CN106222088A

CN106222088A - 一种用于动物组织原位对照培养的微流控芯片

Info

Publication number: CN106222088A
Application number: CN201610838551.4A
Authority: CN
Inventors: 朱真; 陈攀; 陈炜捷; 田倍通; 方磊
Original assignee: Southeast University
Current assignee: Southeast University
Priority date: 2016-09-21
Filing date: 2016-09-21
Publication date: 2016-12-14
Anticipated expiration: 2036-09-21
Also published as: CN106222088B

Abstract

本发明提供了一种用于动物组织原位对照培养的微流控芯片，具有一个阵列形式的微流道网络结构进行动物组织的培养；有多个流体入口与组织培养阵列相连接，利用多个入口流入的流体在微流道内的层流状态及对中间入口流入的组织悬浮液的汇聚作用，通过多级Y型分流区将组织分配到每一列的培养单元，每个培养单元可将组织固定并进行培养、观测；在不同入口输入不同培养液，同时调节其流量配比，可使固定在不同列的组织在不同培养液中培养，实现同一微流控芯片上组织之间的原位对照培养；该微流控芯片使用了透明材料加工，可在显微镜下进行实时监测、原位分析组织的动态生长、分化过程，用以研究动物组织结构和功能在不同培养环境刺激下的动力学参数。

Description

一种用于动物组织原位对照培养的微流控芯片

技术领域

本发明提供了一种用于动物组织原位对照培养的微流控芯片，属于微流控技术及动物组织培养分析技术领域。

技术背景

动物组织培养是指从动物体内取出组织或器官，模拟体内的生理环境条件，在无菌、适宜温度和丰富营养条件下，使离体组织或器官生存、生长，并维持其分化、结构和(或)功能，是现代动物组织工程的重要技术基础。动物组织培养在三维组织器官工程、胚胎干细胞工程、动物克隆、动物细胞产品的大规模制备、介于细胞和动物的药物体外试验等生物、医学、药学领域具有广泛的科学研究和实际应用价值。

传统的动物组织培养技术通常使用培养容器进行组织离体培养，包括培养皿、培养瓶、培养板(6孔、24孔、96孔等)等。培养过程即把从动物体内取出的组织或器官直接放置在培养容器中，然后利用相关培养液在温度、气体等环境因素可控的培养箱内进行培养。虽然基于培养容器的传统组织培养技术具有易于人工操作的优点，但其自动化程度低，需要操作人员定时定点进行培养液的更换，增加了组织或器官受污染的风险；试剂或药物加载的剂量和时间也是由人工完成，缺乏精确可控和自动化；此外，在传统培养容器中进行组织培养往往无法对组织的动态分化过程进行实时监测，从而无法研究组织或器官结构和功能的动力学参数。随着微流控技术在生物学、医学、药学等研究领域的广泛应用，微流控芯片正在发展成为组织操纵、培养和分析的新一代技术。利用微流控芯片进行动物组织培养可实现培养装置的小型化和自动化，可通过程序精确控制培养液的输送、药物或试剂的加载、给样时间等生长环境参数。然而，当前用于组织培养的微流控芯片缺乏原位对照培养的功能，一个芯片只能提供单一培养液环境，同一芯片上的动物组织无法进行不同培养液刺激下的对比培养和原位监测，因此需要使用多个微流控芯片同时进行组织培养。这种情况下，微流控芯片的结构、尺寸，及其使用操作的微小差异均会对对照培养的结果产生重要影响。此外，当前的组织培养芯片集成度不高、可扩展性不强。

发明内容

鉴于上述现有技术的缺点和应用领域的缺失，本发明的目的在于提供一种针对动物组织原位对照培养的微流控芯片及高集成度扩展方法，用于稳定且高效地将动物活体组织或器官固定在芯片的特定位置进行原位对照培养，即固定在芯片不同位置的组织或器官能够暴露于不同培养液环境中，从而进行片上对比培养和原位监测分析；在培养过程中进行精确的环境控制，例如精确控制培养液输送、药物或试剂加载的给样时间等参数；此外，可进行高集成度的扩展，即集成更多的组织固定结构且为原位对照培养提供更多可选择的培养液环境。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供了一种用于动物组织原位对照培养的微流控芯片。其特征在于，该微流控芯片具有一个阵列形式的微流道网络结构进行动物组织的培养；有多个流体入口与组织培养阵列相连接，利用多个入口流入的流体在微流道内的层流状态及对中间入口流入的组织悬浮液的汇聚作用，通过多级Y型分流区将组织分配到每一列的培养单元，每个培养单元可将组织固定并进行培养、观测；在不同入口输入不同培养液或试剂，同时调节其流量配比，可使固定在不同列的组织在不同某一特定培养液或试剂中进行培养，实现同一微流控芯片上组织之间的原位对照培养；该微流控芯片可进行高集成度扩展，每一列可包含多个组织培养单元，整个组织培养阵列的列数也可增加，流体入口的个数也可由培养液或试剂的实际需求而增加，从而实现该微流控芯片的高集成度扩展。

本发明采用的技术方案如下：

一种用于动物组织原位对照培养的微流控芯片，包括顶层结构和底层结构；在所述底层结构上设有阵列式的微流道网络；所述微流道网络包括若干列主流通道及与所述主流通道相对应的若干辅流通道；在所述主流通道与所述辅流通道之间设有若干组织培养单元；所述主流通道通过分流区与主流输入分配通道连通；所述主流输入分配通道入口连通底层组织悬浮液入口、两路底层培养液入口；所述底层组织悬浮液入口位于两路所述底层培养液入口之间；通过调节两路培养液与组织悬浮液之间的流量配比，所述主流输入分配通道将组织悬浮液中的动物组织分配至各个组织培养单元；

在所述顶层结构上设有辅流输入分配通道；所述辅流输入分配通道入口连接辅流入口；所述辅流输入分配通道通过分流区与所述底层结构中的辅流通道连通；所述组织悬浮液中的动物组织通过所述主流通道与所述辅流通道之间的压强差固定在所述组织培养单元中。

在所述主流输入分配通道的入口处设有将所述组织悬浮液及两路培养液以层流形式汇聚的组织汇流区。

所述顶层结构及底层结构中的分流区均为若干Y型分流区；所述阵列式微流道网络的列数为2的正整数次幂。

所述阵列式微流道网络的列数由分流区分流的流道及分流区的级数确定；具体为分流区为m级分流，每级分流区将一个流道分为n个流道。则所述阵列式微流道网络的列数为n^m。

每列所述主流通道与所述辅流通道之间的组织培养单元的个数为大于或等于1的整数。

所述组织悬浮液为包含分离细胞、细胞簇、小块组织或器官其中任一或之间任意混合的悬浮液；所述辅流液体使用常规培养液。

通过调节不同培养液之间的流量配比，选择性地将不同列的动物组织暴露于不同的培养液中进行组织原位对照培养。

本发明具有以下有益效果：1)该微流控芯片采用阵列形式的组织培养微流体网络结构，利用流体力学原理，将每个组织稳定地固定在组织培养单元，实现了多组织在同一芯片上的高通量、稳定、长时间的培养；2)该微流控芯片利用层流的原理，结合液流汇聚、Y型分流等微流体通道结构，对固定在不同列的组织输送不同的培养液，从而实现动物组织的原位对照培养；3)该微流控芯片可进行高集成度扩展，每列可集成更多数目的组织固定单元，亦可增加列数及相应的培养液输入口的数目、Y型分流区和汇流区的级数，实现组织培养对照组数的扩展；4)该微流控芯片使用了透明加工材料，可在显微镜下进行实时监测、原位分析组织的动态生长、分化过程，用以研究组织结构和功能在不同培养环境刺激下的动力学参数。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对方案描述中所需要使用的附图作简要介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，本领域技术人员可在不付出创造性劳动的前提下，根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明的用于动物组织原位对照培养的微流控芯片的顶层微流体通道的平面结构示意图。

图2是本发明的用于动物组织原位对照培养的微流控芯片的底层微流体通道的平面结构示意图。

图3是本发明的微流控芯片的一个组织固定单元的A-A向剖面结构示意图。

图4是本发明的微流控芯片的一个辅流流入通孔的B-B向剖面结构示意图。

图5是本发明的用于动物组织原位对照培养的微流控芯片的三维分解结构示意图。

图6是本发明的用于动物组织原位对照培养的微流控芯片的三维微流体通道网络结构示意图。

图7是本发明的用于动物组织原位对照培养的微流控芯片的俯视结构示意图。

标号说明

10为顶层结构，20为底层结构，30为衬底，40为动物组织，101为顶层组织悬浮液入口(与201对准)，102为顶层培养液入口一(与202对准)，103为顶层培养液入口二(与203对准)，104为辅流入口，105为辅流输入分配通道，105a、105b分别为一级、二级Y型辅流分流区，106为辅流输出通道，106a、106b分别为一级、二级Y型辅流汇流区，107为辅流出口，108为顶层主流出口(与211对准)，201为底层组织悬浮液入口(与101对准)，202为底层培养液入口一(与102对准)，203为底层培养液入口二(与103对准)，204为组织汇流区，205为主流输入分配通道，205a、205b分别为一级、二级Y型主流分流区，206为主流通道，207为辅流通道，208为组织培养单元，209a、209b分别为辅流流入通孔、辅流流出通孔，210为主流输出通道，210a、210b分别为一级、二级Y型主流汇流区，211为底层主流出口(与108对准)。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过其他不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的原理下进行各种修饰或改变。

请参阅图1～图7。需要说明的是，本实施例中所提供的图示仅以例示方式说明本发明的基本原理、组件结构、工作过程及功效，遂图示中仅显示与本发明中有关的组件而非按照实际实施时的组件数目、形成及尺寸绘制，其实际实施时各组件的型态、数量及比例可改变，且其组件布局型态亦可更为复杂。

如图1～图7所示，本实施例提供一种用于动物组织原位对照培养的微流控芯片，该微流控芯片的基本结构包括衬底30，设在衬底30上方的底层结构20、设在底层结构20上的顶层结构10。

所述顶层结构10的基本结构包括顶层组织悬浮液入口101、顶层培养液入口102和103、辅流入口104、辅流输入分配通道105、一级Y型辅流分流区105a、二级Y型辅流分流区105b、辅流输出通道106、一级Y型辅流汇流区106a、二级Y型辅流汇流区106b、辅流出口107、主流出口108；辅流入口104与辅流输入分配通道105连接，辅流输入分配通道105末端通过一、二级Y型辅流分流区105a、105b形成四个辅流通道入口；与四个辅流通道入口相对应设置有四个辅流通道出口，四个辅流通道出口通过一、二级Y型辅流汇流区106a、106b形成一个辅流汇流口与辅流输出通道106连接，辅流输出通道106与辅流出口107连接。

所述底层结构20的基本结构包括底层组织悬浮液入口201、底层培养液入口202和203、组织汇流区204、主流输入分配通道205、一级Y型主流分流区205a、二级Y型主流分流区205b、主流通道206、辅流通道207、组织培养单元208、辅流流入通孔209a、辅流流出通孔209b、主流输出通道210、一级Y型主流汇流区210a、二级Y型主流汇流区210b、主流出口211；所述底层组织悬浮液入口201位于两路所述底层培养液入口202和203之间。在组织悬浮液通道及两路培养液通道汇聚处为组织汇流区204，组织汇流区204连接主流输入分配通道205，主流输入分配通道205末端连接两级Y型主流分流区205a、205b，两级Y型主流分流区205a、205b将流道分成了四个主流通道206；四个主流通道206通过两级Y型主流汇流区210a、210b将流道合并为一个流道并与主流输出通道210连接，主流输出通道210与主流出口211连通。辅流通道207对应设置在主流通道206一侧，在主流通道206与辅流通道207之间设有3个组织培养单元208。

所述顶层结构10的顶层组织悬浮液入口101、顶层培养液入口102和103、顶层主流出口108分别与所述底层结构20的底层组织悬浮液入口201、底层培养液入口202和203、底层主流出口211对准并连通。所述底层结构20的辅流流入通孔209a、辅流流出通孔209b分别与所述顶层结构10的辅流输入分配通道105、辅流输出通道106对准并连通。底层结构20上的四条辅流通道207分别通过辅流流入通孔209a及辅流流出通孔209b与顶层结构10上形成的四个辅流通道入口及四个辅流通道出口相连通；这样，在所述底层结构(20)上形成了阵列式的微流道网络。

具体使用本实施例时，所述的用于动物组织原位对照培养的微流控芯片至少包括以下使用步骤：

如图1～图7所示，首先进行步骤1，将组织悬浮液及两路培养液分别通过所述顶层悬浮液入口101、顶层培养液入口102和103以恒定总流量泵入所述底层结构20；组织悬浮液在所述组织汇流区204被两路培养液构成的层流形式的鞘流汇聚在所述主流输入分配通道205的中间，并与两路培养液共同构成主流液体；该主流液体在流经所述主流输入分配通道205、两级Y型主流分流区205a和205b之后，被分配成多路主流液体，分别流入多列所述主流通道206和组织培养单元208，然后再经过两级所述Y型主流汇流区210a和210b汇聚成一路主流液体，并在流经所述主流输出通道210后，最终从顶层主流出口108流出；同时辅流液体以恒定流量经所述辅流入口104泵入所述顶层结果10，该辅流液体在流经所述辅流输入分配通道105和两级Y型辅流分流区105a和105b之后，被分配成多路辅流液体，经过所述辅流流入通孔209a分别流入多列所述辅流通道207，接着从所述辅流流出通孔209b流出并经过两级Y型辅流汇流区106a和106b后，流经所述辅流输出通道106，最终从所述辅流出口107流出。

接着进行步骤2，调节两路培养液与组织悬浮液之间的流量配比，通过两级所述Y型主流分流区205a和205b，将组织悬浮液依次分配至每一列所述主流通道206和辅流通道207之间的组织培养单元208；具体为主流流速快，辅流流速慢，它们之间有压强差，通过利用主流和辅流间的压强差，使部分流体从主流流向辅流，从而带着组织流到培养单元，实现组织的固定。同时在培养过程中，一直有培养液从主流流向辅流，为组织生长提供充足的营养环境。调节辅流液体的流量，使其比组织悬浮液及两路培养液的总流量小，则所述主流通道206和辅流通道207内的两支流体间存在从主流通道206指向辅流通道207的正向压强差，该压强差恰好施加在组织培养单元208上，主流通道206中的动物组织40将会流入组织培养单元208，由于所述组织培养单元208的特殊结构，实现了所述动物组织40在微流体通道中的固定，如图3所示。

最后进行步骤3，在组织的原位对照培养过程中，使用具有对比差异的两路培养液，同时利用微流道中流体层流的特性，调节两路培养液的流量配比，利用所述组织汇流区204和两级Y型分流区205a和205b，将两路不同的培养液输送到不同列的主流通道206，进而使不同列的培养单元208上固定的组织暴露于两路不同培养液中，实现动物组织原位对照培养。

进一步地，该微流控芯片组织培养阵列的列数为2的正整数次幂，即2、4、8、16等等；每一列组织培养单元的个数为大于或等于1的整数。在本实施例中，微流控芯片具有4列、每列3个组织培养单元，形成一个3x4的组织培养阵列。每一列组织培养单元对应一个所述主流通道206和辅流通道207。两级Y型分流区实现了将流体均匀的一分为二、二分为四，从而将主流和辅流分别均分为4路，流入相应的4个主流通道206和辅流通道207；然后利用两级Y型汇流区将4路主流和辅流流体分别四合为二、二合为一，最后分别从主流出口108和辅流出口107流出。采用上述二级分流的分流区更加容易控制和计算，但本发明并不止于此，本发明的分流区可以为二级以上的多级分流，同时每级分流区可以设置为将一个流道分为两个以上流道的分流区；假设分流区为m级分流，每级分流区将一个流道分为n个流道，那么本发明的微流道网络的流道数量为n^m列。且本发明每列流道上可以设置的组织培养单元数量为1个或1个以上。这样，该微流控芯片上动物组织原位对照培养阵列的规模可进行高集成度扩展，即增加组织培养阵列的列数、增加每一列的组织培养单元个数、提供更多种输入的培养液。扩展规则以组织培养阵列数为8且进行4组原位对照组织培养为例：该微流控芯片须设计并制作4个所述培养液入口、三级Y型分流区、三级Y型汇流区，仅需将4路培养液流量配比设置为1:1:1:1，即可进行4组原位对照组织培养，每两列组织暴露于一种培养液中。

进一步地，利用对两路培养液与组织悬浮液流量配比的调节，将所述组织40依次输送至培养阵列的每一列培养单元。在本实施例中，微流控芯片具有两个培养液入口，当流入所述培养液入口203、组织悬浮液入口201、培养液入口202的流量设置为3:1:12μL/min时，组织悬浮液将被输送至左起第一列培养单元；当三路流量设置为7:1:8μL/min时，组织悬浮液被输送至左起第二列培养单元；当三路流量设置为11:1:4μL/min时，组织悬浮液被输送至左起第三列培养单元；当三路流量设置为14:1:1μL/min时，组织悬浮液被输送至第四列培养单元。

进一步地，当组织培养阵列完成组织固定后，可减小或停止组织悬浮液的输送，但需相应的调高培养液的流量，且培养液流量的增加量须与组织悬浮液流量的减小量相等，使从所述主流通道206指向所述辅流通道207的正向压强差不变，以保证组织固定和培养的稳定性。

进一步地，在进行组织原位对照培养时，通过调节不同培养液之间的流量配比，可选择性地将不同列的组织暴露于不同的培养液中。在本实施例中，在组织固定后停止组织悬浮液的输送，两路培养液的流量设置为8:8μL/min，则左边两列和右边两列的组织分别暴露在从所述培养液入口203和202流入的培养液中；若流量设置为4:12μL/min，则左边一列和右边三列的组织分别暴露在两路培养液中；若流量设置为12:4μL/min，则左边三列和右边一列的组织分别暴露在两路培养液中。

进一步地，在进行动物组织原位对照培养时，组织悬浮液可以是包含分离细胞、细胞簇、小块组织或器官等的悬浮液；一般使用加入不同浓度试剂或药物后的培养液进行组织比对培养；辅流液体通常使用常规培养液。在本实施例中，组织悬浮液使用乳腺癌细胞三维组织，两路培养液分别是常规组织培养液和加入一定浓度他莫昔芬药物后的组织培养液，辅流液体为常规组织培养液。

进一步地，所述组织培养单元208的几何结构和尺寸、微流体通道的宽度和高度均可由实际所用组织的尺寸和形态所确定。在本实施例中，所用乳腺癌细胞三维组织的直径约为100～200μm，所述组织培养单元208的高度为250μm，宽度为250μm，长度为500μm；其狭长微流体通道宽度为40μm，长度为100μm，用于阻挡并将组织稳固在所述培养单元208；该微流控芯片的微流体通道高度为250μm，宽度为500μm。

进一步地，该微流控芯片的所述顶层结构10和底层结构20可用聚二甲基硅氧烷(PDMS)加工；该微流控芯片的所述衬底30可用玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯等硬质透明材料加工。在本实施例中，微流控芯片的衬底30为玻璃，微流控芯片的顶层结构10和底层结构20均为PDMS，则所述顶层结构10的组织悬浮液入口101、培养液入口102和103、主流出口108与所述底层结构20的组织悬浮液入口201、培养液入口202和203、主流出口211可在两层结构键合之后一起打孔实现。所述底层结构20的辅流流入通孔209a、辅流流出通孔209b在两层结构键合之间打孔实现。

综上所述，本发明提供了一种用于动物组织原位对照培养的微流控芯片。具有以下有益效果：1)该微流控芯片采用阵列形式的组织培养微流体网络结构，利用流体力学原理，将每个组织稳定地固定在组织培养单元，实现了多组织在同一芯片上的高通量、稳定、长时间的培养；2)该微流控芯片利用层流的原理，结合液流汇聚、Y型分流等微流体通道结构，对固定在不同列的组织输送不同的培养液，从而实现动物组织的原位对照培养；3)该微流控芯片可进行高集成度扩展，每列可集成更多数目的组织固定单元，亦可增加列数及相应的培养液输入口的数目、Y型分流区和汇流区的级数，实现组织培养对照组数的扩展；4)该微流控芯片使用了透明加工材料，可在显微镜下进行实时监测、原位分析组织的动态生长、分化过程，用以研究组织结构和功能在不同培养环境刺激下的动力学参数。所以本发明有效克服了现有技术中的缺点和应用领域的缺失，在基于微流控芯片的动物组织原位对照培养分析领域具有高度实用价值。

上述实施例仅例示性地说明了本发明的基本原理、组件结构、工作过程及功效，而非用于限制本发明的应用。任何熟练掌握该技术的人员皆可在不违背本发明的原理下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的原理与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应视为本发明的保护范围且由本发明的权利要求所涵盖。

Claims

1.一种用于动物组织原位对照培养的微流控芯片，包括顶层结构(10)和底层结构(20)；其特征在于：

在所述底层结构(20)上设有阵列式的微流道网络；所述微流道网络包括若干列主流通道(206)及与所述主流通道(206)相对应的若干辅流通道(207)；在所述主流通道(206)与所述辅流通道(207)之间设有若干组织培养单元(208)；所述主流通道(206)通过分流区与主流输入分配通道(205)连通；所述主流输入分配通道(205)入口连通底层组织悬浮液入口(201)、两路底层培养液入口(202、203)；所述底层组织悬浮液入口(201)位于两路所述底层培养液入口(202、203)之间；通过调节两路培养液与组织悬浮液之间的流量配比，所述主流输入分配通道(205)将组织悬浮液中的动物组织(40)分配至各个组织培养单元(208)；

在所述顶层结构(10)上设有辅流输入分配通道(105)；所述辅流输入分配通道(105)入口连接辅流入口(104)；所述辅流输入分配通道(105)通过分流区与所述底层结构(20)中的辅流通道(207)连通；所述组织悬浮液中的动物组织(40)通过所述主流通道(206)与所述辅流通道(207)之间的压强差固定在所述组织培养单元(208)中。

2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：在所述主流输入分配通道(205)的入口处设有将所述组织悬浮液及两路培养液以层流鞘流形式汇聚的组织汇流区(204)。

3.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述顶层结构(10)及底层结构(20)中的分流区均为若干Y型分流区；所述阵列式微流道网络的列数为2的正整数次幂。

4.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述阵列式微流道网络的列数由分流区分流的流道及分流区的级数确定；具体为分流区为m级分流，每级分流区将一个流道分为n个流道。则所述阵列式微流道网络的列数为n^m。

5.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：每列所述主流通道(206)与所述辅流通道(207)之间的组织培养单元的个数为大于或等于1的整数。

6.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述组织悬浮液为包含分离细胞、细胞簇、小块组织或器官其中任一或之间任意混合的悬浮液；所述辅流液体使用常规培养液。

7.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：通过调节不同培养液之间的流量配比，选择性地将不同列的动物组织暴露于不同的培养液中进行组织原位对照培养。