P.pastoris pPIC9B-16 351 1

在37℃、不同pH值下对表达的植酸酶的酶活性测定结果(图13)表明，表达的植酸酶的最适pH值有两个，分别为1.8和5.7，在pH1.8～5.7的pH范围内，表达的植酸酶均能维持较高的酶活性。在pH5.5、不同温度下的酶活性测定结果(图14)表明，植酸酶的最适温度为55℃。表达植酸酶的最适pH和最适温度与原菌株A.niger 963所产的植酸酶相比并没有明显差别。

为了研究重组酵母植酸酶的表达量与诱导培养时间的关系，酵母重组子P.pastoris pPIC9A-7和9在诱导培养后每隔12小时取1mL培养液用于测定植酸酶活性，研究表明(图15)，在诱导培养36小时之内，表达的植酸酶随诱导时间的延长而增加，到36小时时达到高峰，再增加诱导表达时间，植酸酶的表达量仅缓慢增加。

实施例8重组酵母在5升发酵罐中高密度发酵生产植酸酶

重组酵母在BMGY培养基中30℃摇床培养24小时，然后按5-10％接种于发酵培养基中开始发酵。本发明探索了三种发酵方法，第一种为以甘油为碳源、甘油饲喂培养的发酵方法，具体如下：1)菌株培养阶段。发酵培养基接种前先加如28％氨水使培养基的pH达到5.0(氨水同时也做为菌株生长的氮源)，再按每升培养基加入4.37mL PTM1，5-10％接种种子液，通气搅拌培养18-24小时，在培养过程中随着菌株的生长，培养基中的溶氧量将由100％逐渐降低，当碳源消耗完后溶氧量将再度升高至80％以上，此时菌体湿重将达到110g/L。2)碳源饲喂阶段。流加50％甘油(包含12mL/L PTM1)，流加量为18.15/hr/L，培养4小时。调整通气量使溶氧量始终大于20％。此时菌体湿重将达到220g/L。3)诱导表达阶段。加如甲醇(含12mL/L PTM1)，使甲醇终浓度维持在0.3％，溶氧量始终大于20％。在诱导过程中每12小时取样一次测定表达的植酸酶的积累量。第二种方法为以甘油为碳源、碳源-甲醇混合饲喂的方法。具体为在第一种方法的第二步即碳源饲喂阶段完成后，增加一个碳源-甲醇混合饲喂阶段，即流加50％甘油∶甲醇(4∶1)培养4小时，流加量为5mL/hr/L，控制溶氧量始终大于20％。接着再进入甲醇诱导阶段。第三种方法为以葡萄糖为碳源、碳源-甲醇混合饲喂的方法。除了把碳源甘油换成葡萄糖外，其余与第二种方法完全相同。此三种方法对植酸酶的表达的影响见图16。三种方法植酸酶的表达量为均可达到50万U/mL发酵液，但第一种发酵诱导时间需要200小时，第二、三种方法可使诱导培养时间缩短到108-120小时，这样，发酵时间的大幅度缩短会大大降低发酵能耗，降低生产成本。第三种方法因使用价格较甘油低廉得多的葡萄糖为碳源，将进一步降低植酸酶的生产成本。

Claims

1．一种产生于黑曲霉菌株CGMCC 0332的植酸酶。

2．按照权利要求1所述的植酸酶，其氨基酸序列如下：M G V S A V L L P L Y L L S G V T S 18G L A V P A S R N Q S T C D T V D Q 36G Y Q C F S E T S H L W G Q Y A P F 54F S L A N K S A I S P D V P A G C Q 72V T F A Q V L S R H G A R Y P T D S 90K G K K Y S A L I E E I Q Q N A T T 108F K E K Y A F L K T Y N Y S L G A D 126D L T P F G E Q E L V N S G V K F Y 144Q R Y E S L T R N I V P F I R S S G 162S S R V I A S G N K F I E G Y Q S T 180K L K D P R A Q P G H S S P K I D V 198V I S E A S T S N N T L D P G T C T 216V S E D N E L A D D F E A N F T A T 234F V P S I R Q S L E N N L S G V A L 252T D T E V T Y L M D L C S F D T I S 270T S T V D T K L S P F C D L F T H E 288K W I N Y D Y L Q S L N K Y Y G H G 306A G N P L G P T Q G V C Y A N E L I 324S R L T H S P V H D Y T S S N H I L 342D S S Q D T F P L N S T L Y A D F S 360L N N G I I S I L F A W G L N K G T 378K P L S S T T A E N I T Q T D G F S 396S A W T V P F A S R M Y V E M M Q C 414Q S E Q E P L V R V L V N D R V V P 432L H G C P V D A L G R C T R D S F V 450K G L S F A R S G G D W A E C F A - 467

3．编码权利要求1或2所述植酸酶的DNA序列。

4．按照权利要求3所述的DNA序列，其特征在于编码Arg的密码子为AGA。

5．按照权利要求3所述的DNA序列，其核苷酸序列如下：5′1 ATGCTGGCAG TCCCCGCCTC GAGAAATCAG TCCACTTGCG ATACGGTCGA TCAGGGGTAT61 CAATGCTTCT CGGAGACTTC GCATCTTTGG GGCCAATACG CGCCGTTCTT TTCTCTGGCA121 AACAAATCGG CCATCTCCCC TGATGTTCCC GCCGGATGCC AAGTCACTTT CGCTCAGGTT181 CTCTCCCGCC ATGGAGCGAG ATATCCGACC GACTCCAAGG GCAAGAAATA CTCCGCTCTC241 ATCGAGGAGA TCCAGCAGAA CGCGACTACC TTCAAGGAGA AATATGCCTT CCTGAAGACA301 TACAACTACA GCCTGGGCGC GGATGACCTG ACTCCCTTTG GAGAGCAGGA GCTGGTCAAC361 TCCGGCGTCA AGTTCTACCA GAGATACGAG TCGCTCACAA GAAACATTGT TCCGTTCATC421 AGATCCTCAG GCTCCAGCCG CGTGATTGCC TCTGGCAATA AATTCATCGA AGGCTACCAG481 AGCACTAAGC TGAAGGATCC TCGTGCTCAG CCCGGCCATT CGTCGCCCAA GATCGACGTG541 GTCATTTCAG AGGCCAGCAC ATCCAACAAC ACTCTCGATC CGGGCACCTG CACCGTTTCC601 GAAGATAACG AATTGGCCGA TGACTTCGAA GCCAATTTCA CCGCCACGTT CGTCCCTTCC661 ATTCGTCAAA GTCTGGAGAA CAACTTGTCT GGCGTGGCTC TCACGGACAC AGAAGTGACC721 TACCTCATGG ACTTGTGCTC CTTCGACACG ATCTCCACCA GCACAGTCGA CACCAAGCTG781 TCCCCCTTCT GTGACCTGTT CACCCATGAA AAATGGATCA ACTACGACTA CCTCCAGTCC841 CTGAACAAGT ACTACGGCCA TGGCGCAGGT AACCCGCTCG GCCCGACCCA GGGCGTCTGC901 TACGCGAACG AGCTCATCTC CCGTCTCACC CATTCGCCTG TCCACGATTA CACCAGCTCC961 AACCACATAT TGGACTCGAG CCAGGATACT TTCCCGCTCA ACTCCACTCT CTATGCGGAC1021 TTTTCGCTTA ATAACGGCAT CATCTCTATC CTCTTTGCTT GGGGTCTGAA CAAGGGCACC1081 AAGCCGCTGT CTTCCACGAC CGCGGAGAAT ATCACCCAGA CCGATGGGTT CTCATCTGCC1141 TGGACGGTTC CTTTCGCGTC GCGCATGTAC GTCGAGATGA TGCAATGCCA GTCTGAGCAG1201 GAGCCTTTGG TCCGTGTCTT GGTTAATGAT CGCGTTGTTC CGCTGCATGG CTGTCCGGTT1261 GATGCTTTGG GGAGATGTAC GAGAGATAGC TTCGTGAAGG GTTTGAGCTT TGCCAGATCT1321 GGCGGTGATT GGGCGGAGTG TTTTGCTTAG 3’

6．一种黑曲霉菌，保藏号为CGMCC 0332。

7．一种重组表达载体，其特征在于它含有权利要求3所述的DNA序列。

8．按照权利要求7所述的表达载体，它是酵母表达载体。

9．含有权利要求7所述表达载体并表达植酸酶的转化的酵母细胞。

10．一种发酵生产植酸酶的方法，包括：

a．将权利要求9所述的转化的酵母细胞接种培养，然后按5-10％再接种于包含3-5％葡萄糖发酵培养基10XBasal salts中；

b．通气搅拌培养，在整个培养过程中氧饱和度不低于20％；

c．18小时后，按照17-19ml/hr/L的流量流动加入23-25％的葡萄糖溶液继续培养3小时以上；

d．按照4-6ml/hr/L的流量流动加入23-27％葡萄糖∶甲醇=3-5∶1-2混合溶液，继续培养3小时以上；

e．加入诱导剂甲醇，使甲醇的终浓度维持在0.1-0.5％，继续培养3小时以上。

11．按照权利要求10所述的方法，其特征在于，通气搅拌培养18小时后，按照18.15ml/hr/L的流量流动加入25％的葡萄糖溶液继续培养4小时；按照5ml/hr/L的流量流动加入25％葡萄糖∶甲醇=4∶1混合溶液，继续培养5小时；加入诱导剂甲醇，使甲醇的终浓度维持在0.3％，继续培养108-132小时。

12．一种饲料，其特征在于它含有权利要求10所述发酵方法的发酵产物。