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CN106222252A - 同时检测三种整合子相关元件的多重pcr引物与检测方法 - Google Patents

同时检测三种整合子相关元件的多重pcr引物与检测方法 Download PDF

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CN106222252A CN201610586484.1A CN201610586484A CN106222252A CN 106222252 A CN106222252 A CN 106222252A CN 201610586484 A CN201610586484 A CN 201610586484A CN 106222252 A CN106222252 A CN 106222252A
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Abstract

本发明涉及细菌耐药性研究领域，具体是一种用于同时检测细菌中三种整合子相关元件的多重PCR引物及多重PCR检测方法，该多重PCR引物包括利用引物设计软件Primerplex 2.61设计筛选的同时检测1类整合子(Int1)、4类超级整合子(SXT)和1型插入序列共同区(ISCR1)的多重PCR引物组合，利用设计的引物建立多重PCR检测体系，通过对引物体积和退火温度的优化建立了针对三种整合子相关元件的多重PCR检测方法，与现有技术相比，本发明的优点在于：采用本发明建立的多重PCR方法可同时检测细菌中三种整合子相关元件，具有操作简便、快速，特异性强等优点。

Description

同时检测三种整合子相关元件的多重PCR引物与检测方法
技术领域
本发明涉及细菌耐药性研究领域，具体地说，是一种用于同时检测1类整合子(Int1)、4类超级整合子(SXT)和1型插入序列共同区(ISCR1)的多重PCR引物及检测方法。
背景技术
抗菌药物在人医临床及食品动物养殖中的使用，拯救了数以亿计人的生命，也推动了陆生和水生动物养殖业的发展；与此同时，也使得细菌耐药性问题日趋严重。整合子是介导革兰氏阴性菌抗菌药物耐药产生和迅速传播的重要机制之一。它是细菌的一种天然的克隆和表达系统，可在整合酶的催化下介导耐药基因盒的捕获、整合和切除，造成耐药基因在菌群中迅速传播。目前，目前已报道的耐药相关的整合子包括五类，其中1类整合子在临床耐药菌株中最为常见。1类整合子携带的耐药基因盒种类多达100余种，涉及到的抗菌药物包括：β-内酰胺类、氨基糖苷类、磺胺类、酰胺醇类、氨基糖苷类、利福霉素类等。在一些复杂的1类整合子3’端保守区的下游通常存在有一段长为2154bp、可编码513个氨基酸的DNA序列，因此被称为Orf513，后来又被命名为1型插入序列共同区(Insertion sequencecommon region,ISCR1)。ISCR1是一种通过“滚环转座”机制转移其相邻耐药基因的可移动遗传元件；大量的证据表明，ISCR1与多种抗菌药物耐药基因的传播扩散密切相关，如氯霉素类、甲氧苄啶类、喹诺酮类、氨基糖苷类耐药基因以及A类和C类β内酰胺酶基因等。Ⅳ型整合子即超级整合子SXT首次发现于霍乱弧菌，被认为是指导宿主基因进化的主要因素，它可携带耐药基因、毒力基因等上百个基因盒，可使细菌迅速适应环境的变化，是细菌生存和进化的重要遗传元件。目前，上述三种整合子相关元件已在国内外多种来源的弧菌中被大量报道，涉及到耐药基因的种类包括：酰胺醇类耐药基因(cat、floR)、β-内酰胺耐药基因(blaPER、blaVIM-1、blaOXA-10)、氨基糖苷类耐药(aadA1、aacA3、aadB、strA/B)、四环素类耐药基因(tetA)、喹诺酮类耐药基因(qnrVC)、利福霉素类耐药基因(arr)、甲氧苄啶耐药基因(dfrA1、dfr16)、磺胺类耐药基因(sul1、sul2)等。本实验室在开展海水养殖源弧菌耐药性研究的过程中，从江苏、山东、辽宁、福建和海南等地区分离的多种弧菌中检测到了Int1、SXT、ISCR1的流行，但未检测到其它类型整合子元件(如2和3类整合子)的存在。然而，到目前为止还没有一种能同时检测Int1、SXT、ISCR1这三种元件的方法。因此需要建立一种能同时检测1类整合子Int1、4类超级整合子SXT、1型插入序列共同区ISCR1的多重PCR方法，以实现上述三种元件的简便和快捷检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够同时检测检测1类整合子(Int1)、4类超级整合子(SXT)和1型插入序列共同区(ISCR1)的多重PCR引物及检测方法，以简便、便捷地检测上述三种元件在细菌中的流行情况。
为实现上述发明目的，本发明的第一方面，提供一种用于同时检测细菌中三种整合子相关元件的多重PCR引物的设计方法，包括：利用多重PCR引物设计软件Primerplex2.61(PREMIER Biosoft)设计同时检测1类整合子整合酶基因int1、4类超级整合子整合酶基因intSXT和1型插入序列共同区转座酶基因ISCR1的多重PCR引物组合，所形成的引物组合所包含的引物碱基数为18-20个，引物的熔解温度Tm值为49.6℃-50.7℃，引物的GC％为40％-55％。
本发明的第二方面，提供一种采用上述设计方法筛选得到的用于同时检测检测1类整合子(Int1)、4类超级整合子(SXT)和1型插入序列共同区(ISCR1)的多重PCR引物，包括1类整合子整合酶基因int1、4类超级整合子整合酶基因intSXT和1型插入序列共同区转座酶基因ISCR1的引物。
其中，1类整合子整合酶基因int1的上下游引物分别为：
P1：5’-CGAACCGAACAGGCTTAT-3’(SEQ ID NO.1)
P2：5’-GGATACTTCCGCTCAAGG-3’(SEQ ID NO.2)
4类超级整合子整合酶基因intSXT的上下游引物分别为：
P3：5’-CTCTACCTACAGCAGGAACG-3’(SEQ ID NO.3)
P4：5’-TCTCAGTGATTTTTGACTCG-3’(SEQ ID NO.4)
1型插入序列共同区转座酶基因ISCR1的上下游引物分别为：
P5：5’-AGACGATACGCTGACTCA-3’(SEQ ID NO.5)
P6：5’-AGAATCTGCTCAATGACCTT-3’(SEQ ID NO.6)。
较优的，所述1类整合子整合酶基因引物int1对应的PCR扩增片段大小为569bp，所述4类超级整合子整合酶基因intSXT引物对应的PCR扩增片段大小为430bp，所述1型插入序列共同区转座酶基因ISCR1引物对应的PCR扩增片段大小为651bp。
本发明的第三方面，提供一种应用上述多重PCR引物同时检测细菌中三种整合子相关元件的多重PCR检测方法，本发明通过多重PCR同时检测1类整合子整合酶基因int1、4类超级整合子整合酶基因intSXT和1型插入序列共同区转座酶基因ISCR1方法的最佳反应条件的测定，利用3对引物进行多重PCR最佳退货温度、引物浓度、模板浓度等的优化，然后根据实验结果进行多重PCR最佳循环次数的测定，得到的较优的同时检测细菌中三种整合子相关元件的多重PCR检测方法包括如下步骤：
A)细菌的初步分离：从培养的细菌中提取基因组DNA，用作PCR模板；
B)多重PCR扩增，包括：a、多重PCR扩增反应体系：取上述基因组DNA模板0.5μL，Premix Ex TaqTM 12.5μL，引物P1、P2(10pmol/L)各0.3μL、引物P3、P4(10pmol/L)各0.6μL，引物P5、P6(10pmol/L)各0.6μL，超纯水定容至25μL。b、扩增反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸35s，循环35次，72℃终末延伸10min；c、将步骤b的扩增产物进行电泳检测及结果分析。
本发明优点在于：
利用设计的引物建立多重PCR检测体系，通过对引物体积和退火温度的优化建立了针对三种整合子相关元件的多重PCR检测方法，与现有技术相比，采用本发明建立的多重PCR方法可同时检测细菌中三种整合子相关元件，具有操作简便、快速，特异性强等优点。
附图说明
图1.多重PCR检测不同细菌中的三种整合子相关元件的电泳结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1
1)利用多重PCR引物设计软件Primerplex 2.61(PREMIER Biosoft)设计同时检测1类整合子整合酶基因int1、4类超级整合子整合酶基因intSXT和1型插入序列共同区转座酶基因ISCR1的多重PCR引物组合；
2)从多重PCR引物设计软件Primerplex 2.61给出的结果中筛选最优的引物组合；
3)提供一种应用上述多重PCR引物同时检测细菌中三种整合子相关元件的最优的多重PCR检测方法。
所述的步骤1)，其中涉及引物参照的是三种整合子相关元件相应的GenBank上发表的基因序列，即1类整合子整合酶基因int1对应的序列是KU130396.1、4类超级整合子整合酶基因intSXT对应的序列是GQ495075.1、1型插入序列共同区转座酶基因ISCR1对应的序列是KT725789.1，利用多重PCR引物设计软件Primerplex 2.61设计能同时检测1类整合子整合酶基因int1、4类超级整合子整合酶基因intSXT和1型插入序列共同区转座酶基因ISCR1的特异性多重PCR引物组合。
备注：在本发明文本中，P1和P2为根据1类整合子整合酶基因int1序列设计的上游引物P1和下游引物P2，P3和P4为根据4类超级整合子整合酶基因intSXT序列设计的上游引物P3和下游引物P4，P5和P6为根据1型插入序列共同区转座酶基因ISCR1序列设计的上游引物P5和下游引物P6。
所述的步骤2)将设计合成的多重PCR引物进行最佳配对筛选实验后，经过反应条件、对比试验和验证试验，得到本发明特异性强的最优多重PCR引物组合。其中，所述的1类整合子整合酶基因引物对应的PCR扩增片段大小为569bp，所述的4类超级整合子整合酶基因intSXT引物对应的PCR扩增片段大小为430bp，所述的1型插入序列共同区转座酶基因ISCR1引物对应的PCR扩增片段大小为651bp。具体引物序列如下：
1类整合子整合酶基因int1的上下游引物：
P1：5’-CGAACCGAACAGGCTTAT-3’(SEQ ID NO.1)
P2：5’-GGATACTTCCGCTCAAGG-3’(SEQ ID NO.2)
4类超级整合子整合酶基因intSXT的上下游引物：
P3：5’-CTCTACCTACAGCAGGAACG-3’(SEQ ID NO.3)
P4：5’-TCTCAGTGATTTTTGACTCG-3’(SEQ ID NO.4)
1型插入序列共同区转座酶基因ISCR1的上下游引物：
P5：5’-AGACGATACGCTGACTCA-3’(SEQ ID NO.5)
P6：5’-AGAATCTGCTCAATGACCTT-3’(SEQ ID NO.6)。
所述的步骤3)，多重PCR同时检测1类整合子整合酶基因int1、4类超级整合子整合酶基因intSXT和1型插入序列共同区转座酶基因ISCR1方法的最佳反应条件的测定，包括：首先优化多重PCR反应体系，然后优化多重PCR反应体系的引物浓度、模板浓度、最佳退火温度等，最后根据实验结果进行多重PCR最佳循环次数的测定。
建立多重PCR体系：建立25μL初始多重PCR体系：Premix Ex TaqTM12.5μL、上下游引物(10pM)各0.5μL、DNA模板0.5μL，超纯水定容至25μL；其中int1、intSXT和ISCR1的上下游引物(10pM)体积均为0.5μL。
初始PCR反应体系：梯度PCR扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸35s，30个循环；最后72℃再延伸10min，4℃保存。扩增产物经1％的琼脂糖凝胶电泳(150V，30min)后，利用凝胶成像系统观察结果，依据结果对多重PCR反应体系进行优化。
优化多重PCR体系的引物体积组合：在上述试验基础上，将退火温度固定为50℃，然后对int1、intSXT和ISCR1三对目的基因引物(10pM)的体积组合进行优化。在预设的int1(0.3μL、0.4μL和0.5μL)、intSXT(0.4μL、0.5μL和0.6μL)和ISCR1(0.4μL、0.5μL和0.6μL)体积范围内，进行三因素三水平的全面实验，以确定各引物的最优体积组合：0.3μL(int1)、0.6μL(intSXT)和0.6μL(ISCR1)。
优化多重PCR体系的退火温度：在上述试验基础上，按照初始多重PCR反应体系和各引物的最优体积组合，设定一系列退火温度：47.0℃、47.5℃、48.0℃、48.5℃、49.0℃、49.5℃、50.0℃、50.5℃、51.0℃、51.5℃、52.0℃和52.5℃，以确定多重PCR反应的最佳退火温度：50℃。
优化多重PCR体系的循环次数：按照初始多重PCR反应体系、各引物的最优体积组合、最优退火温度，设定一系列循环次数：28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，以确定多重PCR反应的最佳循环次数：35次。
所述的步骤3)，多重PCR同时检测1类整合子整合酶基因int1、4类超级整合子整合酶基因intSXT和1型插入序列共同区转座酶基因ISCR1方法的反应体系为25μL，具体如下：Premix Ex TaqTM12.5μL，10pmol/L的1类整合子整合酶基因int1上下游引物各0.3μL，10pmol/L的4类超级整合子整合酶基因intSXT上下游引物各0.6μL，10pmol/L的1型插入序列共同区转座酶基因ISCR1上下游引物各0.6μL，DNA模板0.5μL，超纯水定容至25μL，扩增条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸35s，循环35次，72℃终末延伸10min，将以上PCR产物在1×TAE、1.0％琼脂糖凝胶、150V电压条件下电泳30min，然后在凝胶成像系统中观察。
图1中的泳道1、2、3、4、5、6、7、8和16显示了不同对照(阳性对照，阴性对照和空白对照)菌株DNA模板中1类整合子整合酶基因int1、4类超级整合子整合酶基因intSXT和1型插入序列共同区转座酶基因ISCR1的多重PCR检测结果，其中M号泳道为DL2000DNA Marker；
1号泳道为1类整合子整合酶基因int1阳性对照菌株的扩增结果，在分子量约为569bp处呈现明亮目的扩增条带，说明本实施例的阳性对照菌株DNA样品中含有1类整合子整合酶基因int1；
2号泳道为4类超级整合子整合酶基因intSXT阳性对照菌株的扩增结果，在分子量约为430bp处呈现明亮目的扩增条带，说明本实施例的阳性对照菌株DNA样品中含有4类超级整合子整合酶基因intSXT；
3号泳道为1型插入序列共同区转座酶基因ISCR1阳性对照菌株的扩增结果，在分子量约为651bp处呈现明亮目的扩增条带，说明本实施例的阳性对照菌株DNA样品中含有1型插入序列共同区转座酶基因ISCR1；
4号泳道为1类整合子整合酶基因int1与1型插入序列共同区转座酶基因ISCR1阳性对照菌株的扩增结果，在分子量约为569bp和651bp处呈现明亮目的扩增条带，说明本实施例的阳性对照菌株DNA样品中含有1类整合子整合酶基因int1和1型插入序列共同区转座酶基因ISCR1；
5号泳道为1类整合子整合酶基因int1与4类超级整合子整合酶基因intSXT阳性对照菌株的扩增结果，在分子量约为569bp和430bp处呈现明亮目的扩增条带，说明本实施例的阳性对照菌株DNA样品中含有1类整合子整合酶基因int1和4类超级整合子整合酶基因intSXT；
6号泳道为1型插入序列共同区转座酶基因ISCR1与4类超级整合子整合酶基因intSXT阳性对照菌株的扩增结果，在分子量约为651bp和430bp处呈现明亮目的扩增条带，说明本实施例的阳性对照菌株DNA样品中含有1型插入序列共同区转座酶基因ISCR1和4类超级整合子整合酶基因intSXT；
7号泳道为1型插入序列共同区转座酶基因ISCR1，1类整合子整合酶基因int1与4类超级整合子整合酶基因intSXT阳性对照菌株的扩增结果，在分子量约为651bp、569bp和430bp处呈现明亮目的扩增条带，说明本实施例的阳性对照菌株DNA样品中含有1型插入序列共同区转座酶基因ISCR1、1类整合子整合酶基因int1和4类超级整合子整合酶基因intSXT；
8号泳道为阴性对照菌株的扩增结果，未出现明亮的目的扩增条带，说明本实施例的阴性对照菌株DNA样品中不含1型插入序列共同区转座酶基因ISCR1、1类整合子整合酶基因int1和4类超级整合子整合酶基因intSXT；
16号泳道为空白对照样品的扩增结果，未出现明亮的目的扩增条带，说明本实施例中的多重PCR体系没有受到1型插入序列共同区转座酶基因ISCR1、1类整合子整合酶基因int1和4类超级整合子整合酶基因intSXT阳性DNA的污染。
图1中的泳道9、10、11、12、13、14和15显示了对临床分离弧菌进行1型插入序列共同区转座酶基因ISCR1，1类整合子整合酶基因int1和4类超级整合子整合酶基因intSXT的多重PCR检测结果，其中9号泳道在分子量约为430bp处呈现明亮目的扩增条带，说明本实施例的临床分离弧菌菌株DNA样品中含有4类超级整合子整合酶基因intSXT；
10号泳道在分子量约为569bp处呈现明亮目的扩增条带，说明本实施例的临床分离弧菌菌株DNA样品中含有1类整合子整合酶基因int1；
11号泳道在分子量约为651bp处呈现明亮目的扩增条带，说明本实施例的临床分离弧菌菌株DNA样品中含有1型插入序列共同区转座酶基因ISCR1；
12号泳道在分子量约为569bp和430bp处呈现明亮目的扩增条带，说明本实施例的临床分离弧菌菌株DNA样品中含有1类整合子整合酶基因int1和4类超级整合子整合酶基因intSXT；
13号泳道在分子量约为569bp和651bp处呈现明亮目的扩增条带，说明本实施例的临床分离弧菌菌株DNA样品中含有1类整合子整合酶基因int1和1型插入序列共同区转座酶基因ISCR1；
14号泳道在分子量约为569bp处呈现明亮目的扩增条带，说明本实施例的临床分离弧菌菌株DNA样品中含有1类整合子整合酶基因int1；
15号泳道在分子量约为651bp处呈现明亮目的扩增条带，说明本实施例的临床分离弧菌菌株DNA样品中含有1型插入序列共同区转座酶基因ISCR1。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (4)

1.一种用于同时检测细菌中三种整合子相关元件的多重PCR引物，其特征在于，包括1类整合子整合酶基因int1、4类超级整合子整合酶基因intSXT和1型插入序列共同区转座酶基因ISCR1的引物；
其中，所述的1类整合子整合酶基因int1的上游引物P1和下游引物P2分别如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示；
所述的4类超级整合子整合酶基因intSXT的上游引物P3和下游引物P4分别如SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示；
所述的1型插入序列共同区转座酶基因ISCR1的上游引物P5和下游引物P6分别如SEQID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
2.根据权利要求1所述的用于同时检测细菌中三种整合子相关元件的多重PCR引物，其特征在于：所述的1类整合子整合酶基因int1引物对应的PCR扩增片段大小为569bp，所述的4类超级整合子整合酶基因intSXT引物对应的PCR扩增片段大小为430bp，所述的1型插入序列共同区转座酶基因ISCR1引物对应的PCR扩增片段大小为651bp。
3.一种如权利要求1所述的用于同时检测细菌中三种整合子相关元件的多重PCR引物的设计方法，其特征在于，利用引物设计软件Primerplex 2.61设计同时检测1类整合子整合酶基因int1、4类超级整合子整合酶基因intSXT和1型插入序列共同区转座酶基因ISCR1的多重PCR引物组合，所形成的引物组合所包含的引物碱基数为18-20个，引物的熔解温度Tm值为49.6℃-50.7℃，引物的GC％为40％-55％。
4.一种应用如权利要求1所述的多重PCR引物同时检测细菌中三种整合子相关元件的多重PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
A)细菌的初步分离：从培养的细菌中提取基因组DNA，用作PCR模板；
B)多重PCR扩增，包括：a、多重PCR扩增反应体系：取上述基因组DNA模板0.5μL，PremixEx TaqTM 12.5μL，10pmol/L的引物P1、P2各0.3μL、10pmol/L的引物P3、P4各0.6μL，10pmol/L的引物P5、P6各0.6μL，超纯水定容至25μL；b、扩增反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸35s，循环35次，72℃终末延伸10min；c、将步骤b的扩增产物进行电泳检测及结果分析。
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